CN115380895B - 一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法 - Google Patents

一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115380895B
CN115380895B CN202210932076.2A CN202210932076A CN115380895B CN 115380895 B CN115380895 B CN 115380895B CN 202210932076 A CN202210932076 A CN 202210932076A CN 115380895 B CN115380895 B CN 115380895B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sperm
cryopreservation
solution
sperms
eleutheronema tetradactylum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210932076.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115380895A (zh
Inventor
彭诚
黄舜梅
张晋
汤胜亮
赖文杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhuhai Longsheng Fine Fish Fry Breeding Co ltd
Institute of Zoology of Guangdong Academy of Sciences
Original Assignee
Zhuhai Longsheng Fine Fish Fry Breeding Co ltd
Institute of Zoology of Guangdong Academy of Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhuhai Longsheng Fine Fish Fry Breeding Co ltd, Institute of Zoology of Guangdong Academy of Sciences filed Critical Zhuhai Longsheng Fine Fish Fry Breeding Co ltd
Priority to CN202210932076.2A priority Critical patent/CN115380895B/zh
Publication of CN115380895A publication Critical patent/CN115380895A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115380895B publication Critical patent/CN115380895B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明公开一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液，以精子稀释液作为基础组分，其特征是，采用Hank’s溶液标准液作为精子稀释液，并添加了营养物质、抗冻保护剂、抗氧化剂和小分子化合物添加剂；所述营养物质为蔗糖；所述抗冻保护剂为甲醇；所述抗氧化剂为牛血清白蛋白和维生素C；所述小分子化合物添加剂为氯喹。该冷冻保存溶液有效保证四指马鲅精子在冷冻保存后仍具有较高存活率、活力，并在人工受精时有较高受精率。本发明还公开一种利用所述冷冻保存溶液对四指马鲅精子冷冻保存的方法。

Description

一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法
技术领域
本发明属于鱼类精子冷冻保存技术领域，具体涉及一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法。
背景技术
四指马鲅(Eleutheronema rhadinum)属于辐鳍鱼纲鲈形目马鲅科，是一种暖水性中小型肉食性鱼类，喜欢栖息于近海、河口以及海床地带，主要分布于热带海域，如印度、印度尼西亚、新加坡、菲律宾、澳洲西部和北部等地，在我国渤海、黄海、东海、南海等地区也有分布。四指马鲅肉质鲜美，营养价值高，很受消费者欢迎，是我国重要的海水养殖名贵鱼类。
四指马鲅是雌雄同体雄性先熟鱼类，生活史中存在性反转现象，雄性个体随着体重和年龄的增加，会性反转为雌性。四指马鲅的人工繁育技术研究较晚，直到1994年，才由新加坡水族养殖控股公司首次实现人工繁殖。在我国，则直到2010年以后，才逐步开展四指马鲅人工繁殖技术和养殖技术的相关研究。目前，关于四指马鲅的生殖生理、遗传繁殖和人工育种等方面的研究还处于起步阶段，对于四指马鲅人工繁殖关键技术之一的精子冷冻保存的研究也几乎为空白。
对鱼类精子长期冷冻保存的研究和探索，不仅对进一步理解基本的生命进程具有重要意义，而且对于一些重要经济鱼类和濒临灭绝鱼类进行精子冷冻保存，还会起到保护渔业资源和培育优良品种的作用。目前，精子冷冻保存技术已初步应用于部分海水鱼类的精子冻存，如虹鳟、红鼓鱼和俄罗斯鲟鱼等。该技术中精子冷冻保存液是冷冻保存精子的关键。现有的精子冷冻保存液以精子稀释液作为基础组分，精子稀释液通常为平衡盐溶液，还另外加入抗冻剂(甘油、DMSO和甲醇等)和/或营养组分(脱脂奶粉、卵黄、蛋白质和糖类等)，来保护精子在温度剧烈变化过程中其内部结构的完整性和活力。
此外，现有技术对于四指马鲅精子的研究报道也很还少，而发明人研究发现，其精子主要由头部、中部和尾部组成，头部没有顶体结构，细胞质较少，大部分被细胞核占据，其形态结构与大多数鱼类精子相似，但生存环境、形成机制和成熟过程等，又与大多数鱼类有所差异，因此推测基于该原因，现有的鱼类精子保存液并不能很好的保存四指马鲅精子。所以针对性的开发四指马鲅精子冷冻保存液和保存方法，对于四指马鲅的人工繁殖和选择育种具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液，其有效保证四指马鲅精子在冷冻保存后仍具有较高存活率、活力，并在人工受精时有较高受精率。
本发明的目的之二是提供一种利用所述冷冻保存溶液对四指马鲅精子冷冻保存的方法。
为实现上述第一发明目的，本发明采用以下方案：
一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液，以精子稀释液作为基础组分，其特征是，采用Hank’s溶液标准液作为精子稀释液，并添加了营养物质、抗冻保护剂、抗氧化剂和小分子化合物添加剂；
所述营养物质为蔗糖；所述抗冻保护剂为甲醇；所述抗氧化剂为牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)和维生素C；所述小分子化合物添加剂为氯喹。
鱼类的精子冷冻保存包括精子的超低温冷冻处理和冻精解冻两个关键过程。发明人在研究现有的鱼类精子冷冻保存液对四指马鲅精子进行冷冻保存时，发现冷冻四指马鲅精子解冻复苏后，精子存活率不高，且精子活力低下。研究发现，在精子超低温冷冻保存前的降温平衡阶段，四指马鲅精子会因呼吸作用产生大量的活性氧，使精子膜遭受不可逆转的损伤，从而影响精子冷冻保存效果。因此，本发明在冷冻保存溶液中加入了抗氧化剂BSA和维生素C的抗氧化剂组合；而且，本发明创新地加入一种小分子化合物添加剂——氯喹。氯喹是一种有效的水解酶抑制剂，当氯喹在胞内溶酶体富集时，能有效抑制溶酶体的活力，起到稳定溶酶体膜和细胞膜的作用，对于四指马鲅精子的冷冻保存效果具有提升作用。进一步，发明人通过大量实验证实在精子冷冻保存液中添加合适浓度的氯喹，与BSA和维生素C组合，能够显著提高四指马鲅精子在冷冻保存后的存活率和活力。
在本发明优选实施例中，以精子稀释液为基准，各组分的添加量为：蔗糖22～28g/L，甲醇5～12％(wt％)，BSA 1～2％(wt％)，维生素C1～2μmol/L，氯喹1～3μmol/L。经过大量试验，发明人确定了四指马鲅精子冷冻保存中BSA和维生素C的最适宜浓度组合，能有效提高冷冻保存效果。
在本发明更优选实施例中，以精子稀释液为基准，各组分的添加量为：蔗糖24g/L，甲醇10％(wt％)，BSA 1.5％(wt％)，维生素C1μmol/L，氯喹1.5μmol/L。
为实现上述第二发明目的，本发明采用以下方案：
一种利用所述冷冻保存溶液对四指马鲅精子冷冻保存的方法，包括以下步骤：
(1)精液采集；
(2)配制所述的四指马鲅精子冷冻保存溶液；
(3)精子冻存：将四指马鲅精子冷冻保存溶液与精液在冻存管中以2:1的比例稀释，充分混合混匀；利用程序降温仪对冻存管进行降温处理，然后将其放入液氮中保存。
(4)精子复苏：将装有精子的冻存管从液氮中取出，于37℃水浴中迅速解冻并完全融化，将解冻后的精子置于4℃冰箱中保存；
(5)检测解冻后精子的存活率、活力、受精能力。
步骤(1)所述精液采集的方法为：在四指马鲅繁殖季节(3～5月)，选择健康的、性成熟的雄性亲鱼，用干净毛巾擦拭去除鱼体泄殖孔周围水分，轻轻按压腹部至泄殖孔流出乳白色精液，用1.5ml离心管收集精液。收集的精液用经精子稀释液10倍稀释后，经细胞计数和存活率检测，选择精子存活率在大于90％、精子浓度大于6×108个/mL的样本用于后续冷冻保存。
在步骤(2)中，利用程序降温仪采用三步降温法进行降温，程序为：(1)将冷冻精子放入仪器中，1分钟内快速降至4℃，并在4℃环境中平衡15分钟；(2)以2℃/分钟的速度，从4℃逐步降至-20℃；(3)以0.5℃/分钟的速度，从-20℃逐步降到-100℃；最后，将样品迅速放入液氮中保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用Hank’s溶液标准液作为精子稀释液，加入BSA和维生素C组合作为抗氧化剂，并创新地使用氯喹，使得四指马鲅精子可以长时间冷冻保存，并在解冻后维持高存活率，高活力和高受精能力。在本发明的最优实施例中，对四指马鲅精子进行6个月的冷冻保存后，其存活率达到93％，平均路径速度和直线运动速度分别达到74.9％和86.4％，受精率为63.9％，与新鲜精子的数据相当接近。
本发明的四指马鲅精子冷冻保存溶液可用于四指马鲅种质资源的保护以及大规模人工繁殖和生产，填补了四指马鲅精子冷冻保存技术的空白，本发明对四指马鲅种质资源保护和遗传改良具有重要意义。
具体实施方式
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
四指马鲅精子的冷冻保存溶液的制备方法为：
以Hank’s溶液标准液作为精子稀释液，然后以精子稀释液为基准，依次将营养物质、抗氧化剂、抗冻剂和小分子化合物添加剂按照质量浓度或者摩尔浓度加入到精子稀释液中，混匀，经0.22微米滤膜过滤便可得到无菌的四指马鲅精子冷冻保存溶液，可以长期保存于4℃储备。
其中，Hank’s溶液标准液：8.07g/L氯化钠、0.048g/L磷酸氢二钠、0.35g/L碳酸氢钠、0.060g/L磷酸二氢钾、0.40g/L氯化钾、0.19g/L二水氯化钙、0.10g/L六水氯化镁、1.00g/LD-葡萄糖和0.11g/L七水硫酸镁，pH 7.5。
根据以下步骤进行四指马鲅精子的冷冻保存及相关检测：
(1)按上述方法配置以下7种精子冷冻保存液：
对比例1：以Hank’s溶液标准液为基准，添加22g/L蔗糖，2％(wt％)BSA，8％(wt％)MeOH。
对比例2：以Hank’s溶液标准液为基准，添加22g/L蔗糖，2％(wt％)BSA，8％(wt％)MeOH，1μmol/L维生素C。
对比例3：以Hank’s溶液标准液为基准，添加22g/L蔗糖，2％(wt％)BSA，8％(wt％)MeOH，1μmol/L氯喹。
实施例1：以Hank’s溶液标准液为基准，添加22g/L蔗糖，1.5％(wt％)BSA，8％(wt％)MeOH，1.5μmol/L维生素C，1μmol/L氯喹。
实施例2：以Hank’s溶液标准液为基准，添加24g/L蔗糖，1.5wt％BSA，10％(wt％)MeOH，1μmol/L维生素C，1.5μmol/L氯喹。
实施例3：以Hank’s溶液标准液为基准，添加28g/L蔗糖，2wt％BSA，10％(wt％)MeOH，2μmol/L维生素C，1.5μmol/L氯喹。
实施例4：以Hank’s溶液标准液为基准，添加28g/L蔗糖，2wt％BSA，10％(wt％)MeOH，1μmol/L维生素C，3μmol/L氯喹。
(2)收集四指马鲅精子：
在四指马鲅繁殖季节，选择健康的、性成熟的雄性亲鱼，用干净毛巾擦拭鱼体泄殖孔周围的水分，轻轻按压腹部至泄殖孔流出乳白色精液，用1.5mL离心管收集精液10管。
(3)四指马鲅新鲜精子活力检测：
收集四指马鲅新鲜精液，用精子稀释溶液(Hank’s溶液标准液)分别将10组精液稀释10倍，经过细胞活力检测和细胞计数板计数，确认每组精液的精子存活率在94％以上和精子浓度在6×108个/mL以上，并检测精子的平均路径速度(VAP)和直线运动速度(VSL)。
(4)四指马鲅精子冷冻保存：
将上述对比例1和实施例1～3的四指马鲅精子冷冻保存溶液分别与精液在冻存管中以2:1的比例稀释，充分混合混匀；利用程序降温仪对精子进行降温处理，采用三步降温法，程序为：(1)将冷冻精子放入仪器中，1分钟内快速降至4℃，并在4℃环境中平衡15分钟；(2)以2℃/分钟的速度，从4℃逐步降至-20℃；(3)以0.5℃/分钟的速度，从-20℃逐步降到-100℃；最后，将样品迅速放入液氮中保存。
(5)四指马鲅精子解冻复苏：
在冻存6个月之后，将装有精子的冻存管从液氮中取出，然后立即于37℃水浴中迅速轻轻摇晃，30秒内解冻，解冻后立刻置于冰上(0～4℃)避光保存。
(6)四指马鲅精子存活率统计：
将解冻后的精液，用Hank’s溶液标准液稀释，用10微克/ml的碘化丙啶(PI)和10μg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，在荧光显微镜下观察，分别统计被PI着色发红色荧光的死亡精子和被DAPI着色发蓝色荧光的所有精子数量，从而计算活的精子比例，具体数据见表1。
表1复苏后精子的存活率(％)统计结果
(7)四指马鲅精子活力检测：
取解冻后的精液，用Hank’s溶液标准液稀释，用等体积25‰的灭菌海水将精子激活，利用计算机辅助精液分析(Computer-Aided Sperm Analysiss，CASA)的方法，通过检测平均路径速度(average path velocity，VAP)和直线运动速度(straight-line velocity，VSL)评估四指马鲅精子活力，具体结果见表2。
表2复苏后精子的平均路径速度(μm/s)和直线运动速度(μm/s)统计结果
(8)四指马鲅精子受精能力检测：
取解冻后的精液，用Hank’s溶液标准液稀释，各分成3组，并分别与1000颗成熟卵子充分混合均匀，利用25‰海水进行精子激活，完成授精过程，24小时后，统计存活受精卵的比例，具体结果见表3。
表3复苏后精子的受精率(％)统计结果
组别 新鲜精子 对比例1 对比例2 对比例3 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
1组受精率 70.3 45.3 47.6 49.6 56.4 62.4 59.1 50.3
2组受精率 71.6 50.1 48.9 51.3 54.7 63.5 58.7 51.5
3组受精率 68.4 49.6 51.7 50.9 55.2 65.9 60.1 52.2
均值 70.1 48.3 49.4 50.6 55.4 63.9 59.3 51.3
综上所述，相较于对比例，由于实施例1～4的四指马鲅精子冷冻保存溶液中同时添加了BSA、氯喹和维生素C，冻存后的精子存活率、精子活力和受精能力都显著提高。其中，当维生素C和氯喹添加浓度分别为1μmol/L和1.5μmol/L时，冷冻保存效果最佳。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液，以精子稀释液作为基础组分，其特征是，采用Hank’s溶液标准液作为精子稀释液，并添加了蔗糖、甲醇、牛血清白蛋白、维生素C和氯喹；
其中，以精子稀释液为基准，各组分的添加量为：蔗糖22~28g/L，甲醇5~12 wt %，牛血清白蛋白1~2 wt %，维生素C 1~2μmol/L，氯喹1~1.5μmol/L。
2. 根据权利要求1所述的四指马鲅精子的冷冻保存溶液，其特征是，以精子稀释液为基准，各组分的添加量为：蔗糖24g/L，甲醇10 wt %，牛血清白蛋白1.5 wt %，维生素C 1μmol/L，氯喹1.5μmol/L。
3.一种利用权利要求1或2所述冷冻保存溶液对四指马鲅精子冷冻保存的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）精液采集；
（2）配制所述的四指马鲅精子冷冻保存溶液；
（3）精子冻存：将四指马鲅精子冷冻保存溶液与精液在冻存管中以2:1的比例稀释，充分混合混匀；利用程序降温仪对冻存管采用三步降温法进行降温处理，程序为：①将冷冻精子放入仪器中，1分钟内快速降至4℃，并在4℃环境中平衡15分钟；②以2℃/分钟的速度，从4℃逐步降至-20℃；③以0.5℃/分钟的速度，从-20℃逐步降到-100℃；然后将冻存管迅速放入液氮中保存；
（4）精子复苏：将装有精子的冻存管从液氮中取出，于37℃水浴中迅速解冻并完全融化，将解冻后的精子置于4℃冰箱中保存；
（5）检测解冻后精子的存活率、活力、受精能力。
4.根据权利要求3所述的冷冻保存方法，其特征是，步骤（1）所述精液采集的方法为：在四指马鲅繁殖季节，选择健康的、性成熟的雄性亲鱼，用干净毛巾擦拭去除鱼体泄殖孔周围水分，轻轻按压腹部至泄殖孔流出乳白色精液，用离心管收集精液；收集的精液用经精子稀释液10倍稀释后，经细胞计数和存活率检测，选择精子存活率在大于90%、精子浓度大于6×108个/mL的样本用于后续冷冻保存。
CN202210932076.2A 2022-08-04 2022-08-04 一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法 Active CN115380895B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210932076.2A CN115380895B (zh) 2022-08-04 2022-08-04 一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210932076.2A CN115380895B (zh) 2022-08-04 2022-08-04 一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115380895A CN115380895A (zh) 2022-11-25
CN115380895B true CN115380895B (zh) 2023-10-17

Family

ID=84118444

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210932076.2A Active CN115380895B (zh) 2022-08-04 2022-08-04 一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115380895B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114258911A (zh) * 2022-03-01 2022-04-01 中山大学 一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015138637A1 (en) * 2014-03-11 2015-09-17 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Compositions and methods for modulating the effects of chemotherapeutic agents

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114258911A (zh) * 2022-03-01 2022-04-01 中山大学 一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN115380895A (zh) 2022-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Maria et al. Extenders and cryoprotectants for cooling and freezing of piracanjuba (Brycon orbignyanus) semen, an endangered Brazilian teleost fish
Harvey Cryopreservation of Sarotherodon mossambicus spermatozoa
DeGraaf et al. Cryogenic and refrigerated storage of Atlantic cod (Gadus morhua) and haddock (Melanogrammus aeglefinus) spermatozoa
Gwo et al. Semen cryopreservation of small abalone (Haliotis diversicolor supertexa)
郭金泉 et al. Cryopreservation of spermatozoa from rainbow trout, common carp, and marine puffer.
CN102726367A (zh) 猪精液的低温保护剂
CN112931491B (zh) 一种大泷六线鱼精子低温保存液
CN114258911B (zh) 一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法
CN104145944A (zh) 一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法
Daramola et al. Effects of coconut (Cocos nucifera) water with or without egg-yolk on viability of cryopreserved buck spermatozoa
KR101457526B1 (ko) 돼지 정액의 보존성 개선을 위한 희석액 조성물
Pan et al. Cryopreservation of black seabream (Acanthopagrus schlegelii) sperm
CN105145546B (zh) 一种蜜蜂雄蜂精液的保存液及其制备方法
CN115380895B (zh) 一种四指马鲅精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法
CN103262837B (zh) 一种家畜精液冷冻保护剂及其应用
CN112352777A (zh) 一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用
Stoss et al. Preservation of fish gametes
CN106818708A (zh) 棕点石斑鱼精子超低温冷冻保护剂及其保存方法
CN108552161A (zh) 一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液及其冷冻复苏方法和应用
KR20170122867A (ko) 전복 정액 냉동 보존을 이용한 전복 인공종묘 생산방법
Eriani et al. Effect of fetal bovine serum on the sperm quality of depik (Rasbora tawarensis) after short-term cryopreservation
CN115088707A (zh) 一种高体鰤精子稀释液及其制备方法与应用
Cejko et al. Application of sodium alginate solution for short-term storage of different volumes of sex-reversed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) testicular sperm
CN110036950B (zh) 一种海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法
CN100348096C (zh) 真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant