CN115369033A - 全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统和方法 - Google Patents

全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统和方法，其中，总系统包括制备系统、检测分选系统以及分配发液系统，所述制备系统用于制备体外器官微球；所述检测分选系统对死细胞较多或无细胞的VOS进行了筛选，保证得到的VOS全部为高活性，实现目标VOS的有效分选；所述分配发液系统用于将经过所述检测分选系统分选得到的合格微球流体分装在孔板中以及对分装在所述孔板中的合格微球添加培养液。本发明构建的模块化系统能够实现VOS的自动化制备、检测分选和分配发液培养，操作简单且无污染，为药物筛选及药效评价提供重现性良好的体外生物模型，具有良好的应用前景及推广价值。

Description

全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统和 方法
技术领域
本发明涉及体外器官技术领域，具体而言，本发明涉及全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统和方法。
背景技术
据统计，一种新药的研发平均需要耗资10亿美元以上，历时10年以上，而实际上的资金和时间投入要远远高于这个数字。目前，药物筛选最常用的方法主要是基于动物和细胞实验的药效学模型。但由于动物实验周期长，劳动强度大，操作技术要求高，成本高，且因动物与人之间存在的种族差异导致筛选的药物与临床应用之间尚有很大距离，因而发展缓慢，未能进行大规模筛选，也因涉及动物权益保护等问题备受争议。而传统的细胞实验中细胞大多为二维贴壁培养，且为单种细胞培养，与细胞在体内的生长微环境差距较大，且此状态下的细胞无法表现出体内细胞的完整功能，从而导致体外细胞模型对药物的反应不能体现出药物在体内的真实反应。
近些年类器官的出现为药物筛选提供了一种良好的体外模型。类器官是利用胚胎干细胞，多能干细胞或成体体细胞在一定的培养环境和细胞外基质的支撑作用下形成的具有三维结构的，在功能上接近器官的多细胞结构。相比于细胞系培养，类器官具有三维微结构，更接近体内组织的状态，在肿瘤模型中能保留肿瘤的异质性，具有在药物筛选、病理研究及精准医疗等多个领域广泛应用的潜力。目前传统的类器官培养方法主要有使用基质胶作为支撑基质，将类器官种子与基质胶混合后通过移液枪接种到培养皿中，在37℃环境下使基质胶固化从而达到三维培养的效果。然而，这种方法培养的类器官大小尺寸以及培养皿中形成的类器官微球数量均不可控，且全程为人工操作，效率较低，类器官培养状态受操作人员差异性影响较大，不利于类器官的标准化和通量化培养，同时也无法满足药物筛选的需求。超低粘附U型孔板也被用来进行类器官培养，这种方法对孔板表面材料进行改性，使细胞在其表面不会贴壁生长，再利用原型孔底使细胞因为重力原因聚集在孔板底部成球生长从而达到三维培养的目的，但是这种方法不便于使用基质胶，因而也无法提供类器官生长所需要的营养物质。此外，还有利用3D打印技术进行细胞三维构建后模拟体内器官的三维结构，但是这种方法存在对体内器官结构，细胞种类等了解及认识不够，无法完全在体外进行模拟，而重建的模型也无法重现体内器官的功能。
专利CN110004111B公开了一种类器官球体的制备方法，此方法利用注射泵及三通装置实现类器官液滴微球制备。油相为氟油，水相为matrigel和细胞混合物，将水相和油相分别注入注射器中，注射器连接三通装置并用注射泵驱动注射器，注射泵放入冰箱(4℃)中以维持matrigel不会发生凝固，进而通过注射泵驱动注射器在三通装置中制备类器官微球。专利CN110042077B公开了一种类器官球体的高通量培养方法，本方法为上一专利的延续，利用上面提到的专利进行得到类器官微球后进行加热，并与3D打印平台联动将类器官球体进行分配。
以上两项专利技术的缺点为：1.整个系统为多个仪器(如冰箱)装置简单搭建而成，体积大，操作麻烦，不利于推广；2.系统无法放入生物安全柜中进行操作，无法保证无菌的环境，制备的类器官可能存在污染的风险；3.系统缺少实时观测模块，无法实现观测及质量监控功能；4.系统缺少自动加液功能很难实现真正意义上的高通量培养，类器官的存活率没有保证；5.由于涉及注射泵及注射器，油相及水相样品更换及添加操作繁琐且存在气泡等干扰因素；6.类器官分发采用3D打印平台，在其运动过程中，容易造成管道(tubing)中类器官的扰动，进而影响分发的准确度。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提出一种全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统和方法。本发明构建的模块化系统能够实现VOS的自动化制备、检测分选和分配发液培养，操作简单且无污染，为药物筛选及药效评价提供重现性良好的体外生物模型，具有良好的应用前景及推广价值。
在本发明的第一个方面，本发明提出了一种全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统。根据本发明的实施例，所述全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统包括：
制备系统，所述制备系统用于制备体外器官微球，所述制备系统包括设置在微流控芯片上的微球制备流道，所述微球制备流道包括微球流体流道；
检测分选系统，所述检测分选系统包括由所述微球流体流道分岔形成的缺陷微球流体流道和合格微球流体流道，所述缺陷微球流体流道和所述合格微球流体流道均设置在所述微流控芯片上，所述微球流体流道在分岔前对应的微流控芯片上设置不对称电极，且所述缺陷微球流体流道一侧对应的电极产生的电场大于所述合格微球流体流道一侧对应的电极产生的电场，所述检测分选系统还包括信号发生器、检测分选控制单元和光学检测单元，所述光学检测单元设置在所述微球流体流道在分岔前对应的微流控芯片的上方，所述信号发生器分别与所述不对称电极和所述检测分选控制单元相连，所述检测分选控制单元分别与所述光学检测单元和所述信号发生器相连；
分配发液系统，所述分配发液系统用于将经过所述检测分选系统分选得到的合格微球流体分装在孔板中以及对分装在所述孔板中的合格微球添加培养液。
根据本发明上述实施例的全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统，本发明构建的模块化系统能够实现VOS的自动化制备、检测分选和分配发液培养，操作简单且无污染，为药物筛选及药效评价提供重现性良好的体外生物模型，具有良好的应用前景及推广价值。同时在芯片上集成检测分选功能，对死细胞较多或无细胞的VOS进行了筛选，保证得到的VOS全部为高活性，实现目标VOS的有效分选。
另外，根据本发明上述实施例的全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述微球制备流道包括：壳结构的细胞流体流道、核结构的细胞流体流道和油相流道，所述壳结构的细胞流体流道和所述核结构的细胞流体流道相汇合形成汇合流道，所述汇合流道与所述油相流道相汇合形成微球流体流道，在所述壳结构的细胞流体流道和所述核结构的细胞流体流道的汇合处，所述壳结构的细胞流体流道设置在所述核结构的细胞流体流道的两侧，在所述汇合流道与所述油相流道的汇合处，所述油相流道设置在所述汇合流道的两侧。
在本发明的一些实施例中，所述制备系统还包括：第一储液装置，所述第一储液装置的出液口与所述壳结构的细胞流体流道的入口相连，所述第一储液装置用于储存壳结构的细胞流体；
第二储液装置，所述第二储液装置的出液口与所述核结构的细胞流体流道的入口相连，所述第二储液装置用于储存核结构的细胞流体；
第三储液装置，所述第三储液装置的出液口与所述油相流道的入口相连，所述第三储液装置用于储存油相；
压力控制器和隔膜泵，所述压力控制器分别与所述第一储液装置、所述第二储液装置和所述第三储液装置相连，所述隔膜泵与所述压力控制器相连。
在本发明的一些实施例中，所述制备系统还包括：流速控制单元，所述流速控制单元与所述压力控制器相连。
在本发明的一些实施例中，所述制备系统还包括：制冷模块，所述制冷模块用于将所述微流控芯片、所述第一储液装置、所述第二储液装置和所述第三储液装置的温度维持在某一设定温度。
在本发明的一些实施例中，所述制备系统还包括：保温单元，所述微流控芯片、所述第一储液装置、所述第二储液装置和所述第三储液装置均设置在所述保温单元内。
在本发明的一些实施例中，所述壳结构的细胞流体流道的宽度为100～150μm，所述壳结构的细胞流体流道内的壳结构的细胞流体的流速为0.5～5μL/min。
在本发明的一些实施例中，所述核结构的细胞流体流道的宽度为100～150μm，所述核结构的细胞流体流道内的核结构的细胞流体的流速为0.5～5μL/min。
在本发明的一些实施例中，所述油相流道的宽度为75～300μm，所述油相流道内的油相的流速为1～20μL/min。
在本发明的一些实施例中，所述壳结构的细胞流体流道内的壳结构的细胞流体包括壳结构的细胞和第一水凝胶，所述核结构的细胞流体流道内的核结构的细胞流体包括核结构的细胞和第二水凝胶，所述壳结构的细胞与所述核结构的细胞不同，所述第一水凝胶和所述第二水凝胶不同，所述壳结构的细胞选自脐带静脉内皮细胞和免疫细胞中的至少一种，所述核结构的细胞选自肿瘤细胞和干细胞中的至少一种，所述第一水凝胶选自纤维蛋白原、胶原和海藻酸盐中的至少一种，所述第二水凝胶选自基质胶、纤维蛋白原和胶原中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，所述微球制备流道包括：细胞流体流道和油相流道，所述细胞流体流道和所述油相流道相汇合形成微球流体流道。
在本发明的一些实施例中，所述总系统还包括加热单元，用于将合格微球形成固态，所述加热单元的一端与所述合格微球流体流道的出口相连；
所述分配发液系统包括：
支撑板，所述支撑板上设有滑道；
移动单元，所述移动单元包括移动平台、X方向滑轨和Y方向滑轨，所述Y方向滑轨垂直设置在所述滑道上，所述Y方向滑轨可在所述滑道上沿Y方向移动，所述X方向滑轨垂直设置在所述Y方向滑轨上，所述X方向滑轨可在所述Y方向滑轨上沿X方向移动，所述移动平台固定在所述X方向滑轨的上方；
孔板，所述孔板设置在所述移动平台上，所述孔板上设有多个培养孔；
微球流体分配单元，所述微球流体分配单元包括微球流体分配管、第一连接杆和第一立杆，所述第一立杆设置在所述支撑板上，所述微球流体分配管通过第一连接杆支撑在所述培养孔的上方，所述微球流体分配管包括分配头，所述分配头设置在所述微球流体分配管的下端，所述微球流体分配管的上端与所述加热单元的另一端相连；
培养液移液单元，所述培养液移液单元包括所述培养液移液器、第二连接杆和第二立杆，所述第二立杆设置在所述支撑板上，所述培养液移液器通过第二连接杆支撑在所述培养孔的上方，所述培养液移液器底部设有多个移液枪头。
在本发明的一些实施例中，所述分配发液系统还包括：分配发液控制单元，所述分配发液控制单元分别与所述移动单元、所述微球流体分配单元和所述培养液移液单元相连。
在本发明的一些实施例中，所述第一连接杆设置为可以所述第一立杆为轴周向转动，所述第一立杆设置为可上下伸缩，所述第二立杆设置为可上下伸缩。
在本发明的第二个方面，本发明提出了一种采用以上实施例所述的总系统进行体外器官微球制备、分选以及分配培养的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
(1)在微球制备流道制备得到体外器官微球，所述体外器官微球包裹在油相中形成分选前微球流体；
(2)在所述分选前微球流体分岔前，采用光学检测单元对分选前微球进行观测，所述光学检测单元将观测结果发送至检测分选控制单元，如果所述分选前微球存在缺陷，则所述检测分选控制单元向信号发生器发出指令，所述信号发生器则接通不对称电极，以便产生不均匀电场，所述不均匀电场使缺陷微球发生偏离进入缺陷微球流体流道；
如果所述分选前微球不存在缺陷，则不接通所述不对称电极，以便使合格微球进入合格微球流体流道；
(3)采用分配发液系统将合格微球流体分装在孔板中，对分装在所述孔板中的合格微球添加培养液。
根据本发明实施例所述的全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的方法，具有以上实施例所述的全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养系统的所有优点，在此不再赘述。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统的示意图；
图2是根据本发明实施例的微流控芯片的结构示意图；
图3是根据本发明实施例的制备系统的结构示意图；
图4是根据本发明实施例的检测分选系统的结构示意图；
图5是根据本发明实施例的分配发液系统的结构示意图；
图6是根据本发明实施例的制备双乳化核壳结构微球的原理示意图；
图7是根据本发明实施例的制备单乳化核壳结构微球的原理示意图；
图8是根据本发明实施例的制备双乳化核壳结构微球的示意图；
图9是根据本发明实施例的不同尺寸大小的体外器官微球的示意图；
图10是根据本发明实施例的移动单元的移动路径示意图；
图11是实施例1的分选后的VOS死活细胞染色荧光图；
图12是实施例1的分配至孔板中的matrigel微球示意图；
图13是实施例1培养的VOS状态图；
图14是实施例1与传统手动方法制备培养的VOS进行对比图；
图15是实施例1与传统手动方法制备培养的VOS的生长曲线图；
图16是实施例1培养的核壳结构VOS的荧光图。
附图标记：
1000-制备系统，100-微流控芯片，1100-微球制备流道，1110-油相流道，1120-壳结构的细胞流体流道，1130-核结构的细胞流体流道，1140-汇合流道，1150-微球流体流道，1160-细胞流体流道，1200-流速控制单元，1300-压力控制器，1400-隔膜泵，1500-第一储液装置，1600-第二储液装置，1700-第三储液装置；
2000-检测分选系统，2100-缺陷微球流体流道，2200-合格微球流体流道，2300-不对称电极，2400-光学检测单元，2500-信号发生器，2600-检测分选控制单元；
3000-分配发液系统，3100-支撑板，3200-滑道，3300-Y方向滑轨，3400-X方向滑轨，3500-移动平台，3600-第一立杆，3700-第一连接杆，3800-微球流体分配管，3810-分配头，3900-第二立杆，3910-第二连接杆，3920-培养液移液器，3921-移液枪头。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本发明的实施例中，针对现有制备方法制备的体外器官微球大小尺寸不均一且不可控问题，本发明利用微流控微液滴生成及凝胶固化技术实现了大小尺寸均一可控的体外器官微球的制备。针对现有方法无法对制备的VOS进行检测及分选问题，本发明在微流控芯片上结合光学检测单元及介电泳分选技术实现了VOS的有效分选功能，实现了VOS的自动化检测分选，为VOS的制备提供了有效的质控手段。针对现有分发手段为手动分发导致的效率低及准确率差等问题，本发明利用其移动路径可控制的移动单元实现体外器官微球的自动分配。针对现有培养方法无法满足自动化培养的需求，本发明基于培养液移液单元实现自动加液。针对现有制备系统庞大且无法在生物安全柜内操作问题，本发明通过集成隔膜泵及压力控制器、制冷模块、加热单元、移动单元、微球流体分配单元、培养液移液单元及检测分选系统，具有体积小、操作便捷、全自动化、易于推广等优势。针对现有制备方法中使用注射泵及注射器导致的加样繁琐且存在气泡等干扰因素，本发明基于隔膜泵驱动方式，一次加样后即可实现一键式操作。
有鉴于此，在本发明一个方面，本发明提出了一种全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统，参考附图1，全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统包括：制备系统1000、检测分选系统2000和分配发液系统3000。
在本发明的实施例中，所述制备系统1000用于制备体外器官微球，所述制备系统1000包括设置在微流控芯片100上的微球制备流道1100，所述微球制备流道1100包括微球流体流道1150。制备不同结构的微球，其对应的微球制备流道1100不同，具体来说：
当制备双乳化核壳结构的微球时，参考附图2和6，所述微球制备流道1100包括：壳结构的细胞流体流道1120、核结构的细胞流体流道1130和油相流道1110，壳结构的细胞流体流道1120内为壳结构的细胞流体，核结构的细胞流体流道1130内为核结构的细胞流体，油相流道1110内为油相。所述壳结构的细胞流体流道1120和所述核结构的细胞流体流道1130相汇合形成汇合流道1140，且在所述壳结构的细胞流体流道1120和所述核结构的细胞流体流道1130的汇合处，所述壳结构的细胞流体流道1120设置在所述核结构的细胞流体流道1130的两侧。在汇合流道1140内，壳结构的细胞流体和核结构的细胞流体并不相溶，而是形成依次包括壳结构的细胞流体、核结构的细胞流体和壳结构的细胞流体的三层层流，壳结构的细胞流体分布在核结构的细胞流体的两侧，由此使壳结构的细胞流体包裹在核结构的细胞流体的两侧，以便后续能形成核壳结构的微球。所述汇合流道1140与所述油相流道1110相汇合形成微球流体流道1150，在所述汇合流道1140与所述油相流道1110的汇合处，所述油相流道1110设置在所述汇合流道1140的两侧。在汇合处，上述依次包括壳结构的细胞流体、核结构的细胞流体和壳结构的细胞流体的三层层流被其两侧流入的油相剪切，从而形成核壳结构的微球，且使所述核壳结构体外器官微球包裹在所述油相中。该核壳结构体外器官微球的结构如附图8所示，其中图8a为核结构的示意图，图8b为壳结构的示意图，图8c为核壳结构的示意图。该核壳结构可实现VOS的血管化共培养，进一步提高VOS在性能上对体内器官的仿真度，为VOS作为体外模型应用于临床医学、精准医疗及药物筛选等领域奠定了基础，解决了目前的方法制备的VOS结构简单而无法形成血管结构或与免疫细胞共培养等问题。
在本发明的实施例中，上述壳结构的细胞流体流道1120的宽度以及壳结构的细胞流体流道1120内的壳结构的细胞流体的流速均不受特别限制，本领域人员可根据实际需求进行设计，作为一个优选的方案，所述壳结构的细胞流体流道1120的宽度为100～150μm，所述壳结构的细胞流体流道1120内的壳结构的细胞流体的流速为0.5～5μL/min。
在本发明的实施例中，上述核结构的细胞流体流道1130的宽度以及核结构的细胞流体流道1130内的核结构的细胞流体的流速均不受特别限制，本领域人员可根据实际需求进行设计，作为一个优选的方案，所述核结构的细胞流体流道1130的宽度为100～150μm，所述核结构的细胞流体流道1130内的核结构的细胞流体的流速为0.5～5μL/min。
在本发明的实施例中，上述油相流道1110的宽度以及油相内的油相的流速均不受特别限制，本领域人员可根据实际需求进行设计，作为一个优选的方案，所述油相流道1110的宽度为75～300μm，所述油相流道1110内的油相的流速为1～20μL/min。
在本发明的实施例中，所述壳结构的细胞流体流道1120内的壳结构的细胞流体包括壳结构的细胞和第一水凝胶，第一水凝胶作为壳结构的细胞的分散介质。所述核结构的细胞流体流道1130内的核结构的细胞流体包括核结构的细胞和第二水凝胶，第二水凝胶作为核结构的细胞的分散介质。所述壳结构的细胞与所述核结构的细胞不同，所述第一水凝胶和所述第二水凝胶不同，由此才能形成不相溶的多层层流。需要说明的是，上述壳结构的细胞的具体种类、核结构的细胞的具体种类、第一水凝胶的具体种类以及第二水凝胶的具体种类均不受特别限制，作为一个具体示例，所述壳结构的细胞选自脐带静脉内皮细胞和免疫细胞中的至少一种，所述核结构的细胞选自肿瘤细胞和干细胞中的至少一种，所述第一水凝胶选自纤维蛋白原、胶原和海藻酸盐中的至少一种，所述第二水凝胶选自基质胶、纤维蛋白原和胶原中的至少一种。
根据本发明的一个具体实施例，参考附图3，所述制备系统1000还包括：第一储液装置1500，所述第一储液装置1500的出液口与所述壳结构的细胞流体流道1120的入口相连，所述第一储液装置1500用于储存壳结构的细胞流体；第二储液装置1600，所述第二储液装置1600的出液口与所述核结构的细胞流体流道1130的入口相连，所述第二储液装置1600用于储存核结构的细胞流体；第三储液装置1700，所述第三储液装置1700的出液口与所述油相流道1110的入口相连，所述第三储液装置1700用于储存油相。
进一步地，参考附图3，所述制备系统1000还包括：压力控制器1300和隔膜泵1400，所述压力控制器1300分别与所述第一储液装置1500、所述第二储液装置1600和所述第三储液装置1700相连，所述隔膜泵1400与所述压力控制器1300相连。具体地，隔膜泵1400连接压力控制器1300，压力控制器1300连接储液装置，储液装置通过管子连接压力控制器1300并通过伸入液面下的毛细管连接微流控芯片100。隔膜泵1400的作用是产生压力，压力控制器1300的作用是调节隔膜泵1400产生的压力，储液装置中的流体经压力控制器1300调节后的气压压出后进入微流控芯片100进行VOS制备。由此，通过调节压力控制器1300气压大小对各流道内流体的流速进行调控，从而实现对VOS的大小及间隔距离等参数进行调节；同时还解决了目前体外器官微球制备过程中的通量低、尺寸大小不均一且不可控以及依靠人工操作难实现标准化制备的问题。另外，在细胞或组织微块浓度一定的情况下，可进一步通过调控微球体积大小来决定其中细胞或组织微块的数量，如图9所示。
进一步地，参考附图3，所述制备系统1000还包括：流速控制单元1200，所述流速控制单元1200与所述压力控制器1300相连，所述流速控制单元1200通过控制压力控制器1300控制储液装置中的气压从而达到控制流道内流体的流速的目的。上述流速控制单元1200可以是电子设备，例如可以是手机或者电脑等。
进一步地，所述制备系统1000还包括：制冷模块(在图中未示出)，所述制冷模块用于将所述微流控芯片100、所述第一储液装置1500、所述第二储液装置1600和所述第三储液装置1700的温度维持在某一设定温度(例如4℃)。具体地，可将所述微流控芯片100设置在制冷模块(例如制冷板)上，在所述第一储液装置1500、所述第二储液装置1600和所述第三储液装置1700的外围包裹制冷模块。
进一步地，所述制备系统1000还包括：保温单元(在图中未示出)，所述微流控芯片100、所述第一储液装置1500、所述第二储液装置1600和所述第三储液装置1700均设置在所述保温单元内，使所述微流控芯片100、所述第一储液装置1500、所述第二储液装置1600和所述第三储液装置1700均维持在低温状态(例如维持在4℃)，避免基质胶凝固。
当制备单乳化微球时，参考附图7，所述微球制备流道包括：细胞流体流道1160和油相流道1110，所述细胞流体流道1160和所述油相流道1110相汇合形成微球流体流道。油相作为连续相利用剪切力将细胞流体切断，形成油包水VOS。具体来说，油相可以从一侧将细胞流体切断，如附图7a所示；油相也可以分布在细胞流体的两侧，从而使细胞流体被其两侧流入的油相剪切，如附图7b所示，形成油包水VOS。
需要说明的是，上述制备单乳化微球的制备系统1000也同样包括储存细胞流体的装置和储存油相的装置、压力控制器1300、隔膜泵1400、制冷模块、保温单元等，其连接方式以及作用与制备双乳化微球的制备系统1000的结构相同，在此不再赘述。
在本发明的实施例中，参考附图2和4，检测分选系统，所述检测分选系统包括由所述微球流体流道1150分岔形成的缺陷微球流体流道2100和合格微球流体流道2200，所述缺陷微球流体流道2100和所述合格微球流体流道2200均设置在所述微流控芯片100上，即微球的制备流道和检测分选流道均设置在所述微流控芯片100上，集制备和检测于一体。所述微球流体流道在分岔前对应的微流控芯片100上设置不对称电极2300，且所述缺陷微球流体流道2100一侧对应的电极产生的电场大于所述合格微球流体流道2200一侧对应的电极产生的电场。所述检测分选系统还包括信号发生器2500、检测分选控制单元2600和光学检测单元2400，所述光学检测单元2400设置在所述微球流体流道在分岔前对应的微流控芯片100的上方，所述信号发生器2500分别与所述不对称电极2300和所述检测分选控制单元2600相连，所述检测分选控制单元2600分别与所述光学检测单元2400和所述信号发生器2500相连。
采用上述检测分选系统进行检测分选的过程如下：在所述分选前微球流体分岔前，采用光学检测单元2400(例如显微镜头)对分选前微球进行观测，例如同时对荧光及侧向光散射成像进行观测，所述光学检测单元2400将观测结果发送至检测分选控制单元2600，如果所述分选前微球存在缺陷，例如当捕捉到荧光信号和/或检测到空泡时，则所述检测分选控制单元2600向信号发生器2500发出指令，所述信号发生器2500则接通不对称电极2300，以便产生不均匀电场，所述不均匀电场使缺陷微球发生偏离进入缺陷微球流体流道2100；如果所述分选前微球不存在缺陷，则不接通所述不对称电极2300，以便使合格微球进入合格微球流体流道2200。由此，所述检测分选系统为自动化操作，同时采用了荧光及明场两种检测方式相结合的方式，不仅可以筛选死细胞或组织块同时也可以筛选出空泡，提高了检测效率及准确率。
由此，采用上述制备系统1000和检测分选系统相结合，即可实现高活性VOS的自动化标准化制备。
需要说明的是，上述检测分选控制单元2600是电子设备，例如可以是手机或者电脑等。优选的，上述检测分选控制单元2600和上述流速控制单元可以在同一个电子设备上。
所述总系统还包括加热单元(在图中未示出)，用于将合格微球形成固态(此时的分散介质油相仍然是液态)，所述加热单元的一端与所述合格微球流体流道2200的出口相连。检测合格的VOS流体从合格微球流体流道2200的出口流出，进入加热单元，在加热单元的加热作用下(例如加热至25℃)使合格微球形成固态，然后随油相一起流入分配发液系统。
在本发明的实施例中，所述分配发液系统用于将经过所述检测分选系统分选得到的合格微球流体分装在孔板中以及对分装在所述孔板中的合格微球添加培养液。参考附图5，所述分配发液系统3000包括：支撑板3100，所述支撑板3100上设有滑道3200；移动单元，所述移动单元包括移动平台3500、X方向滑轨3400和Y方向滑轨3300，所述Y方向滑轨3300垂直设置在所述滑道3200上，所述Y方向滑轨3300可在所述滑道3200上沿Y方向移动，所述X方向滑轨3400垂直设置在所述Y方向滑轨3300上，所述X方向滑轨3400可在所述Y方向滑轨3300上沿X方向移动，所述移动平台3500固定在所述X方向滑轨3400的上方；孔板(在图5中未示出)，所述孔板设置在所述移动平台3500上，所述孔板上设有多个培养孔；微球流体分配单元，所述微球流体分配单元包括微球流体分配管3800、第一连接杆3700和第一立杆3600，所述第一立杆3600设置在所述支撑板3100上，所述微球流体分配管3800通过第一连接杆3700支撑在所述培养孔的上方，所述微球流体分配管3800包括分配头3810，所述分配头3810设置在所述微球流体分配管3800的下端，所述微球流体分配管3800的上端与所述加热单元的另一端相连；培养液移液单元，所述培养液移液单元包括所述培养液移液器3920、第二连接杆3910和第二立杆3900，所述第二立杆3900设置在所述支撑板3100上，所述培养液移液器3920通过第二连接杆3910支撑在所述培养孔的上方，所述培养液移液器3920底部设有多个移液枪头3921。进一步地，所述分配发液系统还包括：分配发液控制单元，所述分配发液控制单元分别与所述移动单元、所述微球流体分配单元和所述培养液移液单元相连，所述分配发液控制单元分别控制移动单元的移动路径、每个培养孔中分配的VOS数量以及每个培养孔中添加的培养液的量。
具体地，加热固化后的VOS流体通过PTFE管连接到微球流体分配管3800，通过分配头将加热固化后的VOS流体按照实际需求分发至孔板的各个培养孔中，此种分配方式可避免由于分配头移动产生的震动导致微球流体分配管3800中的VOS出现多个粘结等情况，确保VOS分发的稳定性。微球流体分配管3800垂直向下且位置固定，由此可减少因为移动而造成VOS分发的不稳定影响。在分发过程中将孔板放置于移动平台3500上方，并通过使移动平台3500按照预先设置的路线进行移动，将固化后的VOS通过分配头流出至孔板的各个孔中。每个孔中的VOS数量可根据实际需求进行调节。
具体地，移动单元可根据实际需求按照一定的路径运动，其中所述Y方向滑轨3300可在所述滑道上沿Y方向移动，从而控制移动平台3500在Y方向的移动，所述X方向滑轨3400可在所述Y方向滑轨3300上沿X方向移动，从而控制移动平台3500在X方向的移动，由此，保证每个需要的孔中都有分配到VOS，不需要中途进行换板操作。孔板的移动途径可通过分配发液控制单元进行设置，可根据孔板及测试需求进行个性化设置，确保分配的VOS可以满足后期实验的需求，图10为其中一种路径示意。
当孔板完成VOS的分发后，可控制培养液移液单元移动至孔板上方进行添加培养液。培养液移液器3920底部可连接不同规格及数量的移液枪头，将培养液移液器3920移至储液槽上方，移液枪头通过负压从培养液储液槽吸取一定量的培养基后，移动至孔板上方，释放负压使培养液流出至孔板中。其加液量以及培养液移液器3920底部连接的枪头数量及规格可根据使用的孔板规格进行匹配。自动加液在VOS分配结束后马上进行，避免基质胶脱水而导致细胞活性受到损伤。由此，所述分配发液系统为自动化操作。
进一步地，所述第一连接杆3700设置为可以所述第一立杆3600为轴周向转动，当微球流体分配管3800将加热成型后的微球流体分配完成后，可以第一立杆3600为轴周向转动第一连接杆3700，从而将微球流体分配管3800远离孔板的上方，避免影响后续培养液移液单元的操作。进一步地，所述第一立杆3600设置为可上下伸缩，由此，可实现第一立杆3600在Z轴上的移动，从而实现微球流体分配管3800在Z轴上的移动。
进一步地，所述第二立杆3900设置为可上下伸缩，可实现第二立杆3900在Z轴上的移动，从而实现培养液移液器3920在Z轴上的移动；另外，当微球流体分配单元分配加热成型后的微球流体时，将第二立杆3900升高，从而带动培养液移液器3920和第二连接杆升高，避免影响微球流体分配单元的分配操作；当微球流体分配单元的分配完成后，将第二立杆3900降低，从而带动培养液移液器3920和第二连接杆降低，使培养液移液器3920刚好处于培养孔的上方，对分装在所述孔板中的合格微球添加培养液。
根据本发明实施例所述的全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统，解决了传统制备方法中存在的通量低、尺寸大小不均一且不可控，重现性差以及较难实现自动化制备及分配等问题，进而导致其在基础研究以及临床诊断等方面的应用受限。本发明基于微流控液滴生成及凝胶固化体系制备大小尺寸均一可控的VOS，并实现其自动化制备；同时在芯片上集成检测分选功能，对死细胞较多或无细胞的VOS进行了筛选，保证得到的VOS全部为高活性，实现目标VOS的有效分选；进一步利用微球流体分配单元和可控运动平台相配合实现VOS的自动化分配，解决了手动点样中的效率低及准确性差以及受操作人员影响极大等问题；最后利用培养液移液单元实现自动化的培养基或药物注入，减少操作过程中的污染隐患。本发明构建的模块化系统能够实现VOS的自动化制备和培养，操作简单且无污染，为药物筛选及药效评价提供重现性良好的体外生物模型，具有良好的应用前景及推广价值。同时，上述系统能大大节约原料及用药量，也能极大程度地降低成本及劳动量，提高药物筛选及新药研发的效率，具有极大的经济效益。
在本发明的第二个方面，本发明提出了一种采用以上实施例所述的总系统进行体外器官微球制备、分选以及分配培养的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
S100：在微球制备流道制备得到体外器官微球，所述体外器官微球包裹在油相中形成分选前微球流体，具体包括如下步骤：
S110：将壳结构的细胞流体通入壳结构的细胞流体流道1120，将核结构的细胞流体通入核结构的细胞流体流道1130，将油相通入油相流道1110；
S120：将所述壳结构的细胞流体和所述核结构的细胞流体汇合，形成汇合流体，且使所述壳结构的细胞流体分布在所述核结构的细胞流体的外侧；
S130：将所述汇合流体与所述油相汇合，形成核壳结构体外器官微球，且使所述核壳结构体外器官微球包裹在所述油相中。
S200：在所述分选前微球流体分岔前，采用光学检测单元对分选前微球进行观测，所述光学检测单元将观测结果发送至检测分选控制单元，如果所述分选前微球存在缺陷，则所述检测分选控制单元向信号发生器发出指令，所述信号发生器则接通不对称电极，以便产生不均匀电场，所述不均匀电场使缺陷微球发生偏离进入缺陷微球流体流道2100；如果所述分选前微球不存在缺陷，则不接通所述不对称电极，以便使合格微球进入合格微球流体流道2200。
具体地，VOS流至分选区后可采用显微镜头同时对荧光及侧向光散射成像进行观测，并由电脑控制系统对观测结果进行分析，当捕捉到荧光信号时便向信号发生器发出指令，信号发生器则接通集成在芯片上的电极产生不均匀电场，使产生信号的VOS发生偏离进入缺陷微球流体流道2100中进行分离。同时进行侧向散射检测VOS的粒度的检测，当检测到空泡时触发信号发生器对该VOS进行分离，原理同上。通过双通道检测可达到同时分离低活度VOS及空泡，保证得到的VOS全部为高活性。此外，本发明方法提供的检测方法为对非目标VOS进行检测，即对低活度和空泡进行检测，鉴于目标VOS占生成的VOS的比重较大，且荧光染色剂对细胞活度易造成损害，因此，本方法选择对非目标VOS进行染色，避免了对标记对目标物带来的损伤，对高活度VOS具有保护效果，且分离效率更高。光学检测单元可同时对VOS进行荧光及侧面散射检测，并通过集成在芯片上的电极施加不对称电场使VOS发生偏移而达到分离的目的。
而检测合格的VOS则继续通过芯片中流道从出口流出，随后通过25℃的加热板进行固化处理后进入分配发液系统。
S300：采用分配发液系统将合格微球流体分装在孔板中，对分装在所述孔板中的合格微球添加培养液。
具体地，加热固化后的VOS流体通过PTFE管连接到微球流体分配管，通过分配头将加热固化后的VOS流体按照实际需求分发至孔板的各个培养孔中。在分发过程中将孔板放置于移动平台上方，并通过使移动平台按照预先设置的路线进行移动，将固化后的VOS通过分配头流出至孔板的各个孔中。当孔板完成VOS的分发后，可控制培养液移液单元移动至孔板上方进行添加培养液。培养液移液器底部可连接不同规格及数量的移液枪头，将培养液移液器移至储液槽上方，移液枪头通过负压从培养液储液槽吸取一定量的培养基后，移动至孔板上方，释放负压使培养液流出至孔板中。其加液量以及培养液移液器底部连接的枪头数量及规格可根据使用的孔板规格进行匹配。自动加液在VOS分配结束后马上进行，避免基质胶脱水而导致细胞活性受到损伤。
根据本发明实施例所述的全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的方法，具有以上实施例所述的全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养系统的所有优点，在此不再赘述。
下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
采用附图3和附图7所示的制备系统制备单乳化结构微球，方法如下：
在来自患者的肠肿瘤细胞中加入死细胞荧光染色剂，混合均匀后放置等待染色反应，反应结束后将染色好的细胞与matrigel混合均匀后加入储存装置中，将油相氟油HFE7000加入油相储存装置中，连接芯片。加样完成后对储液槽进行加压进样，打开隔膜泵，调节流量控制器，使细胞液的压力为15mbar，油相压力为25mbar，从而制备得到单乳化结构微球。
采用附图2和4所述的检测分选系统对上述制备得到备单乳化微球进行筛选，将出现红色荧光的微球或者空泡的微球筛选出来流入缺陷微球流体流道，而活性较高的微球流入合格微球流体流道，分选后的VOS再次进行死活细胞染色荧光显示如附图11所示，该荧光图中全是绿色，没有红色，说明分选后的VOS的活性较高。
检测合格的VOS流体从合格微球流体流道的出口流出，进入加热单元，在加热单元的加热作用下(25℃)使合格微球形成固态，然后随油相一起流入分配发液系统。采用附图5所述的检测分选系统自动将合格微球流体分配到384孔板中的各个培养孔中，如附图12所示。然后采用培养液移液单元向各个培养孔中添加培养基，最后放入细胞培养箱中进行培养。每天对VOS进行拍照观察，如附图13所述，从附图13中可以看出，各微球大小均一。同时与传统手动方法制备培养的VOS进行对比，结果如图14所示。绘制生长曲线，如附图15所示，从图14和15中可以看出，本实施例制备培养的VOS培养5天后可以观察到器官微球体积明显变大，与传统手动制备培养的VOS相比生长速度更快。
实施例2
采用附图2和附图3所示的制备系统制备双乳化核壳结构微球，方法如下：
对核层来自患者的肠肿瘤细胞进行带GFP报告基因的病毒转染后与matrigel混合均匀后加入核层细胞液储存装置中，对壳层人脐静脉内皮细胞进行带RFP报告基因的病毒转染后与胶原蛋白混合均匀后加入壳层细胞液储存装置中，将油相氟油HFE7000加入油相储存装置中，连接芯片。加样完成后对储液槽进行加压进样，打开隔膜泵，调节流量控制器，使核层细胞液的压力为15mbar，壳层细胞液的压力为15mbar，油相压力为25mbar，从而制备得到备双乳化核壳结构微球。
将上述双乳化核壳结构微球分配到384孔板中的各个培养孔中。然后采用培养液移液单元向各个培养孔中添加培养基，最后放入细胞培养箱中进行培养。
然后通过荧光显微镜观察，并收集图像，结果如附图16所示，从附图16中可以看出，中间核层细胞为来自患者的肠肿瘤细胞，荧光染色呈绿色，外层壳为人脐静脉内皮细胞形成的血管结构，荧光染色呈红色，红色分布在外圈层(如B所示)，绿色分布在中间层(如A所示)，因此可证明本方法制备的VOS为核壳结构。同时从图16中还可以看出，该VOS具有血管结构(如C所示)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统，其特征在于，包括：
制备系统，所述制备系统用于制备体外器官微球，所述制备系统包括设置在微流控芯片上的微球制备流道，所述微球制备流道包括微球流体流道；
检测分选系统，所述检测分选系统包括由所述微球流体流道分岔形成的缺陷微球流体流道和合格微球流体流道，所述缺陷微球流体流道和所述合格微球流体流道均设置在所述微流控芯片上，所述微球流体流道在分岔前对应的微流控芯片上设置不对称电极，且所述缺陷微球流体流道一侧对应的电极产生的电场大于所述合格微球流体流道一侧对应的电极产生的电场，所述检测分选系统还包括信号发生器、检测分选控制单元和光学检测单元，所述光学检测单元设置在所述微球流体流道在分岔前对应的微流控芯片的上方，所述信号发生器分别与所述不对称电极和所述检测分选控制单元相连，所述检测分选控制单元分别与所述光学检测单元和所述信号发生器相连；
分配发液系统，所述分配发液系统用于将经过所述检测分选系统分选得到的合格微球流体分装在孔板中以及对分装在所述孔板中的合格微球添加培养液。
2.根据权利要求1所述的总系统，其特征在于，所述微球制备流道包括：壳结构的细胞流体流道、核结构的细胞流体流道和油相流道，所述壳结构的细胞流体流道和所述核结构的细胞流体流道相汇合形成汇合流道，所述汇合流道与所述油相流道相汇合形成所述微球流体流道，在所述壳结构的细胞流体流道和所述核结构的细胞流体流道的汇合处，所述壳结构的细胞流体流道设置在所述核结构的细胞流体流道的两侧，在所述汇合流道与所述油相流道的汇合处，所述油相流道设置在所述汇合流道的两侧。
3.根据权利要求2所述的总系统，其特征在于，所述制备系统还包括：
第一储液装置，所述第一储液装置的出液口与所述壳结构的细胞流体流道的入口相连，所述第一储液装置用于储存壳结构的细胞流体；
第二储液装置，所述第二储液装置的出液口与所述核结构的细胞流体流道的入口相连，所述第二储液装置用于储存核结构的细胞流体；
第三储液装置，所述第三储液装置的出液口与所述油相流道的入口相连，所述第三储液装置用于储存油相；
压力控制器和隔膜泵，所述压力控制器分别与所述第一储液装置、所述第二储液装置和所述第三储液装置相连，所述隔膜泵与所述压力控制器相连；
任选地，所述制备系统还包括：流速控制单元，所述流速控制单元与所述压力控制器相连。
4.根据权利要求3所述的总系统，其特征在于，所述制备系统还包括：
制冷模块，所述制冷模块用于将所述微流控芯片、所述第一储液装置、所述第二储液装置和所述第三储液装置的温度维持在某一设定温度；
任选地，所述制备系统还包括：
保温单元，所述微流控芯片、所述第一储液装置、所述第二储液装置和所述第三储液装置均设置在所述保温单元内。
5.根据权利要求2所述的总系统，其特征在于，所述壳结构的细胞流体流道的宽度为100～150μm，所述壳结构的细胞流体流道内的壳结构的细胞流体的流速为0.5～5μL/min；
任选地，所述核结构的细胞流体流道的宽度为100～150μm，所述核结构的细胞流体流道内的核结构的细胞流体的流速为0.5～5μL/min；
任选地，所述油相流道的宽度为75～300μm，所述油相流道内的油相的流速为1～20μL/min。
6.根据权利要求2所述的总系统，其特征在于，所述壳结构的细胞流体流道内的壳结构的细胞流体包括壳结构的细胞和第一水凝胶，所述核结构的细胞流体流道内的核结构的细胞流体包括核结构的细胞和第二水凝胶，所述壳结构的细胞与所述核结构的细胞不同，所述第一水凝胶和所述第二水凝胶不同，所述壳结构的细胞选自脐带静脉内皮细胞和免疫细胞中的至少一种，所述核结构的细胞选自肿瘤细胞和干细胞中的至少一种，所述第一水凝胶选自纤维蛋白原、胶原和海藻酸盐中的至少一种，所述第二水凝胶选自基质胶、纤维蛋白原和胶原中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的总系统，其特征在于，所述微球制备流道包括：细胞流体流道和油相流道，所述细胞流体流道和所述油相流道相汇合形成微球流体流道。
8.根据权利要求1所述的总系统，其特征在于，所述总系统还包括加热单元，用于将合格微球形成固态，所述加热单元的一端与所述合格微球流体流道的出口相连；
所述分配发液系统包括：
支撑板，所述支撑板上设有滑道；
移动单元，所述移动单元包括移动平台、X方向滑轨和Y方向滑轨，所述Y方向滑轨垂直设置在所述滑道上，所述Y方向滑轨可在所述滑道上沿Y方向移动，所述X方向滑轨垂直设置在所述Y方向滑轨上，所述X方向滑轨可在所述Y方向滑轨上沿X方向移动，所述移动平台固定在所述X方向滑轨的上方；
孔板，所述孔板设置在所述移动平台上，所述孔板上设有多个培养孔；
微球流体分配单元，所述微球流体分配单元包括微球流体分配管、第一连接杆和第一立杆，所述第一立杆设置在所述支撑板上，所述微球流体分配管通过第一连接杆支撑在所述培养孔的上方，所述微球流体分配管包括分配头，所述分配头设置在所述微球流体分配管的下端，所述微球流体分配管的上端与所述加热单元的另一端相连；
培养液移液单元，所述培养液移液单元包括所述培养液移液器、第二连接杆和第二立杆，所述第二立杆设置在所述支撑板上，所述培养液移液器通过第二连接杆支撑在所述培养孔的上方，所述培养液移液器底部设有多个移液枪头。
9.根据权利要求8所述的总系统，其特征在于，所述分配发液系统还包括：分配发液控制单元，所述分配发液控制单元分别与所述移动单元、所述微球流体分配单元和所述培养液移液单元相连；
任选地，所述第一连接杆设置为可以所述第一立杆为轴周向转动，所述第一立杆设置为可上下伸缩，所述第二立杆设置为可上下伸缩。
10.一种采用权利要求1-9任一项所述的总系统进行体外器官微球制备、分选以及分配培养的方法，其特征在于，包括：
(1)在微球制备流道制备得到体外器官微球，所述体外器官微球包裹在油相中形成分选前微球流体；
(2)在所述分选前微球流体分岔前，采用光学检测单元对分选前微球进行观测，所述光学检测单元将观测结果发送至检测分选控制单元，如果所述分选前微球存在缺陷，则所述检测分选控制单元向信号发生器发出指令，所述信号发生器则接通不对称电极，以便产生不均匀电场，所述不均匀电场使缺陷微球发生偏离进入缺陷微球流体流道；
如果所述分选前微球不存在缺陷，则不接通所述不对称电极，以便使合格微球进入合格微球流体流道；
(3)采用分配发液系统将合格微球流体分装在孔板中，对分装在所述孔板中的合格微球添加培养液。
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