CN115386518B - 一株以d-阿洛酮糖为碳源的鼠李糖乳杆菌菌株及其衍生产品和应用 - Google Patents
一株以d-阿洛酮糖为碳源的鼠李糖乳杆菌菌株及其衍生产品和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株以D‑阿洛酮糖为碳源的鼠李糖乳杆菌菌株及其衍生产品和应用，属于功能菌株技术领域。本发明从植物表面分离得到一株能以鼠李糖乳杆菌菌株217‑189，保藏编号为CGMCC No.24308。菌株217‑189和D‑阿洛酮糖为唯一碳源的D‑阿洛酮糖联合使用较单独使用能有效降低糖尿病模型体重、降低空腹血糖浓度以及血糖耐量，说明菌株217‑189和D‑阿洛酮糖具有协同预防和/或治疗糖尿病的作用。
Description
技术领域
本发明属于功能菌株技术领域，具体涉及一株以D-阿洛酮糖为碳源的鼠李糖乳杆菌菌株及其衍生产品和应用。
背景技术
D-阿洛酮糖是一种白色结晶、无臭、吸湿性低、在水中溶解度高、熔点为96℃的单糖，其分子式为C6H12O6，分子量为180。D-阿洛酮糖的甜度约为蔗糖甜度的70％，热量值为0.2Kcal/g，比蔗糖减少了95％。美国食品和药物管理局(food and drug administration，FDA)将D-阿洛酮糖确认为安全食品(Generallyregarded as safe，GRAS)，可以广泛应用在食品、药物制剂和膳食补充剂中。
D-阿洛酮糖也有多种活性和功能，如D-阿洛酮糖因不会提高糖尿病患者的血糖水平，是一种独特的脂肪和葡萄糖代谢调节剂；D-阿洛酮糖可以通过促进脂肪分解来抑制脂质积累，减轻Ⅱ型糖尿病模型小鼠的各种代谢紊乱，包括血脂异常、高血糖和炎症；D-阿洛酮糖能通过增加清道夫受体B类型(scavengerreceptor class B type，SR-B)表达来增强肝脏对高密度脂蛋白胆固醇(highdensity liptein cholesterol，HDL-C)的摄取，使HDL-C水平相应降低，防止动脉粥样硬化的发展，如D-阿洛酮糖可与益生菌混合组成合成元，合生元在通过调节脂质代谢抑制饮食诱导的肥胖(diet-induced obsisity，DIO)及其并发症方面比单独使用益生菌(清酒乳杆菌LS03、明串珠菌GJ2)或单独使用阿洛酮糖效果更佳。
益生菌具有抵抗病原菌、抗炎、增强肠道屏障功能以及调节肠道菌群等作用。鼠李糖乳杆菌是目前最常见并被广泛应用的模式益生菌，不同鼠李糖乳杆菌菌株被报道在胃肠道感染和腹泻、抗生素和艰难梭菌相关性腹泻、肠易激综合征、炎症性肠病、呼吸道感染、过敏、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、囊性纤维化、癌症等方面发挥有益作用。鼠李糖乳杆菌在以葡萄糖、乳糖和蔗糖作为主要碳源时生长良好，然而，以上3种糖都不能发挥益生功能。这大大限制了合生元在肥胖或糖尿病等人群的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株以D-阿洛酮糖为碳源的鼠李糖乳杆菌菌株，为糖尿病患者提供了新型的益生菌。
本发明提供了一株以D-阿洛酮糖为碳源的鼠李糖乳杆菌菌株217-189，保藏编号为CGMCC No.24308。
本发明提供了一种所述鼠李糖乳杆菌菌株217-189的培养方法，包括以下步骤：
将鼠李糖乳杆菌菌株217-189接种于以D-阿洛酮糖或葡萄糖为唯一碳源，pH值为4.9的MRS培养基上，在25～42℃下培养。
本发明提供了一种益生菌菌剂，包括所述鼠李糖乳杆菌菌株217-189和辅料。
本发明提供了一种适合糖尿病人群的益生组合物，包括所述鼠李糖乳杆菌菌株217-189和D-阿洛酮糖。
优选的，鼠李糖乳杆菌菌株217-189的活菌数和D-阿洛酮糖的质量比为(1～10)×109CFU：200mg。
本发明提供了所述益生菌菌剂或所述益生组合物在制备预防和/或治疗糖尿病的药物中的应用。
优选的，所述药物具有降低体重、降低空腹血糖含量和降低葡萄糖耐量的作用。
本发明提供了所述益生菌菌剂或所述益生组合物在制备预防和/或治疗肥胖症的药物中的应用。
本发明提供了一株以D-阿洛酮糖为碳源的鼠李糖乳杆菌菌株217-189，保藏编号为CGMCC No.24308。所述鼠李糖乳杆菌菌株217-189能够在以D-阿洛酮糖为唯一碳源的培养基上正常生长，为葡萄糖敏感的人群提供一种新型的益生菌种类。
本发明提供了一种适合糖尿病人群的益生组合物，包括所述鼠李糖乳杆菌菌株217-189和D-阿洛酮糖。本发明以糖尿病小鼠模型为对象，分别给药鼠李糖乳杆菌菌株217-189和/或D-阿洛酮糖，与模型组相比，均能显著降低小鼠体重，显著降低空腹血糖值，同时还能快速降低餐后血糖值，并且鼠李糖乳杆菌菌株217-189和D-阿洛酮糖组合方案优于单独给药效果。这表明D-阿洛酮糖和鼠李糖乳杆菌在糖尿病或对葡萄糖敏感的相关疾病具有协同治疗功能，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为鼠李糖乳杆菌CGMCC No.24308在D-阿洛酮糖为唯一碳源的MRS培养基生长曲线；
图2为不同分组对小鼠口服葡萄糖耐量的影响；
图3为鼠李糖乳杆菌(编号为217-1)在D-阿洛酮糖为唯一碳源的MRS培养基生长曲线。
生物材料保藏信息
鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)菌株217-189，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年01月14日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.24308。
具体实施方式
本发明提供了一株以D-阿洛酮糖为碳源的鼠李糖乳杆菌菌株217-189，保藏编号为CGMCC No.24308。
在本发明中，菌株217-189分离自植物表面。形态特性为革兰氏阳性、无芽孢、过氧化氢酶阴性、兼性厌氧、不具备运动能力；菌落为白色凸起菌落，表面粗糙，直径较小(0.5μm～2.0μm)显微镜下细胞呈杆状。经过16S rDNA鉴定，所述鼠李糖乳杆菌菌株217-189的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示，与鼠李糖乳杆菌的序列相似性最高，达到99.59％。综合形态学和分子鉴定结果，菌株217-189属于鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)。
在本发明中，所述菌株217-189具备在以D-阿洛酮糖为唯一碳源培养基上生长的能力，并且所述菌株217-189在以D-阿洛酮糖为唯一碳源培养基上生长趋势与葡萄糖相似。
本发明提供了一种所述鼠李糖乳杆菌菌株217-189的培养方法，包括以下步骤：
将鼠李糖乳杆菌菌株217-189接种于以D-阿洛酮糖或葡萄糖为唯一碳源，pH值为4.9的MRS培养基上，在25～42℃下培养。
在本发明中，D-阿洛酮糖或葡萄糖为唯一碳源的MRS培养基优选为10g蛋白陈、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g碳源、1ml吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、15g琼脂粉、1000ml蒸馏水。配制方法：将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH值4.9、在121℃高压灭菌15～20min。所述接种的接种量优选为1％～5％。所述培养的温度优选为30～38℃，更优选为37℃。所述培养的时间优选为10～14h，更优选为12h。
本发明提供了一种益生菌菌剂，包括所述鼠李糖乳杆菌菌株217-189和辅料。
在本发明中，所述益生菌菌剂的剂型优选为水剂或粉剂。根据剂型种类的不同，选择合适的辅料。所述菌剂中鼠李糖乳杆菌菌株217-189的活菌数优选为(1～10)×109CFU/mg或(1～10)×109CFU/ml。本发明对所述益生菌菌剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的益生菌菌剂的制备方法即可。所述益生菌菌剂可有效防治胃肠道感染和腹泻、抗生素和艰难梭菌相关性腹泻、肠易激综合征、炎症性肠病、呼吸道感染、过敏、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、囊性纤维化、癌症等疾病。
本发明提供了一种适合糖尿病人群的益生组合物，包括所述鼠李糖乳杆菌菌株217-189和D-阿洛酮糖。
在本发明中，鼠李糖乳杆菌菌株217-189的活菌数和D-阿洛酮糖的质量比优选为(1～10)×109CFU：200mg，更优选为5×109CFU：200mg。
本发明提供了所述益生菌菌剂或所述益生组合物在制备预防和/或治疗糖尿病的药物中的应用。
本发明实施例结果证实，所述药物优选具有降低空腹血糖含量和降低葡萄糖耐量的作用。
鉴于所述益生菌菌剂具有降低体重的作用，本发明提供了所述益生菌菌剂或所述益生组合物在制备预防和/或治疗肥胖症的药物中的应用。
下面结合实施组对本发明提供的一株以D-阿洛酮糖为碳源的鼠李糖乳杆菌菌株及其衍生产品和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施组1
一株鼠李糖乳杆菌菌株217-189的培养方法，包括以下步骤：
1)以MRS为基础培养基，设置成三种条件的培养基：a.不添加任何碳源的MRS培养基，记为阴性对照培养基；b.添加0.5％D-阿洛酮糖为唯一碳源的MRS培养基，记为实验培养基；添加0.5％葡萄糖为唯一碳源的MRS培养基记为阳性对照培养基；
2)培养过程
将鼠李糖乳杆菌菌株217-189按照5％的接种量接种至上述三种培养基中，每种培养基设置3个重复，在37℃下培养55h，每隔5h测定一定菌液的OD值，绘制生长曲线。
结果见图1。由图1可知，不添加任何碳源的MRS培养基使鼠李糖乳杆菌菌株217-189无法正常生长。而鼠李糖乳杆菌菌株217-189在以葡萄糖为唯一碳源的MRS培养基中快速生长，在12h时菌体数量达到最高，继续培养菌体数量开始呈下降趋势。鼠李糖乳杆菌菌株217-189在D-阿洛酮糖为唯一碳源的MRS培养基上能够正常生长，并且生长趋势与以葡萄糖为唯一碳源的MRS培养基组相似，在培养12h时菌体密度达到最高为5.5，但菌体数量与以葡萄糖为唯一碳源的MRS培养基组相比略有下降。
实施组2
鼠李糖乳杆菌菌株217-189和/或D-阿洛酮糖对糖尿病小鼠模型的影响
建立由链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型：小鼠选择雄性C57BL/KsJ-db/db(4周龄，n＝36)，适应性饲养1周后，正常组继续食用标准饮食，糖尿病组喂养高糖高脂饮食。3周后，所有小鼠禁食12h，糖尿病组腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(100mg/kg·BW)，正常组(NC)注射等体积生理盐水。1周后，通过血糖仪测量空腹血糖(FBG)，FBG≥11.1mmol/L的小鼠被视为建模成功。
选取建模成功小鼠54只，随机分为9组，每组6只，分别为正常组、模型组、阳性对照组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4、实验组5和实验组6。各给药组于造模完成后分别灌胃给药30天，模型组和正常组灌胃给予等量生理盐水。
正常组(NC)：0.2ml生理盐水；
模型组(Mod)：0.2ml生理盐水；
阳性对照组(Met)：0.2ml，200mg/kg/d二甲双胍；
实验组1(比较组1)(DP)：0.2ml，200mg/kg/d D-阿洛酮糖；
实验组2(比较组2)：0.2mL，109CFU/ml/d鼠李糖乳杆菌悬液；
实验组3(比较组3)：0.2mL，109CFU/ml/d不能代谢利用D-阿洛酮糖的鼠李糖乳杆菌(编号为217-1)悬液；
实验组4(实施组1DP+LR-L)：0.1ml D-阿洛酮糖+0.1ml鼠李糖乳杆菌细胞悬液；
实验组5(实施组2DP+LR-M)：0.2ml D-阿洛酮糖+0.2ml鼠李糖乳杆菌细胞悬液；
实验组6(实施组3+LR-H)：0.4ml D-阿洛酮糖+0.4ml鼠李糖乳杆菌细胞悬液。
从第10周小鼠造模成功开始，治疗期间每周称量小鼠体质量，小鼠体重变化如表1所示：
表1不同分组对小鼠体重的影响
由表1可知，与正常对照组相比，高脂饲料结合STZ诱导的使得小鼠体重明显升高。治疗期间，正常对照组小鼠的体重持续上升，其余各组小鼠的体重均逐渐下降。到第14周，与模型组相比，阳性对照组、比较组1和实施组组1、组2和组3小鼠的体重均明显降低，其中实施组3下降最为明显，结果表明实施组3，即阿洛酮糖和鼠李糖乳杆菌细胞悬液混合使用对小鼠体重的降低作用优于单独使用阿洛酮糖。
用葡萄糖分析仪(Asan Pharm Co.，Seoul，Korea)测量小鼠空腹血糖水平。在第10周至14周实验周期内，每周固定时间取血测量并记录一次每组小鼠血糖值。小鼠血糖值变化如表2所示：
表2不同分组对小鼠空腹血糖的影响
如表2所示，成功造成2型糖尿病模型后(第10周)小空腹血糖值明显升高。治疗期间，各给药组小空腹血糖值均呈降趋势。鼠李糖乳杆菌组小空腹血糖值在第12、13、14周显著下降，第14周时空腹血糖值降到8.82mmol/L。实施组2组在第11～12周空腹血糖值下降趋势并不明显，第13周下降趋势明显，到第14周实施组2组小鼠空腹血糖值降至7.05mmol/L，与模型组相比有显著差异。以上结果表明，实施组2组对2型糖尿病小鼠高血糖症有治疗作用，且效果优于单独使用比较组2。
口服葡萄糖耐量(OGTT)的测定在实验期结束时进行，将各组小鼠提前禁食12h，可自由饮水。然后灌胃2.0g/kg的标准葡萄糖溶液，分别给药后的0、30、60、120min时进行小鼠尾静脉取血，使用血糖仪检测四个时间段的血糖值。
结果如图2所示。各组小鼠血糖值在灌胃葡萄糖后30min达到峰值，比较组2组小鼠餐后血糖值在30～60min下降较缓慢，在60～90min时快速下降，120min时降至8.05mmol/L。实施组3小鼠在30～60min血糖值迅速降低，到120min时恢复到7.3mmol/L，与模型组18.1相比有显著差异(P＜0.05)。
实施例3
对实施例1筛选的鼠李糖乳杆菌菌株217-189以及对照鼠李糖乳杆菌菌株217-1进行抑制α-葡萄糖苷酶活性的测定[1]，测定方法如下：
首先将25μL20mmol/L 4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(p-nitrophenyl-D-galactopyranoside，PNPG)和25μL样品加入96孔板中，于37℃孵育10min，再加入50μL0.2U/mL的α-葡萄糖苷酶，37℃反应20min，最后加入100μL 0.1mol/L Na2CO3溶液终止反应，使用酶标仪于波长405 nm处检测反应溶液的吸光度(A)，以阿卡波糖为阳性对照，用公式I计算抑制率。
抑制率(％)＝[1-(C-D)/(A-B)] 公式I
其中A是含有α-葡萄糖苷酶不含样品的吸光度，B是不含α-葡萄糖苷酶和样品的吸光度，C是含有α-葡萄糖苷酶和样品的吸光度，D是含有样品但不含α-葡萄糖苷酶的吸光度。
测定结果表明，所述菌株217-1对α-葡萄糖苷酶的抑制率仅为1.15％，而217-189对α-葡萄糖苷酶的抑制率为6.53％，更接近阳性对照阿卡波糖的15.98％，同时菌株217-189的DPPH自由基清除率为93.76％。
[1]王家彬.高效α-葡萄糖苷酶抑制能力益生菌的筛选及其胞外多糖的结构与功能研究[D].华南理工大学,2021.
对比例1
对照鼠李糖乳杆菌菌株217-1在不同碳源的MRS培养基上的生长曲线
1)以MRS为基础培养基，设置成三种条件的培养基：a.不添加任何碳源的MRS培养基，记为阴性对照培养基；b.添加0.5％D-阿洛酮糖为唯一碳源的MRS培养基，记为实验培养基；添加0.5％葡萄糖为唯一碳源的MRS培养基记为阳性对照培养基；
2)培养过程
将鼠李糖乳杆菌菌株217-1按照5％的接种量接种至上述三种培养基中，每种培养基设置3个重复，在37℃下培养55h，每隔5h测定一定菌液的OD值，绘制生长曲线。
结果见图3，对照鼠李糖乳杆菌菌株217-1在添加0.5％葡萄糖为唯一碳源的MRS培养基上能正常生长，而在添加0.5％D-阿洛酮糖为唯一碳源的MRS培养基的生长情况同不添加任何碳源的MRS培养基上的生长情况一样，且无法生长。这说明鼠李糖乳杆菌菌株217-1无法利用D-阿洛酮糖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一株以D-阿洛酮糖为碳源的鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosu)菌株217-189，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.24308。
2.一种权利要求1所述鼠李糖乳杆菌菌株217-189的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将鼠李糖乳杆菌菌株217-189接种于以D-阿洛酮糖或葡萄糖为唯一碳源，pH值为4.9的MRS培养基上，在25～42℃下培养。
3.一种益生菌菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述鼠李糖乳杆菌菌株217-189和辅料。
4.一种适合糖尿病人群的益生组合物，其特征在于，包括权利要求1所述鼠李糖乳杆菌菌株217-189和D-阿洛酮糖。
5.根据权利要求4所述益生组合物，其特征在于，鼠李糖乳杆菌菌株217-189的活菌数和D-阿洛酮糖的质量比为(1～10)×109CFU：200mg。
6.权利要求3所述益生菌菌剂或权利要求4或5所述益生组合物在制备预防和/或治疗糖尿病的药物中的应用。
7.权利要求3所述益生菌菌剂或权利要求4或5所述益生组合物在制备预防和/或治疗肥胖症的药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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