CN110806408A - 一种检测头皮马拉色菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测头皮马拉色菌的方法，属于微生物检测技术领域，所述方法包括以下步骤：1)在头皮定点处用透明胶带粘取头皮屑样本，将粘有头皮屑样本的透明胶带粘贴在镂空载片上；2)采用KOH龙胆紫溶液对头皮屑样本进行染色，清洗残留染液，镜检。本发明的方法能够直观的反映皮损的自然状态，判断单位面积的相对菌量。本发明将粘取皮屑样本的透明胶带粘贴在镂空载片上，便于染色和镜检，并且胶带透明度高、表面平整、镜检折光率好，便于镜检时移动观察及相关视野的查找。本发明能有效、简便、快捷的检测出头皮马拉色菌。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种检测头皮马拉色菌的方法。
背景技术
马拉色菌为嗜脂性担子菌纲酵母菌，该菌属于人类及温血动物皮肤上的常驻菌。马拉色菌包括糠秕马拉色菌(M.furfur)、厚皮马拉色菌(M.pachydermatis)、合轴马拉色菌(M.sympodialis)、球形马拉色菌(M.globosa)、钝型马拉色菌(M.obtuse)、限制性马拉色菌(M.restricta)和斯洛菲马拉色菌(M.slooffiae)等。目前，对马拉色菌的生物学特性，致病因素，以及相关疾病与治疗研究越来越广泛深入。
日常生活中，困扰我们的头皮屑，与马拉色菌是密切相关的。而在马拉色菌种属当中，糠秕马拉色菌成为了头皮马拉色菌中的优势菌群。有研究表明，用抗头皮屑制剂治疗头皮屑，头皮屑数量减少的同时，糠秕马拉色菌的数量也减少了。这样一个现象推测糠秕马拉色菌与头皮屑的发病有关。在46％的正常人，74％的头皮屑过多者，83％的脂溢性皮炎患者中均能检测到糠秕马拉色菌。还有一组数据，脂溢性皮炎患者中，糠秕马拉色菌数量为900000个/cm2，占全部微生物总数的74％；非脂溢性皮炎中，糠秕马拉色菌数量为500000个/cm2，占全部微生物总数的46％；前者差不多是后者数量的2倍，表明糠秕马拉色菌与头皮屑有关。
在马拉色菌样品采集上，目前采用的方法包括钝手术刀刮取法、擦洗法、牙刷刷取法和挤压法；上述方法中较为简便的是牙刷刷取法，但是这一方法会改变标本中菌与皮肤细胞的相对位置，不能直观的反映皮损的自然状态，无法判断单位面积的相对菌量。在样品染色上，目前采用的方法包括KOH法、DMSO-KOH法、乳酸酚棉蓝染色、革兰氏染色法和派克墨水染色，但是上述方法适用于临床医学或是基础科学研究，不适用于日常生活中快速、简便染色。在样品镜检上，目前通常是将样品置于普通镜检玻璃载片上进行染色和镜检，但是玻璃载片易碎且样品不能固定，不便于染色和镜检。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测头皮马拉色菌的方法，该方法能够检测单位面积头皮马拉色菌的相对菌量，且检测方法更加简便。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测头皮马拉色菌的方法，包括以下步骤：
1)在头皮定点处用透明胶带粘取头皮屑样本，将粘有头皮屑样本的透明胶带粘贴在镂空载片上；
2)采用KOH龙胆紫溶液对头皮屑样本进行浸泡染色，清洗残留染液，镜检。
优选的，步骤1)中所述头皮定点选自前额发际线、头顶、脑后颈部发际线、左耳际正上方2cm和右耳际正上方2cm中的一处或几处。
优选的，步骤1)中所述头皮定点的采样面积为2～2.5cm2。
优选的，步骤1)中所述透明胶带包括透明聚酯薄膜胶带。
优选的，步骤1)中所述透明胶带的长度和宽度独立为1.5cm。
优选的，步骤1)中所述镂空载片的长度为7～8cm，宽度为2.2～2.8cm；所述镂空载片的镂空部分的长度和宽度独立为1.5cm。
优选的，步骤2)中所述KOH龙胆紫溶液中KOH的质量浓度为10％。
优选的，步骤2)中所述染色的时间为25～35s。
优选的，步骤2)中所述染色的方式是将KOH龙胆紫溶液覆盖头皮屑样本进行染色。
本发明的有益效果：本发明提供了一种检测头皮马拉色菌的方法。本发明采用透明胶带粘取头皮屑样本，对取材皮肤状态及类型无要求，不损伤皮肤，无畏惧感，可多处反复取材，对鳞屑少或不宜刮取鳞屑者特别适用，解决了儿童及不合作者的取材难题，该方法操作简便、受试者可自行取样，本方法由于未改变标本中菌与皮肤细胞的相对位置，能够直观的反映皮损的自然状态，判断单位面积的相对菌量；本发明采用龙胆紫作为染色剂，该染色剂对马拉色菌菌体及孢子染色较深，为深紫色，形态清晰；龙胆紫溶液价格低、易于采购，操作简便。本发明在镜检观察时为了方便定位，将粘取皮屑样本的透明胶带粘贴在镂空载片上，便于染色和镜检，并且胶带透明度高、表面平整、镜检折光率好，便于镜检时移动观察及相关视野的查找。本发明能有效、简便、快捷的检测出头皮马拉色菌。
附图说明
图1为透明聚酯薄膜胶带Corneofix拍照图；
图2为镂空载片拍照图；
图3为实施例1中糠秕马拉色菌的10％KOH龙胆紫染色，40X镜检图；
图4为实施例1中糠秕马拉色菌的10％KOH龙胆紫染色，100X镜检图；
图5为实施例1中糠秕马拉色菌的10％KOH派克蓝黑墨水染色，40X镜检图；
图6为实施例1中糠秕马拉色菌的10％KOH派克蓝黑墨水染色，100X镜检图；
图7为实施例2中受试者头皮马拉色菌的10％KOH龙胆紫染色剂染色镜检结果；
图8为实施例2中受试者头皮马拉色菌的10％KOH派克蓝黑墨水染色剂染色镜检结果；
图9为实施例3中干性头皮洗头后3h头皮马拉色菌镜检，40X；
图10为实施例3中干性头皮洗头后24h头皮马拉色菌镜检，40X；
图11为实施例3中干性头皮洗头后48h头皮马拉色菌镜检，40X；
图12为实施例3中干性头皮洗头后72h头皮马拉色菌镜检，40X；
图13为实施例3中干性头皮洗头后96h头皮马拉色菌镜检，40X；
图14为实施例3中干性头皮洗头后130h头皮马拉色菌镜检，40X；
图15为实施例3中油性头皮受试者3h头皮马拉色菌检测，40X；
图16为实施例3中油性头皮受试者24h头皮马拉色菌检测，40X；
图17为实施例3中油性头皮受试者48h头皮马拉色菌检测，40X；
图18为实施例3中健康头皮受试者24h头皮马拉色菌检测，40X；
图19为实施例3中健康头皮受试者48h头皮马拉色菌检测，40X；
图20为实施例3中健康头皮受试者72h头皮马拉色菌检测，40X；
图21为实施例3中三种头皮类型的马拉色菌的数量对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测头皮马拉色菌的方法，包括以下步骤：
1)在头皮定点处用透明胶带粘取头皮屑样本，将粘有头皮屑样本的透明胶带粘贴在镂空载片上；
2)采用KOH龙胆紫溶液对头皮屑样本进行浸泡染色，清洗残留染液，镜检。
本发明首先在头皮定点处用透明胶带粘取头皮屑样本，将粘有头皮屑样本的透明胶带粘贴在镂空载片上；所述头皮定点优选的选自前额发际线、头顶、脑后颈部发际线(正中线)、左耳际正上方2cm和右耳际正上方2cm中的一处或几处；本发明将整个头皮头发分为5个区域，每个区域选择具有代表性的点进行取样并取平均值，可以有效的表示整个头皮头发中马拉色菌数量的平均分布情况，进而用来指征头皮头发的状态。
本发明具体实施过程中，5个采样点分别采样，采样时胶带紧贴头皮，贴1min后取下；所述头皮定点的采样面积优选为2～2.5cm2，更优选为2.25cm2；头皮定点的采样面积选择2.25cm2正好与胶带的尺寸相符，而载片镂空部分的尺寸正好稍小于胶带尺寸，可以有效的保证整个镂空部分的染色都有马拉色菌的分布；所述透明胶带优选的包括透明聚酯薄膜胶带，更优选为透明聚酯薄膜胶带Corneofix，如图1所示；透明聚酯薄膜胶带在均衡的按压下不易变形，透明度高，染色时染色剂不易附着，便于镜检，取样前，胶带和镂空载片的分开的，这样便于头皮屑样的采集；所述透明胶带的长度和宽度独立优选为1.5cm；所述镂空载片的长度优选为7～8cm，更优选为7.6cm，宽度优选为2.2～2.8cm，更优选为2.5cm；所述镂空载片的镂空部分优选的靠近镂空载片短边的一侧，这种设置便于粘贴透明胶带，同时便于采样者手持载片，便于样本记号贴标；所述镂空载片的镂空部分的长度和宽度独立优选为1.5cm。
本发明具体实施过程中，所述镂空载片优选的购自于珠海伊斯佳股份有限公司，结构如图2所示；所述镂空载片的作用是粘有头皮屑样本的透明胶带能够直接黏贴到载片上进行染色及镜检，起到很好的固定支撑作用，且便于染色和观察。
将粘有头皮屑样本的透明胶带粘贴在镂空载片上后，本发明采用KOH龙胆紫溶液对头皮屑样本进行染色，清洗残留染液，镜检。
本发明中，所述KOH龙胆紫溶液中KOH的质量浓度优选为10％；所述染色的时间优选为25～35s，更优选为30s；染色的方式优选的是将KOH龙胆紫溶液覆盖头皮屑样本进行染色；所述龙胆紫溶液的用量优选为2～4滴，更优选为3滴，以能够充分覆盖样本表面为准；所述清洗的方式优选为用水冲洗；所述清洗残留染液后，优选的还包括对待检样本进行干燥；所述干燥的方式优选的包括风干和烘干；所述镜检优选的包括40X高倍镜镜检和油镜镜检；所述镜检优选的采用以下步骤进行：在镂空载片的透明胶带样本上滴加2滴香柏油，从低倍镜向高倍镜转换，进行镜检；40X下镜检即可清楚看到马拉色菌。
镜检后，本发明优选的还包括统计单个视野内的马拉色菌孢子数，根据所述马拉色菌孢子数评估头皮屑状态；所述单个视野内的马拉色菌孢子数优选为选择5个视野进行马拉色菌孢子计数后计算得到的平均值；所述评估的标准为：0～6个孢子，评分为0，头皮屑状态为阴性；7～14个孢子，评分为1，头皮屑状态为较少；15～29个孢子，评分为2，头皮屑状态为中等；30～49个孢子，评分为3，头皮屑状态为大量；大于等于50个孢子，评分为4，头皮屑状态为密集。得出评估结果后，所述评估结果能够用于去屑洗发水的去屑功能评价和/或头皮去屑药物的功能评价。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1标准菌株糠秕马拉色菌染色比较
1.器材
仪器：徕卡显微镜；
耗材：镂空载玻片、透明聚酯薄膜胶带Corneofix、吸管；
试剂：10％KOH龙胆紫染色剂、10％KOH派克墨水染色剂、香柏油、超纯水。
2.样品
标准菌株糠秕马拉色菌(该菌株购于ATCC，糠秕马拉色菌是马拉色菌属的一个模式种；可以用它来作为马拉色菌的特征性计数菌株。
3.步骤
1)标准菌株糠秕马拉色菌在进行染色计数时，用无菌的接种环挑取一环小菌落，并将其涂布在透明胶带上；
2)染色：在样本镂空载片上，用一次性滴管滴加3滴10％KOH龙胆紫染色剂或3滴10％KOH派克墨水染色剂覆盖样本表面；染色30s。
3)水洗：染色完成后，用流水冲洗干净镂空载片上的胶带样本(不能看到残留的染液痕迹为宜)；自然风干或是烘箱烘干。
4)镜检：用一次性滴管在镂空载片胶带样本上滴加2滴香柏油，从低倍镜向高倍镜转换，进行镜检。高倍镜镜检为40X和100X。
采用10％KOH龙胆紫染色剂、10％KOH派克墨水染色剂分别对标准菌株糠秕马拉色菌进行染色，检测结果详见图3至图6，其中图3为中糠秕马拉色菌的10％KOH龙胆紫染色，40X镜检图；图4为糠秕马拉色菌的10％KOH龙胆紫染色，100X镜检图；图5为糠秕马拉色菌的10％KOH派克蓝黑墨水染色，40X镜检图；图6为糠秕马拉色菌的10％KOH派克蓝黑墨水染色，100X镜检图。
由图3～图6可知，10％KOH龙胆紫染色剂染色马拉色菌着色清晰，与背景角质细胞能很好的区分；龙胆紫染色后因在油镜下观察，放大倍数高，外环深蓝色、内环深红色的马拉色菌双核孢子在深蓝色皮屑的背景下特别明显，形态及出芽现象非常清晰，不会被角质层细胞等杂质干扰。10％KOH派克墨水染色剂染色，马拉色菌及背景角质细胞着色浅，油镜下很难找到视野，不便于观察；使用派克墨水滴入标本直接湿片镜检，染液对角质细胞着色较深，不能观察到明显的马拉色菌孢子，与背景区分不明显，在马拉色菌较少的情况下，染色效果较差。
实施例2受试者样本染色比较
本发明中选择透明胶带粘取法进行头部皮屑样本采集，在马拉色菌染色上选择国际常用的派克墨水染色法，与本发明的龙胆紫染色法进行对比。具体方法如下：
1.器材
仪器：徕卡显微镜
耗材：镂空载玻片、透明聚酯薄膜胶带Corneofix、吸管
试剂：10％KOH龙胆紫染色剂、10％KOH派克墨水染色剂、香柏油、超纯水
2.头皮屑采样
方法：透明胶带粘取法；
采样部位：头部定点定位为前额发际线、头顶、脑后颈部发际线、左右耳际正上方2cm，采样面积为2.25cm2；5个采样点分别采样，采样时胶带紧贴头皮，贴1min后快速取下。
受试者：头皮易出油，有头皮屑者。
3.步骤
1)皮屑获取：在头皮定点处用透明聚酯薄膜胶带Corneofix粘取头皮屑，以获得对应定点处的马拉色菌；将胶带粘贴在镂空载片上，备用染色。
2)染色：在透明聚酯薄膜胶带Corneofix粘取的样本镂空载片上，用一次性滴管滴加3滴10％KOH龙胆紫染色剂或3滴10％KOH派克墨水染色剂覆盖样本表面；染色30s。
3)水洗：染色完成后，用流水冲洗干净镂空载片上的胶带样本(不能看到残留的染液痕迹为宜)；自然风干或是烘箱烘干。
4)镜检：用一次性滴管在镂空载片胶带样本上滴加2滴香柏油，从低倍镜向高倍镜转换，进行镜检。高倍镜为100X，能清楚看到马拉色菌；镜检结果详见图7和图8，其中图7为受试者头皮马拉色菌的10％KOH龙胆紫染色剂染色镜检结果；图8为受试者头皮马拉色菌的10％KOH派克蓝黑墨水染色剂染色镜检结果。
由图7和图8可以看出，在视野中，圆球状的为球形马拉色菌，与头皮瘙痒敏感相关；米粒状的为限制新马拉色菌，与头皮屑形成相关。另外，龙胆紫染色后因在油镜下观察，可清晰观察到外环深蓝色、内环深红色的马拉色菌双核孢子在深蓝色皮屑的背景下特别明显，形态及出芽现象非常清晰，不会被角质层细胞等杂质干扰。胶带粘取能够进行很好的定位及头皮状态复制，镜检时胶面的折光率以及清晰度也较为理想，所镜检清晰度较好。在用派克墨水进行染色时，皮屑中的马拉色菌未能很好的着色，且与背景色较难分开，因此派克墨水不适合在胶带粘取中的染色。
实施例3不同头皮类型受试者跟踪检测
选择3位不同头皮类型受试者进行跟踪，采样点分别设定在洗头后，干性头皮时间点为3h、24h、48h、72h、96h、130h；油性头皮时间点为3h、24h、48h；健康头皮时间点为24h、48h、72h；采样完成后，按以上染色步骤进行染色及镜检，对马拉色菌进行孢子计数，作出马拉色菌在头皮定植的生长曲线；从而判定受试者头皮类型、给予何种护理方式及产品使用。
具体实施方法如下：
1.器材
仪器：徕卡显微镜；
耗材：镂空载玻片、透明聚酯薄膜胶带Corneofix、吸管；
试剂：10％KOH龙胆紫染色剂、香柏油、超纯水。
2.头皮屑采样
方法：透明胶带粘取法；
采样部位：头部定点定位为前额发际线、头顶、脑后颈部发际线、左右耳际正上方2cm，采样面积为2.25cm2；5个采样点分别采样，采样时胶带紧贴头皮，贴1min后快速取下。
3.步骤
1)皮屑获取：在头皮定点处用透明聚酯薄膜胶带Corneofix粘取头皮屑，以获得对应定点处的马拉色菌；将胶带粘贴在镂空载片上，备用染色。
2)染色：在透明聚酯薄膜胶带Corneofix粘取的样本镂空载片上，用一次性滴管滴加3滴10％KOH龙胆紫染色剂覆盖样本表面；染色30s。
3)水洗：染色完成后，用流水冲洗干净镂空载片上的胶带样本(不能看到残留的染液痕迹为宜)；自然风干或是烘箱烘干。
4)镜检：用一次性滴管在镂空载片胶带样本上滴加2滴香柏油，从低倍镜向高倍镜转换，进行油镜镜检。高倍镜为40X。
镜检结果参见图9～图20；其中图9为干性头皮洗头后3h头皮马拉色菌镜检，40X；图10为干性头皮洗头后24h头皮马拉色菌镜检，40X；图11为干性头皮洗头后48h头皮马拉色菌镜检，40X；图12为干性头皮洗头后72h头皮马拉色菌镜检，40X；图13为干性头皮洗头后96h头皮马拉色菌镜检，40X；图14为干性头皮洗头后130h头皮马拉色菌镜检，40X；图15为油性头皮受试者3h头皮马拉色菌检测，40X；图16为油性头皮受试者24h头皮马拉色菌检测，40X；图17为油性头皮受试者48h头皮马拉色菌检测，40X；图18为健康头皮受试者24h头皮马拉色菌检测，40X；图19为健康头皮受试者48h头皮马拉色菌检测，40X；图20为健康头皮受试者72h头皮马拉色菌检测，40X。
由图9～图14可知，干性头皮测试者在72h前，头皮马拉色菌以球形马拉色菌为优势菌，72h后限制性马拉色菌逐渐增长，表明了该受试者前期有头皮瘙痒敏感状态，后期伴随着皮屑的发生。该检测结果与受试者感受一致。
由图15～图17可知，油性头皮受试者马拉色菌以球形马拉色菌为主，因头皮油分较多，马拉色菌数量基数较高。
由图18～图20可知，健康头皮马拉色菌定植数量相对较少，球形马拉色菌和限制性马拉色菌都有定植，但数量基数较小；受试者未出现头皮瘙痒及皮屑状态；检测结果与受试者感知一致。
5)计数：马拉色菌计数。对3位不同头皮类型受试者的头皮样本分别选取5个视野进行马拉色菌孢子计数，并取相应平均数；三种头皮类型的马拉色菌的数量进行比对，结果参见图21。
由图21可知，每种头皮类型受试者马拉色菌定植数量及增长曲线各有特点，从马拉色菌基数来看，油性头皮类型马拉色菌基数最高，48h时数量往上走；干性头皮类型，马拉色菌基数较低，96h后趋于平衡；健康头皮类型，马拉色菌基数最小，整个过程数量涨幅不大；表明了油性头皮的最佳护理时间应该在24～48h之间；干性头皮护理时间可以稍微延后到48h之后；健康头皮可以在根据个人护理习惯来确定时间，48h左右为宜。
6)不同头皮类型的护理
①干性头皮每48h清洁一次，清洁过程中进行抗菌和抗氧化护理；
②油性头皮每24h清洁一次，清洁过程中进行抗炎和抗氧化护理；
③健康头皮每48h清洁一次，清洁过程中进行抗氧化护理；
护理产品中抗菌活性成分选自白头翁提取物和/或龙胆提取物；抗氧化活性成分选自掌叶大黄和/或去甲二氢愈创木酸；抗炎活性成分选自广藿香提取物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种检测头皮马拉色菌的方法，包括以下步骤：
1)在头皮定点处用透明胶带粘取头皮屑样本，将粘有头皮屑样本的透明胶带粘贴在镂空载片上；
2)采用KOH龙胆紫溶液对头皮屑样本进行浸泡染色，清洗残留染液，镜检。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述头皮定点选自前额发际线、头顶、脑后颈部发际线、左耳际正上方2cm和右耳际正上方2cm中的一处或几处。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述头皮定点的采样面积为2～2.5cm2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述透明胶带包括透明聚酯薄膜胶带。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述透明胶带的长度和宽度独立为1.5cm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述镂空载片的长度为7～8cm，宽度为2.2～2.8cm；所述镂空载片的镂空部分的长度和宽度独立为1.3～1.8cm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述KOH龙胆紫溶液中KOH的质量百分浓度为10％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述染色的时间为25～35s。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述染色的方式是将KOH龙胆紫溶液覆盖头皮屑样本进行染色。
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