CN115372295A - 一种高效检测透明质酸组合物含量的方法 - Google Patents

一种高效检测透明质酸组合物含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效检测透明质酸组合物含量的方法，本发明首次提出高效分离并检测透明质酸组合物中的透明质酸及降解产物含量的方法，并科学筛选检测方法条件及检测参数，建立了一种特定的间接分析方法，为有效控制产品质量、保障产品有效性和安全性，实现产品质量可控提供了有力保障。

Description

一种高效检测透明质酸组合物含量的方法
技术领域
本发明属于分析技术领域，具体涉及一种高效检测透明质酸组合物含量的方法。
背景技术
透明质酸是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位糖胺聚糖。研究表明，透明质酸具有多种生物活性而成为应用最为广泛、市场前景广阔的医用高分子材料。透明质酸类化妆品无须准确检测其透明质酸含量。鉴于组合物中的透明质酸及其它组分的含量直接影响透明质酸组合物的生物活性及医用安全性，为了确保使用者的安全有效性，国家严格要求就有关含有透明质酸的3类医疗器械产品需准确检测其透明质酸含量。但透明质酸组合物的组成复杂且干扰物多，需要研究改进并优化分析方法及检测条件，开发专属性好的检测方法，以保障医用透明质酸及组合物的质量及安全有效性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种透明质酸组合物的检测方法，包括下述步骤：
（1）将待检测的透明质酸组合物置于透析袋中，加水，完成透明质酸组合物的透析后，取透析袋中的样品加水溶解，将其配制成浓度为1-200μg/mL的供试品溶液，其中，所述透明质酸组合物含有透明质酸与氨基酸、维生素、硫辛酸、胶原蛋白的任一种或其组合，透析袋的截留分子量为2000-500000道尔顿，任选不同截留分子量的透析袋进行至少1级截留，所述氨基酸选自谷胱甘肽、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、半胱氨酸中的任一种或其组合，所述维生素选自维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12、维生素C的任一种或其组合，所述每次截留的透析次数为2-5次；
（2）称取葡萄糖醛酸对照品，将其配制成浓度为0-200μg/mL的葡萄糖醛酸对照溶液，再根据需要将其配制成葡萄糖醛酸标准液系列；
（3）取供试品溶液、葡萄糖醛酸标准液系列，加入浓度为0.01-0.05mol/L的四硼酸钠硫酸溶液，搅拌至反应完全后，再加入浓度为0.05-0.50%的咔唑乙醇溶液，搅拌至反应完全后，采用紫外-可见分光光度计在波长为500-600nm处检测吸光度；
（4）采用葡萄糖醛酸标准液系列的吸光度绘制吸光度—浓度曲线，再利用供试品溶液的吸光度在吸光度—浓度曲线上的位置来计算并确定供试品溶液中的葡萄糖醛酸含量，再据此计算待测透明质酸组合物中的透明质酸含量。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由水或pH6-9的磷酸盐缓冲液的任一种与选自0.1-50mg/ml透明质酸、1-50mg/ml氨基酸、1-100mg/ml维生素、1-50mg/ml硫辛酸和1-100mg/ml胶原蛋白的任一种或其组合组成。
本发明的优选技术方案中，组合物中的透明质酸含量为0.5-20mg/ml，氨基酸含量为2-40mg/ml，维生素含量为5-50mg/ml，硫辛酸含量为2-25mg/ml，胶原蛋白含量为5-50mg/ml，磷酸盐缓冲液pH6.5-8。
本发明的优选技术方案中，组合物中的透明质酸含量为1-10mg/ml，氨基酸含量为3-30mg/ml，维生素含量为10-20mg/ml，硫辛酸含量为3-15mg/ml，胶原蛋白含量为10-20mg/ml，磷酸盐缓冲液pH6.5-8。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由1-10mg/ml透明质酸、3-15mg/ml硫辛酸、10-20mg/ml维生素C和磷酸盐缓冲液pH7-8组成。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由1mg/ml透明质酸、3mg/ml硫辛酸、10mg/ml维生素C和磷酸盐缓冲液pH8组成。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由1-10mg/ml透明质酸、3-30mg/ml谷胱甘肽和磷酸盐缓冲液pH7-8组成。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由1mg/ml透明质酸、3mg/ml谷胱甘肽和磷酸盐缓冲液pH8组成。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由1-10mg/ml透明质酸、3-30mg/ml维生素和磷酸盐缓冲液pH7-8组成。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由1mg/ml透明质酸、3mg/ml维生素B12、10mg/ml维生素B2和磷酸盐缓冲液pH8组成。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由1-10mg/ml透明质酸、3-30mg/ml氨基酸和磷酸盐缓冲液pH7-8组成。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由1mg/ml透明质酸、3mg/ml甘氨酸、10mg/ml脯氨酸和磷酸盐缓冲液pH8组成。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由1-10mg/ml透明质酸、10-20mg/ml胶原蛋白、10-20mg/ml维生素C和磷酸盐缓冲液pH6.5-7.5组成。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由1mg/ml透明质酸、10mg/ml胶原蛋白、10mg/ml维生素C和磷酸盐缓冲液pH6.5组成。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由1-10mg/ml透明质酸、3-30mg/ml氨基酸和水组成。
本发明的优选技术方案中，所述透明质酸组合物由1mg/ml透明质酸、3mg/ml甘氨酸、10mg/ml脯氨酸和水组成。
本发明的优选技术方案中，所述供试品溶液、葡萄糖醛酸标准液系列的配制顺序没有先后之分。
本发明的优选技术方案中，透析袋的截留分子量为3500-200000道尔顿，优选为10000-100000道尔顿，更优选为50000-80000道尔顿。
本发明的优选技术方案中，所述截留级数至少为2级。
本发明的优选技术方案中，每级透析次数为3-4次。
本发明的优选技术方案中，供试品溶液的浓度为10-150μg/mL，优选为30-100μg/mL，更优选为60-80μg/mL。
本发明的优选技术方案中，步骤（3）包括下述步骤：
1）取供试品溶液、葡萄糖醛酸标准液系列，分别置于0-4℃，在搅拌条件下，加入浓度为0.02-0.04mol/L的四硼酸钠硫酸溶液后，将其置于80-100℃条件下搅拌至反应完全后，冷却至室温，制得反应液；
2）在反应液中分别加入浓度为0.10-0.20%的咔唑乙醇溶液后，将其置于80-100℃条件下搅拌至反应完全，冷却至室温；
3）以浓度为0的葡萄糖醛酸标准液做对照，采用紫外-可见分光光度计在波长为530-550nm处检测吸光度；
4）根据供试品溶液吸光度在葡萄糖醛酸标准液系列绘制的吸光度—浓度曲线上的位置计算并确定供试品溶液中的葡萄糖醛酸含量，由此计算透明质酸含量，其中，计算公式为透明质酸含量=2.056*葡萄糖醛酸含量。
本发明的优选技术方案中，所述四硼酸钠硫酸溶液浓度为0.025-0.03mol/L。
本发明的优选技术方案中，所述咔唑乙醇溶液的浓度为0.125-0.15%。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
本发明首次提出高效分离并检测透明质酸组合物中的透明质酸及降解产物含量的方法，并科学筛选检测方法条件及检测参数，建立了一种特定的间接分析方法，该方法消除了其他成分对其含量测定专属性的影响，并具有专属性强、灵敏度和准确度高、回收率好、测定结果准确可靠、可满足透明质酸组合物质量控制的要求等优点，以有效控制产品质量、保障产品的有效性和安全性，且为透明质酸类填充产品提供了确实可行、精准的检测方法。
附图说明
图1 实施例8线性图谱；
图2 对比例3高效液相色谱图；
图3 对比例4高效液相色谱图；
图4 对比例5高效液相色谱图。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明。本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
本发明实施例所使用的材料、仪器如下所述：
紫外可见分光光度计（UV-2600，岛津），高效液相色谱仪（LC-20AT，岛津），色谱柱（Waters Ultrahydrogel 1000，7.8*300mm），磁力搅拌器（84-1，上海梅颖浦），千分之一电子天平（Satorius，美国），万分之一电子天平（Satorius，美国）。
实施例1 透明质酸组合物的制备
称取1g透明质酸钠、3g硫辛酸、10g维生素C，将其加入至1000ml pH8.0的磷酸盐缓冲液（十二水磷酸氢二钠34.00g，二水磷酸二氢钠0.82g，加水至1000g，调节pH为8.0）中，搅拌至完全溶解，即得。
实施例2 透明质酸组合物检测方法
透明质酸组合物的检测方法，包括下述步骤：
1）供试品溶液的配制：精密移取实施例1制备的产品3.0mL，将其置透析袋中，夹紧透析袋（透析袋的截留分子量为50000道尔顿），将其放至烧杯中，烧杯中加入纯化水约1000mL作为透析液。搅拌透析约24小时，并3次更换透析液后，将透析袋中的样品转移至50ml容量瓶中，用水少量多次冲洗透析袋内部，将其全部转移至容量瓶中，用水定容，摇匀，制得浓度为60μg/ml的透明质酸钠溶液。精密吸取1.0ml制得的透明质酸钠溶液，将其置于具塞试管中备用。
2）对照品溶液的配制：精密称取葡萄糖醛酸（GA）对照品约0.1g，将其置100mL量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，将制得的贮备液置于2～8℃贮存备用。精密吸取贮备液5.0mL，将其置于100mL量瓶中，加水，将其制成浓度为50μg/mL的葡萄糖醛酸对照品溶液。吸取制得的葡萄糖醛酸对照品溶液，将其置于具塞试管中，按表1配置葡萄糖醛酸标准液系列。
表1
试管编号 0（空白） 1 2 3 4 5
GA标准溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
GA含量/(μg/mL) 0 10 20 30 40 50
3）试验方法：将标准液系列各试管和供试品试管均置于冰水浴中，用移液器缓慢地向每管中加入浓度为0.025mol/L的四硼酸钠硫酸5mL（使用之前在2-8℃冰箱内贮存至少2h），边加边摇匀。加毕后，混匀，并将其置于沸水浴中煮沸15min，取出冷却至室温。各试管内均加入浓度为0.125%的咔唑乙醇溶液0.2mL，充分摇匀后，将其置于沸水浴中加热15min，冷却至室温。用0号管作对照，用紫外-可见分光光度计测定530nm处各标准管和供试品管的吸光度。用标准管绘制吸光度—浓度曲线，根据样品管的吸光度从标准曲线上查得供试品溶液中的葡萄糖醛酸含量，由此计算实施例1组合物中的游离透明质酸钠含量。
检测结果：实际透明质酸钠投料量为0.1%，测得量为0.1%，回收率合格。
实施例3 透明质酸组合物的制备
称取1g透明质酸钠、3g谷胱甘肽，将其加入至1000ml pH8.0的磷酸盐缓冲液（十二水磷酸氢二钠34.00g，二水磷酸二氢钠0.82g，加水至1000g，调节pH为8.0）中，搅拌至完全溶解，即得。
检测方法同实施例2。
检测结果：实际透明质酸钠投料量为0.1%，测得量为0.1%，回收率合格。
实施例4 透明质酸组合物的制备
称取1g透明质酸钠、3g维生素B12、10g维生素B2，将其加入至1000ml pH8.0的磷酸盐缓冲液（十二水磷酸氢二钠34.00g，二水磷酸二氢钠0.82g，加水至1000g，调节pH为8.0）中，搅拌至完全溶解，即得。
检测方法同实施例2。
检测结果：实际透明质酸钠投料量为0.1%，测得量为0.1%，回收率合格。
实施例5 透明质酸组合物的制备
称取1g透明质酸钠、3g甘氨酸、10g脯氨酸，将其加入至1000ml pH8.0的磷酸盐缓冲液（十二水磷酸氢二钠34.00g，二水磷酸二氢钠0.82g，加水至1000g，调节pH为8.0）中，搅拌至完全溶解，即得。
检测方法同实施例2。
检测结果：实际透明质酸钠投料量为0.1%，测得量为0.1%，回收率合格。
实施例6 透明质酸组合物的制备
称取1g透明质酸钠、3g甘氨酸、10g脯氨酸，将其加入至1000ml纯化水中，搅拌至完全溶解，即得。
检测方法同实施例2。
检测结果：实际透明质酸钠投料量为0.1%，测得量为0.1%，回收率合格。
实施例7 透明质酸组合物的制备
称取1g透明质酸钠、3g硫辛酸、3g甘氨酸、10g维生素C、10g胶原蛋白，将其加入至1000ml pH8.0的磷酸盐缓冲液（十二水磷酸氢二钠34.00g，二水磷酸二氢钠0.82g，加水至1000g，调节pH为8.0）中，搅拌至完全溶解，即得。
实施例8 透明质酸组合物检测方法的方法学验证
1、回收率
回收率溶液的配制
（1）80%浓度准确度：
Accu-80%-1：分别取透明质酸钠8.61mg，维生素C 100.90mg，硫辛酸30.41mg，置10ml量瓶中，加pH为8.0的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀。
Accu-80%-2：分别取透明质酸钠8.76mg，维生素C 99.34mg，硫辛酸30.42mg，置10ml量瓶中，加pH为8.0的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀。
Accu-80%-3：分别取透明质酸钠8.51mg，维生素C 100.03mg，硫辛酸30.19mg，置10ml量瓶中，加pH为8.0的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀。
（2）100%浓度准确度：
Accu-100%-1：分别取透明质酸钠10.55mg，维生素C 99.74mg，硫辛酸30.02mg，置10ml量瓶中，加pH为8.0的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀。
Accu-100%-2：分别取透明质酸钠10.53mg，维生素C 100.02mg，硫辛酸30.10mg，置10ml量瓶中，加pH为8.0的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀。
Accu-100%-3：分别取透明质酸钠10.31mg，维生素C 100.20mg，硫辛酸30.10mg，置10ml量瓶中，加pH为8.0的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀。
（3）120%浓度准确度：
Accu-120%-1：分别取透明质酸钠12.37mg，维生素C 99.81mg，硫辛酸30.12mg，置10ml量瓶中，加pH为8.0的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀。
Accu-120%-2：分别取透明质酸钠12.71mg，维生素C 100.47mg，硫辛酸30.03mg，置10ml量瓶中，加pH为8.0的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀。
Accu-120%-3：分别取透明质酸钠12.77mg，维生素C 100.22mg，硫辛酸30.08mg，置10ml量瓶中，加pH为8.0的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀。
计算公式：回收率%=(测得量（mg）)/(加入量（mg）×（100%-水分%）)×100%；
结果：3个浓度的平均回收率均在95%-105%之间，满足检测需求。
2、重复性
同“回收率”实验，平行配制3份100%浓度准确度母液，分别测定。
实验结论，3份样品检测结果的RSD%为3.65%，满足检测需求。
3、精密度
取“Accu-100%-3”溶液，连续测定6次吸光度值，计算含量及RSD%。实验结论，连续6次测定量的RSD%为0.11%，满足检测需求。
4、线性
精密称取葡萄糖醛酸对照品108.12mg，置100mL量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密吸取贮备液5.0mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。按表1吸取对照品溶液置具塞试管中，配制曲线，进行测定。
线性结果显示，在10-50µg/ml范围内，浓度与吸光度呈线性，相关系数r=0.998，满足检测需求。标准曲线见图1。
5、稳定性
对照品溶液稳定性：取线性测定溶液3，在配制完成之后的第0min、20min、40min、60min、100min进行吸光度测定。
供试品溶液稳定性：取“Accu-100%-3”溶液，在配制完成之后的第0、20min、40min、60min、100min进行吸光度测定。
实验结论，不同时间点对照品溶液及供试品溶液的吸光度RSD%值分别为0.13%、0.22%。
6、供试品溶液处理及测定
分别精密移取测定项下样品3.0mL，置透析袋中，夹紧透析袋，将其放至烧杯中，烧杯中加入纯化水约1000mL，作为透析液。用磁力搅拌器搅拌透析约24小时，中途更换3次透析液，透析结束后，将透析袋中的样品取出，转移至50ml容量瓶中，用水少量多次冲洗透析袋内部并全部转移置容量瓶中，用水定容，摇匀。分别精密吸取1.0ml置具塞试管中。
检测方法同实施例2试验方法部分。
实施例9 透明质酸组合物的制备
称取1g透明质酸钠（分子量100-130W）、10g胶原蛋白（分子量3500）、10g维生素C，将其加入至1000ml pH6.5的磷酸盐缓冲液（十二水磷酸氢二钠22.50g，二水磷酸二氢钠18.90g，加水至1000g，调节pH为6.5）中，搅拌使完全溶解，作为样品。
实施例10 透明质酸组合物的各组分含量测定
透明质酸组合物的检测方法，包括下述步骤：
供试品溶液的配制：精密移取实施例9制备的样品3.0mL，将其置透析袋（透析袋的截留分子量为3500道尔顿）中，夹紧透析袋，将其放至烧杯中，烧杯中加入纯化水约100mL，作为透析液。搅拌透析约24小时，并3次更换透析液后，收集透析液，标识为透析液1。将透析袋中的样品取出，用水少量多次冲洗透析袋内部，将其全部转移至另一透析袋中（透析袋截留分子量为 14000道尔顿），同前操作，收集透析液，标识为透析液2。此后，将透析袋中的样品取出，转移至50ml容量瓶中，用水少量多次冲洗透析袋内部，将其全部转移至容量瓶中，用水定容，摇匀，制得浓度为60μg/ml的透明质酸钠溶液（A）。将透析液1使用旋转蒸发仪（70℃，100rpm）减压浓缩至50ml以下，使用纯化水将浓缩液完全转移，并定容至50ml容量瓶（B）。将透析液2使用旋转蒸发仪（70℃，100rpm）减压浓缩至50ml以下，使用纯化水将浓缩液完全转移，并定容至50ml容量瓶，精密量取1ml，以纯化水定容至100ml容量瓶（C）。
（1）透明质酸的含量测定
对照品溶液的配制：精密称取葡萄糖醛酸（GA）对照品约0.1g，将其置100mL量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，将制得的贮备液置于2-8℃贮存备用。精密吸取贮备液5.0mL，将其置于100mL量瓶中，加水，将其制成浓度为50μg/mL的葡萄糖醛酸对照品溶液。吸取制得的葡萄糖醛酸对照品溶液，将其置于具塞试管中，按表2配置葡萄糖醛酸标准液系列。
表2
试管编号 0（空白） 1 2 3 4 5
GA标准溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
GA含量/(μg/mL) 0 10 20 30 40 50
试验方法：将标准液系列各试管和样品（A）试管均置于冰水浴中，用移液器缓慢地向每管中加入浓度为0.025mol/L的四硼酸钠硫酸5mL（使用之前在2-8℃冰箱内贮存至少2h），边加边摇匀。加毕后，混匀，并置沸水浴中煮沸15min，取出冷却至室温。各试管内均加入浓度为0.125%的咔唑乙醇溶液0.2mL，充分摇匀后，并将其置于沸水浴中加热15min，冷却至室温。用0号管作对照，用紫外-可见分光光度计测定530 nm处各标准管和供试品管的吸光度。用标准管绘制吸光度—浓度曲线，根据样品管的吸光度从标准曲线上查得供试品溶液中的葡萄糖醛酸含量，由此计算实施例7组合物中的游离透明质酸钠含量。
（2）胶原蛋白的含量测定
考马斯亮蓝染色液：称取考马斯亮蓝G-250 100mg，加95%乙醇50mL，待考马斯亮蓝溶解后，再加85%磷酸100mL，加水稀释至1000mL，混匀。滤过，取滤液,即得。
牛血清白蛋白标准溶液：牛血清白蛋白加水溶解，稀释至浓度约10μg/mL。
表3
棕色试管编号 0（空白） 1 2 3 4 5
牛血清白蛋白标准溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
牛血清白蛋白含量/(μg/mL) 0 2 4 6 8 10
标准液系列各试管和供试品（C）试管中，分别加考马斯亮蓝染色液5.0mL，混匀，室温放置5min，如产生气泡，可以通过超声去除；或者倒入比色皿时，沿着比色皿的角落倒溶液，排除气泡。在波长为595 nm处测定吸光度。以牛血清白蛋白的浓度对相应的吸光度计算回归方程，由回归方程计算供试品溶液胶原蛋白中蛋白质的含量。
（3）维生素C的含量测定
对照溶液制备：取维生素C适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1mL中约含维生素C 0.6mg的溶液。
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250，5μm）色谱柱，流动相为磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠6.8g与庚烷磺酸钠2.2g，加水1000mL使溶解，用磷酸调节pH值至3.0）-甲醇（96:4）；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长为210nm。
测定法：精密量取供试品溶液（B）与对照品溶液各10μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算。
经测定，透明质酸的含量为102.0%，胶原蛋白的含量为97.1%,维生素C的含量为98.0%。
对比例1 透明质酸组合物的制备
称取1g透明质酸钠、100g PEG-PLA共聚物，加入适量pH5.0的磷酸盐缓冲液（十二水磷酸氢二钠2.15g，二水磷酸二氢钠30.35g，加水至1000g，调节pH为5.0），搅拌使完全溶解，定容至1000ml，作为样品。检测方法同实施例2。
检测结果：实际透明质酸钠投料量为0.1%，测得量为0.15%，回收率不合格。
对比例2
1）供试品溶液的配制：精密移取实施例1制备的产品3.0mL，将其置50ml容量瓶中，用水定容，摇匀，制得浓度为60μg/ml的透明质酸钠溶液。精密吸取1.0ml制得的透明质酸钠溶液，将其置于具塞试管中备用。
2）对照品溶液的配制：精密称取葡萄糖醛酸（GA）对照品约0.1g，置将其100mL量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，将制得的贮备液置于2-8℃贮存备用。精密吸取贮备液5.0mL，将其置于100mL量瓶中，加水，将其制成浓度为50μg/mL的葡萄糖醛酸对照品溶液。吸取制得的葡萄糖醛酸对照品溶液，将其置于具塞试管中，按表4配置葡萄糖醛酸标准液系列。
表4
试管编号 0（空白） 1 2 3 4 5
GA标准溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
GA含量/(μg/mL) 0 10 20 30 40 50
3）试验方法：将标准液系列各试管和供试品试管均置于冰水浴中，用移液器缓慢地向每管中加入浓度为0.025mol/L的四硼酸钠硫酸5mL（使用之前在2-8℃冰箱内贮存至少2h），边加边摇匀。加毕后，混匀，并将其置于沸水浴中煮沸15min，取出冷却至室温。各试管内均加入浓度为0.125%的咔唑乙醇溶液0.2mL，充分摇匀后，将其置于沸水浴中加热15min，冷却至室温。用0号管作对照，用紫外-可见分光光度计测定530nm处各标准管和供试品管的吸光度。用标准管绘制吸光度—浓度曲线，根据样品管的吸光度从标准曲线上查得供试品溶液中的葡萄糖醛酸含量，由此计算实施例1组合物中的游离透明质酸钠含量。
产品中的硫辛酸及维生素C干扰透明质酸钠的检测。实际透明质酸钠投料量为0.1%，测得量为0.3%，回收率不合格。
对比例3 色谱法检测
取样品，用水稀释制成浓度为0.2mg/mL的透明质酸钠的溶液，进行高效液相色谱分析。
色谱柱：Waters Ultrahydrogel 1000 (7.8×300mm)；
流动相：水；
柱温：30℃；
流速：0.6ml/min；
紫外吸收波长：200nm
结果显示，透明质酸钠峰型差，无法进行定量分析。
对比例4 色谱法检测
供试品溶液的配制：精密移取实施例1制备的产品3.0mL，置50ml容量瓶中，用水定容，摇匀，使成为浓度为60μg/mL的透明质酸钠溶液。精密吸取1.0ml，置具塞试管中。
对照品溶液的配制：精密称取葡萄糖醛酸（GA）对照品约0.1g，置100 mL量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，将制得的贮备液置于2-8℃贮存备用。精密吸取贮备液5.0mL，将其置于100mL量瓶中，加水，将其制成浓度为50μg/mL的葡萄糖醛酸对照品溶液。吸取制得的葡萄糖醛酸对照品溶液，将其置于具塞试管中。
试验方法：将标准液系列各试管和供试品试管均置于冰水浴中，用移液器缓慢地向每管中加入浓度为0.025mol/L的四硼酸钠硫酸5mL（使用之前在2-8℃冰箱内贮存至少2h），边加边摇匀。加毕后，混匀，并将其置于沸水浴中煮沸15min，取出冷却至室温。
将本品酸解成D-葡萄糖醛酸后，用5ml饱和氢氧化钠溶液中和，进行高效液相色谱分析。
色谱条件：ODS C18色谱柱（4.6×250，5μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠6.8g与辛烷磺酸钠2.2g，加水1000mL使溶解，用磷酸调节pH值至3.0）-甲醇（96:4）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：210nm）。
结果显示，用硫酸酸解后加氢氧化钠中和过程中，反应放热，操作危险，且目标峰峰型差，无法进行分析。
对比例5 色谱法检测
取样品溶液0.2mL，加入0.5mL透明质酸酶，混匀，密封，42℃酶解2h，煮沸2min使酶失活。将上述溶液转移入10mL容量瓶中以流动相定容至刻度，随后进行高效液相色谱分析，色谱条件（ODS C18色谱柱（4.6×250，5μm），流动相：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠6.8g与庚烷磺酸钠2.2g，加水1000mL使溶解，用磷酸调节pH至3.0）-甲醇（96:4）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：210nm）。
结果显示，目标峰与样品中维生素C无法分离，不能进行分析。
对比例6. 色谱法检测
在对比例4的基础上，将流动相试剂中的庚烷磺酸钠变为保留能力更强的癸烷磺酸钠，并调整流速为0.6mL/min。
结果显示，目标峰与维生素C分离效果得到改善，但是透明质酸钠酶解产物为D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖无法进行有效分离，不能进行分析。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种透明质酸组合物的检测方法，包括下述步骤：
（1）将待检测的透明质酸组合物置于透析袋中，加水，完成透明质酸组合物的透析后，取透析袋中的样品加水溶解，将其配制成浓度为1-200μg/mL的供试品溶液，其中，所述透明质酸组合物含有透明质酸与氨基酸、维生素、硫辛酸、胶原蛋白的任一种或其组合，透析袋的截留分子量为2000-500000道尔顿，任选不同截留分子量的透析袋进行至少1级截留，所述氨基酸选自谷胱甘肽、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、半胱氨酸中的任一种或其组合，所述维生素选自维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12、维生素C的任一种或其组合，每次截留的透析次数为2-5次；
（2）称取葡萄糖醛酸对照品，将其配制成浓度为0-200μg/mL的葡萄糖醛酸对照溶液，再根据需要将其配制成葡萄糖醛酸标准液系列；
（3）取供试品溶液、葡萄糖醛酸标准液系列，加入浓度为0.01-0.05mol/L的四硼酸钠硫酸溶液，搅拌至反应完全后，再加入浓度为0.05-0.50%的咔唑乙醇溶液，搅拌至反应完全后，采用紫外-可见分光光度计在波长为500-600nm处检测吸光度；
（4）采用葡萄糖醛酸标准液系列的吸光度绘制吸光度—浓度曲线，再利用供试品溶液的吸光度在吸光度—浓度曲线上的位置来计算并确定供试品溶液中的葡萄糖醛酸含量，再据此计算待测透明质酸组合物中的透明质酸含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述透明质酸组合物由水或pH6-9的磷酸盐缓冲液的任一种与选自0.1-50mg/ml透明质酸、1-50mg/ml氨基酸、1-100mg/ml维生素、1-50mg/ml硫辛酸和1-100mg/ml胶原蛋白的任一种或其组合组成。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述供试品溶液、葡萄糖醛酸标准液系列的配制顺序没有先后之分。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，透析袋的截留分子量为3500-200000道尔顿。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述截留至少为2级。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其中，每级透析次数为3-4次。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其中，供试品溶液的浓度为10-150μg/mL。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤（3）包括下述步骤：
1）取供试品溶液、葡萄糖醛酸标准液系列，分别置于0-4℃，在搅拌条件下，加入浓度为0.02-0.04mol/L的四硼酸钠硫酸溶液后，将其置于80-100℃条件下搅拌至反应完全后，冷却至室温，制得反应液；
2）在反应液中分别加入浓度为0.10-0.20%的咔唑乙醇溶液后，将其置于80-100℃条件下搅拌至反应完全，冷却至室温；
3）以浓度为0的葡萄糖醛酸标准液做对照，采用紫外-可见分光光度计在波长为530-550nm处检测吸光度；
4）根据供试品溶液吸光度在葡萄糖醛酸标准液系列绘制的吸光度—浓度曲线上的位置计算并确定供试品溶液中的葡萄糖醛酸含量，由此计算透明质酸含量，其中，计算公式为透明质酸含量=2.056*葡萄糖醛酸含量。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其中，所述四硼酸钠硫酸溶液浓度为0.025-0.03mol/L。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其中，所述咔唑乙醇溶液的浓度为0.125-0.15%。
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