CN115398198A - 用于测试皮肤样本的方法 - Google Patents

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Abstract

一种获取皮肤样本的方法可以包括将粘合剂置于皮肤的一部分上并将粘合剂从皮肤上提起。然后可以在皮肤样本仍处于粘合剂上时，例如通过用细菌、真菌、病毒或组合对样本进行接种，来测试样本。

Description

用于测试皮肤样本的方法
技术领域
本申请涉及测试皮肤样本的方法和测试护肤品的方法。
背景技术
皮肤是身体的最大器官，并且是身体针对微生物攻击的天然防御的一部分。天然皮肤防御由多个组分构成。例如，皮肤的天然防御包括皮肤成为物理屏障的能力、皮肤的pH、皮肤微生态、皮肤上的脂质、皮肤的化学组分等。
皮肤提供对抗微生物攻击的天然防御的能力可以受到其在一天当中所接触的事物(如护肤品)的影响。针对这一点而言，对皮肤的天然防御进行测试主要聚焦于微生态。然而，正如所述，这只是皮肤的天然防御系统的一个方面。另外，对微生态进行测试通常通过以下来完成：取下皮肤样本，从样本中分离感兴趣的分子，然后将感兴趣的分子定量。然而，从目标分子的天然环境中移出目标分子可能对结果具有非预期的后果，并且还可以防止了解对皮肤天然防御的多于一个组分的影响和/或皮肤天然防御机制对所收集信息的潜在影响。另外，从原始样本中分离目标分子可能是昂贵且耗时的。照此，需要一种用于评估皮肤样本的新方法。
发明内容
一种用于测试皮肤样本的方法，包括：a)从目标区域获得皮肤细胞的样本，其中所述皮肤细胞是利用施加并取下粘合剂而获得的；b)将细菌负载、真菌负载、病毒负载或它们的组合施加于处于所述粘合剂上的样本；以及c)测量所述样本的细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合。
一种用于测试护肤品的方法，包括：a.将护肤品施加于目标区域；b.任选地，从所述目标区域冲洗下所述护肤品；c.从所述目标区域获得皮肤细胞的样本，其中所述皮肤细胞是利用施加并取下粘合剂而获得的；d.将细菌负载、真菌负载、病毒负载或它们的组合施加于处于所述粘合剂上的样本；以及e.测量所述样本的细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合。
下文将更全面地论述本发明的这些和其它表述。
附图说明
图1是利用标准后遗功效测试方法示出在用条皂底盘(chassis)和液体洗手皂底盘清洗后细菌的对数计数的图；
图2是利用处于粘合剂上的皮肤样本描绘在用条皂底盘和液体洗手皂底盘清洗后细菌的对数计数的图；
图3是描绘在取下受试者手臂上的皮肤样本之后受试者手臂上的pH相对于胶带条的表面上的pH的图；并且
图4是利用处于胶带条上的皮肤样本描绘不同沐浴液配方对皮肤天然防御功效的影响的图，所述皮肤样本是直接在胶带条上进行接种的。
具体实施方式
在市场上投放产品之前进行产品测试很重要。对产品进行测试允许开发者了解例如产品是否正如预期以及是否存在消费者接受产品。当制造用于向人体施加的产品时，可以针对产品完成的测试类型可以是受限的和/或昂贵的，这因为人受试者的需要和对那些受试者的安全性的要求是至关重要的。
由于时机和成本约束，有利的是能够以快速和成本相关的方式评估配制物的功效。先前这些快速且不太昂贵的测试包括事物(如皮肤模拟物或外植的人皮肤)。皮肤模拟物是制成类似于皮肤的人工材料。然而，尽管有益于对事物(如将成分沉积到皮肤上和/或在清洁期间起泡沫)进行初始筛选；但是其缺乏真正皮肤的潜在生物学。因此，在皮肤模拟物上所看到的情况与在实际人皮肤上所观察到的情况之间可以存在差异。而且，皮肤模拟物无法用于测试产品对一个或多个皮肤天然防御组分的任何影响或者无法了解皮肤天然防御组分是否影响任何测试的能力是使用皮肤模拟物的另外减损因素。
用于对人进行直接测试的另一个替代物是使用外植体皮肤。外植体皮肤是在外科手术期间取下并且不再需要的皮肤。外植体皮肤几乎没有严重衰败。首先，外植体皮肤仅在非常短的时间段内存活，这使运输、接收和测试的时机处于非常受限的窗口。其次，外植体皮肤的供应可以是不可预测的。此外，即使皮肤外植体仅具有很短的储藏寿命，但其维护也很费力。所有这些因素使皮肤外植体不太理想。用皮肤活检可以看到类似的问题。
为了对人进行直接测试，将产品直接施加在皮肤的目标部位上。取决于所进行的测试的类型，可以在施加产品之后用细菌和/或真菌对测试部位进行接种。当将这些材料接种在皮肤上时，它们通常被闭塞贴片覆盖，以帮助防止所接种的材料向其它皮肤区域的非预期转移。将细菌和/或真菌直接接种于使用者的皮肤上存在固有风险。鉴于受试者的这种风险，对既昂贵又适时的这些类型测试有严格的要求。
一旦目标部位准备好用于样本收集，研究人员就可以通过例如在皮肤上摩擦拭子，使用粘合剂提起皮肤样本，或者将圆筒置于皮肤区域上并利用特殊流体和机械搅拌来获取皮肤样本。虽然收集程序不像上述一些那样侵入，但是目标材料被捕获在收集工具中或者被捕获在收集过程中使用且通常需要在分析之前去除的液体中。这是通过使用提取程序来完成的。提取可以利用冲洗液、提取缓冲液等来实现。需要在可以执行分析之前将材料与收集工具或液体分离需要另外的时间。由于不完全或低效的提取方法，也可以存在目标材料的部分损失。
然后可能需要在分析目标材料之间将目标材料与提取材料分离，从而要求甚至更多时间。向样本添加液体和在提取和/或分离过程中一些材料的损失可以产生关于分析灵敏度的限制。此外，目标材料已经由提取方法而从其天然皮肤环境移出。在没有完整的天然皮肤防御组分的情况下，还不清楚这些因素如何/是否有助于结果。在研究人员研究抗微生物功效的情况下尤其如此。
本发明人已经发现，用粘合剂获取的皮肤样本可以直接在粘合剂上利用。例如，这意味着可以在获取皮肤样本之前在条上对处于条上的皮肤样本进行接种，从而无需直接在专门小组成员的皮肤上进行接种。另外，在至少一些测试方法中，可以使用处于条上的样本而无需从粘合剂移出材料或无需在测试之前去除粘合剂上的任何背衬材料。因此，可以将处于粘合剂上的皮肤样本置于例如测试设备中或甚至切成碎片并置于测试设备中。
为了显示处于粘合剂上的皮肤样本可以用于与传统的直接专门小组成员接种和提取方法类似的效果，比较了传统后遗功效测试临床(“传统RET方法”)的结果与对处于粘合剂上的皮肤样本进行接种的新方法(“NET方法”)的结果。着眼于在条皂底盘(条皂)和液体洗手皂底盘(LHS)的抗微生物效果下后遗功效测试，这两者都不含传统的抗微生物活性物质。
对于传统RET方法，随机研究、安慰剂对照研究和双盲研究后接利用后遗功效方案。使专门小组成员经历7-14天的洗脱期，在该洗脱期中要求他们避免使用具有抗细菌功效的任何产品，直到试验完成为止。在洗脱期之后，每个专门小组成员访问指定部位，其中前臂以一小时间隔用目标产品清洗3次。在清洗期间，在保持在95℃至100℃处的流动自来水下润湿前臂腹面和目标产品。以从腕部到肘部的上下运动来摩擦条皂15秒。对于液体洗手皂，将0.7mL的洗手皂置于手臂腹面上，并且均匀地铺展15秒。然后使用相同的运动将泡沫在前臂上摩擦另外45秒。然后将手臂冲洗15秒，并用纸巾轻轻拍干。
在第三天清洗的第三次清洗之后，在前臂上标记用于病菌接种的一个区域。该区域接种有105至106个菌落形成单位(CFU)的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC 27217)并用闭塞室贴片闭塞。闭塞后约5小时，将贴片去除，并且使用杯擦洗技术收获细菌。然后，立即使用75％乙醇和抗生素对每个测试区域进行消毒，并且在2至3天后重新检查。
对于收获的杯擦洗方法，抵靠皮肤的目标区域(这里是皮肤被接种的部分，除非它是对照区域)放置刚性圆筒。用足够的压力将圆筒压靠在皮肤上以形成不透液密封。将回收液体置于圆筒内与皮肤接触。然后用适当的工具(如玻璃棒或橡胶棒)擦洗皮肤。然后将液体从圆筒中去除，并且进行适当操作以用于所需测试。例如，将收获的细菌稀释、铺板并温育约48小时，然后计数(CFU)。用于一口擦洗程序的美国标准测试方法是ASTM E1874-14。示例性后遗功效测试方法的详细描述被包括于Billhimer、Berge、Englehart、Rains和Keswick,“A modified cup scrub method for assessing the antibacterialsubstantivity of personal cleansing products,”J.Cosmet.Sci.,52,369-375(2001)中。
从图1中可以看出，传统RET结果显示出条皂底盘没有对抗金黄色葡萄球菌的可测量后遗功效，而液体洗手皂底盘显示出对抗金黄色葡萄球菌的显著先天性防御特性。
利用直接在粘合剂上对皮肤样本进行接种的新NET方法来测试相同的底盘。对于NET方法，在如上文针对传统RET所述的清洗和冲洗方案之后，用粘合剂获取皮肤样本。然后，也如上文针对传统RET所述，用金黄色葡萄球菌对处于粘合条上的皮肤样本进行接种。将粘合剂置于胰蛋白酶大豆琼脂平板上，其中皮肤样本侧向上。然后，针对细菌和/或真菌随时间的生长，对经接种的样本进行复查。这利用光学检测方法(
Figure BDA0003859579540000051
系统)来完成。然后将结果绘制在图上，该图显示了与基线(处理之前)和处理后4小时样本的差异。如在图2中可以看出，新方法显示出与图1的传统方法相同的趋势。下面在皮肤样本测试章节中描述了关于NET方法的另外细节。
新方法更快且更便宜，这至少部分地归因于消除了直接在皮肤上接种细菌和/或真菌的需要。如果需要的话，它还允许在粘合剂上使用样本而无需提取。此外，对处于粘合剂上的皮肤样本进行接种的能力也存在安全优势。先前，细菌和/或真菌样本被直接置于专门小组成员的皮肤上。通过去除向专门小组成员的皮肤施加细菌和/或真菌的需要而去除了必须这样做的任何风险。它还允许对更宽范围的细菌和/或真菌进行测试，因为这些材料中的一些材料不能直接置于皮肤上。此外，它允许专门小组成员在用粘合剂取下皮肤样本之后离开，先前他们需要停留另外5小时以完成接种期和收集期。这种变化可能会更容易募集专门小组成员，并且可能需要给专门小组成员的薪酬更少，因为需要他们的时间少得多。
直接在粘合剂上对样本进行接种的能力也有助于测试的稳健性。通常，从一个手臂测试部位获取仅3个样本，这至少部分地归因于接种和闭塞覆盖范围需要充分空间的样本。直接在粘合剂上对皮肤样本进行接种允许从取样部位获取更多的样本。这增加了测试的稳健性。从部位获取更多样本的能力也允许更高的通量，并且因此更快的产品测试循环。
另外的优点来自直接在粘合剂上测试样本的能力。如上所述，用于从粘合剂中提取皮肤样本或至少目标材料的程序存在许多缺点。当包括皮肤样本的整个粘合剂用于测试时，消除或至少最小化这些缺点。
此外，在仍处于粘合剂上时对皮肤样本进行测试显示出皮肤样本处于更天然状态。例如，粘合带条上的皮肤角质细胞保持与所取样的皮肤表面相同的pH(参见图3)。因此，可以在将产品施加于皮肤之后使用粘合剂取样方法(如胶带条)，以确定产品的施加是否影响所处理的皮肤区域的pH。这允许确定产品是否影响皮肤的pH，并且因此影响皮肤的天然防御。
除了能够从pH角度了解影响之外，据信在粘合剂上提起的皮肤样本也具有皮肤天然防御系统的至少一些组分的代表性样本。这允许在更天然的皮肤环境中评估任何产品施加。例如，当尝试了解产品是否影响皮肤保护自身的天然能力或产品是否对皮肤具有抗微生物效果时，这可能是重要的。测试还可以用于了解一个人与另一个人的天然皮肤防御的差异。一旦获取皮肤样本并用细菌和/或真菌接种，就可以测量细菌和/或真菌的生长速率。这将给出研究人员了解皮肤排斥所选细菌和/或真菌侵入的天然能力。
进一步探讨，研究人员可以将产品施加于相同的皮肤区域，用粘合剂获取皮肤样本，用相同细菌和/或真菌对样本进行接种，并且测量细菌和/或真菌的生长。然后可以将此结果与原始皮肤样本的结果进行比较，以确定产品对皮肤的天然防御的影响。也可以在不同时间点比较结果以了解随时间和随不同次数施加的影响。另外，此结果可以用于确定所测试的产品是否向皮肤提供任何抗微生物和/或抗真菌有益效果，该任何抗微生物和/或抗真菌有益效果超出皮肤的天然防御组分供应的任何抗微生物和/或抗真菌有益效果。此过程还可以用于比较来自多种产品相对彼此的影响，以及将一种或多种产品与未处理的皮肤区域进行比较。
粘合剂
如上所述，可以用粘合剂来获取皮肤样本。粘合剂可以是例如条、贴片、圆盘状物(disc)或测试所需的任何其它形状的形式。粘合剂可以具有背衬。粘合剂也可以是双面的以允许例如具有皮肤样本的粘合剂卡在另一表面上以进行测试。例如，粘合剂的不含皮肤样本的一侧可以粘附于载玻片。此类粘合剂或胶带材料可以包括但不限于粘合带诸如
Figure BDA0003859579540000061
Figure BDA0003859579540000062
(CuDerm Corporation,Dallas,Tex.)、
Figure BDA0003859579540000063
Figure BDA0003859579540000064
(
Figure BDA0003859579540000065
Company,St.Paul,Minn.)、patchProtectTM皮肤贴片、水凝胶诸如
Figure BDA0003859579540000066
(Hymedix International,Inc.,Dayton,N.J.)、和具有粘合特性或适当粘性的其它类型材料诸如胶水、树胶和树脂、以及它们的组合。
将粘合剂置于目标皮肤表面上。这可以是例如前臂、胫部、前额和/或背部，但也可以是可以取样的任何期望的皮肤表面。将粘合剂在适当位置保持足够的时间量，以允许附接于目标皮肤表面。这可以是例如5秒、7秒、10秒、20秒、25秒、30秒等。这可以按特定测试所需来调整。另外，可以在处于皮肤上时向粘合剂施加压力，以允许更好和/或更均匀的粘附。这可以例如通过在与皮肤接触时利用辊将粘合剂压到皮肤上等在粘合剂上向下推动来完成。
一旦已经过足够的时间量，就将粘合剂从皮肤上剥离。这可以例如用手指、镊子、钳子等完成。可以例如从一个边缘开始并且轻轻地拉回粘合剂并远离皮肤表面来剥离粘合剂。
皮肤样本测试
一旦粘合剂已从皮肤取下，其就含有皮肤样本。可以将处于粘合剂上的皮肤样本置于另一表面上，例如载玻片或琼脂平板。根据测试仪的期望，可以面向上或面向下施加粘合剂的具有皮肤样本的部分。例如，可以将在双面的粘合剂上获取的皮肤样本粘附于载玻片，使得含有皮肤样本的部分面向上，并且可以在显微镜下观察载玻片。在另一示例中，将粘合剂置于胰蛋白酶大豆琼脂平板上，其中皮肤样本侧向上。另外，可以通过吸收光谱(如
Figure BDA0003859579540000071
Scan 850A)来定量皮肤样本。
然后可以测试皮肤样本。例如，可以获取皮肤样本的pH。这可以例如由置于皮肤上的pH平坦表面电极来完成。
也可以在样本处于粘合剂上时处理样本。这可以包括例如用细菌、真菌或它们的组合对皮肤样本进行接种。可以基于感兴趣的抗微生物和/或抗真菌特性的类型来选择用于接种的材料。这些材料可以包括例如：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、白色念珠菌(Candida albicans)、糠秕马拉色菌(Malasseziafurfur)或它们的组合。
可以通过将所需材料置于粘合剂的含有皮肤样本的一侧上来处理样本。例如，可以通过将金黄色葡萄球菌的等分试样置于皮肤样本上来对粘合剂进行接种。然后可以进一步处理或评估经接种的粘合剂。在接种的情况下，可以利用接种环将经接种的样本铺展在条上，使其风干，置于加湿器中等，直到收集数据的时间为止。
针对细菌和/或真菌随时间的生长，可以对经接种的样本进行复查。这可以例如利用光学检测方法(如
Figure BDA0003859579540000081
系统)来完成。在这种类型的系统中，将含有皮肤样本的粘合剂置于液体肉汤中。由于微生物生长并代谢营养物质，故光学测定监测pH和正在发生的其它生化反应。随着微生物生长，所用试剂改变其光谱图案。该变化可以由仪器以预先确定的时间间隔光学地、光度测定地检测。
对于每个样本，将由仪器记录检测时间(DT)。DT与粘合剂上携带的细菌的数量和/或代谢健康成反比。更长的DT指示强抗菌效果，而更短的DT表明弱或无抗菌效果。人们可将具有已知负载(CFU)的病菌加载到粘合剂上以生成与DT的相关性曲线。然后，可以通过标准曲线来计算测试胶带上的病菌负载(CFU)。此外，也可以计算病菌功效比较，如LOG减少和病菌抑制率(％)。
还可以利用等温微量热法来评估经接种的样本。这是一种用于查看生物过程的实时数据的方法。对于等温微量热法，用所需材料对含有皮肤样本的粘合剂进行接种。然后将经接种的粘合剂置于安瓿中。例如，用卷曲机密封安瓿，并且可以擦拭安瓿以去除安瓿外部的任何潜在污染物。然后将安瓿置于可以保持在恒定的预先确定的温度处的设备中，适当选择以用于被测试的材料。对于微生物测试，用于选择温度的原理可以利用将产生目标微生物的最快生长速率的温度。可以将温度设定在例如约15℃至约150℃的范围内。设定温度可以为例如32℃、35℃或37℃。该设备能够相对于实耗时间测量和记录流入或流出试样安瓿的净热流率(μJ/sec＝μW)，以及消耗或产生的累积热量(J)。根据该信息，可以确定样本内的微生物生长参数。此测量方法可以允许在粘合剂上存在的共生微生物和外源微生物的定量方面提高灵敏度。
产品测试
处于粘合剂上的皮肤样本可以用于产品测试。处于粘合剂上的皮肤样本可以如上所述获取。样本可以用于在任何产品施加之前确定皮肤的健康和/或皮肤微生态。这可以利用上文测试方法或用于确定此类特性的其它已知测试方法来完成。这些特性可以用作产品测试中的对照。另外，可以相对于特定属性，将多种产品针对彼此进行测试和/或与对照进行比较。
当测试产品时，可以首先使用于测试的皮肤的目标区域经历洗脱期。这是给予一个或多个受试者特定清洁剂以在开始研究之前在皮肤上使用规定时间量的情况。通常利用洗脱，使得每个受试者的皮肤在进行产品测试之前已经历相同处理，并且因此，可以排除其它产品的效果(如有助于结果)。洗脱期还可以包括非清洗期，从而意味着可以要求受试者在一定时间段内不清洁皮肤。而且，在洗脱期中，可能要求受试者不在皮肤上使用针对测试所提供的产品之外的任何产品。洗脱期通常为至少1天，并且可以持续至多10天。
一旦完成任何所要求的洗脱期，就可以从目标区域获取基线皮肤样本。在获取任何期望的基线样本之后，个体将使用目标产品开始。产品可以是洗去型产品，如例如，条皂、液体洗手皂、面部清洁剂、沐浴液等。产品还可以是免洗型产品，如例如手部消毒液、面部保湿霜、润肤露等。对于洗去型产品，方案可以包括例如水温度、水硬度、流速、待清洗的皮肤目标区域、产品样品的处理、如何将样品施加于皮肤、如何用样品清洗皮肤、使用多少产品、用产品清洗多久、使用产品后冲洗多久、是否/如何在冲洗后弄干经处理的手臂、重复该过程多少次、施加后等待多久才能获取皮肤样本、或它们的不同组合。一旦该过程完成，就可以利用如上所述的粘合剂来获取皮肤样本。然后可以对此样本进行(或不进行)处理并且也如上所述用于确定目标属性。
对于免洗型产品，方案可以包括例如其上施加产品的皮肤目标区域、产品样品的处理、如何将样品施加于皮肤、使用多少产品、向皮肤施加产品多久、重复该过程多少次、施加后等待多久才能获取皮肤样本、或它们的不同组合。一旦该过程完成，就可以利用如上所述的粘合剂来获取皮肤样本。然后可以对此样本进行(或不进行)处理并且也如上所述用于确定目标属性。
组合
这里是本发明范围内的一些示例性组合。
A)一种用于测试皮肤样本的方法，包括：i)从目标区域获得皮肤细胞的样本，其中所述皮肤细胞是利用施加并取下粘合剂而获得的；ii)将细菌负载、真菌负载、病毒负载或它们的组合施加于处于所述粘合剂上的样本；以及iii)测量所述样本的细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合。
B)根据段落A所述的方法，其中所述粘合剂包括胶带条、贴片或圆盘状物。
C)根据段落A或B中任一段所述的方法，其中在所述样本处于所述粘合剂上时测量所述细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合。
D)根据段落A至D中任一段所述的方法，其中经由光学检测系统来测量所述细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合。
E)根据段落D所述的方法，其中将所述样本置于含有液体生长培养基的容器中，以在所述细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合的所述光学检测期间使用。
F)根据段落A至D中任一段所述的方法，其中从所述目标区域获取多个样本。
G)根据段落A至F中任一段所述的方法，其中所述细菌负载包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或它们的组合；优选地金黄色葡萄球菌。
H)根据段落A至G中任一段所述的方法，其中所述真菌负载包括白色念珠菌(Candida albicans)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)或它们的组合。
I)根据段落A至H中任一段所述的方法，其中所述病毒负载包括1型脊髓灰质炎病毒、5型腺病毒、流感病毒或它们的组合；优选地1型脊髓灰质炎病毒。
J)根据段落A至I中任一段所述的方法，其中所述细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合用于确定所述皮肤样本的抗细菌、抗病毒、和/或抗真菌特性。
K)根据段落A至I中任一段所述的方法，其中在获得所述皮肤样本之前准备所述目标区域。
L)根据段落K所述的方法，其中通过利用皮肤清洁剂清洗所述目标区域并且冲洗所述目标区域一次或多次一天，优选地3次一天，来准备所述皮肤。
M)根据段落L所述的方法，其中所述准备还包括在每个清洁和冲洗组合之后弄干所述目标区域。
N)根据段落L或M中任一段所述的方法，其中在每个清洁和冲洗循环之间存在一小时的时段。
O)经接种的处于粘合剂上的皮肤样本的用途，所述经接种的处于粘合剂上的皮肤样本用于测量所述皮肤样本的抗微生物特性、抗真菌特性、抗病毒特性或它们的组合，其中所述粘合剂优选地是胶带条。
P)根据段落O所述的用途，其中在所述皮肤样本处于所述粘合剂上时进行所述测量。
Q)一种用于测试护肤品的方法，包括：将护肤品施加于目标区域；任选地，从所述目标区域冲洗下所述护肤品；从所述目标区域获得皮肤细胞的样本，其中所述皮肤细胞是利用施加并取下粘合剂而获得的；将细菌负载、真菌负载、病毒负载或它们的组合施加于处于所述粘合剂上的样本；以及测量所述样本的细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合。
R)根据段落Q所述的方法，其中所述粘合剂包括胶带条、贴片或圆盘状物。
S)根据段落Q或R中任一段所述的方法，其中在所述样本处于所述粘合剂上时测量所述细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合。
T)根据段落Q至S中任一段所述的方法，其中在所述预先确定的时间量内测量所述细菌水平、真菌水平或它们的组合。
U)根据段落Q至T中任一段所述的方法，其中经由光学检测系统来测量所述细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合。
V)根据段落U所述的方法，其中将所述样本置于含有液体生长培养基的容器中，以在所述细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合的所述光学检测期间使用。
W)根据段落Q至V中任一段所述的方法，其中所述细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合用于确定所述护肤品的抗细菌、抗病毒、和/或抗真菌特性。
X)根据段落Q至X中任一段所述的方法，其中所述细菌水平、真菌水平或它们的组合用于确定所述护肤品相对于第二护肤品的功效。
Y)根据段落Q至X中任一段所述的方法，其中从所述目标区域获取多个样本。
Z)根据段落Q至Y中任一段所述的方法，其中所述细菌负载包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或它们的组合；优选地金黄色葡萄球菌。
AA)根据段落Q至Z中任一段所述的方法，其中所述真菌负载包括白色念珠菌(Candida albicans)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)或它们的组合。
BB)根据段落Q至AA中任一段所述的方法，其中所述病毒负载包括1型脊髓灰质炎病毒、5型腺病毒、流感病毒或它们的组合；优选地1型脊髓灰质炎病毒。
CC)根据段落Q至BB中任一段所述的方法，其中在获得所述皮肤样本之前准备所述目标区域。
DD)根据段落Q至CC中任一段所述的方法，其中所述护肤品包括皂、沐浴液、洗手液、面部清洁剂或私处洗液，并且所述护肤品被施加于所述皮肤并且被从所述皮肤冲洗下一次或多次一天，优选地3次一天。
EE)根据段落DD所述的方法，其中在每个清洁和冲洗组合之后弄干所述目标部位。
FF)根据段落DD或EE中任一段所述的方法，其中在每个清洁和冲洗循环之间存在一小时的时段。
GG)根据段落Q至CC中任一段所述的方法，其中所述护肤品是免洗型护肤品。
HH)根据段落GG所述的方法，其中所述免洗型护肤品是手部消毒液或保湿霜。
II)一种用于比较两种护肤品的方法，包括：i)将一种护肤品施加于目标区域；ii)任选地，从所述目标区域冲洗下所述护肤品；iii)从所述目标区域获得皮肤细胞的第一样本，其中所述皮肤细胞是利用施加并取下粘合剂而获得的；iv)在所述第一样本处于所述粘合剂上时将细菌负载、真菌负载、病毒负载或它们的组合施加于所述第一样本；v)测量所述第一样本的细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合；vi)将第二护肤品施加于第二目标区域；vii)任选地，从所述第二目标区域冲洗下所述第二护肤品；viii)从所述第二目标区域获得皮肤细胞的第二样本，其中所述皮肤细胞是利用施加并取下粘合剂而获得的；ix)在所述第二样本处于所述粘合剂上时将细菌负载、真菌负载、病毒负载或它们的组合施加于所述第二样本；x)测量所述第二样本的细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合；以及xi)将所述第一样本的细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合与所述第二样本的细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合进行比较，以确定所述第一产品相对于所述第二产品的功效。
实施例
1)用于测量产品的后遗抗微生物功效的示例性方法
此方案提供了一种非侵入式方法，该方法用于评估洗去型产品(例如液体洗手皂、沐浴液产品、条皂等)对抗指定细菌和真菌的后遗抗微生物功效。该方法包括体内下进行的产品施加、经由胶带剥离而进行皮肤角质层取样、针对处于胶带条上的皮肤样本的病菌挑战测试、以及经由
Figure BDA0003859579540000131
检测时间(DT)的病菌负载定量。
所述测试生物体的选择基于结果的预期用途，例如，用于通告权利要求支持。可以测试的细菌的两个示例包括金黄色葡萄球菌(
Figure BDA0003859579540000132
Figure BDA0003859579540000133
27127)和大肠杆菌(
Figure BDA0003859579540000134
10536)。理想地，菌株处于5代内并且具有在细菌和测试的意义上的频率下的常规鉴定。
准备所述测试生物体以用于研究。对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，如果需要的话，通过在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)平板上划线并生长18-24小时来更新所述测试生物体。在第二天，在含有30ml胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)的50ml管中接种1个菌落的生物体并使该生物体在35±2℃下生长18小时±15分钟。测试的一天，以1:10或其它浓度将以上细菌培养物稀释到新TSB(例如将0.5ml培养物稀释到4.5ml TSB培养基)。也可以用营养物质受限的培养基或缓冲液(例如1:100稀释的TSB、营养物质缓冲液和/或甘油)来准备所述测试生物体。所述测试生物体培养物可在半小时内用于对所有测试样本的胶带条进行接种。
针对测试选择目标人口统计数据，例如，健康的中国个体年龄20-60，这包括20-40与40-60之间的同龄分布在内。可以指示受试者具有洗脱期。例如，洗脱期可以在第1-5天用所规定的皂清洗，在第6天仅用城市水清洗，并且避免在第7天淋浴。
在洗脱期之后，可以在任何产品施加之前在目标部位上获取基线皮肤样本。然后，指示受试者如何执行以下步骤或者经过训练的专业人员可以对个体进行步骤。利用温度为35℃+/-2℃且水流速为4.0L/min+/-0.3L/min的自来水在流动水下将前臂腹面润湿。如果利用固体皂(如条皂)，则在流动水下将皂短暂地润湿。然后，使用从腕部到肘部的上下运动来将条皂在前臂上摩擦15秒。对于液体产品，在前臂上添加0.7ml，并且均匀地铺展15秒。如有必要，放下条皂，使用从腕部到肘部的相同上下运动来继续在前臂上摩擦泡沫，持续另外45秒。通过将手臂保持在流动水下，将前臂冲洗15秒。请勿在冲洗过程中摩擦手臂。将手臂从流动水中移出。用纸巾将手臂轻轻拍干而无摩擦。部位现在准备好用于用粘合剂进行皮肤取样。在另选方案中，可以重复以上步骤，使得在取样之前将区域清洗多次。
一旦目标部位(这里是手臂)准备好用于取样，就可以在第三天清洗的第三次清洗之后，将粘合带条粘附于感兴趣的皮肤部位，避免折叠。可以提前标记感兴趣的皮肤部位以便一致性。为了保持均匀的压力并达到最佳粘合剂粘结，可以使用辊将胶带压到皮肤表面上(每个部位上两次)。然后，将胶带从皮肤上剥离并置于TSA琼脂平板的表面上，其中皮肤样本侧向上。也可以在置于TSA琼脂平板上之前对胶带条进行接种。
A)准备并用光学检测方法(例如，
Figure BDA0003859579540000141
)进行测试
将10μl测试微生物培养物接种在每个胶带条的皮肤样本侧上。例如，用无菌接种环或移液管头均匀地铺展在胶带表面上。对于每个胶带条使用一个接种环或移液管头，并在使用后丢弃接种环或移液管头。允许接种物在胶带条的表面上视觉地干燥(大约～3-5分钟)。
经接种的测试条可随后被准备用于取样测量，这取决于要测量的内容。例如，如果经接种的测试条将通过光学分析以检测微生物生长和/或pH，则将位于TSA琼脂平板上的经接种的胶带条置于35℃和60％±20％相对湿度下的加湿培养箱中，直到收集时间为止。
在每个取样时间，将每个胶带无菌地转移到一个NF-TVC(非发酵总活菌计数)小瓶中，以用于连续监测24小时以确定检测时间(DT)。Soleris参数可以被设定为：温度34℃；阈值：10；Shuteye：25；Skip 1。
B)接种并使用等温微量热法进行测试
制备胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)/
Figure BDA0003859579540000151
80(聚氧乙烯化脱水山梨糖醇酯)溶液。添加
Figure BDA0003859579540000152
80以产生0.1％溶液。如果仅感兴趣共生物(已经存在于皮肤上的细菌)，则将向条并施加接种并使用例如接种环小心地铺展以覆盖条。可以使用各种体积，例如10至50μl。
如果需要使用金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌作为对条进行测试的一部分，则应存在第一稀释以产生正确强度溶液。将原液金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌按1:9稀释到TSB中，第一稀释产生了107cfu的溶液。然后如上将该溶液铺展到条上。然后将条置于TSA琼脂平板上，其中皮肤样本侧向上。将表面上具有条的TSA琼脂平板在层流柜中弄干，通常在30分钟与2小时之间，这取决于施加于每个条的溶液量。
一旦弄干条，就可以进行测试。将来自TSA板的琼脂切割成小立方体，并且将这些小立方体中的2或3块置于将容纳条的安瓿的底部。琼脂用作安瓿内的水分来源，因为在没有水分的情况下，细菌可能不生长。然后将条放入到安瓿中。如果使用完整的条，则可以使用镊子将其小心地推入到安瓿中，条的末端形状通常是漏斗形状的。如果使用条的薄部分，则可以使用镊子将其掉落到安瓿的颈部中。用卷曲机密封安瓿，并且用纸巾擦拭安瓿以去除外部表面上的任何潜在水分或油。将经卷曲的安瓿加载到等温微量热法机器(IMC)中。
等温微量热法机器被设定成产生目标生物体的最快生长速率的温度，例如37℃。在将安瓿置于IMC之前进行基线读数。在记录数据之前，IMC执行平衡阶段。在运行结束时记录基线。收集数据。可以绘制安瓿的热流并将其用于确定细菌生长。运行可能需要1天以上。
2)对洗去型产品进行测试
招募了一组受试者进行研究。这里使用的研究方法与上文针对实施例1所列的方法(包括实施例1(A)中列出的
Figure BDA0003859579540000161
检测)相同。在第三天清洗的第三次清洗之后立即用粘合剂获取测试样本，并且在获取初始样本后4小时后再次获取样本。对于4小时样本，要求专门小组成员保持所测试的手臂部分不与任何事物接触。如图4中可以看出，NET方法成功地用于了解不同沐浴液产品对取样部分的皮肤的天然防御能力的影响。这里，沐浴液D显示出非常强的金黄色葡萄球菌的皮肤天然防御，其中皮肤的天然防御的基线表示为BL。
本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
除非明确排除或以其它方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。对任何文献的引用不是对其作为与本发明的任何所公开或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其自身或与任何一个或多个参考文献的组合提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。
虽然已举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出各种其他变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有此类变化和修改。

Claims (15)

1.一种用于测试皮肤样本的方法，包括：
a.从目标区域获得皮肤细胞的样本，其中所述皮肤细胞是利用施加并取下粘合剂而获得的；
b.将细菌负载、真菌负载、病毒负载或它们的组合施加于处于所述粘合剂上的样本；以及
c.测量所述样本的细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述粘合剂包括胶带条、贴片或圆盘状物。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中在所述样本处于所述粘合剂上时测量所述细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中经由光学检测系统来测量所述细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中将所述样本置于含有液体生长培养基的容器中，以在所述细菌水平、真菌水平、病毒水平或它们的组合的所述光学检测期间使用。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中从所述目标区域获取多个样本。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细菌负载包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或它们的组合；优选地金黄色葡萄球菌。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述真菌负载包括白色念珠菌(Candida albicans)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)或它们的组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述病毒负载包括1型脊髓灰质炎病毒、5型腺病毒、流感病毒或它们的组合；优选地1型脊髓灰质炎病毒。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在获得所述皮肤样本之前准备所述目标区域。
11.根据权利要求10所述的方法，其中通过利用皮肤清洁剂清洗所述目标区域并且冲洗所述目标区域一次或多次一天，优选地3次一天，来准备所述皮肤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述准备还包括在每个清洁和冲洗组合之后弄干所述目标区域。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的方法，其中在每个清洁和冲洗循环之间存在一小时的时段。
14.经接种的处于粘合剂上的皮肤样本的用途，所述经接种的处于粘合剂上的皮肤样本用于测量所述皮肤样本的抗微生物特性、抗真菌特性、抗病毒特性或它们的组合，其中所述粘合剂优选地是胶带条。
15.根据权利要求14所述的用途，其中在所述皮肤样本处于所述粘合剂上时进行所述测量。
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