CN115398237A - 将破坏性甲状腺炎与其他病理状态鉴别的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题是提供鉴别破坏性甲状腺炎的方法。本发明涉及鉴别破坏性甲状腺炎的方法,其包括测定试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种。
Description
技术领域
本发明涉及基于血液等甲状腺外存在的一碘酪氨酸(MIT)和/或二碘酪氨酸(DIT)的量鉴别破坏性甲状腺炎的方法。
背景技术
甲状腺是基于食物中所含的碘产生甲状腺激素,并向血液中分泌的内分泌器官。存在两种甲状腺内分泌细胞,在占其大部分的滤泡细胞的滤泡腔中,酪氨酸残基在过氧化氢的存在下被碘化。即,在碘的有机化过程中,碘与甲状腺球蛋白(Tg)的酪氨酸残基的3位和5位的碳结合,生成作为甲状腺激素前体的一碘酪氨酸(MIT)、二碘酪氨酸(DIT)。然后,MIT和DIT通过过氧化物酶聚合生成甲状腺激素的三碘甲状腺原氨酸(T3),DIT和DIT聚合生成甲状腺素(T4)。在滤泡细胞内,碘化的Tg通过蛋白水解酶释放T3、T4、MIT和DIT。然后,T3和T4被分泌到血中,通过脱碘酶的作用,碘离子从MIT和DIT游离出来,被再利用。从甲状腺分泌到血中的甲状腺激素,大部分以与血中的蛋白质结合的状态存在,而发挥作用的是不与蛋白质结合的游离T3(FT3)或游离T4(FT4)。甲状腺激素的主要作用多涉及生命维持,涉及对心脏和骨骼肌的作用和代谢关联、神经系统和发育等多方面。
破坏性甲状腺炎是由于分娩或手术等的应激或部分药剂、食物等原因引起甲状腺滤泡的破坏,甲状腺激素漏出至血中,引起心悸、体重减少、发汗过多等甲状腺中毒症状的疾病。破坏性甲状腺炎包括伴有疼痛的亚急性甲状腺炎和不伴有疼痛的无痛性甲状腺炎。破坏性甲状腺炎与巴塞杜氏病不同,甲状腺激素过量状态是暂时的,在被破坏的甲状腺恢复期间,激素量下降,有时会发生甲状腺功能减退症,但经数月后恢复。
在亚急性甲状腺炎的情况下,在患部为一侧性且有轻微疼痛时,与甲状腺未分化癌、囊内出血的鉴别变得重要,在无痛性甲状腺炎的情况下,与巴塞杜氏病的鉴别变得重要。破坏性甲状腺炎的情况下,自然治愈多,症状严重时,若是亚急性甲状腺炎,则有时进行肾上腺皮质激素的给药,若是无痛性甲状腺炎,则有时进行β阻断剂的给药。特别是与巴塞杜氏病的鉴别很重要,若对无痛性甲状腺炎的患者给予巴塞杜氏病的治疗药,则当然有可能容易陷入甲状腺功能减退,而且在巴塞杜氏病的治疗药的副作用(特别是粒细胞减少症)出现时成为大问题。
作为破坏性甲状腺炎和巴塞杜氏病的鉴别方法,一般是在患者的FT3、FT4值高、促甲状腺激素(TSH)为0.1μIU/mL以下时,进一步测定抗TSH受体抗体(TRAb),阳性时诊断为巴塞杜氏病,阴性时诊断为破坏性甲状腺炎。TRAb测定使用试剂盒进行,但作为TRAb测定的抗体并不限于单一的抗体,例如特发性粘液水肿等也会变为高值,因此性质和测定方法中存在问题。另外,TRAb在无痛性甲状腺炎、亚急性甲状腺炎中也偶尔成为阳性(非专利文献1-4)。
作为其他的破坏性甲状腺炎和巴塞杜氏病的鉴别方法,已知有以下方法。
(i)FT3/FT4比
若FT3/FT4比同程度地上升,则为无痛甲状腺炎,若FT3/FT4比为2.5以上,则为巴塞杜氏病,但灵敏度、特异度低。
(ii)血流指数或血流密度
在甲状腺超声检查中,若血流量降低则为无痛甲状腺炎,若血流量增加则为巴塞杜氏病。
(iii)下甲状腺动脉血流速度
若速度从正常到低值则为无痛甲状腺炎,从正常到异常高值则为巴塞杜氏病。但是,也有在巴塞杜氏病中显示低值、在无痛甲状腺炎中显示高值的情况。
(iv)123I或99mTc闪烁扫描(摄入率)
若123I或99mTc(通过与碘相同的机制摄取)的摄取降低,则为无痛性甲状腺炎,若从正常增加,则为巴塞杜氏病。99mTc是用时级别的放射性同位素,不能取消检查,制作完成时鉴别结束的情况也很多。另一方面,99mTc具有没有碘摄取限制的优点,但摄取大量碘则无法判别。
(v)尿中碘排出量测定
若尿中总碘排出量增加则为无痛性甲状腺炎,若不增加则为巴塞杜氏病。但是,由于受到进食的影响,测定时期受到限制。
如上这样,对于破坏性甲状腺炎,开发了各种鉴别方法,但没有简便且正确地鉴别的方法。
但是,如上所述,MIT是甲状腺激素的前体,是在酪氨酸的苯酚环的间位配位有碘的物质。两个分子结合形成3.3’-二碘甲状腺原氨酸。另外,在甲状腺的胶体中,另外一个分子与二碘酪氨酸结合,形成三碘甲状腺原氨酸。
另外,如上所述,DIT是甲状腺激素的前体,是在一碘酪氨酸的苯酚环的另一个间位配位有碘的物质。二碘酪氨酸调节碘化物过氧化物酶的作用。另外,在甲状腺胶体中与一碘酪氨酸结合,形成三碘甲状腺原氨酸。当两个分子的二碘酪氨酸结合时,可以形成甲状腺素。
MIT和DIT作为抗癌剂的用途是已知的(专利文献1),但甲状腺被破坏后释放到血液中的情况是未知的。
现有技术文件
专利文献
专利文献1:日本专利特公平7-116031号公报
非专利文献
非专利文献1:池田齐《25.甲状腺功能亢进症、甲状腺功能减退症》,《诊断组别临床检查指南2003~面向医疗的标准化~》,日本临床检查医学会编,107-110,2003年
非专利文献2:吉村弘:甲状腺激素异常的研究,日本内科学会杂志,第103卷,第4号(平成26年4月10日):855-861
非专利文献3:吉田克己等:亚急性甲状腺炎和无痛性甲状腺炎的诊断,日本内科学会杂志,第86卷,第7号(平成9年7月10日):48-53
非专利文献4:中野亚有子等:巴塞杜氏病和破坏性甲状腺炎的初诊时的迅速鉴别法,Dokkyo Journal of Medical Science,36(2),105-108,2009
发明内容
本发明的课题是提供鉴别破坏性甲状腺炎的方法。
本发明的发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究,结果发现,在破坏性甲状腺炎患者中,与破坏性甲状腺炎以外的甲状腺疾病和甲状腺功能异常(以下,将两者也合称为“非破坏性甲状腺炎疾病”)的患者、例如TSH和FT4在基准值内的患者或巴塞杜氏病患者相比,不知道甲状腺被破坏后释放到血中等甲状腺外的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸在血中的量出人意料地更高,从而完成了本发明。
即,本发明如下所述。
[1]一种破坏性甲状腺炎的鉴别方法,其包括测定试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种。
[2]根据上述项目[1]所述的鉴别方法,其中,测定一碘酪氨酸和二碘酪氨酸这两者。
[3]根据上述项目[1]或[2]所述的鉴别方法,其中,试样为血液。
[4]根据上述项目[1]~[3]中任意一项所述的鉴别方法,其中,使用LC-MS进行试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种的测定,所述LC-MS使用它们的稳定同位素作为内标物质。
[5]一种用于鉴别破坏性甲状腺炎的生物标记物,其特征在于,所述生物标记物为试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的任意一种。
[6]根据上述项目[5]所述的生物标记物,其中,所述生物标记物为一碘酪氨酸和二碘酪氨酸这两者。
[7]根据上述项目[5]或[6]所述的生物标志物,其中,试样为血液。
[8]一种破坏性甲状腺炎的鉴别用试剂盒,其特征在于,该鉴别用试剂盒包括:用于测定从被检体采集的试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种的单元;以及将得到的被检体的测定值与从非罹患体、非破坏性甲状腺炎疾病罹患体、和破坏性甲状腺炎罹患体采集的对应的试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种的测定值进行对比的单元。
[9]一种破坏性甲状腺炎的鉴别用试剂盒,其特征在于,该鉴别用试剂盒包括:用于测定从被检体采集的试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种的单元;以及将得到的被检体的测定值与一碘酪氨酸和/或二碘酪氨酸的截止值进行对比的单元。
[10]根据上述项目[8]或[9]所述的鉴别用试剂盒,其中,测定一碘酪氨酸和二碘酪氨酸这两者。
根据本发明,可以鉴别破坏性甲状腺炎。特别地,可以鉴别破坏性甲状腺炎与非破坏性甲状腺炎疾病,例如巴塞杜氏病、普鲁麦氏病和妊娠一过性甲状腺功能亢进症,特别是巴塞杜氏病。
附图说明
图1是表示甲状腺疾病患者的血清中的一碘酪氨酸(MIT)浓度的图。
图2是表示甲状腺疾病患者的血清中的二碘酪氨酸(DIT)浓度的图。
图3是表示甲状腺疾病患者的血清中的MIT浓度的图。
图4是以四分位(箱线图)表示图3的结果的图。
图5是表示甲状腺疾病患者的血清中的DIT浓度的图。
图6是以四分位(箱线图)表示图5的结果的图。
图7是将图1和图3的结果汇总的图。
图8是以四分位(箱线图)表示图7的结果的图。
图9是将图2和图5的结果汇总的图。
图10是以四分位(箱线图)表示图9的结果的图。
图11是表示DIT的标准曲线的图。
具体实施方式
本发明中,如前所述,“非破坏性甲状腺炎疾病”是指破坏性甲状腺炎以外的甲状腺疾病和甲状腺功能异常,例如可例示巴塞杜氏病、普鲁麦氏病、和妊娠一过性甲状腺功能亢进症等。此外,“非破坏性甲状腺炎疾病”还包括甲状腺全摘并给药左甲状腺素(LT4)的疾病、甲状腺检查值中发现异常但不属于甲状腺疾病的疾病、在甲状腺中毒症(功能亢进症)或功能减退症的治疗中甲状腺激素和TSH的值处于正常范围的疾病等。
在本发明中,由于从破坏性甲状腺炎罹患体、非罹患体和非破坏性甲状腺炎疾病罹患体采集的试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸(以下也统称为“本发明的生物标记物”)中的至少一种的量,在破坏性甲状腺炎罹患体中,比非罹患体和非破坏性甲状腺炎疾病罹患体中更高,通过测定本发明的生物标记物,可以鉴别破坏性甲状腺炎,特别是可以鉴别破坏性甲状腺炎与非破坏性甲状腺炎(特别是巴塞杜氏病)。
具体而言,例如,测定从成为鉴别对象的被检体、非罹患体、和非破坏性甲状腺炎疾病罹患体分别采集的试样中的本发明生物标志物的至少一种,将得到的被检体的测定值与非罹患体和非破坏性甲状腺炎疾病罹患体的测定值进行对比,由此能够鉴别被检体是否罹患破坏性甲状腺炎。例如,如果通过统计学方法,被检体的测定值显著高于非罹患体和非破坏性甲状腺炎疾病罹患体的测定值,则可以将该被检体鉴别为罹患破坏性甲状腺炎而不是非破坏性甲状腺炎疾病。
或者,也可以通过设定截止值,将得到的被检体的测定值与截止值进行对比,来鉴别破坏性甲状腺病。截止值是指当被检体的试样中的MIT和/或DIT的测定值超过该值时,则将该被检体鉴别为罹患破坏性甲状腺炎疾病而不是非破坏性甲状腺炎的值。
截止值根据动物种和试样而不同。例如,作为MIT在人血清中的截止值,优选为250pg/mL(例如260pg/mL)、更优选为210pg/mL(例如200pg/mL)、进一步优选为160pg/mL、特别优选为120pg/mL。另外,例如作为DIT在人血清中的截止值,为400pg/mL、优选为300pg/mL(特别是350pg/mL)、更优选为260pg/mL、进一步优选为250pg/mL、特别优选为200pg/mL。
截止值例如能够基于例如ROC(Receiver Operating Characteristic,被检体工作特征)曲线来计算。
本发明中,通过测定一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种进行对比,可以进行鉴别,但特别优选测定二碘酪氨酸进行对比。进而,在本发明中,为了提高鉴别的精度和准确性,优选测定一碘酪氨酸和二碘酪氨酸这两者进行对比。
在本发明的鉴别方法中,“被检体”是指包括人的动物,“非罹患体”是指未在甲状腺中毒症和功能减退症等甲状腺疾病和甲状腺功能异常的治疗中的TSH和FT4在基准值内的包括人的动物,“非破坏性甲状腺炎疾病罹患体”是指医师或兽医师诊断为罹患非破坏性甲状腺炎疾病的包括人的动物,“破坏性甲状腺炎罹患体”是指医师或兽医师诊断为罹患破坏性甲状腺炎的包括人的动物。
此外,作为上述TSH和FT4的基准值,只要是与健康人或人以外的健康动物相比没有大的异常的值即可,根据动物种和试样的不同而不同,例如,作为上述TSH在人血清中的基准值,可以举出0.61-4.68μIU/mL,作为FT4在人血清中的基准值,可以举出0.76-1.65ng/dL。
作为人以外的动物,可例示狗、猫、鹦鹉等的宠物,牛、猪、马等的家畜,以及鸡等的家禽。
在本发明的鉴别中,在对比被检体、非罹患体、非破坏性甲状腺炎疾病罹患体、以及破坏性甲状腺炎罹患体的测定值,或者对比被检体的测定值和截止值时,优选这些值至少是在同一动物种中测定的值。进而,优选亚种(包括人种)、性别、年龄(包括月例、周龄)、身高和体重、以及试样等的条件也相同。
在本发明中测定MIT、DIT的“试样”是从被检体、非罹患体、非破坏性甲状腺炎疾病罹患体、以及破坏性甲状腺炎罹患体中采集的试样,只要是甲状腺以外的来自生物的试样,就没有特别限制,可以使用任意的试样。例如,可以举出血液(全血、血清、血浆)、唾液、泪液、汗、尿、粪便、胆汁、组织、毛发、或生物细胞、或者组织、生物细胞的培养液、或者从器官得到的调制物等(其中,器官不包括甲状腺,组织和细胞不包括甲状腺的组织和细胞)。优选血液、唾液和尿,更优选血液,特别是血清和血浆。
在本发明中,本发明生物标记物的测定方法只要能够测定试样中的一碘酪氨酸和/或二碘酪氨酸,就没有特别限制,可以使用惯用的测定方法。
例如,可以使用惯用的放射免疫分析(RIA)法(Elevated serum diiodotyrosine(DIT)in severe infections and sepsis:DIT,a possible new marker of leukocyteactivity.Meinhold H,Gramm HJ,Meissner W,Zimmermann J,Schwander J,Dennhardt R,Voigt K.J Clin Endocrinol Metab.1991 Apr;72(4):945-53)或LC-MS/MS法(Effects ofexogenous monoiodotyrosine on the serum levels of anterior pituitaryhormones.Tan SA,Lewis JE,Berk LS,Wilcox RB.Acta Endocrinol(Copenh).1991 Mar;124(3):251-7)。此外,也可以使用化学发光酶免疫测定(CLEIA)法、酶联免疫测定(ELISA)法、电化学发光免疫测定(ECLIA)法。
优选为具有宽定量范围的液相色谱质谱(LC-MS),其不需要使用放射性物质或进行衍生物化处理,并且可以使用稳定同位素作为内标物质(I.S)。
LC-MS表示使用组合了液相色谱和质谱仪的装置进行的分析方法,例示有液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)、液相色谱飞行时间型质谱法(LC-TOF-MS)等,优选为LC-MS/MS。
为了进行质量分析,需要将目标成分电离。电离法可以举出大气压化学电离法(APCI)、电喷雾电离法(ESI)、大气压光电离法(APPI)等。将这些电离法与LC-MS/MS组合,使用Liquid Chromatography-Electrosprayionization based Tamdem Mass Spectrometry(LC-ESI/MS/MS)、Liquid Chromatography-Atmospheric pressure chemical ionizationbased Tamdem Mass Spectrometry(LC-APCI/MS/MS)等方法。这些测定本身可以通过一般的方法进行。在这次测定中优选LC-ESI/MS/MS。离子检测有正离子检测和负离子检测,其中,在本次的测定中优选使用负离子检测。
另外,质量分析部例如可以举出磁场型、四重极型、飞行时间型等,但在本发明中,优选使用定量性良好、动态范围宽且直线性良好的四重极型。
进而,作为定量中的离子检测,可以举出选择性离子监测(Selected IonMonitoring)和选择反应监测(Selected Reaction Monitoring:SRM)等,其中,选择性离子监测仅选择性地检测目标离子,选择反应监测选择由第一质量分析部生成的离子种类中的一种作为前体离子,并由第二质量分析部检测由该前体离子的分裂而产生的产物离子。在本发明中,优选通过增加选择性、减少噪声来提高信噪比的基于SRM的测定。
一碘酪氨酸和二碘酪氨酸的稳定同位素可以是市售的或用常规的方法合成。
本发明的鉴别方法的优点在于,由于MIT或DIT是测定对象,因此可以使用上述负离子检测LC-ESI/MS/MS测定法,可以简便且准确地鉴别破坏性甲状腺炎。
本发明还涉及使用一碘酪氨酸或二碘酪氨酸、优选这二者作为用于鉴别破坏性甲状腺炎、特别是用于鉴别破坏性甲状腺炎与非破坏性甲状腺炎疾病(特别是巴塞杜氏病)的生物标记物的方法。
本发明还涉及用于本发明的鉴别方法的鉴别用试剂盒。
用于本发明鉴别方法的试剂盒可以包含选自缓冲剂、酸、碱、醇、注射器、抗体和描述测量程序的文件中的至少一种。此外,用于本发明鉴别方法的试剂盒还可包含记载有标准的文件。
更具体地,本发明的“鉴别用试剂盒”包括将从被检体采集的试样中的本发明的生物标记物的至少一种的测定值与从非罹患体、非破坏性甲状腺炎疾病罹患体和破坏性甲状腺炎罹患体采集的相应试样中的本发明的生物标记物的至少一种的测定值或截止值进行比较以鉴别破坏性甲状腺炎所需的单元。例如,作为存在于从被检体采集的试样中的本发明的生物标志物的至少一种的测定单元,可以举出试样的采集用具或制备用具、MIT和/或DIT的测定用具或试剂、例如柱筒等,另外,作为将从被检体采集的试样中的本发明的生物标志物的至少一种的测定值与从非罹患体、非破坏性甲状腺炎疾病罹患体和破坏性甲状腺炎罹患体采集的相应试样中的本发明的生物标志物的至少一种的测定值或截止值进行比较的比较单元,可以举出非罹患体、非破坏性甲状腺炎疾病罹患体和破坏性甲状腺炎罹患体各自的测定值或截止值的对比表。其中,该对比表即使不根据医师的判断也能够对鉴别对象疾病进行鉴别,特别有用。
本发明还涉及破坏性甲状腺炎的治疗或预防剂的筛选方法,所述方法包括测定试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种,优选测定这两种。
实施例
以下,列举实施例,具体地说明本发明,但本发明不受下述实施例的限制。此外,实施例中使用的装置和材料如下所述。
[实施例1]基于LC-MS/MS测定的破坏性甲状腺炎患者的鉴别(1)
1.包含MIT和DIT的试样的制备
向试管中加入人血清0.05mL和内标(300pg/0.05mL的MIT-13C6和DIT-13C9 15N的混合甲醇溶液)0.05mL,添加25mg/mL二硫苏糖醇/1%吡啶水溶液0.1mL,搅拌后,在室温下静置30分钟。静置后,在试管中加入纯化水1mL、甲基叔丁基醚4mL,振荡5分钟后,离心3分钟,除去甲基叔丁基醚。将乙酸/乙腈(1:50)0.5mL加入到水层中,离心3分钟后,将上清液转移至另一个试管中,并将其上样至预先用甲醇3mL、纯化水1mL和1%乙酸水溶液1mL调节的CX柱(thermo-fisher公司)上。用纯化水1mL、甲醇3mL洗涤后,用甲醇/纯化水/氨水(6:14:1)1mL溶出MIT和DIT后,将洗脱液用离心蒸发器蒸馏,溶解于20mM甲酸铵水溶液0.1mL中,制备含有MIT和DIT的试样。
2.LC-MS/MS条件
通过LC-MS/MS分析以上制备的试样。LC-MS/MS的条件示于以下的表1。
[表1]
LC-MS/MS分析条件
测定对象物/内标物质
测定区间:1.2~2.5min
Resolution:Q1/Unit Q3/unit
3.有效性验证结果
上述LC-MS/MS分析的有效性验证结果示于以下的表2。
[表2]
如表1和表2所示,本发明的基于LC-MS/MS的MIT和DIT的测定方法的每1个试样的测定时间短至3分钟,定量下限为60pg/mL,有效性验证结果也良好。
使用上述本发明的基于LC-MS/MS的MIT和DIT的测定方法,测定甲状腺疾病患者的人血清中的MIT和DIT。结果示于表3以及图1和2。
[表3]
Control:在医师的诊断中,有怀疑甲状腺疾病的身体、数据的异常,尽管测定了TSH/FT4,但TSH和FT4仍在基准内的患者
DT:诊断为破坏性甲状腺炎(DT)的患者(亚急性1名,无痛性2名)
GD:诊断为巴塞杜氏病(GD)的患者
GTH:妊娠一过性甲状腺功能亢进患者
从表3以及图1和2中可知,通过测定血液中的MIT或DIT,可以鉴别破坏性甲状腺炎。特别地,可知可以鉴别破坏性甲状腺炎与非破坏性甲状腺疾病,特别是巴塞杜氏病。
[实施例2]基于LC-MS/MS测定的破坏性甲状腺炎患者的鉴别(2)
按照实施例1记载的方法,测定甲状腺疾病患者的人血清中的MIT和DIT。结果示于表4和图3-6。
[表4]
Control:在医师的诊断中,有怀疑甲状腺疾病的身体、数据的异常,尽管测定了TSH/FT4,但TSH和FT4仍在基准内的具有甲状腺的患者
DT:诊断为破坏性甲状腺炎(DT)的患者
GD:诊断为巴塞杜氏病(GD)的患者
从表4和图3-6可知,可以通过测定血液中的MIT或DIT来鉴别破坏性甲状腺炎。特别是,可知可以鉴别破坏性甲状腺炎与巴塞杜氏病。
[实施例3]基于LC-MS/MS测定的破坏性甲状腺炎患者的鉴别(3)
将实施例1和2的结果汇总并计算数据。结果示于表5和图7-10。
[表5]
Control:在医师的诊断中,有怀疑甲状腺疾病的身体、数据的异常,尽管测定了TSH/FT4,但TSH和FT4仍在基准内的具有甲状腺的患者
DT:诊断为破坏性甲状腺炎(DT)的患者
GD:诊断为巴塞杜氏病(GD)的患者
GTH:妊娠一过性甲状腺功能亢进患者
表5和图7-10是将实施例1和2的结果汇总的结果,因此可知例数增加,精度进一步提高。
从表5和图7-10可知,通过测定血液中的MIT或DIT,可以鉴别破坏性甲状腺炎。特别地,可知可以鉴别破坏性甲状腺炎与非破坏性甲状腺疾病,特别是巴塞杜氏病。
[实施例4]基于化学发光酶免疫测定法(CLEIA)的DIT的测定
1.板和溶液的制备
抗小鼠IgG兔抗体固相化96孔板的制作如下。用磷酸缓冲生理盐水将抗小鼠IgG兔抗体溶液(Jackson Immunoresearch公司)稀释至10μg/mL的浓度,将100μL的该溶液分注于96孔空板(thermofisher scientific公司)。接着,在4℃下反应16小时后,用0.02%Triton(注册商标)X-100洗涤两次,再用5%蔗糖洗涤两次,由此制作。碱性磷酸酶标记DIT溶液如下制备。用Alkaline Phosphatase Labelling Kit-NH2(同仁化学研究所),在100nmol的DIT中标记碱性磷酸酶,制成碱性磷酸酶标记DIT原液。用测定缓冲液(含有2mmol/L氯化镁、20μmol/L氯化锌、0.1%牛血清白蛋白和0.1%叠氮化钠的0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液pH7.5)将碱性磷酸酶标记DIT原液稀释5000倍进行制备。通过用测定缓冲液将抗二溴酪氨酸单克隆抗体(日本老化控制研究所)稀释至100ng/mL的浓度来制备抗DIT小鼠抗体溶液。在酶反应缓冲液(含有0.002%Triton(注册商标)X-100的50mmol/L 2-单乙醇胺-盐酸缓冲液pH9.5)中溶解苯甲酰甲基磷酸至0.5mmol/L的浓度来制备0.5mmol/L的苯甲酰甲基磷酸溶液。通过将光泽精溶解于光泽精稀释液(0.2mol/L磷酸二氢钾水溶液)中至0.001%的浓度来制备0.001%的光泽精溶液。
2.DIT的标准曲线的制作
在固定化了抗小鼠IgG兔抗体的96孔板中分注100μL的DIT标准溶液,再添加25μL碱性磷酸酶标记DIT溶液和25μL抗DIT小鼠抗体溶液并混合,在10℃反应2小时。用含有0.02%Triton(注册商标)X-100和0.1%叠氮化钠的清洗液清洗4次后,分注100μL的0.5mmol/L苯甲酰甲基磷酸溶液并在室温下反应2小时后,分注50μL的0.001%的光泽精溶液,混合后,放置于生物/化学发光测定装置(阿托株式会社)。在生物/化学发光测定装置内分注150μL的1.0mol/L的氢氧化钠溶液,累计从分注8秒后到9秒后的发光强度。
3.DIT标准曲线的结果
DIT标准曲线的结果示于表6和图11。可知,生成了良好的标准曲线,能够进行基于CLEIA法的DIT的测定。
[表6]
DIT(ng/mL) | 发光强度 | B/Bo |
0 | 8.81E+06 | 100.0% |
15 | 8.01E+06 | 90.9% |
50 | 7.41E+06 | 84.0% |
150 | 5.93E+06 | 67.3% |
500 | 2.52E+06 | 28.6% |
1500 | 6.62E+05 | 7.5% |
5000 | 1.52E+05 | 1.7% |
B/B0=各浓度下的发光强度/0浓度的发光强度
工业可利用性
本发明的鉴别方法可以通过测定试样中的一碘酪氨酸(MIT)和二碘酪氨酸(DIT)中的至少一种来鉴别破坏性甲状腺炎。特别是可以进行治疗上必要的破坏性甲状腺炎与巴塞杜氏病的鉴别。另外,一碘酪氨酸(MIT)和二碘酪氨酸(DIT)也可以用作诊断或鉴别破坏性甲状腺炎的生物标记物。
本发明例如可以应用于医学、药学等领域。
Claims (10)
1.一种破坏性甲状腺炎的鉴别方法,其包括测定试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法,其中,测定一碘酪氨酸和二碘酪氨酸这两者。
3.根据权利要求1或2所述的鉴别方法,其中,试样为血液。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的鉴别方法,其中,使用LC-MS进行试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种的测定,所述LC-MS使用它们的稳定同位素作为内标物质。
5.一种用于鉴别破坏性甲状腺炎的生物标记物,其特征在于,所述生物标记物为试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的生物标记物,其中,所述生物标记物为一碘酪氨酸和二碘酪氨酸这两者。
7.根据权利要求5或6所述的生物标志物,其中,试样为血液。
8.一种破坏性甲状腺炎的鉴别用试剂盒,其特征在于,该鉴别用试剂盒包括:用于测定从被检体采集的试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种的单元;以及将得到的被检体的测定值与从非罹患体、非破坏性甲状腺炎疾病罹患体、和破坏性甲状腺炎罹患体采集的对应的试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种的测定值进行对比的单元。
9.一种破坏性甲状腺炎的鉴别用试剂盒,其特征在于,该鉴别用试剂盒包括:用于测定从被检体采集的试样中的一碘酪氨酸和二碘酪氨酸中的至少一种的单元;以及将得到的被检体的测定值与一碘酪氨酸和/或二碘酪氨酸的截止值进行对比的单元。
10.根据权利要求8或9所述的鉴别用试剂盒,其中,测定一碘酪氨酸和二碘酪氨酸这两者。
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