CN115414528A

CN115414528A - 一种复合透明质酸钠微球凝胶及其制备方法和应用

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Publication number: CN115414528A
Application number: CN202211168202.8A
Authority: CN
Inventors: 金家铸; 李成健; 江云东; 盛江伟; 朱华青; 陈家智; 黎斌
Original assignee: Hangzhou Keteng Biological Product Co ltd
Current assignee: Hangzhou Keteng Biological Product Co ltd
Priority date: 2022-09-23
Filing date: 2022-09-23
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2042-09-23
Also published as: CN115414528B

Abstract

本发明提供一种复合透明质酸钠微球凝胶，包括修饰透明质酸钠凝胶以及均匀分布于凝胶中的聚己内酯复合微球；所述修饰透明质酸钠凝胶包括交联透明质酸钠和利多卡因，所述聚己内酯复合微球为甲基纤维素包裹的聚己内酯微球；本发明还提供一种复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法和用途；本发明的复合透明质酸钠微球凝胶具有良好的生物相容性，具有良好的弹性和机械强度，且形状维持性佳。

Description

一种复合透明质酸钠微球凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种可降解材料，特别是涉及一种复合透明质酸钠微球凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

聚酯类材料如聚乳酸、聚己内酯等，具有良好的生物相容性、抗凝血性、无毒和低免疫性等优点，因此被广泛应用于生物医药和组织工程领域。目前皮肤填充物已发展到高聚物填充物，如：PDO，PLA，PCL……它们具有更长的皮下降解时间，但仍有各种问题需要解决。如聚己内酯微球作为细胞生长支持材料，其耐热性差，经过高温灭菌后稳定性较差，且聚己内酯微球易团聚、沉淀，流动性较差，因此流动性及耐热性能影响其作为人体填充材料时的使用。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种复合透明质酸钠微球凝胶及其制备方法和应用，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种复合透明质酸钠微球凝胶，包括修饰透明质酸钠凝胶以及均匀分布于凝胶中的聚己内酯复合微球；所述修饰透明质酸钠凝胶包括交联透明质酸钠和利多卡因，所述聚己内酯复合微球为甲基纤维素包裹的聚己内酯微球。

优选地，所述复合透明质酸钠微球凝胶中各成分的含量为聚己内酯微球280～320mg/mL，交联透明质酸钠8～24mg/mL，利多卡因1～5mg/mL，甲基纤维素5～20mg/mL。

优选地，所述交联透明质酸钠为透明质酸钠交联反应得到。

优选地，所述聚己内酯复合微球粒径为25-50um。

本发明还提供一种复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1.制备聚己内酯复合微球；

S2.制备交联透明质酸钠；

S3.将步骤S2制备的交联透明质酸钠进行透析，并加入利多卡因溶液，获得修饰透明质酸钠凝胶；

S4.将步骤S1制备的聚己内酯复合微球加入步骤S3制备的修饰透明质酸钠凝胶中，混合均匀，干燥，灭菌，即得复合透明质酸钠微球凝胶。

优选地，步骤S1中，所述聚己内酯复合微球是通过包衣或覆膜的方法将甲基纤维素均匀包裹于聚己内酯微球表面的。

优选地，步骤S2中，所述交联透明质酸钠为透明质酸钠与交联剂在碱液中发生交联反应制得。

优选地，步骤S3中，所述透析采用透析液进行透析；所述透析液为磷酸盐缓冲液；所述透析液pH为6.8～7.6；所述透析液渗透压为270-350mOsm/L。

优选地，步骤S3中，所述利多卡因溶液的浓度为5～20mg/mL；所述修饰透明质酸钠凝胶中利多卡因的含量为2～5mg/mL。

优选地，步骤S3中，透析后交联透明质酸钠溶液浓度为8～10mg/mL。

优选地，步骤S4中，所述聚己内酯复合微球与修饰透明质酸钠凝胶的质量比为(0.5～5):(5～9.5)。

优选地，步骤S4中，所述混合均匀为采用螺旋桨式增力搅拌器搅拌均匀。

优选地，步骤S4中，所述干燥采用旋转真空蒸发器。

优选地，步骤S4中，所述灭菌为于预灌封注射器中100～120℃、30～50min湿热灭菌。

本发明另一方面还提供一种如上所述的复合透明质酸钠微球凝胶作为支撑材料和塑形材料的用途

如上所述，本发明的复合透明质酸钠微球凝胶及其制备方法和用途，具有以下有益效果：

本发明的复合透明质酸钠微球凝胶具有良好的生物相容性，具有良好的弹性和机械强度，且形状维持性佳。

本发明的复合透明质酸钠微球凝胶分散均匀，不会堆积沉淀，且使用时推挤顺畅。

本发明的复合透明质酸钠微球凝胶耐热性能佳，经高温杀菌后仍保持较好的稳定性。

附图说明

图1显示为本发明实施例1制备的复合透明质酸钠微球凝胶的显微图。

图2显示为本发明实施例4制备的复合透明质酸钠微球凝胶的显微图。

图3显示为本发明实施例12空白对照组的显微图。

图4显示为本发明实施例12对照组一的显微图。

图5显示为本发明实施例12对照组二的显微图。

图6显示为本发明实施例1制备的复合透明质酸钠微球凝胶于注射器中的状态图。

图7显示为本发明实施例5制备的复合透明质酸钠微球凝胶于注射器中的状态图。

图8显示为本发明实施例1制备的复合透明质酸钠微球凝胶的试验力图。

图9显示为本发明实施例6制备的复合透明质酸钠微球凝胶的试验力图。

图10显示为实施例9中动物体注射点示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本发明第一方面提供一种复合透明质酸钠微球凝胶，包括修饰透明质酸钠凝胶以及均匀分布于凝胶中的聚己内酯复合微球；修饰透明质酸钠凝胶包括交联透明质酸钠和利多卡因，聚己内酯复合微球为甲基纤维素包裹的聚己内酯微球。

聚己内酯具有良好的生物相容性、良好的有机高聚物相容性，以及良好的生物降解性，可用作细胞生长支持材料，在体内与生物细胞相容性很好，细胞可在其基架上正常生长，并可降解成CO₂和H₂O。

透明质酸钠是人体内分布最广的一种酸性黏糖，存在于结缔组织的基质中，具有良好的保湿作用。透明质酸钠是皮肤固有的生物物质，外源性的透明质酸钠是对皮肤内源性的补充。较小的透明质酸钠可渗入皮肤表皮层，促进皮肤营养的供给和废物的排泄，从而防止皮肤老化，起到美容和养颜作用。透明质酸钠通过促进表皮细胞的增殖和分化，以及清除氧自由基的作用，可促进受伤部位皮肤的再生，事先使用也有一定预防作用。

甲基纤维素是一种非离子纤维素醚，可作水溶性胶黏剂的增稠剂。

利多卡因具有麻醉作用，可用作表面麻醉、局部浸润麻醉和神经阻滞麻醉。

本发明的复合透明质酸钠微球凝胶中，在聚己内酯微球表面包裹甲基纤维素增强了微球的耐热性，本发明中的修饰透明质酸钠凝胶能够使聚己内酯复合微球均匀分散于其中，不会堆积沉淀，修饰透明质酸钠凝胶中的利多卡因具有麻醉作用，能够减轻或消除本发明复合透明质酸钠微球凝胶注射时的疼痛感。

本发明提供的复合透明质酸钠微球凝胶中，复合透明质酸钠微球凝胶的各成分的含量为聚己内酯微球280～320mg/mL，交联透明质酸钠8～24mg/mL(以参与交联的透明质酸钠量计)，利多卡因1～5mg/mL(以利多卡因物质含量计)，甲基纤维素5～20mg/mL(以甲基纤维素物质含量计)。聚己内酯的含量可以为280～290mg/mL、290～300mg/mL、300～310mg/mL或310～320mg/mL。在本发明较佳的实施方式中，复合透明质酸钠微球凝胶中聚己内酯微球含量为300mg/mL。交联透明质酸钠的含量可以为8～12mg/mL、12～16mg/mL、16～20mg/mL或20～24mg/mL。在本发明较佳的实施方式中，复合透明质酸钠微球凝胶中交联透明质酸钠的含量为15mg/mL。利多卡因的含量为1～2mg/mL、2～3mg/mL、3～4mg/mL或4～5mg/mL。在本发明较佳的实施方式中，复合透明质酸钠微球凝胶中利多卡因的含量为3mg/mL。甲基纤维素的含量为5～10mg/mL、10～15mg/mL或15～20mg/mL。在本发明较佳的实施方式中，复合透明质酸钠微球凝胶中甲基纤维素的含量为10mg/mL。

本发明提供的复合透明质酸钠微球凝胶中，交联透明质酸钠为透明质酸钠交联反应获到。

其中，交联反应的交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。交联反应在碱液中进行。在本发明较佳的实施方式中，碱液为质量浓度0.5～4％的氢氧化钠溶液。氢氧化钠溶液的质量浓度可以为0.5～1％、1～1.5％、1.5～2％、2～2.5％、2.5～3％、3～3.5％或3.5～4％。

本发明提供的复合透明质酸钠微球凝胶中，聚己内酯复合微球粒径为25-50um。本发明中控制聚己内酯复合微球的粒径，使粒子之间摩檫力小，流动性好，在凝胶中分散好，分散均匀度高。

本发明第二方面提供一种复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1.制备聚己内酯复合微球；

S2.制备交联透明质酸钠凝胶；

S3.将步骤S2的交联透明质酸钠凝胶进行透析，并加入利多卡因溶液，获得修饰透明质酸钠凝胶；

S4.将步骤S1制备的聚己内酯复合微球加入步骤S3制备的修饰透明质酸钠凝胶中，混合均匀，干燥，即得复合透明质酸钠微球凝胶。

本发明提供的复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法中，步骤S1中，聚己内酯复合微球是通过包衣或覆膜的方法将甲基纤维素均匀包裹于聚己内酯微球表面的。在聚己内酯微球表面包覆甲基纤维素可增加微球的耐热性。具体制备过程为：将聚己内酯微球置于流化床包衣机滚筒内，将甲基纤维素溶液置于注射泵中，甲基纤维素溶液经气化后以极细雾滴由喷枪喷射入滚筒，在滚筒内的微球表面溶剂迅速挥发形成薄膜。

其中，甲基纤维素溶液为浓度5～20mg/mL的水溶液。甲基纤维素水溶液的浓度可以为5～10mg/mL、10～15mg/mL或15～20mg/mL。聚己内酯复合微球中聚己内酯微球与甲基纤维素的质量比为(28～32):(0.5～2)，例如为(28～30):(0.5～2)、(30～32):(0.5～2)、(28～32):(0.5～1)、(28～32):(1～1.5)或(28～32):(1.5～2)。

本发明提供的复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法中，步骤S2中，交联透明质酸钠凝胶为透明质酸钠与交联剂在碱液中发生交联反应制得。交联后的透明质酸钠粘弹性增强，交联后得到的交联透明质酸钠凝胶进行透析利于聚己内酯复合微球均匀分布于其中。

其中，交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。

交联剂与透明质酸钠的质量比为1:15～1:30。例如为1:15～1:20、1:20～1:25或1:25～1:30。在本发明较佳的实施方式中，交联剂与透明质酸钠的质量比为1:20。

碱液为质量百分比浓度0.5～4％的NaOH水溶液。NaOH水溶液的质量浓度可以为0.5～1％、1～1.5％、1.5～2％、2～2.5％、2.5～3％、3～3.5％或3.5～4％。在本发明较佳的实施方式中，NaOH水溶液的质量百分比浓度为1％。

交联剂在碱液中的质量百分比浓度为0.1～3％。例如为0.1～0.5％、0.5～1％、1～1.5％、1.5～2％、2～2.5％或2.5～3％。在本发明较佳的实施方式中，交联剂在碱液中的质量百分比浓度为0.67％。

本发明提供的复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法中，步骤S3中，透析采用透析液进行透析，透析液为磷酸盐缓冲液；透析液pH为6.8～7.6；透析液渗透压为270-350mOsm/L。可更换透析液进行3～6次透析。

其中，透析液pH可以为6.8～7.0、7.0～7.2、7.2～7.4或7.4～7.6。

透析液渗透压可以为270-280mOsm/L、280-290mOsm/L、290-300mOsm/L、300-310mOsm/L、310-320mOsm/L、320-330mOsm/L、330-340mOsm/L或340-350mOsm/L。

交联透明质酸钠与透析液的质量比为1:360～1:1200；例如为1:360～1:400、1:400～1:500、1:500～1:600、1:600～1:700、1:700～1:800、1:800～1:900、1:900～1:1000、1:1000～1:1100或1:1100～1:1200。在本发明较佳的实施方式中，交联透明质酸钠凝胶与透析液的质量比为1:700～1:800。在本发明优选的实施方式中，交联透明质酸钠凝胶与透析液的质量比为1:750。

利多卡因溶液的浓度为5～20mg/mL。例如为5～10mg/mL、10～15mg/mL或15～20mg/mL。在本发明较佳的实施方式中，利多卡因溶液的浓度为10mg/mL。利多卡因溶液的溶剂为水。

修饰透明质酸钠凝胶中利多卡因的含量为2～5mg/mL。例如为2～3mg/mL、3～4mg/mL或4～5mg/mL。在本发明较佳的实施方式中，修饰透明质酸钠凝胶中利多卡因的含量为3mg/mL。

透析后，交联透明质酸钠溶液浓度为8～10mg/mL。例如为8～9mg/mL或9～10mg/mL。此时交联透明质酸钠溶液的浓度是以初始加入的透明质酸钠的量除以透析后溶液的总体积计算得到。本发明中通过控制交联剂的用量以及采用透析的方式，使透析后的交联透明质酸钠溶液既有交联凝胶的特性又有非交联凝胶的性质。

本发明提供的复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法中，步骤S4中，聚己内酯复合微球与修饰透明质酸钠凝胶的比例为(0.5～5):(5～9.5)。例如为(0.5～1):(5～9.5)、(1～2):(5～9.5)、(2～3):(5～9.5)、(3～4):(5～9.5)、(4～5):(5～9.5)、(0.5～5):(5～6)、(0.5～5):(6～7)、(0.5～5):(7～8)、(0.5～5):(8～9)或(0.5～5):(9～9.5)。在本发明较佳的实施方式中，聚己内酯复合微球与修饰透明质酸钠凝胶的比例为3:7。

步骤S4中，混合均匀为采用螺旋桨式增力搅拌器搅拌均匀。干燥采用旋转真空蒸发器。

步骤S4中，灭菌为于预灌封注射器中100～120℃、湿热灭菌30～50min。灭菌温度可以为100～110℃或110～120℃。灭菌时间可以为30～40min或40～50min。在本发明较佳的实施方式中，灭菌为于预灌封注射器中110℃、湿热灭菌30min。

本发明第三方面提供一种如上所述的复合透明质酸钠微球凝胶作为支撑材料和塑形材料的用途。

本发明的复合透明质酸钠微球凝胶注入皮下，能刺激自身胶原增生，被自生的胶原包裹，从而达到柔软的持久的充填效果，并随着包裹的透明质酸钠凝胶被吸收，微球间的间隙会被自生胶原填充，达到长期充填的效果，本发明的复合透明质酸钠微球凝胶使用时简单、安全且无需修复期。

实施例1

一种复合透明质酸钠微球凝胶，包括修饰透明质酸钠凝胶以及均匀分布于凝胶中的聚己内酯复合微球；修饰透明质酸钠凝胶包括交联透明质酸钠和利多卡因，聚己内酯复合微球为甲基纤维素包裹的聚己内酯微球；复合透明质酸钠微球凝胶中的各成分的含量为聚己内酯微球300mg/mL，交联透明质酸钠15mg/mL，利多卡因3mg/mL，甲基纤维素10mg/mL。

复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法为：

S1.将浓度为10mg/mL的甲基纤维素溶液置于包膜仪器的注射泵中，将20～50um粒径的聚己内酯微球置于滚筒中，在流化床包衣机中将甲基纤维素溶液气化以极细雾滴由喷枪喷射入滚筒聚己内酯微球上，溶剂迅速挥发在微球表面上形成薄膜，获得聚己内酯微球与甲基纤维素质量比为30：1的聚己内酯复合微球；

S2.将BDDE与质量百分比浓度1％的NaOH溶液混合得混合液(BDDE在碱液中的质量百分比浓度为0.67％)，将透明质酸钠加入混合溶液中(透明质酸钠与BDDE的质量比为20:1)，溶解完全，在50℃热交联反应1.5h，冷却至室温后，放入冷藏柜在6℃保存14h，得到交联透明质酸钠凝胶；

S3.将交联透明质酸钠凝胶以1g:750mL比例浸泡在磷酸盐缓冲液(pH7.0～7.2；渗透压为300-320mOsm/L)，进行透析，更换五次缓冲液以充分透析，透析后得交联透明质酸钠溶液浓度8mg/mL，加入浓度10mg/mL的利多卡因溶液，搅拌均匀，得到修饰透明质酸钠凝胶，修饰透明质酸钠凝胶中利多卡因的含量为3mg/mL；

S4.将步骤S1制备的聚己内酯复合微球加入步骤S3制备的修饰透明质酸钠凝胶中，聚己内酯复合微球与修饰透明质酸钠凝胶的质量比为3:7，用螺旋桨式增力搅拌器搅拌均匀，并于旋转真空蒸发器干燥，并于预灌封注射器中110℃、30min湿热灭菌，得到各成分的含量为聚己内酯微球300mg/mL、交联透明质酸钠15mg/mL、利多卡因3mg/mL、甲基纤维素10mg/mL的复合透明质酸钠微球凝胶。

本实施例制备的复合透明质酸钠微球凝胶通过显微观察发现：微球基本维持球状，不黏连，通过粒径分析检测，25-50μm区间的颗粒占总比的70％左右(如图1：放大350倍)，且微球无形变。本实施例的复合透明质酸钠微球凝胶不会出现聚集沉淀现象，放置两周后微球仍均匀分布于凝胶中(如图6)。且在注射使用时推挤顺畅，用推拉力测试机检测，用力均小于25N。

采用XBD4000系列万能试验机，检测本实施例的复合透明质酸钠微球凝胶，结果如图8所示：平稳时最小值和最大值相差很小，推挤力很平稳，推挤力度不到13N，推起来很顺畅。

本发明的复合透明质酸钠微球凝胶耐热性增强，相较于聚己内酯在高温后不稳定、出现粘连的现象，本实施例制备的复合透明质酸钠微球凝胶在110℃、30min湿热灭菌后仍保持较好性能，基本维持球状，分布均匀，稳定性佳。

实施例2

一种复合透明质酸钠微球凝胶，包括修饰透明质酸钠凝胶以及均匀分布于凝胶中的聚己内酯复合微球；修饰透明质酸钠凝胶包括交联透明质酸钠和利多卡因，聚己内酯复合微球为甲基纤维素包裹的聚己内酯微球；复合透明质酸钠微球凝胶中的各成分的含量为聚己内酯微球280mg/mL，交联透明质酸钠8mg/mL，利多卡因1mg/mL，甲基纤维素5mg/mL。

复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法为：

S1.将浓度为5mg/mL的甲基纤维素溶液置于包膜仪器的注射泵中，将20～50um粒径的聚己内酯微球置于滚筒中，在流化床包衣机中将甲基纤维素溶液气化以极细雾滴由喷枪喷射入滚筒聚己内酯微球上，溶剂迅速挥发在微球表面上形成薄膜，获得聚己内酯微球与甲基纤维素质量比为28：0.5的聚己内酯复合微球；

S2.将交联剂BDDE与质量百分比浓度0.5％的NaOH溶液混合得混合液(BDDE在碱液中的质量百分比浓度为0.1％)，将透明质酸钠加入混合溶液中(透明质酸钠与BDDE的质量比为15:1)，溶解完全，在50℃热交联反应1.5h，冷却至室温后，放入冷藏柜在6℃保存12h，得到交联透明质酸钠凝胶；

S3.将交联透明质酸钠凝胶以1g:360mL比例浸泡在磷酸盐缓冲液()，进行透析，更换五次缓冲液以充分透析，透析后得交联透明质酸钠溶液浓度为8mg/mL，加入浓度5mg/mL的利多卡因溶液，搅拌均匀，得到修饰透明质酸钠凝胶，修饰透明质酸钠凝胶中利多卡因的含量为2mg/mL；

S4.将步骤S1制备的聚己内酯复合微球加入步骤S3制备的修饰透明质酸钠凝胶中，聚己内酯复合微球与修饰透明质酸钠凝胶的质量比为0.5:5，用螺旋桨式增力搅拌器搅拌均匀，并于旋转真空蒸发器干燥，并于预灌封注射器中100℃、50min湿热灭菌，得到各成分的含量为聚己内酯微球280mg/mL、交联透明质酸钠8mg/mL、利多卡因1mg/mL、甲基纤维素5mg/mL的复合透明质酸钠微球凝胶。

本实施例制备的复合透明质酸钠微球凝胶通过显微观察发现：微球基本维持球状，不黏连，且微球无形变。本实施例的复合透明质酸钠微球凝胶不会出现聚集沉淀现象，放置两周后仍能保持均匀分布。且在注射使用时推挤顺畅，用推拉力测试机检测，推挤力保持在10～30N。本实施例制备的复合透明质酸钠微球凝胶在100℃、50min湿热灭菌后仍保持较好性能，稳定性佳。

实施例3

一种复合透明质酸钠微球凝胶，包括修饰透明质酸钠凝胶以及均匀分布于凝胶中的聚己内酯复合微球；修饰透明质酸钠凝胶包括交联透明质酸钠和利多卡因，聚己内酯复合微球为甲基纤维素包裹的聚己内酯微球；复合透明质酸钠微球凝胶中的各成分的含量为聚己内酯微球320mg/mL，交联透明质酸钠24mg/mL，利多卡因5mg/mL，甲基纤维素20mg/mL。

复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法为：

S1.将浓度为20mg/mL的甲基纤维素溶液置于包膜仪器的注射泵中，将20～50um粒径的聚己内酯微球置于滚筒中，在流化床包衣机中将甲基纤维素溶液气化以极细雾滴由喷枪喷射入滚筒聚己内酯微球上，溶剂迅速挥发在微球表面上形成薄膜，获得聚己内酯微球与甲基纤维素质量比为32：2的聚己内酯复合微球；

S2.将BDDE与质量百分比浓度4％的NaOH溶液混合得混合液(BDDE在碱液中的质量百分比浓度为3％)，将透明质酸钠加入混合溶液中(透明质酸钠与BDDE的质量比为30:1)，溶解完全，在50℃热交联反应1.5h，冷却至室温后，放入冷藏柜在6℃保存16h，得到交联透明质酸钠；

S3.将交联透明质酸钠以1g:1200mL比例浸泡在磷酸盐缓冲液，进行透析，更换五次缓冲液以充分透析，透析后得交联透明质酸钠溶液浓度为10mg/mL，加入浓度20mg/mL的利多卡因溶液，搅拌均匀，得到修饰透明质酸钠凝胶，修饰透明质酸钠凝胶中利多卡因的含量为5mg/mL；

S4.将步骤S1制备的聚己内酯复合微球加入步骤S3制备的修饰透明质酸钠凝胶中，聚己内酯复合微球与修饰透明质酸钠凝胶的质量比为5:9.5，用螺旋桨式增力搅拌器搅拌均匀，并于旋转真空蒸发器干燥，并于预灌封注射器中120℃、40min湿热灭菌，得到各成分的含量为聚己内酯微球320mg/m、交联透明质酸钠24mg/mL、利多卡因5mg/mL、甲基纤维素20mg/mL的复合透明质酸钠微球凝胶。

本实施例制备的复合透明质酸钠微球凝胶通过显微观察发现：微球基本维持球状，不黏连，且微球无形变。本实施例的复合透明质酸钠微球凝胶不会出现聚集沉淀现象，放置两周后仍能保持均匀分布。且在注射使用时推挤顺畅，用推拉力测试机检测，推挤力保持在10～30N。本实施例制备的复合透明质酸钠微球凝胶在120℃、40min湿热灭菌后仍保持较好性能，稳定性佳。

实施例4

一种复合透明质酸钠微球凝胶，包括修饰透明质酸钠凝胶以及分布于凝胶中的聚己内酯微球；本实施例中的聚己内酯微球没有经过甲基纤维素包裹，其余方法同实施例1。

本实施例制备的复合透明质酸钠微球凝胶通过显微观察发现：微球变形黏连成不规则形状，难以维持原本球状(如图2：放大350倍)；通过粒径分析检测，微球体积在25-50μm区间约30％，大于100μm大约有45％，影响注射使用。

实施例5

一种复合透明质酸钠微球凝胶，包括修饰透明质酸钠凝胶以及分布于凝胶中的聚己内酯复合微球；本实施例中的修饰透明质酸钠凝胶为未交联的透明质酸钠与利多卡因溶液混合，其余方法同实施例1。

本实施例制备的复合透明质酸钠微球凝胶，在放置两周时间后发生聚沉现象(如图7)。

实施例6

一种复合透明质酸钠微球凝胶，包括修饰透明质酸钠凝胶以及分布于凝胶中的聚己内酯复合微球；修饰透明质酸钠凝胶包括交联透明质酸钠和利多卡因，聚己内酯复合微球为甲基纤维素包裹的聚己内酯微球。与实施例1的不同之处在于步骤S3中透析后，透析后得交联透明质酸钠溶液大于24mg。

采用XBD4000系列万能试验机，检测本实施例的复合透明质酸钠微球凝胶，结果如图9所示：波动很大，推挤时用的力也大，平均也在40N以上，表明本实施例制备的复合透明质酸钠微球凝胶，因凝胶浓度过大，在使用过程中，推挤不顺畅。

功效实验：

实施例7

将实施例1的复合透明质酸钠微球凝胶进行热源试验：

在试验环境与饲养环境相似，且排除外界导致动物兴奋的干扰情况下，对实验动物禁饲并控制饮水。挑选家兔3只，测定其正常体温后15min以内，自耳静脉缓缓注入对应10mL/kg剂量并温热至约38℃的供试溶液。注射后每隔30min测量体温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度。试验结果如表1所示：

表1热源试验结果

由表1数据可知：3只家兔中，体温升高均＜0.6℃，并且3只家兔体温升高总和＜1.3℃，样品符合要求。即在本实验下，实验动物未引起发热反应。

实施例8

将实施例1的复合透明质酸钠微球凝胶进行体外细胞毒性试验：

L-929细胞用含10％胎牛血清的MEM培养基置于含5％CO₂的培养箱中37℃培养2-3代。用含0.25％胰蛋白酶的消化液消化，获得细胞悬液，200G离心3min，弃上清，用MEM培养基重新悬浮，制备1×10⁵/mL的细胞悬液。于96孔板中接种制备好的细胞悬液，每孔100uL,置于5％CO₂的培养箱(相对湿度大于90％)中37℃培养24h。评估细胞生长形态，以验证单层细胞生长良好。

弃去原有培养基，每孔分别加入100uL测试样品浸提液(浓度100％、75％、50％、25％)、对照品浸提液和空白对照液，每组重复6孔。置于含5％CO₂的培养箱中37℃培养24h。观察细胞形态，弃去培养基，各孔分别加入50uL浓度为1mg/mL的MTT溶液，再次培养2h。弃去液体，加入100uL异丙醇，振荡10min，使用酶标仪于570nm(参考波长650nm)处测定OD值。

样品的制备：

浸提介质：含10％胎牛血清的MEM培养基；

测试样品：称取样品(实施例1的复合透明质酸钠微球凝胶)2.00g，饱和吸收20.00g浸提介质后，按照0.2g/mL比例加入10.0mL浸提介质。37℃，浸提72h。系列稀释浸提液，制备100％、75％、50％和25％的样品供试液。浸提液未经过滤、离心或其他方式处理。浸提液pH值约为6.7。

阳性对照：使用含有0.25％苯酚的浸提介质作为阳性对照，浸提条件同测试样品制备条件。

阴性对照：使用高密度聚乙烯作为阴性对照，按3cm²/mL的比例，使用15cm²浸没于5mL浸提介质中，浸提条件同测试样品制备条件。

空白对照：使用浸提介质作为空白对照，浸提条件同测试样品制备条件。

浸提液状态：样品供试液为浑浊，阴性对照、阳性对照和空白对照液均为澄清。

试验结果如表2所示：

表2细胞毒性测试结果

显微镜观察细胞形态描述：

0：细胞形态正常，贴壁生长良好，胞浆内有离散颗粒；无细胞溶解；

1：不超过20％的细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒或显示形态学方面的改变；偶见细胞溶解；仅观察到轻微的细胞生长抑制现象；

2：不超过50％的细胞呈圆缩、无胞浆内颗粒，无大范围细胞溶解；可观察到不超过50％的细胞生长抑制现象；

3：不超过70％的细胞层包含圆缩细胞或溶解细胞；细胞层未完全破坏，但可观察到超过50％的细胞生长抑制现象；

4：细胞层几乎完全或完全破坏。

由表2可知：50％样品浸提液的细胞相对活力不低于100％浸提液的细胞相对活力；试剂空白吸光度≥0.2，试剂空白值与平均值的差值不大于15％，试验符合质控要求。阳性对照显示细胞毒性，阴性对照无细胞毒性。试验结果表明，样品浸提液的细胞相对活力为91.39％以上，大于70％，无潜在细胞毒性。

实施例9

将实施例1的复合透明质酸钠微球凝胶进行皮内反应试验：

试验前4-18h除去动物背部脊柱两侧被毛，以备注射浸提液。准备3只家兔。每只兔背部脊柱上部两侧(图10中方框外围2、4所包括的位置)的5个点分别皮内注射0.2mL极性浸提液和极性溶剂对照液(极性溶剂：氯化钠注射液(SC)；测试样品量：1mL；浸提介质：50mL；浸提条件：37℃，72h)；在脊柱后端两侧(图10中方框外围3、5所包括的位置)的5个点分别皮内注射非极性浸提液和非极性溶剂对照液(非极性溶剂：棉籽油(CO)；测试样品量：2mL；浸提介质：10mL；浸提条件：37℃，72h)。注射后即刻观察。将动物放回笼具中。在(24±2)h、(48±2)h和(72±2)h观察记录各注射部位状况，按表3-1给出的记分系统对每一观察期各注射部位的红斑和水肿的组织反应评分，并记录试验结果，如表3、表3-2与表3-3。表3为每只动物的评分结果；表3-1为注射部位所有时间点的评分结果；表3-2为注射部位所有时间点的评分结果。根据GB/T16886.10-2017测试标准进行阳性对照激发试验(每三个月进行一次)，结果见表3-4。

评分方法：在72h评分后，分别将每只动物的每一测试样品组和溶剂对照组的(24±2)h、(48±2)h及(72±2)h的全部红斑与水肿记分相加，再除以15(3(观察期)×5(测试点或空白注射点))计算出每一测试样品组和每一对应溶剂对照组的综合平均记分。如试验样品和溶剂对照平均记分之差不大于1.0，则符合实验要求。

图10中，方框外围的1表示动物头端，2表示0.2mL极性浸提液注射点，3表示0.2mL非极性浸提液注射点，4表示0.2mL极性溶剂对照液注射点，5表示0.2mL非极性溶剂对照液注射点，6表示动物尾端。

表3皮内反应评分结果

表3-1皮内反应评分标准

表3-2极性浸提液评分结果

表3-3非极性浸提液评分结果

由表3-1至3-3可知：本发明的复合透明质酸钠微球凝胶的极性浸提液或极性溶剂不会造成家兔出现红斑或水肿的情况，而非极性浸提液和非极性溶剂可能部分会造成极轻微(勉强可见)的红斑和水肿现象。

通过试验观察及由表3至表3-3数据可知：每只动物所有注射部位即刻观察结果正常。且统计分析测试样品组和溶剂对照组平均记分之差不大于1.0，符合测试要求。

表3-4阳性对照激发试验

通过试验观察及由表3与表3-4对比可知：测试样品和溶剂对照的平均记分之差不大于1.0，样品符合测试要求。阳性对照激发试验也确保了本发明复合透明质酸钠微球凝胶的敏感性。

实施例10

将实施例1的复合透明质酸钠微球凝胶进行急性全身毒性试验：

试验前，标识小鼠并称重。每种浸提液使用5只小鼠，以50mL/kg的剂量分别将极性浸提液和极性溶剂(氯化钠注射液)通过尾静脉注入小鼠体内，非极性浸提液和非极性溶剂(棉籽油)通过腹腔注射进入小鼠体内。观察小鼠即时及注射后4h、24h、48h、72h后的反应，记录注射时及注射后24h、48h、72h的动物体重并观察临床反应。如表4、表5。在观察期内试验组动物的反应不大于对应的对照组，浸提液符合测试要求。如果有两只或两只以上动物死亡或明显行为异常，或者有三只或三只以上动物体重减少多于10％，浸提液不符合测试要求。

表4动物体重变化/g

表5动物临床观察

上述急性全身毒性试验以及表4、5数据表明：样品浸提液组与溶剂对照组对小鼠体重的影响均在可接受范围内，试验期间小鼠临床表现正常，表明本发明的复合透明质酸钠微球凝胶无毒性。

实施例11

将实施例1的复合透明质酸钠微球凝胶进行皮肤致敏试验：

实验时，每种浸提介质(极性浸提液：氯化钠注射液；非极性浸提液：棉籽油)对应15只豚鼠，其中10只试验，5只对照，称重并做标记区分。使用电推剔除动物肩肿骨内侧部位的毛发，每只豚鼠的背部肩胛骨内测2cm*4cm区域，皮内注射。结果如表6所示。

表6皮肤致敏实验结果

注：*为皮内诱导时的体重

由表6皮肤致敏试验结果可知：本发明的复合透明质酸钠微球凝胶不会造成皮肤过敏现象，认为无潜在的皮肤致敏性。

实施例12

将实施例1的复合透明质酸钠微球凝胶进行灭菌试验：

空白对照组：制备方法与实施例4相同，将制得产品装入预灌封注射器封盖后110℃湿热灭菌30min，冷却后进行显微观察和粒径分析。

对照组一：修饰透明质酸钠凝胶的制备方法同实施例1，将30g聚己内酯微球加入70mL修饰透明质酸钠凝胶中，搅拌均匀后加入1g甲基纤维素，继续混合均匀，装入预灌封注射器封盖后110℃湿热灭菌30min，冷却后进行显微观察和粒径分析。

对照组二：修饰透明质酸钠凝胶的制备方法同实施例1，将30g聚己内酯微球与1g甲基纤维素干粉混合均匀后，加入到70mL修饰透明质酸钠凝胶中，搅拌均匀，装入预灌封注射器封盖后110℃湿热灭菌30min，冷却后进行显微观察和粒径分析。

实验组：制备方法与实施例1相同，将制得产品装入预灌封注射器封盖后110℃湿热灭菌30min，冷却后进行显微观察和粒径分析。

实验结果：空白对照组经湿热灭菌后，显微观察(如图2、图3)可以明显看到聚己内酯微球变形黏连成不规则形状，难以维持原本球状，通过粒径分析检测，由于微球变形黏连，微球体积在25-50μm区间约30％，大于100μm大约有45％，影响注射使用。

对照组一灭菌后进行显微观察(图4)可以看出，微球基本能够保持球形，但有一定气泡混在胶体当中，通过粒径分析检测，对照组一加入甲基纤维素后，整体粒径相对于聚己内酯微球(25-50μm)增大约30％体积，25-50μm仅占整体粒径的10％左右，100-200μm间的微球占比约为50％。

对照组二显微观察(图5)：凝胶中包含大量气泡。

实验组显微观察(图1)：气泡少，且凝胶胶体粘度较对照组二粘度小，使用过程中，推挤顺畅，效果优于对照组。

综上所述，本发明的复合透明质酸钠微球凝胶通过在聚己内酯微球表面覆膜增加微球的耐热性，经过高温灭菌后仍能保持稳定性，通过使透明质酸钠交联增加凝胶的粘弹性，并通过控制凝胶的浓度使微球能够均匀分布于修饰透明质酸钠凝胶，不会堆积沉淀，且使用时易推挤，本发明的复合透明质酸钠微球凝胶具有良好的生物相容性，具有良好的弹性和机械强度，且形状维持性佳。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种复合透明质酸钠微球凝胶，其特征在于，包括修饰透明质酸钠凝胶以及均匀分布于凝胶中的聚己内酯复合微球；所述修饰透明质酸钠凝胶包括交联透明质酸钠和利多卡因，所述聚己内酯复合微球为甲基纤维素包裹的聚己内酯微球。

2.根据权利要求1所述的复合透明质酸钠微球凝胶，其特征在于，包括以下特征中的一项或多项：

a.所述复合透明质酸钠微球凝胶中各成分的含量为聚己内酯微球280～320mg/mL，交联透明质酸钠8～24mg/mL，利多卡因1～5mg/mL，甲基纤维素5～20mg/mL；

b.所述交联透明质酸钠为透明质酸钠交联反应获到；

c.所述聚己内酯复合微球粒径为25-50um。

3.根据权利要求2所述的复合透明质酸钠微球凝胶，其特征在于，包括以下特征中的一项或多项：

b1.所述交联反应的交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚；

b2.所述交联反应在碱液中进行。

4.根据权利要求1～3任一项所述的复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.制备聚己内酯复合微球；

S2.制备交联透明质酸钠凝胶；

S3.将步骤S2的交联透明质酸钠进行透析，并加入利多卡因溶液，获得修饰透明质酸钠凝胶；

5.根据权利要求4所述的复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述聚己内酯复合微球是通过包衣或覆膜的方法将甲基纤维素均匀包裹于聚己内酯微球表面的。

6.根据权利要求5所述的复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法，其特征在于，所述聚己内酯复合微球中聚己内酯微球与甲基纤维素的质量比为(28～32):(0.5～2)。

7.根据权利要求4所述的复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述交联透明质酸钠为透明质酸钠与交联剂在碱液中发生交联反应制得。

8.根据权利要求4所述的复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述透析采用透析液进行透析；所述透析液为磷酸盐缓冲液；所述透析液pH为6.8～7.6；

所述透析液渗透压为270-350mOsm/L；

和/或，步骤S3中，所述利多卡因溶液的浓度为5～20mg/mL；所述修饰透明质酸钠凝胶中利多卡因的含量为2～5mg/mL；

和/或，步骤S3中，透析后，交联透明质酸钠溶液浓度为8～10mg/mL。

9.根据权利要求4所述的复合透明质酸钠微球凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述聚己内酯复合微球与修饰透明质酸钠凝胶的质量比为(0.5～5):(5～9.5)；

和/或，步骤S4中，所述混合均匀为采用螺旋桨式增力搅拌器搅拌均匀；

和/或，步骤S4中，所述干燥采用旋转真空蒸发器；

和/或，步骤S4中，所述灭菌为于预灌封注射器中100～120℃、30～50min湿热灭菌。

10.一种如权利要求1～3任一项所述的复合透明质酸钠微球凝胶作为支撑材料和塑形材料的用途。