CN1154112A

CN1154112A - 二核苷-5'，5'-焦磷酸酯

Info

Publication number: CN1154112A
Application number: CN 95194159
Authority: CN
Inventors: A·德·费罗拉; U·本纳蒂; M·基维尼
Original assignee: Genoa Technical Research University; Gruppo Lepetit SpA
Current assignee: Genoa Technical Research University; Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1994-07-15
Filing date: 1995-07-10
Publication date: 1997-07-09

Abstract

本发明描述了选自胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷、鸟嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷、次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷、胞嘧啶-2′3′-二脱氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′，5′-焦磷酸酯，以及它们的生产和作为抗肿瘤和抗逆转录病毒感染，包括HIV感染的治疗剂的用途。化合物可以作为药物组合物的活性发生成分或作为包藏在生物载体如转化红细胞中的前药来给药，从而导向引起病理学疾病产生的特定细胞群。

Description

二核苷-5′，5′-焦磷酸酯

本发明涉及式(I)的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯：

其中：

符号A和B各自独立地代表选自胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷、鸟嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷、次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷、胞嘧啶-2′，3′二-脱氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′-C′基团；

符号X各自独立地代表氧或硫；

符号R和R₁各自独立地代表氢或从1至10个碳原子的烷基基团；以及其中R和/或R₁代表氢的式(I)化合物与提供生物学上可接受的阳离子的碱的加成盐。

本发明还包括制备式(I)的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的方法，将它们包藏在生物载体特别是红细胞中从而将上述化合物导向特定部位或参与病理学疾病如肿瘤或病毒感染的发展或引起这些疾病如肿瘤或病毒感染的细胞群的方法，以及含有包藏式(I)的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的所述生物载体，特别是红细胞的组合物。

包藏生物活性分子的红细胞膜化学修饰是一种向靶细胞传递生理活性形式的被包藏分子的有利方法。参见，例如：

-De Flora A.et al.“作为载体和生物反应器的工程化红细胞”，免疫学年，Basel，Karger，(1993)，第7卷，168-174。

-Tonetti M.等人，“负载阿霉素的自体红细胞的肝导向”欧洲癌症研究杂志，(1991)，第27卷，No.7,947-948。

-Zocchi E.等人，“作为释放抗赘生物药物5-氟-2’-脱氧尿苷的人和鼠源红细胞”，生物科学进展，(1991)，第8卷，Pergamon出版社plc.51-57。

-De Flora A.等人，“被囊性5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-单磷酸在人体红细胞中向抗赘生物药物5-氟-2’-脱氧尿苷的转化”。美国国家学术科学汇编，(1988)，第85卷，3145-3149。

-De Flora A.等人，“载体红细胞技术：一种用于诊断和治疗的多用途工具”，诊断学中的生物技术，Elsevier科学出版社B.V.，(1985)，223-236。

上述文章和出版物引用了本领域中进一步的文献。

下列专利文献也公开了将生物活性物质，特别是磷酸化化合物包藏在转化红细胞中的方法和适于其用途的组合物，以及诱导动物产生的细胞，尤其是红细胞选择性地挑出其它细胞并与之融合的方法：国际专利申请公开号92/22306，美国专利号4,931,276，美国专利号4,652,449以及欧洲专利申请公开号298280。

在本说明书和权利要求书中，“非天然存在核苷的5′-C′基团”一词是指通过除去戊糖基团中5′位置上的羟基从非天然存在的核苷衍生的基团。

“符号X各自独立地代表氧或硫”一语是指每个符号X可以代表氧或硫原子，而与其它假设的含义无关。根据本发明的优选实施方案，所有符号X代表氧或者其中只有一或两个代表硫而其它代表氧。在后一种情况下，最优选的式(I)化合物是其中代表硫的符号X通过双键与磷原子直接相连或者是基团XR或(和)XR₁的一部分的那些化合物。

术语“生物学上可接受的阳离子”是指适用于药学实际的阳离子并且包括那些对式(I)化合物的生物载体无毒并适合于将其包藏到所述载体的过程的阳离子。当符号R和/或R₁独立地代表氢时，式(1)化合物可以与提供生物学上可接受的阳离子的碱形成加成盐。可以用式(I)的化合物代表这样的盐，其中基团XR和/或XR₁中的符号X代表阴离子形式的氧和/或硫原子(即O-和/或S-)并且符号R和/或R₁代表生物学上可接受的阳离子。

药学实际应用中可接受的阳离子是从碱或碱土金属如钠、钾和镁，铵，以及脂肪族、脂环族和芳香族胺如甲胺、二甲胺、三乙醇胺、呱啶、哌嗪、N-甲基哌啶、N-甲基哌嗪、吗啉和甲基吡啶衍生的阳离子。

适于药学实际应用以及包藏过程的生物学上可接受的阳离子是，例如，Na⁺和K⁺。

术语“从1至10个碳原子的烷基基团”是指直链或支链烷基残基，其可选择性地含有不饱和和/或一或两个选自羟基、巯基、氯、碘、氟、溴、氨基、(C₁-C₄)烷基氨基、二-(C₁-C₄)烷基氨基、(C₁-C₄)烷氧基和(C₁-C₄)烷硫基的取代基。优选地，上述术语是指1至4个碳原子的烷基基团如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、和2-甲基丙基，其可选择性地含有一或两个如上所述的取代基。

进一步优选的本发明化合物组包括其中符号A、B和X如上述规定而符号R和R₁各自独立地代表氢或上述(C₁-C₄)烷基的那些式(I)化合物。这一组优选的化合物还包括其中R和/或R₁代表氢的式(I)化合物与提供生物学上可接受的阳离子如Na⁺、K⁺、和其它上面提到的阳离子的碱的加成盐。

最优选的本发明化合物组是其中符号A和B如上述规定，所有符号X代表氧而R和R₁代表氢的式(I)的那些衍生物及它们与生物学上可接受的阳离子如Na⁺或K⁺的盐。

可以说明本发明的某些具体的式(I)二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的实例具体表示于下列表I中。

表1A B

表1(续)A B

表1(续)A B

表1(续)A B

表1(续)A B

表1(续)A B

表1(续)A B

表1(续)A B

表1(续)A B

表1(续)A B

表1(续)A B

表1(续)A B

表1(续)A B

其中A和B至少一个代表从5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷衍生的5′-C′基团的上述式(I)二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯可用作抗肿瘤治疗药和其中A和B至少一个代表选自下列非天然存在的核苷的5′-C′基团的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯可用作抗病毒治疗药，特别是抗逆转录病毒感染如HIV感染，这些非天然存在的核苷是胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷，尿嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷，鸟嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷，次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷，胞嘧啶-2′，3′-二脱氧-D-核苷，以及腺嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷。

根据上述特性，含有两种类型上述5′-′C′基团的二核苷可以用作抗肿瘤和抗病毒药。

制备二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的方法是按照已在本领域描述过的方法进行的。参见例如：A.M.Michelson，“通过阳离子交换进行核苷酸酐的合成”，于生物化学生物物理学报，(1964)，91，1-13。按照该方法，式(II)的磷酸核苷：

其中A、X和R具有如上的同样含义，其通过与活化剂如焦磷酸四苯基酯或氯基磷酸二苯基酯(diphenyl phosphochloridate)反应在磷酸部分的XH基团上活化，形成上述磷酸核苷的活化磷酸酯。然后将活化磷酸酯与式(III)的磷酸核苷反应：

其中B、X和R₁具有如上的同样含义，通过活化的磷酸二苯基酯部分的替代从活化的磷酸酯形成式(I)化合物。

用于制备本发明的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的方法的其它例子可以从US4855304引用的文献中获得，US4855304公开了一些适用于抑制植物病毒复制的二核苷焦磷酸酯和焦磷酸酯类似物。

国际专利申请公开号WO91/00867描述了具有生物活性包括抗病毒活性的5′-二磷酸己糖核苷。

在本发明有代表性的实施方案中，基本上在A.M.Michelson所述的条件下进行上述反应途径，即，先将式(II)的磷酸核苷或其盐(如钠、锂、或钡盐)转化成与受阻叔胺碱如三正丁基胺或三正辛基胺、或与受阻季铵碱如甲基-三-正辛基氢氧化铵的相应盐。通常通过将磷酸核苷或其盐(优选钠盐)洗脱流过吡啶鎓型的离子交换(强阳离子)树脂经过吡啶鎓中间体的形成进行这一转化。该步骤的主要目的是消除钠或其它矿物阳离子。然后将吡啶鎓盐与含等摩尔量受阻叔胺碱的甲醇溶液一起保温，然后减压干燥生成与受阻叔胺碱的盐。然后在不干扰反应物的过量酸受体(每摩尔活化剂1.2至2摩尔)如脂肪族叔胺(如三正丁胺)或杂环叔胺(如N-甲基哌啶、N-甲基吡咯烷)的存在下使式(II)磷酸核苷的盐与过量(每摩尔磷酸核苷1.5至2.5摩尔)活化剂(如氯基磷酸二苯基酯或焦磷酸四苯基酯)接触。一般通过使用惰性非质子传递有机溶剂如环醚(如二噁烷)或其混合物作为溶剂的无水条件下在室温进行活化反应。在某些情况下，建议加入其它溶解力高的惰性有机溶剂(如二甲基甲酰胺)以提高反应物浓度，从而提高反应速度。

在上述条件下，活化的磷酸酯的形成通常在2至5小时内完成。

然后在惰性有机非质子传递溶剂如吡啶、六甲基磷酰胺二甲基甲酰胺或其混合物的存在下使活化的磷酸酯和磷酸核苷(III)与受阻叔胺碱或氢氧化季铵(如前面例举的那些)的盐反应。反应一般在20℃和35℃之间的温度范围进行，在15至30小时期间内完成。

一般通过在减压下蒸发溶剂，然后付诸常用的纯化步骤，包括色谱法，来回收反应粗品。例如，对于其中R和/或R₁是氢的式(I)化合物的纯化步骤，将粗产物悬浮于水中，用碱金属氢氧化物水溶液调节pH值至8后，用不与水相混合的非质子传递有机溶剂如乙醚萃取该溶液。通过联合柱色谱法(如用凝胶过滤柱并以水作洗脱剂)和HPLC法(如用直链烃官能化的硅胶反相柱并以于水中的甲醇线性梯度洗脱，或者用强阴离子交换树脂并以于水中的氯化锂线性梯度洗脱)对含二核苷焦磷酸酯的水相进行进一步纯化。

本发明的式(I)二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯通常是稳定的化合物，特别是在与生物学上可接受的阳离子的盐如钠或钾盐的形式下分离时很稳定。因此，尽管当R和/或R₁表示氢时，它们可以游离酸的形式得以分离和表征，(例如，通过将盐的水溶液载于H⁺型离子交换树脂上并用水或甲醇和水的混合物洗脱树脂)，但优选以盐的形式保存或使用，最优选为生物学上可接受的阳离子的盐。

可以按照标准方法从相应的非磷酸化核苷制备非天然存在的磷酸核苷的原料。

现有技术中所述的这样的非磷酸化前体的例子是：胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷(AZT)，腺嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷(DDA)，5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷(FDU)，胞嘧啶-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷(DDC)，尿嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷(AZDDU)，次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷(DDI)，以及鸟嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷(DDG)。参见下列文献：

Levene P.A.，生物化学杂志，(1929)，第83卷，793；Davoli等人，化学学会杂志，(1948)，967；Howard G.A.等人，化学学会杂志，(1947)，1052；Robins M.J.等人，美国化学学会杂志(1971)，93：20，5277；Chu C.K.等人，有机化学杂志(1989)，54，2217；Colla L.等人，欧洲医学化学治疗杂志，(1985)，No.4,295。

在大多数情况下上述前体也是可商购的(例如从SIGMA化学公司，St.Louis，MO，美国，购买)。

将非磷酸化的前体转化成相应的磷酸化化合物的方法也是现有技术已知的。一个典型的制备核苷单磷酸酯的步骤包括在缩合剂如二环己基碳化二亚胺的存在下于室温使核苷与磷酸氰乙基酯在无水吡啶中的溶液相接触。通常可以在与碱或碱土金属的盐如钠、锂或钡盐的形式下回收和纯化最终产物。

在某些情况下，核苷单磷酸酯是可以商购的(例如5-氟-2′-脱氧尿嘧啶-5′-单磷酸酯，SIGMA化学公司，St.Louis，MO，美国)。

具有抗病毒(包括抗HIV)和/或抗肿瘤活性的式(I)化合物可用作药物组合物的活性成分。

为了证实某些代表本发明的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的抗-HIV活性，在HTLV-1转化的细胞素MT-4上进行了体外实验，MT-4对HIV感染高度敏感并可被HIV感染。用HIV诱导的细胞病变的抑制作为终点。该试验的步骤基本上如R.Pauwels等人所述：“用于检测抗HIV化合物的基于四唑鎓的快速自动比色检查法”，病毒学方法杂志，20，(1988)，309-321。

下列表II显示了二-(胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷)-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯(二-AZT-5′，5′，P¹，P²-焦磷酸酯)的50％有效浓度(IC.50)和50％细胞毒浓度(CC50)。用胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷(AZT)作为对照化合物。

表II

抗-HIV体外活性

化合物	IC50(μM)	CC50(μM)
化合物	IC50(μM)	CC50(μM)	二-AZT-5′，5′，P¹，P²-焦磷酸酯(化合物1，表1)	0.031	＞100
AZT	0.028	70	二-AZT-5′，5′，P¹，P²-焦磷酸酯(化合物1，表1)	0.031	＞100

本发明的化合物特别适于用作前药而被细胞携带到特定的细胞群，化合物在这里可被迅速地体内转化成活性形式。

红细胞提供了作为药物或前药的生物载体的极难得的机会，这是因为：

(a)其代谢非常简单，因此具有相对有限的可与包藏的药物或前药相互作用的酶系列，

(b)其可到达身体的各个部位，并可作为生物反应器按照被控制的动力学将包藏的药物或前药转化成活性形式，该动力学可以根据所涉及的酶的性质来设计，以及

(c)其适于相对简单的修饰，该悠饰可以提供对富含血细胞的组织或器官的位点特异性导向。

我们知道某些核苷药物的活性形式是磷酸化衍生物。具体地说，一般认为三磷酸化衍生物是通过具有抗-HIV活性的脱氧核苷抑制病毒复制的形式。但是，三磷酸化的脱氧核苷不适用于临床，因为它们不能通过细胞膜。因此，抗-HIV脱氧核苷作用效果的一个重要因素是它们如何能容易地进入靶细胞并通过细胞内酶进行磷酸化。

无论怎样，我们知道核苷不仅可以进行细胞内磷酸化而且将核苷转化成治疗活性较低或根本无活性的化合物。细胞内酶还可以促进其它反应。如果这些反应的速率与磷酸化过程的速率差不多一样，那么核苷的治疗效果则被降低。这些问题非常重要，因为某些靶细胞(如巨噬细胞)磷酸化酶水平较低，因此给予所述被感染细胞磷酸化形式的抗病毒核苷可以在病毒抑制方面明显优越于一般的给药途径。

本发明的一个目的是开发二核苷-5′，5′-P¹，P²焦磷酸酯的性能，该化合物被包藏于红血细胞中并被特异地带到靶细胞，在这里可以通过酶途径裂解焦磷酸酯键生成两个核苷酸。包含有磷酸化基团的两个核苷酸以适当的化学形式实现所需生物功能或者迅速转化成三磷酸化衍生物的活性形式，基本上没有失活。

二核苷焦磷酸酯比相应的单磷酸酯更适合包藏和导向技术，这是因为一旦它们被引入红细胞则其更加稳定，并且在包藏和前药位点特异性传递之间的时间里从红血细胞膜扩散出来的速率较低。这些特征更适于设计将核苷从其载体释放出来的动力学。

二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的另一个优点是其可以通过焦磷酸酯键结合不同的核苷对。这些核苷对显示互补或协同作用，并将两个核苷引入载体，传递到特定的靶细胞并在每一个步骤中同时以所希望的活性形式释放。

被包埋的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的典型靶细胞是巨噬细胞或者肝脏或脾脏身体部位。将所使用的红细胞导向网状内皮系统的方法已有描述，例如，Zocchi E.等人，在“载体红细胞的肝或脾导向：鼠体模型”中，生物技术和应用生物化学(1987)，9，423-434以及在上面提到的Tonetti M.等人的论文中有述。这些方法使靶细胞或身体部位能识别生物载体并与它们反应，从而引起位点特异性和受药代动力学控制的药物释放。

将抗肿瘤药和前药包藏于适宜的生物载体如红细胞中，已被认为是一种完成选择性器官导向使对治疗反应和毒性均有阳性作用的治疗剂缓慢释放出来的有效方法(Zocchi E.等人，在美国国家学术科学汇编(1989)，第86卷，2040-2044)。将5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯前药包藏到红血细胞中的一个实施例(参见：De Plora A.等人，美国国家学术科学汇编(1988)，第85卷，3145-3149)。表明为了达到对活性非磷酸化药物释放的药代动力学上有用的控制，需要共同包藏等摩尔量的其它三磷酸核苷。

同时夹带其它核苷酸会引起生物相容性及选择的核苷前药与伴随的三磷酸核苷之间的相互反应问题。本发明提供的一个优点在于可以制备不需要同时夹带其它三磷酸核苷的5-尿嘧啶前药而完成适当的药代动力学控制

一个表现出有用的药代动力学特征的本发明前药的代表性实例是含有两个通过焦磷酸酯键相连的5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-[二-(5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷)-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯]，核糖核苷单位的二核苷-5′，5′-焦磷酸酯，该焦磷酸酯相对于相应的单磷酸酯表现出较低的脱磷酸化速率。

将代表本发明的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯包藏到人红血细胞中的典型实例是通过低渗透析和等渗释放法用二-AZT-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯进行的(De Flora A.等人，美国国家学术科学汇编(1988)，第85卷，3145-3149)。所用的两步法包括首先的透析步骤，在轻度旋转下于4℃将经洗涤和包装的红细胞(80％血细胞比容)对70倍体积的溶血缓冲液(5mM Na₂HPO₄添加4mM MgCl₂，pH7.2，26mOsm)透析35分钟。该步骤之后在透析袋中加入10-15M二-AZT-5′，5′-，P¹，P²-焦磷酸酯并在同样条件下再透析15分钟。然后通过将红细胞在4℃对添加了10mM葡萄糖和腺苷的pH7.4、310mOsm的磷酸盐-盐水缓冲液透析40分钟而使其重封。然后用冰冷的NaCl水溶液(0.9％体积/体积)充分洗涤载带的红细胞并在37℃于10％血细胞比容的自体血浆中温育。

用下列方法以连续的时间间隔测定血浆和红血细胞中二核苷焦磷酸酯及其代谢产物的浓度。

在不同的时间，取出1ml保温混合物的等分试样。从血浆中分离红细胞后，分别萃取这两部分。

将100微升包装的红血细胞(RBC)加在100微升水中，然后在剧烈振荡下加入68微升3.7M高氯酸(PCA)。将样品离心并用30微升3M碳酸钾中和上清液，然后将样品离心以除去形成的沉淀。

用50微升3.7M PCT处理150微升血浆部分，用27微升3M碳酸钾中和120微升的上清液并离心。将每种萃取液5微升注射到配备有HP ODS Hypersil 4.6×60mm 3微米粒经柱子的HP1090仪(Hew/ett-Packard，Palo Alto，加拿大)中。溶剂程序是一线性梯度，从100％缓中液A(0.1M KH₂PO₄加5mM氢氧化叔丁铵(TBA)，pH4.9)开始，在30分钟后增加到100％的缓冲液B(0.1MKH₂PO₄加5mM)TBA，在40％(体积/体积)的甲醇水中，pH4.9)；将100％缓冲液B维持到50分钟。流速为0.4ml/分钟，用设置在265nM的分克克度计监测洗脱出来的化合物。各种化合物的保留时间是(用分钟表示)：AZT，17；AZT-单磷酸酯，21；二-AZT-焦磷酸酯，33。

下面的表III和IV记载了上述测定的结果。

表III

二-AZT-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯及其代谢物在人血红细胞中的浓度，以nmol/ml表示

时间(小时)	二-AZT-焦磷酸酯	AZT-单磷酸酯	AZT
时间(小时)	二-AZT-焦磷酸酯	AZT-单磷酸酯	AZT	0	3.9	0.04	-
2	4.1	0.09	-	0	3.9	0.04	-
2	4.1	0.09	-	6	2.9	0.65	0.60
24	1.8	0.93	0.10	6	2.9	0.65	0.60

表IV

二-AZT-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯及其代谢物在人血浆中的浓度，以nm/ml表示

时间(小时)	二-AZT-焦磷酸酯	AZT-单磷酸酯	AZT
时间(小时)	二-AZT-焦磷酸酯	AZT-单磷酸酯	AZT	0	4.49	21.94	4.6
2	3.75	28.21	14.42	0	4.49	21.94	4.6
2	3.75	28.21	14.42	6	5.27	24.68	62.43
24	5.34	67.11	355.78	6	5.27	24.68	62.43

上面的数据表明人红血细胞中二-AZT-5′，5′，P¹，P²-焦磷酸酯浓度达到的值符合目前实践中的治疗要求，并且药物从红细胞中释放出来的速率很低。上述特征使含有抗-HIV有效量的磷酸二核苷前药的工程红细胞特别适用于治疗目的。实际上我们知道可以对人红细胞进行适当修饰以包藏核苷药物并给予特定的导向性质，并且这样的修饰除了选择性导向特征外并不改变红细胞的生理行为(国际专利申请公开号WO92/22306)。

根据B.L.Robbins等人在抗微生物剂和化学治疗，第38卷，No.1，(1994)115-121中报导的数据；我们估算了当将其导向HIV-感染的细胞如巨噬细胞时相应于治疗有效作用的红细胞中二核苷焦磷酸酯的浓度。实际上，这些作者指出，在用AZT有效治疗下的HZV感染患者中，外用血单核细胞(PBMCs)内AZT三磷酸酯的细胞内浓度的范围是从5×10^-15mol/10⁶细胞至9×10^-14mol/10⁶细胞。当至少一个含表III中所示浓度值的二核苷焦磷酸酯的红细胞(相当于约2×10^-10mol/10⁶细胞至4×10^-10mol/10⁶细胞)被PBMCs(例如单核细胞或巨噬细胞)捕获时这些值明显增加。

如上所述，本发明的二核苷-5¹，5¹-P¹，P²-焦磷酸酯可以用作口服或胃肠外途经给药的药物组合物的活性成分，或者可以用作包藏到生物载体中的活性药物或前药，这些生物载体被导向特定的身体部位(如肝/脾)和/或细胞群(如单细胞/巨噬细胞)。

当二核苷-5¹，5¹-P¹，P²-焦磷酸酯被用作口服或胃肠外给药的药物组合物的活性成分时，所述组合物通常含有有效治疗量的二核苷焦磷酸酯以及惰性载体和/或稀释剂。例如，在口服给药的液体药组合物中，水，优选灭菌水，可以用作载体和/或稀释剂。口服给药的固体药物组合物可以含有粘合剂、崩解剂和润滑剂、例如，白明胶、黄蓍胶或微晶纤维素可以用作粘合剂，藻酸或玉米淀粉可以用作崩解剂；硬脂酸镁或钙可以用作润滑剂。某些固体形式，如胶囊，可以含有液体载体，例如脂油。对于胃肠外给药形式，优选的载体和/或稀释剂可以是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水。口服和胃肠外给药的液体药物组合物还可以包括其它相容性成分，如溶剂、防腐剂、和/或辅料，比如：聚乙二醇、丙二醇或甘油作为溶剂，羟苯甲酸甲酯作为抗菌剂。抗坏血酸或二硫化钠作为抗氧化剂，乙二胺四乙酸作为螯合剂，乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐作为缓冲剂。另外，不破坏二核苷焦磷酸酯所需作用的其它活性成分也可被掺入药物制剂。

通常口服或胃肠外药物组合物在患者体内应该能够提供0.1至3.0μM范围的血清浓度。但是，可以使用在该范围之外的剂量，这被理解为必须根据疾病的类型和严重程度、被治疗患者的状态以及所用的特定二核苷焦磷酸酯来调整每日剂量。

片剂、丸剂、胶囊、锭剂等等可以用作口服给药的固体剂型，而溶液、悬液、配剂和糖浆是优先选用的液体剂型。胃肠外制剂通常包括用于皮下注射或静脉给药的溶液。

单位剂型通常可以含有10至500mg的二核苷-5¹，5¹-P¹，P²-焦磷酸酯，这一表示具有纯粹的举例性质，对本发明的范围没有任何限制。

当本发明的二核苷-5¹，5¹-P¹，P²-焦磷酸酯用作包藏在适宜生物载体中的药物或前药时，含有这样的二核苷焦磷酸酯的药物组合物优选含有转化红细胞。修饰这些转化红细胞的表面使其可被生物体细胞特异性识别，包含于这些红细胞中的二核苷焦磷酸酯在生物体中将被整合。例如，欧洲专利申请公开号517986描述了一种完成被人或动物病原性RNA-型病毒宿主细胞的所述特异性识别的典型途径，这一途径主要是基于在包藏二核苷焦磷酸酯之前或之后红细胞的表面蛋白和/或跨膜蛋白与可被吞噬细胞(例如淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞)识别的特异性抗体结合，该吞噬细胞连续地吞噬红细胞。按照优选的实施方案，载带二核苷-5¹，5¹-P¹，P²-焦磷酸酯后，首先用表面或跨膜蛋白的可逆群集剂处理红细胞，然后用共价连接的交联剂处理，最后在自体血浆中温育以结合IgG分子。这些红细胞通过它们的受体被人巨噬细胞识别，然后以约每个巨噬细胞一个红细胞的比率被吞噬。

下面的实验详细描述了载带二-AZT-焦磷酸酯的红细胞到人巨噬细胞的导向。

使人红细胞进行上述的载带二-AZT-焦磷酸酯的步骤，然后修饰红细胞以提高巨噬细胞对它们的识别，这一步骤详细描述于EP-A-517986中。如表V所示，发现载带二-AZT-焦磷酸酯的红细胞表现出约1,500IgG分子/细胞，并且比未处理过的红细胞被更有效地吞噬。通过将50μlRBC与100μl5mM HEPES在含4％(重量/体积)牛血清白蛋白和0.1mCi放射性标证的蛋白质A(比活力30mCi蛋白质)的pH7.4的PBS中测定了结合的IgG/细胞的数量。将样品在室温保温30分钟，然后洗涤4次，在Beckman 5500γ-计数器中计数结合的放射活性。如M.Magnani等人的论文中所述在体外测定载带药物的红细胞的细胞吞噬：“磷酸化形式的抗逆转录病毒核苷类似物导向巨噬细胞：体外和体内研究(1992)，美国国家学术科学汇编，89：6477-6481。”

表V

巨噬细胞对载带二-AZT-焦磷酸酯的红细胞的识别

	天然的	载带二-AZT-焦磷酸酯的	载带-AZT-焦磷酸酯的加ZnCl₂/BS³
	天然的	载带二-AZT-焦磷酸酯的	载带-AZT-焦磷酸酯的加ZnCl₂/BS³	结合的IgG(分子/细胞)	20-40	20-40	＝1,500
吞噬作用(红细胞/巨噬细胞)	0.1-0.2	0.1-0.2	＞1(1-1.2)	结合的IgG(分子/细胞)	20-40	20-40	＝1,500
吞噬作用(红细胞/巨噬细胞)	0.1-0.2	0.1-0.2	＞1(1-1.2)	巨噬细胞中的二-AZT-焦磷酸酯	N.D.	N.D.	3pmol/106细胞

N.D.：未检出

还估算了通过载体红细胞向巨噬细胞传递的二-AZT-焦磷酸酯的量及其在巨噬细胞中的稳定性。如上所述使人红细胞以0.4μmol/ml RBC的浓度载带二-AZT-焦磷酸酯，然后将其进行修饰以提高巨噬细胞对它们的识别。以每个巨噬细胞100个RBC的比率向巨噬细胞中加入修饰过的红细胞并吞噬24小时。用RP-MI1640介质充分洗涤未消化的RBC(3次)并用0.9％(重量/体积)氯化铵洗涤一次。然后在RBC细胞吞噬后的0和24、48或72小时时制备巨噬细胞高氯酸提取液，用K₂CO₃中和。然后中和提取液，通过用Isolute ^TMC8柱(得自国际吸着剂技术公司，英国)按照厂方说明并用甲醇作为洗脱剂进行二-ATZ-焦磷酸酯的固相萃取。如上所述用HPLC分析提取液。二-AZT-焦磷酸酯在人巨噬细胞中的稳定性的结果示于图1中。

还进行了在被猫免疫缺陷型病毒(FIV)感染的猫单核细胞衍生的巨噬细胞上载带二-AZT-焦磷酸酯的红细胞的抗病毒活性的测定。

按M.Magnani等人对人单核细胞衍生的巨噬细胞的报导培养了猫单核细胞衍生物巨噬细胞：“磷酸化形式的抗逆转录病毒核苷类似物导向巨噬细胞：体外和体内研究(1992)，美国国家学术科学汇编，89：6477-6481 。经15小时以每个巨噬细胞100个RBC的比率加入载带二-AZT-焦磷酸酯的红细胞。载带药物的红细胞的二-AZT-焦磷酸酯含量是)0.4μmol/ml RBC。充分洗涤除去未消化的红细胞”。作为对照用“无载”红细胞(即以同样步骤处理红细胞但不加入二-AZT-焦磷酸酯处理巨噬细胞培养物。

如M.Bendinelli等人论文中所述用330i.d./孔的猫免疫缺陷性病毒(pisa M-2)感染接受载带二-AZT-焦磷酸酯的RBC、“无载”RBC或未加入RBC的巨噬细胞培养物：“猫免疫缺陷性病毒和用于AIDS研究的模型以及重要的猫病原体，(1995)，临床微生物学评论，8：87-112。感染8小时后，充分洗涤(6次)细胞培养物以除去任何与巨噬细胞结合的病毒颗粒。然后将细胞培养物在37℃、5％CO₂中保持3天，分离它们的全部DNA。用标准技术获得来自巨噬细胞的DNA分离物，该技术包括于37℃用8M脲、0.3M NaCl、10mM Tris Hcl，pH7.5溶解细胞60分钟。用苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1体积/体积/体积)萃取，用乙醇沉淀DNA。通过在两个阶段扩增病毒p24 gag基因的498个碱基对进行FIV原病毒DNA的分析。扩增的第一阶段使用了下列引物：相应于病毒序列中核苷酸1025-1044的5’-GG(ATATCCTATTCAAACAG-3’(有义)(SEQ ID No：1)以及相应于核苷酸1680-1699的5’-CC-TATATTTTACGTTGAGAA-3’(反义)(SEQ ID No：2)。对于扩增的第二步骤所用的引物为：相应于病毒序列核苷酸1141-1160的5’-TATGGTTTACTGCCTTCTCT-3’(有义)(序列ID No：3)以及相应于核苷酸1619-1638的5’-GAATTCG-GTCTTTCATGGGA-3’(反义)(SEQ ID No：4)。

在Perkin-Elmer循环变温加热器中进行的PCR是在终体积为50μl的含168ng基因组DNA、50mll KCl、10mM Tric HCl、pH8.3、1.5mM MgCl₂、0.005％Tween-20、0.005％NP-40、0.001％白明胶、150nM每种引物及5u Replitherm DNA聚合酶(Epicentre技术公司，Madison，威斯康星州，美国)的溶液中完成的。将含有第一对引物的反应混合物在94℃变性1分钟，在50℃退火1分钟，在72℃延伸2分钟，最后在72℃延伸15分钟，如此循环40次。然后将如此扩增的混合物10μl与第二对引物在完全同样的条件下再次扩增。

通过在1.5％琼脂糖凝胶上电泳分析PCR产物，将其转移到尼龙膜上并与克隆到TA-克隆质粒(Invitrogen公司，Sam Diego，加利福尼亚，美国)中的498个碱基对的p24 gag基团探针杂交。作为内部对照，用下列引物扩增猫己糖激酶基因：相应于人己糖激酶I型cDNA中核苷酸2198-2219的5’-ACATG-GAGTGGGGGGCCTTTGG-3’(有义)(SEQ ID No：5)。以及相应于核苷酸2328-2349的5’-GTTGCGGACGATTTCACCCAGG-3’(反义)(SEQ ID No：6)。用FIV己糖激酶探针检测。

结果示于图2。

在用鼠免疫缺陷病毒感染的鼠巨噬细胞上进一步测定了载带二-AZT-焦磷酸酯的红细胞的抗病毒活性。

从C57BL/6小鼠的腹膜腔获得鼠巨噬细胞，如Rossi等人论文中所述进行培养：“利用二脱氧胞苷和二脱氧胞苷5’-三磷酸来抑制鼠体逆转录病毒诱发性免疫缺陷性疾病”，(1993)，J.AIDS，6：1179-1186 。对于FIV的载带二-AZT-焦磷酸酯的红细胞及感染如文中所述，但有下列改进：按照标准方法(D.E.Yetter等人“鼠体逆转录病毒诱导性免疫缺陷性疾病(MAIDS)所需要的功能性T-淋巴细胞”，(1987)，实验医学杂志，165：1737-1742)从SC-1细胞以不含细胞的上清液制备鼠免疫缺陷病毒(LP-BM5)。

按照下列步骤进行病毒DNA的PCR分析。

用下列寡核苷酸引物扩增缺陷性病毒基因组(BM5d)：5’-引物，相应于病毒序列中核苷酸1456-1473的5’-AACCTTCCTC-CTCTGCCA-3’(有义)，以及3’引物，相应于BM5d基因组的核苷酸1579-1596的5’-ACCACCTCCTGGGCTTTC-3’(反义)。第二对寡核苷酸引物用于扩增203个碱基对的小鼠G6PD基因。这种扩增作为内部对照(自身标准)估算小鼠基因组中相对的BM5d整合。

用于该扩增的核苷酸引物是5’-引物，5’-TGTTCTTCAAC-CCCGAGGAT-3’(有义)和3’-引物，5’-AAGACGTCCAGGAT-GAGGTGATC-3’(反义)。

此处所用的四种引物描述于G.Brandi等人的论文中：“在LP-BM5鼠体诱发性免疫缺陷性疾病模型中长期施用2’，3’-二脱氧尿苷的功效和毒性”，(1995)，抗病毒化学和化学治疗，6，153-161。

在Perkin-Elmer循环变温加热器中进行的PCR是在终体积为25μl的含0.229μg基因组DNA，相当于约114,000个细胞、50mMKCl、10mM Tris-HCl、pH8.3、1mM MgCl²、0.05％吐温-20、0.005％NP-40、0.001％白明胶、四种三磷酸脱氧核糖核苷中的每一种150μM、每种引物20pmol以及2.5U Replither DNA聚合酶(Epicontre技术公司，Madison，威斯康星州，美国)的溶液中完成的。将反应混合物在95℃变性30秒，在58℃退火30秒，在72℃延伸30秒，最后在72℃延伸10分钟，如此循环37次。通过在2.5％琼脂糖凝胶上电泳分析PCR产物，转移到尼龙膜上并与32P-标记的D30或G6PD探针杂交。用得自Bio-Rad(Bio-Rad实验室，Hercules，加利福尼亚，美国)的随机引物DNA-标记试剂盒标记DNA探针。结果示于图3。

含有夹带本发明的二核苷焦磷酸酯的修饰后的红细胞的药物组合物通常是以等渗溶液，如注射用生理盐水或葡萄糖等渗溶液的形式存在，或者以可用于静脉内或腹膜内给药的注射用溶液的临时配制制剂形式存在。

这些药物组合物通常含有的红细胞的量为优选从2至8ml，二核苷-5¹，5¹-P¹，P²-焦磷酸酯的量为约0.5至约10mM。本发明被包藏的二核苷焦磷酸酯的给药剂量为约0.5至约80μg二核苷焦磷酸酯/每十克体重的患者，应该理解，给出的这些数值是说明性的，而对本发明的范围不构成任何限制。

附图说明

——图1显示了二-AZT-焦磷酸酯在人巨噬细胞中的稳定性。

——图2显示了通过分析巨噬细胞中的FIV原病毒DNA测定的载带双-AZT-焦磷酸酯的红细胞对抗FIV(Pisa M-2)感染的猫单细胞-衍生的巨噬细胞的抗病毒活性。

——图3显示了通过分析缺陷性病毒基因组(Bμ5d)DNA测定的载带双-ATZ-焦磷酸酯的红细胞对抗被鼠免疫缺陷病毒(LP-BM5)感染的鼠巨噬细胞的抗病毒活性。

实施例1

次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯的制备。

将100mg(0.4毫摩尔)次黄嘌呤2′，3′-二脱氧-D-核糖糖苷加入于1ml磷酸三乙酯中的0.11ml(1.2毫摩尔)磷酰氯中，并将混合物于-5℃搅拌2小时。用10ml冰冷的乙醚萃取混合物4次，然后在0℃于2000转/分离心5分钟。除去乙醚后，将残余物于0℃悬浮在5ml水中，并立即用冷的1N NaOH中和。将混合物在冰浴上放置10分钟并将pH值调节至7。真空干燥后，将残余物溶于25ml甲醇中。将溶液加在含35g悬浮于乙醚中的硅胶的柱子上。通过如下洗脱柱子获得了纯化的标题化合物(流速3ml/分钟)：150ml乙醚，150ml乙醚∶甲醇60∶40(体积/体积)的混合物，为了洗去所有杂质，最后，用约300ml甲醇洗脱纯化的产物。

总过程产率为85％。

用Hewlett-Packard 5989A仪器记录的质谱表明相应于标题化合物[M-1]-离子的分子离子在m/z315.2。

实施例2

胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯的制备。

将240mg(1mmol)胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷(AZT)溶于2ml 1M磷酸氰乙基酯在吡啶中的溶液中，30℃真空干燥。将残余物悬浮于19ml无水吡啶中，然后于30℃真空干燥，两次。加入9.6ml无水吡啶和1.15g二环己基碳化二亚胺后，将混合物于25℃搅拌48小时。然后，加入2.8ml水并将溶液于25℃再搅拌30分钟，最后于30℃真空干燥。将残余物悬浮于9.6ml水中，过滤并在滤器上用9.6ml水再次洗涤。然后，在合并的滤液中加入19.6ml 1N NaOH并使混合物回流加热40分钟。

将溶液冷却至25℃，经过用15g Dowex^_50(H⁺)离子交换树脂填充的柱子洗脱除去钠阳离子。用饱和Ba(OH)₂溶液调节洗脱液的pH值至7.5以沉淀磷酸盐阴离子。离心后，在30℃真空下使上清液减少至较小体积(30ml)，再次离心除去残余的无机磷酸盐。在4℃向混合物中加入二倍体积的乙醇以沉淀标题化合物的钡盐。最后用丙酮和乙醚洗涤沉淀并在缓和的氮气流下干燥。

将标题化合物的钡盐悬浮于5ml水中并与2gDowex^_50(H⁺)离子交换树脂的混合。然后将混合物加在含2gDowex^_50(H⁺)离子交换树脂的柱子上。用30ml甲醇∶水的1∶1(体积/体积)混合物洗脱柱子，最后用1N NaOH中和洗脱液，然后将含AZT-5′-单磷酸酯钠盐的溶液冷冻干燥，给出产率为70％的标题产物的钠盐。

用Hewlett-Packard 5989A仪器记录的质谱表明相应于标题化合物[M-1]-离子的分子离子在m/z346.50。

实施例3

胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷，次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷-5′，5′-P¹-P²-焦磷酸酯的制备。

a)次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯的活化：

将50mg(0.016mmol)次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯溶于2ml水和1ml甲醇的混合物中，然后将溶液经过1g Dowex^_50W-X8(吡啶翁型)离子交换树脂洗脱。用20ml50％甲醇水溶液洗涤柱子并将溶液真空干燥。将残余物悬浮于0.22ml三正辛基胺于1.6ml甲醇的溶液中，然后，搅拌30分钟，最后在30℃真空干燥。将所得残余物悬浮于1ml N，N-二甲基甲酰胺中并于30℃真空干燥。这一步骤重复三次。将所得产物加入2.24ml二恶烷、0.096ml氯基磷酸二苯酯和0.137ml三丁基胺的溶液，并将混合物于25℃搅拌3小时。然后将其在旋转蒸发器中干燥，在强烈振荡下向残余物中加入16ml乙醚。使混合物在冰上放置30分钟，然后于1000转/分钟离心5分钟。除去乙醚，将残余物溶于0.96ml二恶烷中并于室温真空干燥，产物按原样用于继续的步骤c)中。

b)ATZ-5′-单磷酸酯三正辛基铵盐：

将120mg(0.35mmol)AZT-5′-单磷酸酯钠盐溶于2ml水和2ml甲醇中，并使溶液经过1g Dowex^_50W-X8(吡啶翁型)离子交换树脂用20ml50％甲醇水溶液洗脱，在旋转蒸发器中干燥。然后，向残余产物中加入0.49ml三正辛基胺和3.5ml甲醇，搅拌混合物30分钟，最后在30℃真空干燥。将残余物再悬浮于1.75ml N，N-二甲基甲酰胺中并于30℃减压(5mm汞柱)干燥。这一步骤重复三次，得到的产物按原样用于继续的步骤c)中。

c)反应：

将步骤a)的活化的次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯溶于0.9ml无水吡啶中，将混合物加入步骤b)的AZT-5′-单磷酸酯三正辛基铵盐中。之后，向混合物中加入0.16ml六甲基磷酰胺，再在旋转蒸发器中干燥。然后加入0.2ml无水吡啶，在25℃搅拌混合物24小时，将残余物悬浮于5ml水中并用1N NaOH调节pH值至8，用5ml乙醚萃取溶液3次。分离含上述标题产物的水层并按照下列步骤d)纯化产物。

d)纯化：

将从步骤c)得到的水溶液的0.5ml等分试样加在Sephadex^_G10柱(55×1.3cm)上并以0.25ml/分钟的流速用水洗脱。用装备了反相柱(C18μBondapack^_，10μm粒径)的HPLC仪进一步纯化含标题化合物的部分。溶剂程序是在30分钟内以流速1.5ml/分钟甲醇在水中的线性梯度从0至30％(体积/体积)。

在这些条件下，上述标题化合物表现出的保留时间(Rt)约为7分钟。

合并表现出上述Rt值的部分，加样至2g离子交换树脂(Dowex^_50W-X8，H⁺型)上并用20ml水洗脱。将洗脱液冷冻干燥给出产率为35％的上述标题产物。

用Hewlett-Packard 5989A记录的质谱表现出相应于标题化合物的[M-1]-离子的分子离子在m/z644。

在pH4.940％(体积/体积)甲醇于水的磷酸盐缓中液中紫外吸收光谱在252nm表现出最大吸收，在270nm有一肩峰。

实施例4

二-(胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷)-5′-5′-P¹-P²-焦磷酸酯的制备

a).AZT-5′-单磷酸酯的活化：

将100mg(0.26mmol)AZT-5′-单磷酸酯钠盐溶于30ml水和2ml甲醇的混合物中，然后将溶液经过1g Dowex^_50W-X8(吡啶翁型)离子交换树脂用20ml50％甲醇水溶液洗脱，然后在室温真空干燥，将残余物悬浮于0.45ml三正辛基胺和3.2ml甲醇的混合液中并在25℃搅拌30分钟，然后，将其在室温真空干燥。将残余物溶于2ml N，N-二甲基甲酰胺中并减压(5mm汞柱)干燥。这一步骤重复三次。然后，向残余物中加入4.48ml二恶烷、0.2ml氯基磷酸二苯酯和0.27ml三正丁基胺，在25℃搅拌3小时后，将混合物于30℃减压(5mm汞柱)干燥，然后，在强烈振荡下向残余物中加入16ml己烷。并将混合物在冰上放置30分钟，然后于1000转/分钟离心5分钟。将残余物溶于2.0ml二恶烷中并真空干燥，回收的产物按原样用于继续的步骤c)中。

b)AZT-5′-单磷酸酯三正辛基铵盐：

将100mg(0.26mmol)AZT-5′-单磷酸酯钠盐溶于3ml水和2ml50％甲醇水溶液的混合物中，将溶液载于含1g Dowex^_50W-X8(吡啶翁型)离子交换树脂的柱子上并用20ml50％甲醇水溶液洗脱，将洗脱液真空干燥。然后，向残余物中加入0.45ml三正辛基胺和3.2ml甲醇，使混合物在25℃搅拌30分钟，，最后在室温真空干燥。将残余物悬浮于2ml N，N-二甲基甲酰胺中并减压(5mm汞柱)干燥。这一步骤重复三次，得到的产物按原样用于继续的步骤c)中。

c)反应：

将步骤a)的活化的AZT-5′-单磷酸酯溶于1.8ml无水吡啶中，并将溶液与0.32ml六甲基磷酰胺一起加至步骤b)的AZT-5′-单磷酸酯三正辛基铵盐中。室温真空干燥后，将残余物悬浮于6ml水中，用1N NaOH调节pH值至8，用6ml乙醚萃取混合物3次。离心分离含上述标题产物的水层，回收产物，并按照下列步骤d)纯化。

d)纯化：

将从上面的步骤c)中得到的水溶液用反相HPLC柱纯化。将水溶液的1ml等分试样加在Bio-sil^_C18 Hl 90-10柱(Biorad)(250×10mm，10μm粒径)上，并用如下所述的乙醇于水中的线性梯度洗脱：

％(体积/体积)乙醇	时间(分钟)
％(体积/体积)乙醇	时间(分钟)	3	0′
3	7′	3	0′
3	7′	5	10′
15	15′	5	10′
15	15′	100	16′
100	25′	100	16′

洗脱上述标题化合物，Rt为11分钟。

合并表现出上述Rt值的部分，加样至2g离子交换树脂(Dowex^_50W-X8，H⁺型)上并用30ml甲醇∶水50∶50(体积/体积)的混合物洗脱。将洗脱液冷冻干燥给出产率为35％的上述标题产物。

用Howlett-Packard 5989A仪器记录的质谱表现出相应于上述标题化合物的[M-1]-离子的分子离子在m/z675.9。

在pH4.9，40％(体积/体积)甲醇于水的磷酸盐缓冲液中紫外吸收光谱在265nm处表现出最大吸收。

在D₂O中，在Varian Gemini分光光度计上，在20℃至30℃的温度范围在200MHz记录的¹H-NMR谱表现出的最明显的化学位移在(δppm)：1.639(-CH₃)，2.225(-O-CH₂)，3.943(宽1′-CH-和2′-CH₂)，4.275(3′-CH)，5.955(4′-CH)，7.439(芳香族质子6-CH)。

实施例5

5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷，胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的制备

a)AZT-5′-单磷酸酯的活化：

将70mg(0.182mmol)AZT-5′-单磷酸酯钠盐按照实施例4步骤a)中所述的同样步骤进行活化，并将产物按原样用于下列步骤c)中。

b)5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯三正辛基铵盐：

按照实施例4步骤b)中所述的同样步骤将100mg(0.27mmol)5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯钠盐转化成相应的三正辛基铵盐，并将产物按原样用于下列步骤c)中。

c)反应：

将步骤a)的活化的AZT-5′-单磷酸酯溶于1ml无水吡啶中并将溶液和0.2ml六甲基磷酰胺一起加入步骤b)的5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯钠盐中。真空干燥后，向残余物中加入0.2ml无水吡啶，并将混合物在室温下搅拌24小时。在30℃于旋转蒸发器中蒸去溶剂后，将残余物悬浮于5.3ml水中，通过加入1N NaOH调节pH值至8，用5ml乙醚萃取混合物3次。分离含上述标题产物的水层，回收产物并按照下列步骤d)进行纯化。

d)纯化：

将从步骤c)中得到的水溶液加在含有2g事先用5mM HCl处理的Dowex^_1-X8(C1-型)离子交换树脂的柱子上。流速为0.4ml/分钟。用10ml5mMHCl洗涤柱子，然后使用流速为0.5ml/分钟的在5mM HCl中从0至600mM的LiCl线性梯度洗脱。

收集并合并含标题产物的部分，并通过加入1M LiCl调节pH值至6.5。然后在30℃于旋转蒸发器中将溶液浓缩至体积为4ml。用反相HPLC柱(μBondapack^_C18，250×10mm，10μm粒径)以流速为4ml/分钟的水洗脱，上样量为500μl，通过HPLC进一步纯化浓缩液。将回收的部分冷冻干燥，产生25mg标题产物的锂盐。按照实施例4步骤d)的最后一部分所述的同样步骤以实际的定量产率将该产物转化成标题的游离酸化合物。

用Hewlett-Packard 5989A仪器记录的质谱表现出相应于标题化合物的[M-1]-离子的分子离子在m/z653。

实施例6

二-(5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷)-5′5′-P¹，P²-焦磷酸酯的制备

a)5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯的活化：

按照实施例4步骤a)中所述的同样步骤活化100mg(0.27mmol)5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯钠盐。

按照实施例4步骤b)中所述的同样步骤将100mg(0.27mmol)5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯钠盐转化成相应的三正辛基铵盐；并将产物按原样用于下列步骤c)中。

c)反应：

将步骤a)的活化的5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯钠盐溶于1ml无水吡啶中并将溶液和0.2ml六甲基磷酰胺一起加入步骤b)的5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核糖核苷-5′-单磷酸酯三正辛基铵钠盐中。真空干燥后，向残余物中加入0.2ml无水吡啶，并将混合物在室温下搅拌24小时。在30℃于旋转蒸发器中蒸去溶剂后，将残余物悬浮于6ml水中，通过加入1N NaOH调节pH值至8，用6ml乙醚萃取混合物3次。分离含上述标题产物的水层，回收产物并按照下列步骤d)进行纯化。

d)纯化：

将从步骤c)中得到的水溶液加在含有2g事先用5mM HCl处理的Dowex^_1-X8(C1-型)离子交换树脂的柱子上。流速为0.4ml/分钟。用10ml5mMHCl洗涤柱子，然后使用流速为0.4ml/分钟的在5mM HCl中从0至600mM的LiCl线性梯度洗脱。

收集并合并含上述标题产物的部分，并通过加入1M LiCl调节pH值至6.5。然后在30℃于旋转蒸发器中将溶液浓缩至体积为2ml，然后在冰中通过加入2倍体积的乙醇∶丙醇1∶4(体积/体积)混合物沉淀化合物，最后用丙酮和乙醚洗涤沉淀的化合物，用缓和的氮气气流干燥，得到上述标题化合物的锂盐，按照实施例3步骤d)最后一部分中所述的同样步骤将其转化为游离酸。

产率30％。

在40％(体积/体积)甲醇水的pH4.9磷酸盐缓冲液中的紫外吸收光谱在269nm处表现出最大吸收。

序列表(1)一般信息

(I)申请人：

(A)名称：GRUPPO LEPETIT S.P.A.

(B)街道：Via R.Lepetit34

(C)城市：GERENZANO(VA)

(E)国别：意大利

(F)邮编：(ZIP)：I-21040

(II)发明名称：二核苷-5′，5′-焦磷酸酯

(III)序列数目：6

(IV)计算机可读形式：

(A)媒介类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patentin Release#1.0，Version#1.30(EPO)

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(I)序列特征

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(II)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(IV)反义：否

(XI)序列描述：SEQ ID NO：1：

GGCATATCCT ATTCAAACAG 20

(2)SEQ ID No：2的信息

(I)序列特征

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(II)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(IV)反义：否

(XI)序列描述：SEQ ID NO：2：

CCTATATTTT ACGTTGAGAA 20

(2)SEQ ID No：3的信息

(I)序列特征

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(II)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(IV)反义：是

(XI)序列描述：SEQ ID NO：3：

TATGGTTTAC TGCCTTCTCT 20

(2)SEQ ID No：4的信息

(I)序列特征

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(II)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(IV)反义：是

(XI)序列描述：SEQ ID NO：4：

GAATTCGGTC TTTCATGGGA 20

(2)SEQ ID No：5的信息

(I)序列特征

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(II)分子类型：其它核酸

(A)描述：/dess＝“合成寡核苷酸”

(IV)反义：否

(XI)序列描述：SEQ ID NO：5：

ACATGGAGTG GGGGGCCTTT GG 22

(2)SEQ ID No：6的信息

(I)序列特征

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(II)分子类型：其它核酸

(A)描述：/dess＝“合成寡核苷酸”

(IV)反义：是

(XI)序列描述：SEQ ID NO：6：

GTTGCGGACG ATTTCACCCA GG 22

Claims

1、式(I)的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯

其中

符号A和B各自独立地代表选自胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷、鸟嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷、次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷、胞嘧啶-2′，3′-二脱氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′-C′基团；

符号X各自独立地代表氧或硫；

2、权利要求1的二核苷，其中符号A代表选自下列非天然存在的核苷的5′-C′-基团：

胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷，

5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷，

次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷，

腺嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷，

胞嘧啶-2′，3′-二脱氧-D-核苷，

尿嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷以及

鸟嘧呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷；

符号B代表选自下列非天然存在核苷的5′-C′基团

胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷，

腺嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷，

5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷，

胞嘧啶-2′，3′-二脱氧-D-核苷，

次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷，

尿嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷以及

鸟嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷；

选自通过双键与磷原子直接相连的那些化合物以及是基团XR和XR₁的一部分的那些化合物的一个或两个符号X代表氧或硫并且其它的符号X分别代表氧；

符号R和R₁各自独立地代表氢或1至4个碳原子的烷基基团；以及其中R和/或R₁代表氢的化合物与提供生物学上可接受的阳离子，优选钠和钾离子，的碱的加成盐。

3、如权利要求2的化合物，其中所有符号X代表氧，R和R₁均代表氢，及其与生物学上可接受的阳离子，优选Na⁺或K⁺，的碱的盐。

4、权利要求2的化合物，其中每个符号A和B代表下列组合的非天然存在的核苷的5′-C′基团：1)A：胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷2)A：5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷

B：腺嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷3)A：5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷

B：5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷4)A：5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷

B：胞嘧啶-2′，3′-二脱氧-D-核苷5)A：5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷

B：胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷6)A：5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷

B)次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷7)A：胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷8)A：胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：胞嘧啶-2′，3-二脱氧-D-核苷9)A：胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：腺嘧呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷10)A：腺嘧呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：腺嘧呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷11)A：次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：腺嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷12)A：次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷13)A：次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：胞嘧啶-2′，3′-二脱氧-D-核苷14)A：胞嘧啶-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：胞嘧啶-2′，3′-二脱氧-D-核苷15)A：腺嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：胞嘧啶-2′，3′-二脱氧-D-核苷16)A：尿嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：尿嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷17)A：鸟嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：鸟嘌呤-2′-，3′-二脱氧-D-核苷18)A：胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：尿嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷19)A：尿嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷20)A：胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：鸟嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷21)A：尿嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷

B：鸟嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷；

每个符号X代表氧；

每个符号R和R₁代表氢；及其与提供生物学上可接受的阳离子，优选钠或钾离子，的碱的加成盐。

5、权利要求4的化合物，其中：

I)A代表非天然存在的核苷胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷的5′-C′基团而

B代表非天然存在的核苷次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷的5′-C′基团；

II)每个符号A和B代表非天然存在的核苷胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2，′3′-二脱氧-D-核苷的5′-C′-基团；或者

III)A代表非天然存在核苷5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷的5′-C′基团，而

B代表非天然存在核苷胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷的5′-C′基团；或者

IV)每个符号A和B代表非天然存在核苷5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷的5′-C′基团；

每个符号X代表氧；

每个符号R和R₁代表氢；及其钠盐和钾盐。

6、权利要求5的化合物，其中：

每个符号A和B代表非天然存在核苷胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷的5′-C′基团；

每个符号X代表氧；

每个符号R和R₁代表氢；及其它们的钠和钾盐。

7、权利要求1至6任何一项中的化合物作为药物的用途。

8、权利要求1至4任何一项中的化合物，其中至少一个符号A和B代表选自下列非天然存在的核苷的5′-C′基团：

胸腺嘧啶-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-D-核苷，

尿嘌呤-3′-叠氮基-2′，3-二脱氧-D-核苷

鸟嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷

次黄嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷

胞嘧啶-2′，3′-二脱氧-D-核苷

腺嘌呤-2′，3′-二脱氧-D-核苷其作为抗病毒剂的用途，特别是对抗逆转录病毒感染如猫和鼠免疫缺陷性病毒感染和HZV感染。

9、权利要求6的化合物作为抗病毒剂的用途，特别是对抗逆转录病毒感染如猫和鼠免疫缺陷性病毒感染和HIV感染。

10、权利要求1至4任何一项中的化合物，其中至少一个符号A和B代表非天然存在核苷5-氟尿嘧啶-2′-脱氧-D-核苷的5′-C′-基团，其作为抗肿瘤剂的用途。

11、权利要求5I)、II)和III)项的任何化合物用于生产抗-HIV剂的用途。

12、权利要求6的化合物用于生产抗-HIV剂的用途。

13、权利要求5III)项的任何化合物用于生产抗肿瘤剂的用途。

14、一种含有式(I)的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的药物组合物：其中：

符号X各自独立地代表氧或硫；

15、权利要求1至6的任何一项中的化合物用于生产抗肿瘤和/或抗病毒感染的治疗剂的用途，其特征在于所述化合物被包藏在生物载体中。

16、根据权利要求15的用途，其中的生物载体是转化红细胞。

17、一种含有包含式(I)的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的转化红细胞的组合物：其中：

符号X各自独立地代表氧或硫；

18、一种制备式(I)的二核苷-5′，5′-P¹，P²焦磷酸酯的方法：

其中：

符号X各自独立地代表氧或硫；

符号R和R₁各自独立地代表氢或从1至10个碳原子的烷基基团；以及其中R和/或R₁代表氢的式(I)化合物与提供生物学上可接受的阳离子的碱的加成盐。该方法包括活化式(II)的磷酸核苷的XH基团：

其中A，X和R具有与上面相同的含义，以形成活化的磷酸酯并将该活化的磷酸酯与式(III)的酸核苷与受阻叔胺碱的盐反应：

其中B、X和R₁具有与上面相同的含义。

19、根据权利要求18的方法，其中通过与焦磷酸酯四苯基或磷酸一酰氯二苯基酯反应活化式(II)的磷酸核苷的XH基团。

20、根据权利要求18和19中任何一项的方法，其中式(III)的磷酸核苷与受阻叔胺碱的盐是与三正丁基胺、三正辛基胺或甲基-三正辛基氢氧化铵的盐。

21、根据权利要求18、19和20中任何一项的方法，其中活化的式(II)磷酸核苷和式(III)的磷酸核苷与受阻叔胺的盐的反应是在不干扰反应物的过量酸受体，优选脂肪族叔胺或杂环叔胺存在下进行的。

22、根据权利要求18、19、20和21中任何一项的方法，其中活化的式(II)的磷酸核苷与式(III)的磷酸核苷的盐的反应是在室温下在惰性有机溶剂优选二噁烷的存在下进行的，可选择地还存在溶解力高的其它惰性有机溶剂，优选二甲基甲酰胺。

23、一种将权利要求1至6中任何一项的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯包藏到红细胞中的方法，其特征在于将红细胞：(I)在溶血性缓冲液中透析，(II)在同样的透析条件下与二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯接触，(III)通过针对比所述溶胞产物高渗的磷酸盐缓中液透析进行重封，并且(IV)充分洗涤重封后的红细胞。

24、含权利要求1至6中任何一项的二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的转化红细胞的组合物，进一步的特征在于修饰了这种转化红细胞的表面，从而可被人或动物病原性逆转录病毒的宿主细胞特异性识别。

25、制备权利要求24的组合物的方法，其特征在于如下处理含二核苷-5′，5′-P¹，P²-焦磷酸酯的红细胞：(I)先用表面蛋白或跨膜蛋白的可逆群集剂处理，(II)然后用共价连接交联剂处理，最后，(III)在自体血浆中温育以结合IgG分子。