CN115368368A - 一种8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物及制备方法和应用 - Google Patents
一种8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物及制备方法和应用 Download PDFInfo
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-
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-
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种8‑吲哚[4,3‑c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物及制备方法和应用。本发明提供的8‑吲哚[4,3‑c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物，具有式Ⅰ所示结构：
R包括
或
R1包括氢、碳原子数为1～5的烷基、碳原子数为3～6的环烷基、苯基、苄基、取代苄基或对甲苯磺酰基；R2包括氢、甲基或腈基；R3包括氢、甲基或对甲苯磺酰基；R4包括氢、甲基、氟或甲氧基；R5包括氢或甲基；R6包括氢或叔丁氧羰基。在嘧啶并三氮唑上连接吲哚基团改善了化合物与EED的结合能力；同时提高了衍生物对EED蛋白的抑制活性，可以作为EED抑制剂。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物及制备方法和应用。
背景技术
癌症是一种致死率高、治疗成本高昂且发病率逐年增高的一种严重危害人类健康的疾病，一直以来癌症都是医学领域研究的重点。癌症与PRC2-H3K27me3之间的失调有关，研究表明PRC2在各种恶性肿瘤、肉瘤、淋巴瘤以及白血病等多种肿瘤疾病的产生、发展以及预后过程中发挥重要的表观遗传学作用，胚胎外胚层发育蛋白(EED)作为PRC2核心蛋白之一，不仅能够感知已经被H3K27me3标记的组蛋白的甲基化状态，而且还可以发挥对EZH2的调控作用：通过与EZH2和H3K27me3形成复合物促进EZH2的催化作用。由于PRC2在肿瘤发生中的作用，PRC2成为近年来抗癌药物的作用靶点，EED具有感知已经被H3K27me3标记的组蛋白的甲基化状态，而且能结合EZH2调节其活性的作用，因此EED抑制剂也成了一个新兴的研究热点。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物及制备方法和应用，本发明提供的8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物与EED有较强的结合性，对EED具有良好的抑制作用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了、一种8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物，具有式Ⅰ所示结构：
其中，R包括
R1包括-H、碳原子数为1～5的烷基、碳原子数为3～6的环烷基、苯基、苄基、取代苄基或对甲苯磺酰基；
R2包括-H、-CH3或-CN；
R3包括-H、-CH3或对甲苯磺酰基；
R4包括-H、-F、-CH3或甲氧基；
R5包括-H或-CH3；
R6包括-H或叔丁氧羰基。
优选的，所述烷基包括甲基、乙基或异丙基。
优选的，所述环烷基包括环丙基或环己基。
优选的，所述取代苄基包括
优选的，R为
本发明还提供了上述技术方案所述8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物的制备方法，包括：
将第一原料、第二原料、第一过渡金属催化剂、第一强碱弱酸盐和第一有机溶剂混合，进行偶联反应，得到式I所示结构的衍生物；
所述第一原料具有如式1所示结构：
所述第二原料具有如式2～式4中任一结构：
优选的，所述具有式1所示结构的第一原料的制备方法包括以下步骤：
将5-溴-2,4-二氯嘧啶、水合肼溶解于有机溶剂中进行亲核取代反应，得到
将
和原甲酸三甲酯混合进行环化反应，得到
将
2-氨甲基呋喃、碱性物质和有机溶剂混合进行取代反应，得到所述第一原料。
优选的，所述具有式2所示结构的第二原料的制备方法包括以下步骤：
将
R1-I和碱性物质溶解于有机溶剂进行亲核取代反应，得到
将
双联频哪醇硼酸酯、过渡金属催化剂、碱性物质和有机溶剂混合，进行偶联反应，得到
优选的，所述具有式3所示结构的的第二原料的制备方法包括以下步骤：
将
卤素单质、强碱和有机溶剂进行卤代反应，得到
R7为-Br或-I；
将
双联频哪醇硼酸酯、过渡金属催化剂和强碱弱酸盐溶解于有机溶剂进行偶联反应，得到
优选的，所述具有式4所示结构的第二原料的制备方法包括以下步骤：
将
卤素单质、强碱和有机溶剂进行卤代反应，得到
R8为-Br或-I；
将
双联频哪醇硼酸酯、过渡金属催化剂和强碱弱酸盐溶解于有机溶剂进行偶联反应，得到
本发明还提供了上述技术方案所述8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物或上述技术方案所述制备方法制备得到的8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物在制备EED抑制剂的应用。
本发明提供了一种8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物，具有式Ⅰ所示结构：
式Ⅰ；其中，R包括
R1包括-H、碳原子数为1～5的烷基、碳原子数为3～6的环烷基、苯基、苄基、取代苄基或对甲苯磺酰基(-Ts)；R2包括-H、-CH3或-CN；R3包括-H、-CH3或对甲苯磺酰基；R4包括-H、-F、-CH3或甲氧基；R5包括-H或-CH3；R6包括-H或叔丁氧羰基(-Boc)。本发明在嘧啶并三氮唑上连接吲哚基团改善了化合物与EED的结合能力；同时提高了8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物对EED蛋白的抑制活性，可以作为EED抑制剂，为寻找基于EED为靶点的抗肿瘤药物开辟一条新方向。
附图说明
图1为Control组、25mg/kg组及50mg/kg组BALB/c-nu不同给药时间后小鼠肿瘤体积的曲线图；
图2为Control组、25mg/kg组及50mg/kg组BALB/c-nu不同给药时间后小鼠体重的曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物，具有式Ⅰ所示结构：
其中，R包括
R1包括-H、碳原子数为1～5的烷基、碳原子数为3～6的环烷基、苯基、苄基、取代苄基或对甲苯磺酰基，优选为-H或取代苄基。在本发明中，所述烷基的碳原子数优选为1～3，所述烷基优选为甲基、乙基或异丙基，更优选甲基。在本发明中，所述环烷基优选包括环丙基或环己基，更优选为环丙基。在本发明中，所述取代苄基优选包括
更优选为
在本发明中，R2包括-H、-CH3或-CN，优选为-H或-CH3，更优选为-H。
在本发明中，R3包括-H、-CH3或对甲苯磺酰基，优选为-H或对甲苯磺酰基，更优选为-H。
在本发明中，R4包括-H、-F、-CH3或甲氧基，优选为-H、-CH3或甲氧基，更优选为-H或甲氧基。
在本发明中，R5包括-H或-CH3，优选为-H。
在本发明中，R6包括-H或叔丁氧羰基，优选为-H。
在本发明中，R优选为
更优选为
本发明还提供了上述技术方案所述8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将第一原料、第二原料、第一过渡金属催化剂、第一强碱弱酸盐和第一有机溶剂混合，进行第一偶联反应，得到式I所示结构的衍生物；
所述第一原料具有如式1所示结构：
所述第二原料具有如式2～式4中任一结构：
在本发明中，所述具有式1所示结构的第一原料的制备方法优选包括以下步骤：
将5-溴-2,4-二氯嘧啶、水合肼溶解于有机溶剂中进行亲核取代反应，得到
将
和原甲酸三甲酯混合进行环化反应，得到
将
2-氨甲基呋喃、碱性物质和有机溶剂混合进行取代反应，得到所述第一原料。
本发明将5-溴-2,4-二氯嘧啶、水合肼溶解于有机溶剂中进行亲核取代反应，得到
在本发明中，所述有机溶剂优选包括乙醇、甲醇、异丙醇或叔丁醇，更优选为乙醇。在本发明中，所述溶解优选包括以下步骤：
将5-溴-2,4-二氯嘧啶第一溶解于部分有机溶剂，得到5-溴-2,4-二氯嘧啶溶液；
将水合肼第二溶解于剩余有机溶剂，得到水合肼溶液；
将所述水合肼溶液滴加至所述5-溴-2,4-二氯嘧啶溶液。
在本发明中，所述5-溴-2,4-二氯嘧啶和水合肼的摩尔比优选为0.8～1.2:2，更优选为1:2。本发明对所述第一溶解和第二溶解无特殊要求，只要能够溶解完全即可。
本发明对所述滴加的速率无特殊要求。
在本发明中，所述亲核取代反应的温度优选为0～10℃，更优选为0℃；所述亲核取代反应的时间优选为4～6h，更优选为5h。
得到
后，本发明将
和原甲酸三甲酯混合进行环化反应，得到
在本发明中，所述
的质量和原甲酸三甲酯的体积比优选为0.8～1.2g:10mL，更优选为1g:10mL。本发明在环化反应前还优选包括：利用氮气置换三次。在本发明中，所述环化反应的温度优选为0～100℃，更优选为50～70℃；所述环化反应的时间优选为0.1～2h，更优选为1～1.5h。
在本发明中，所述环化反应后还优选包括：
将环化反应后体系冷却后进行萃取，取有机相；
将有机相浓缩后，进行层析，得到
在本发明中，所述冷却后温度优选为室温，所述室温的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃。本发明对所述冷却的方式无特殊限定，只要能够达到所需的温度即可。
得到
后，本发明将
2-氨甲基呋喃、碱性物质和有机溶剂混合进行取代反应，得到所述第一原料。在本发明中，所述碱性物质优选为N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)。在本发明中，所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺。在本发明中，所述
和2-氨甲基呋喃的摩尔比优选为0.8～1.2:1～2，更优选为1:1.1～1.5。在本发明中，所述
和碱性物质的摩尔比优选为0.8～1.2:2～5，更优选为1:3～4.6。本发明对所述有机溶剂的用量无特殊限定，只要能够溶解完全即可。本发明对所述混合无特殊要求，只要能够混合均匀即可。在本发明中，所述取代反应的温度优选为0～100℃，更优选为25～50℃；所述取代反应的时间优选为5～7h，更优选为6h。
在本发明中，制备第一原料的方程式如式a所示：
在本发明中，所述具有式2所示的第二原料的制备方法优选包括以下步骤：
将
R1-I和碱性物质溶解于有机溶剂进行亲核取代反应，得到
将
双联频哪醇硼酸酯、过渡金属催化剂、碱性物质和有机溶剂混合，进行偶联反应，得到
本发明将
R1-I和碱性物质溶解于有机溶剂进行亲核取代反应，得到
在本发明中，所述碱性物质优选包括氢氧化钾或氢氧化钠，更优选为氢氧化钾。在本发明中，所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。在本发明中，所述
和R1-I的摩尔比优选为0.8～1.2:1.3～2，更优选为1:1.5～1.7。在本发明中，所述
和碱性物质的摩尔比优选为0.8～1.2:2.5，更优选为1:2.5。本发明对所述有机溶剂的用量无特殊限定，只要能够溶解完全即可。在本发明中，所述亲核取代反应的温度优选为0～15℃，更优选为5～10℃；所述亲核取代反应的时间优选为2～6h，更优选为3～5h。
在本发明中，所述亲核取代反应后还优选包括：
将亲核取代反应后体系进行萃取，取有机相；
将有机相浓缩后，进行层析，得到
在本发明中，当R1为-H时省略这一制备步骤。
得到
后，本发明将
双联频哪醇硼酸酯、过渡金属催化剂、碱性物质和有机溶剂混合，进行偶联反应，得到
在本发明中，所述过渡金属催化剂优选为[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(Pd(dppf)2Cl2)。在本发明中，所述碱性物质优选包括醋酸钾、醋酸钠、碳酸钠或碳酸钾，更优选为醋酸钾。在本发明中，所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺。在本发明中，所述
和双联频哪醇硼酸酯的摩尔比优选为0.8～1.2:1.1～1.7，更优选为1:1.2～1.5。在本发明中，所述
和过渡金属催化剂的摩尔比优选为0.8～1.2:0.01～0.02，更优选为1:0.01～0.02。在本发明中，所述
和碱性物质的摩尔比优选为0.8～1.2:1.2～2，更优选为1:1.2～1.5。本发明对所述有机溶剂用量无特殊限定，只要能够溶解完全即可。
在本发明中，所述偶联反应的温度优选为90～120℃，更优选为100～110℃；所述偶联反应的时间优选为4～8h，更优选为5～7h。
本发明优选采用薄层层析TLC监测反应。在本发明中，所述偶联反应后还优选包括：
将偶联反应后体系冷却后进行萃取，取有机相，得到
在本发明中，所述冷却后温度优选为室温，所述室温的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃。本发明对所述冷却的方式无特殊限定，只要能够达到所需的温度即可。
在本发明中，制备所述具有式2所示结构的第二原料的方程式如式b所示：
在本发明中，所述具有式3所示结构的第二原料的制备方法包括以下步骤：
将
卤素单质、强碱和有机溶剂进行卤代反应，得到
R7为-Br或-I；
将
双联频哪醇硼酸酯、过渡金属催化剂和强碱弱酸盐溶解于有机溶剂进行偶联反应，得到
本发明将
卤素单质、强碱和有机溶剂混合进行卤代反应，得到
R7为-Br或-I。本发明中，所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺。在本发明中，所述混合优选包括以下步骤：
将
和强碱溶解于部分有机溶剂，得到第一溶液；
将卤素单质溶解于剩余有机溶剂，得到卤素溶液；
将所述卤素溶液滴加至所述第一溶液中。
本发明将
和强碱溶解于部分有机溶剂，得到第一溶液。在本发明中，所述强碱优选包括氢氧化钾或氢氧化钠，更优选为氢氧化钾。在本发明中，所述
和强碱的摩尔比优选为0.8～1.2:1～2，更优选为1:1.2～1.5。本发明对部分有机溶剂的用量无特殊限定，只要能够溶解完全即可。本发明对所述溶解无特殊要求，只要能够溶解完全即可。在本发明中，所述
以吲哚为原料制备得到，本发明对制备所述
的方法无特殊要求，采用本领域常规方法即可。
本发明将卤素单质溶解于剩余有机溶剂，得到卤素溶液。在本发明中，所述卤素单质优选包括溴或碘，更优选为碘。本发明对剩余有机溶剂的用量无特殊要求，只要能够溶解完全即可。本发明对所述溶解无特殊限定，只要能够溶解完全即可。
得到第一溶液和卤素溶液后，本发明将所述卤素溶液滴加至所述第一溶液中。在本发明中，所述
和卤素单质的摩尔比优选为1:1.03～1.07，更优选为1:1.05。
本发明对所述滴加速率无特殊要求。
在本发明中，所述卤代反应的温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述卤代反应的时间优选为0.4～0.6h，更优选为0.5h。
本发明优选采用薄层层析TLC监测反应。在本发明中，所述卤代反应后还优选包括：
将卤代反应后体系进行萃取，取有机相；
将有机相浓缩后，进行层析，得到
在本发明中，所述
优选为
得到
后，本发明将
双联频哪醇硼酸酯、过渡金属催化剂和强碱弱酸盐溶解于有机溶剂进行偶联反应，得到
在本发明中，所述过渡金属催化剂优选为Pd(dppf)2Cl2。在本发明中，所述强碱弱酸盐优选包括醋酸钾、醋酸钠、碳酸钠或碳酸钾，更优选为醋酸钾。在本发明中，所述
和双联频哪醇硼酸酯的摩尔比优选为0.8～1.2:1～2，更优选为1:1.2～1.5。在本发明中，所述
和过渡金属催化剂的摩尔比优选为0.8～1.2:0.02，更优选为1:0.02。在本发明中，所述
和醋酸钾的摩尔比优选为0.8～1.2:1.2，更优选为1:1.2。本发明对所述溶解无特殊要求，只要能够溶解完全即可。
在本发明中，所述偶联反应的温度优选为90～120℃，更优选为100～110℃；所述偶联反应的时间优选为4～8h，更优选为5～7h。
本发明优选采用薄层层析TLC监测反应。在本发明中，所述偶联反应后还优选包括：
将偶联反应后体系冷却后进行萃取，取有机相，得到
以卤素单质为碘为例，制备第二原料的方程式如式d所示：
在本发明中，所述具有式4所示结构的第二原料的制备方法包括以下步骤：
将
卤素单质、强碱和有机溶剂进行卤代反应，得到
R8为-Br或-I；
将
双联频哪醇硼酸酯、过渡金属催化剂和强碱弱酸盐溶解于有机溶剂进行偶联反应，得到
本发明将
卤素单质、强碱和有机溶剂混合进行卤代反应，得到
R8为-Br或-I。本发明中，所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺。在本发明中，所述混合优选包括以下步骤：
将
和强碱溶解于部分有机溶剂，得到第二溶液；
将卤素单质溶解于剩余有机溶剂，得到卤素溶液；
将所述卤素溶液滴加至所述第二溶液中。
本发明将
和强碱溶解于部分有机溶剂，得到第二溶液。在本发明中，所述强碱优选包括氢氧化钠或氢氧化钾，更优选为氢氧化钾。在本发明中，所述
和强碱的摩尔比优选为0.8～1.2:1～2，更优选为1:1.2～1.5。本发明对部分有机溶剂的用量无特殊限定，只要能够溶解完全即可。本发明对所述溶解无特殊要求，只要能够溶解完全即可。在本发明中，所述
以吲哚为原料制备得到，本发明对所述
的制备方法无特殊要求，采用本领域常规方法即可。
本发明将卤素单质溶解于剩余有机溶剂，得到卤素溶液。在本发明中，所述卤素单质优选包括溴或碘，更优选为碘。本发明对剩余有机溶剂的用量无特殊要求，只要能够溶解完全即可。本发明对所述溶解无特殊限定，只要能够溶解完全即可。
得到第二溶液和卤素溶液后，本发明将所述卤素溶液滴加至所述第二溶液中。在本发明中，所述
和卤素单质的摩尔比优选为1:1.03～1.07，更优选为1:1.05。本发明对所述滴加的滴加速率无特殊要求。
在本发明中，所述卤代反应的温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述卤代反应的时间优选为0.4～0.6h，更优选为0.5h。
本发明优选采用薄层层析TLC监测反应。在本发明中，所述卤代反应后还优选包括：
将卤代反应后体系进行萃取，取有机相；
将有机相浓缩后，进行层析，得到
在本发明中，所述
优选为
得到
后，本发明将
双联频哪醇硼酸酯、过渡金属催化剂和强碱弱酸盐溶解于有机溶剂进行偶联反应，得到
在本发明中，所述过渡金属催化剂优选为Pd(dppf)2Cl2。在本发明中，所述强碱弱酸盐优选包括醋酸钾、醋酸钠、碳酸钠或碳酸钾，更优选为醋酸钾。在本发明中，所述
和双联频哪醇硼酸酯的摩尔比优选为0.8～1.2:1～2，更优选为1:1.2～1.5。在本发明中，所述
和过渡金属催化剂的摩尔比优选为0.8～1.2:0.02，更优选为1:0.02。在本发明中，所述
和强碱弱酸盐的摩尔比优选为0.8～1.2:1.2，更优选为1:1.2。本发明对所述溶解无特殊要求，只要能够溶解完全即可。
在本发明中，所述偶联反应的温度优选为90～120℃，更优选为100～110℃；所述偶联反应的时间优选为4～8h，更优选为5～7h。
本发明优选采用薄层层析TLC监测反应。在本发明中，所述偶联反应后还优选包括：
将偶联反应后体系冷却后进行萃取，取有机相，得到
在本发明中，所述冷却后温度优选为室温，所述室温的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃。本发明对所述冷却的方式无特殊限定，只要能够达到所需的温度即可。
以卤素单质为碘为例，制备具有式4所示结构的第二原料的反应方程式如式e所示：
在本发明中，所述第一过渡金属催化剂优选为Pd(dppf)2Cl2。在本发明中，所述第一强碱弱酸盐优选包括碳酸钠或碳酸钾，更优选为碳酸钠。在本发明中，所述第一有机溶剂优选为二氧六环和水的混合液，所述二氧六环和水的摩尔比优选为3.8～4.2:1，更优选为4:1。在本发明中，所述第一原料和第二原料的摩尔比优选为0.8～1.2:1.1～1.7，更优选为1:1.2～1.5。在本发明中所述第一原料和第一过渡金属催化剂的摩尔比优选为0.8～1.2:0.1，更优选为1:0.1。在本发明中，所述第一原料和第一强碱弱酸盐的摩尔比优选为0.8～1.2:1.1～1.7，更优选为1:1.2～1.5。本发明对所述第一有机溶剂的用量无特殊限定，只要能够溶解完全即可。
在本发明中，所述第一偶联反应的温度优选为88～92℃，更优选为90℃；所述第一偶联反应的时间优选为10～14h，更优选为11～13h。
本发明优选采用薄层层析TLC监测反应。在本发明中，所述第一偶联反应后还优选包括：
将第一偶联反应后体系冷却后进行萃取，取有机相；
将有机相浓缩后，进行层析，得到R为
的式Ⅰ所示衍生物。
在本发明中，所述冷却后温度优选为室温，所述室温的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃。本发明对所述冷却的方式无特殊限定，只要能够达到所需的温度即可。
在本发明中，所述第一偶联反应的方程式如式c所示：
本发明还提供了上述技术方案所述8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物或上述技术方案所述制备方法制备得到的8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物在制备胚胎外胚层发育蛋白(EED)抑制剂的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
制备第一原料：将20mL乙醇和5g(21.94mmol)5-溴-2，4-二氯嘧啶于0℃下搅拌20min，得到5-溴-2,4-二氯嘧啶溶液；将2g(43.88mmol)水合肼溶解于10mL乙醇得到水合肼溶液；
将水合肼溶液滴加至5-溴-2,4-二氯嘧啶溶液，于0℃环化反应5h，利用TLC板检测反应，将反应体系进行减压抽滤，将减压抽滤得到的固体，得到3.97g白色固体
(产率为81％)；
将3g(13.43mmol)
和30mL原甲酸三甲酯混合后用氮气置换三次，于70℃下反应1.5h，用TLC板监测反应；将反应体系萃取三次，取有机相；然后用无水MgSO4对有机相进行干燥浓缩；通过硅胶柱柱层析(洗脱剂为质量比为5:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液)，得到2.26g淡黄色固体
(产率为72％)；
将2g(8.57mmol)
20mL DMF、832mL(9.42mmol)2-氨甲基和1.6mL(25.6mmol)DIPEA混合后25℃取代反应6h，TLC板检测反应，萃取3次，取有机相；用无水MgSO4对有机相干燥浓缩，通过干法上样进行硅胶柱柱层析(洗脱剂为质量比为40:1的二氯甲烷和甲醇混合液)，得到2.21g棕色固体
(产率为87％)；
制备第二原料：将300mg(0.73mmol)5-溴吲哚与224mg(0.88mmol)双联频哪醇硼酸酯、108mg(1.09mmol)醋酸钾和5.4mg(0.007mmol)Pd(dppf)2Cl2，溶于15mL二甲基亚砜(DMSO)中，氮气置换3次，于90℃下偶联反应8h，TLC板检测反应，降温至25℃，萃取3次，取有机相；用无水MgSO4对有机相干燥浓缩后过滤，得到滤液
以第一原料和第二原料为反应物制备衍生物：将滤液、236mg(0.68mmol)
60mg(0.081mmol)Pd(dppf)2Cl2、216mg(2.04mmol)Na2CO3和20mL二氧六环和水的混合液(二氧六环和水的摩尔比为4：1)，氮气置换3次，于90℃下偶联反应12h，TLC板检测反应，降温至25℃，萃取3次，取有机相；用无水MgSO4对有机相干燥浓缩，通过干法上样进行硅胶柱柱层析(洗脱剂为质量比为50:1的二氯甲烷和甲醇混合液)，得到黄色固体简称为Ⅰ-2，
(产率为31％，m.p.:235.5-235.8℃)。
Ⅰ-2的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),9.49(s2,1H),8.73(t,J＝25.4Hz,1H),8.33(s,1H),7.95(s,1H),7.75(d,J＝9.9Hz,1H),7.64(s,1H),7.49(d,J＝8.5Hz,1H),7.39(t,J＝2.6Hz,1H),6.51(s,1H),6.43-6.46(m,2H),4.78(d,J＝5.3Hz,2H)。
实施例2
按照实施例1的方法制备第一原料
制备第二原料：将500mg(2.55mmol)5-溴吲哚和357mg(6.38mmol)KOH溶于20mLDMF中，0℃下搅拌0.5h和碘甲烷(543mg，3.83mmol)，15℃亲核取代反应4h，TLC板检测反应，萃取3次，取有机相；用无水MgSO4对有机相干燥浓缩，过滤后通过干法上样进行硅胶柱柱层析(洗脱剂为质量比为20:1的石油醚和乙酸乙酯混合液)得到439mg无色油状液体
(产率为82％)；
将
与双联频哪醇硼酸酯、醋酸钾和Pd(dppf)2Cl2，溶于15mL二甲基亚砜(DMSO)中，氮气置换3次，于90℃下偶联反应8h，TLC板检测反应，降温至25℃，萃取3次，取有机相；用无水MgSO4对有机相干燥浓缩后过滤，得到滤液
制备衍生物：按照实施例1制备衍生物不同之处在于以
作为第二原料，制备得到的衍生物简称为Ⅰ-3，
(产率为26％，m.p.:233.1-233.9℃)。
实施例3
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将碘甲烷替换为碘乙烷；第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为棕色固体简称为Ⅰ-4，
(产率为29％，m.p.:198.1-199.6℃)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.47(s,1H),8.73(t,J＝5.1Hz,1H),8.33(s,1H),7.96(s,1H),7.79(d,J＝8.4Hz,1H),7.64(s,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,1H),7.43(d,J＝2.8Hz,1H),6.51(d,J＝2.8Hz,1H),6.45(s,2H),4.78(d,J＝5.2Hz,2H),4.24(q,J＝7.1Hz,2H),1.39(t,J＝7.1Hz,3H)。
实施例4
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将碘甲烷替换为(CH3)2CH-I；第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-5，
(产率为26％，m.p.:242.1-243.5℃)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.48(s,1H),8.74(t,J＝5.1Hz,1H),8.33(s,1H),7.96(s,1H),7.79(d,J＝8.5Hz,1H),7.64(s,1H),7.59(d,J＝8.5Hz,1H),7.52(d,J＝2.8Hz,1H),6.53(d,J＝2.7Hz,1H),6.45(s,2H),4.73-4.82(m,3H),1.49(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例5
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将碘甲烷替换为
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为黄色固体简称为Ⅰ-6，
(产率为26％，m.p.:190.7-191.9℃)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.47(s,1H),8.74(t,J＝5.4Hz,1H),8.33(s,1H),7.96(s,1H),7.83(d,J＝8.6Hz,1H),7.63(d,J＝9.2Hz,2H),7.36(d,J＝3.1Hz,1H),6.44-6.48(m,3H),4.78(d,J＝5.3Hz,2H),3.45-3.49(m,1H),1.13-1.04(m,3H),1.03-0.87(m,3H)。
实施例6
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将碘甲烷替换为I-Ts；第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-7，
(产率为39％，m.p.:212.7-213.5℃)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.48(s,1H),8.86(t,J＝5.4Hz,1H),8.38(s,1H),8.01(s,3H),7.90(d,J＝8.4Hz,2H),7.84(d,J＝3.7Hz,1H),7.64(s,1H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),6.92(d,J＝3.7Hz,1H),6.43-6.47(m,2H),4.78(d,J＝5.4Hz,2H),2.31(s,3H)。
实施例7
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将碘甲烷替换为
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为灰色固体简称为Ⅰ-8，
(产率为14％，m.p.:168.7-169.8℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.48(s,1H),8.75(t,J＝5.4Hz,1H),8.35(s,1H),7.95(s,1H),7.75(d,J＝8.6Hz,1H),7.64(s,1H),7.58-7.43(m,2H),7.32(t,J＝7.2Hz,2H),7.29-7.09(m,3H),6.58(d,J＝3.0Hz,2H),6.50-6.33(m,3H),5.46(s,2H),4.77(d,J＝5.3Hz,2H)。
实施例8
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将碘甲烷替换为
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-9，
(产率为18％，m.p.:193.1-193.7℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.48(s,1H),8.74(t,J＝5.4Hz,1H),8.35(s,1H),7.95(s,1H),7.74(d,J＝10.1Hz,1H),7.64(s,1H),7.59-7.40(m,2H),7.07-7.16(m,4H),6.56(d,J＝2.9Hz,1H),6.49-6.27(m,2H),5.40(s,2H),4.77(d,J＝5.3Hz,2H),2.24(s,3H)。
实施例9
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将碘甲烷替换为
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-10，
(产率为25％，m.p.:198.4-198.9℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.48(s,1H),8.75(t,J＝5.4Hz,1H),8.38(s,1H),7.97(s,1H),7.78(d,J＝10.1Hz,1H),7.72-7.60(m,4H),7.56(t,J＝9.0Hz,2H),7.46(d,J＝7.8Hz,1H),6.61(d,J＝3.0Hz,1H),6.50-6.38(m,2H),5.59(s,2H),4.78(d,J＝5.3Hz,2H)。
实施例10
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将碘甲烷替换为
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为黑色固体简称为Ⅰ-11，
(产率为13％，m.p.:168.6-169.8℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.51(s,1H),8.78(t,J＝5.2Hz,1H),8.39(s,1H),7.98(s,1H),7.80(d,J＝8.4Hz,1H),7.65(s,1H),7.59(d,J＝3.2Hz,2H),7.32-7.41(m,,2H),7.06(s,1H),6.61(d,J＝2.8Hz,1H),6.46(d,J＝4.4Hz,2H),5.47(s,2H),4.79(d,J＝5.1Hz,2H)。
实施例11
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将碘甲烷替换为
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-12，
(产率为20％，m.p.:191.9-193.1℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.49(s,1H),8.76(t,J＝5.4Hz,1H),8.38(s,1H),7.97(s,1H),7.77(d,J＝8.7Hz,1H),7.65(s,1H),7.58(d,J＝3.1Hz,1H),7.55(d,J＝8.7Hz,1H),7.36(q,J＝7.9Hz,1H),7.18-6.88(m,3H),6.60(d,J＝3.0Hz,1H),6.50-6.27(m,2H),5.50(s,2H),4.78(d,J＝5.3Hz,2H)。
实施例12
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将碘甲烷替换为
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为黄色固体简称为Ⅰ-13，
(产率＝26％，m.p.:165.1-165.9℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),8.80(t,J＝5.3Hz,1H),8.47(s,1H),8.01(s,1H),7.88(d,J＝9.7Hz,1H),7.79–7.51(m,6H),7.42(t,J＝7.0Hz,1H),6.80(d,J＝3.1Hz,1H),6.46(d,J＝2.3Hz,2H),4.79(d,J＝5.3Hz,2H)。
实施例13
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将碘甲烷替换为碘环己烷；第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为黄色固体简称为Ⅰ-14，
(产率＝11％，m.p.:190.5-191.3℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.48(s,1H),8.74(t,J＝5.4Hz,1H),8.32(s,1H),7.96(s,1H),7.78(d,J＝8.8Hz,1H),7.64(s,1H),7.61(d,J＝8.8Hz,1H),7.51(d,J＝3.2Hz,1H),6.52(d,J＝3.1Hz,1H),6.45(d,J＝2.8Hz,2H),4.77(d,J＝5.4Hz,2H),4.33-4.41(m,,1H),2.00(d,J＝11.4Hz,2H),1.86(d,J＝13.1Hz,2H),1.84-1.66(m,3H),1.48-1.58(m,2H),1.25-1.33(m,1H)。
实施例14
按照实施例1制备第一原料；
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为灰色固体简称为Ⅰ-15，
(产率为21％，m.p.:264.6-265.7℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.83(s,1H),9.49(s,1H),8.73(t,J＝5.2Hz,1H),8.26(s,1H),7.97(s,1H),7.74(d,J＝8.5Hz,1H),7.65(s,1H),7.43(d,J＝8.5Hz,1H),7.16(s,1H),6.45(s,2H),4.78(d,J＝5.2Hz,2H),2.32(s,3H)。
实施例15
按照实施例1制备第一原料；
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为黄色固体简称为Ⅰ-16，
(产率为16％，m.p.:283.0-284.1℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.28(s,1H),9.50(s,1H),8.85(t,J＝5.0Hz,1H),8.51(s,1H),8.30(d,J＝2.3Hz,1H),8.08(s,1H),7.94(d,J＝8.5Hz,1H),7.64-7.65(m,2H),6.53-6.37(m,2H),4.79(d,J＝5.2Hz,2H)。
实施例16
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将5-溴吲哚替换为2-溴吲哚，将碘甲烷替换为I-Boc；第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-17，
(产率为15％，m.p.:177.5-177.8℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54-9.36(m,2H),8.98(s,1H),8.16(d,J＝8.3Hz,1H),7.78(s,1H),7.65(d,J＝8.2Hz,3H),7.36(d,J＝8.3Hz,1H),7.29(d,J＝7.6Hz,1H),6.86(s,1H),6.47-6.41(m,2H),4.80(d,J＝5.4Hz,3H),1.07(s,9H)。
实施例17
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例1制备第二原料，不同之处在于将5-溴吲哚替换为2-溴吲哚；第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-18，
(产率为27％，m.p.:233.0-233.5℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.46(s,1H),9.50(s,1H),8.93(t,J＝5.3Hz,1H),8.29(s,1H),7.65(s,1H),7.57(d,J＝7.8Hz,1H),7.48(d,J＝8.0Hz,1H),7.42(s,1H),7.09-7.13(m,1H),6.99-7.03(m,1H),6.45-6.47(m,2H),4.79(d,J＝5.3Hz,2H)。
实施例18
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例1制备第二原料，不同之处在于5-溴吲哚替换为3-溴吲哚；第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为棕色固体简称为Ⅰ-19，
(产率为41％，m.p.:279.5-280.3℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.47(s,1H),9.50(s,1H),8.65(t,J＝5.2Hz,1H),8.27(d,J＝2.3Hz,1H),8.16(s,1H),7.98(d,J＝7.9Hz,1H),7.64(d,J＝8.1Hz,2H),7.50(d,J＝8.0Hz,1H),7.19(t,J＝7.4Hz,1H),7.12(t,J＝7.4Hz,1H),6.46-6.41(m,2H),4.78(d,J＝5.3Hz,2H)。
实施例19
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将5-溴吲哚替换为2-溴吲哚；第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-20，
(产率为18％，m.p.:224.1-224.7℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.47(s,1H),8.65(t,J＝5.2Hz,1H),8.31(s,1H),8.14(s,1H),7.99(d,J＝8.0Hz,1H),7.64(s,1H),7.53(d,J＝8.0Hz,1H),7.23-7.27(m,1H),7.14-7.18(m,1H),6.41-6.49(m,2H),4.77(d,J＝5.3Hz,2H),3.90(s,3H)。
实施例20
按照实施例1制备第一原料；
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-21，
(产率为22％，m.p.:186.4-187.2℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.45(s,1H),8.91(t,J＝5.2Hz,1H),8.13(d,J＝8.4Hz,1H),7.85(d,J＝8.2Hz,2H),7.61-7.70(m,2H),7.42(d,J＝8.2Hz,3H),7.33(t,J＝7.7Hz,1H),7.26(d,J＝7.6Hz,1H),7.19(t,J＝7.7Hz,1H),6.57-6.32(m,2H),4.79(d,J＝5.2Hz,2H),2.55(s,3H),2.27(s,3H)。
实施例21
按照实施例1制备第一原料；
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-22，
(产率为31％，m.p.:251.2-252.4℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),8.96(t,J＝5.4Hz,1H),8.67(s,1H),8.20(s,1H),8.03-8.07(m,1H),7.92(d,J＝8.3Hz,2H),7.80(d,J＝9.7Hz,1H),7.65(s,1H),7.40(d,J＝8.3Hz,2H),7.30(t,J＝9.0Hz,1H),6.63-6.23(m,2H),4.79(d,J＝5.3Hz,2H),2.31(s,3H)。
实施例22
按照实施例1制备第一原料；
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-23，
(产率为29％，m.p.:221.3-221.8℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),8.93(t,J＝5.3Hz,1H),8.57(s,1H),8.22(s,1H),7.93(d,J＝9.0Hz,1H),7.86(d,J＝8.3Hz,2H),7.65(s,1H),7.50-7.23(m,3H),7.04(d,J＝9.0Hz,1H),6.60-6.35(m,2H),4.80(d,J＝5.3Hz,2H),3.81(s,3H),2.30(s,3H)。
实施例23
按照实施例1制备第一原料；
第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-24，
(产率为32％，m.p.:179.8-180.6℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),8.94(t,J＝5.4Hz,1H),8.63(s,1H),8.26(s,1H),7.91(d,J＝8.5Hz,1H),7.88(s,1H),7.84(d,J＝8.3Hz,2H),7.65(s,1H),7.37(d,J＝8.3Hz,2H),7.25(d,J＝8.5Hz,1H),6.55-6.37(m,2H),4.79(d,J＝5.3Hz,2H),2.41(s,3H),2.29(s,3H)。
实施例24
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例1制备第二原料，不同之处在于将5-溴吲哚替换为4-溴吲哚；第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为黄色固体简称为Ⅰ-25，
(产率为27％，m.p.:263.3-265.1℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.24(s,1H),9.48(s,1H),8.81(t,J＝5.4Hz,1H),7.92(s,1H),7.69-7.63(m,1H),7.51(d,J＝7.7Hz,1H),7.44(d,J＝8.1Hz,1H),7.38(t,J＝2.7Hz,1H),7.19(t,J＝7.7Hz,1H),6.54-6.31(m,3H),4.80(d,J＝5.3Hz,2H)。
实施例25
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例1制备第二原料，不同之处在于将5-溴吲哚替换为6-溴吲哚；第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为黄色固体简称为Ⅰ-26，
(产率＝15％，m.p.:182.6-183.5℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.24(s,1H),9.50(s,1H),8.77(t,J＝5.2Hz,1H),8.40(s,1H),8.03(s,1H),7.63(d,J＝11.2Hz,2H),7.40(t,J＝2.6Hz,1H),6.69-6.15(m,3H),4.79(d,J＝5.2Hz,2H)。
实施例26
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例1制备第二原料，不同之处在于将5-溴吲哚替换为7-溴吲哚；第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-27，
(产率为28％，m.p.:276.1-276.9℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.81(s,1H),9.50(s,1H),8.89(t,J＝4.8Hz,1H),7.85(s,1H),7.65(s,1H),7.62(d,J＝7.9Hz,1H),7.36(d,J＝7.1Hz,1H),7.33(t,J＝2.7Hz,1H),7.11(t,J＝7.6Hz,1H),6.52(s,1H),6.50-6.27(m,2H),4.81(d,J＝4.8Hz,2H)。
实施例27
按照实施例1制备第一原料；
按照实施例2制备第二原料，不同之处在于将5-溴吲哚替换为7-溴吲哚，碘甲烷替换为碘异丙烷；第二原料的结构式为
制备衍生物：按照实施例1方法制备得到的衍生物为白色固体简称为Ⅰ-28，
(产率为17％，m.p.:203.4-204.0℃)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.48(s,1H),8.84(t,J＝5.3Hz,1H),7.67-7.71(m,2H),7.62(d,J＝7.8Hz,1H),7.51(d,J＝3.3Hz,1H),7.06(t,J＝7.5Hz,1H),6.95(d,J＝7.0Hz,1H),6.60(d,J＝3.2Hz,1H),6.47(dd,J＝5.2,3.5Hz,2H),5.06-4.61(m,2H),4.40-3.77(m,1H),1.38-0.78(m,6H)。
由氢谱结果可知实施例1～27制备得到的8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物具有实施例中结构式所示的结构。
对比例1
以市售的PRC2抑制剂，EED226作为对比例。
测试例
按照如下方法检测实施例1～27制备得到的8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物与EED的结合活性以及对KARPAS422细胞和Pfeiffer细胞的抗增殖活性。
采用了HTRF的方法，检测实施例1～27制备得到的8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物对EED的结合能力；利用CCK-8法测定细胞毒性即利用Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂盒检测实施例1～27制备得到的8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物对KARPAS422细胞和Pfeiffer细胞的抗增殖活性，其结果列于表1中。
具体步骤如下：
1.细胞悬浮培养
(1)细胞收集：待培养基上的细胞密度达到80％左右时，将含有细胞的培养基收集到10mL EP管中，于室温(25℃)下以800r/min的转速离心5min；取出上清液。在干净大皿(10cm)中加进培养基(7mL)待用。
(2)细胞重悬与传代：加入1mL培养基重悬细胞在EP管下部沉淀中，适当比例地均匀铺在步骤(1)中准备好的10cm大皿中，放入含有5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中。
2.细胞蛋白提取
用1640培养基将衍生物I-2～I-28分别配置为0.31μM、0.63μM、1.25μM、2.5μM及5μM浓度溶液，于60mm细胞培养皿中，加入适量细胞悬液，在细胞培养箱中培养4天。
取出细胞，用离心机按照3000r/min的转速离心5min，舍弃上清培养基，随后加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS,pH＝7.5)混匀清洗，继续按照3000r/min的转速离心5min，舍弃PBS，然后加入适量RIPA裂解液，冰浴下反应30min，并多次震荡细胞使其充分裂解，最后，于4℃1200r/min离心10min，取上清，BCA定量，加入适量琼脂糖凝胶电泳(loading buffer)，100℃水浴变性10min，-20℃下保存备用。
3.BCA蛋白定量
(1)BCA标准曲线的建立
将BCA试剂配制成BCA工作液按B:A比例为1:50，充分混匀放置备用。取10μL标准品稀释至0.5mg/ml。分别取标准品0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL加到96孔板的不同孔中，加入PBS使各孔补到20μL。随后各孔分别再加入200μL配置好的BCA工作液，37℃下放置20min，冷却到室温，最后用酶标仪测定562nm吸光值，绘制标准曲线。
(2)蛋白浓度的检测
在96孔板中，加入19μLPBS，再分别加入1μL蛋白样品，加入BCA的A液与B液(50:1)混合液200μL，37℃孵育20min，在562nm处测定OD值，根据BCA标准曲线计算出蛋白浓度。
4.CCK8法测细胞毒
(1)含药培养基配制：取9个EP管放置在样品板上，使用梯度稀释的方法得到含化合物终浓度5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.313μM、0.156μM、0.078μM、0.039μM和0.020μM的培养基。
(2)细胞计数与加入：运用细胞计数仪算出细胞密度。随后按照每孔1000个细胞的细胞量取细胞加入已配置好的含药培养基。
(3)铺板：加入一定量100μL的PBS(pH＝7.5)溶液于无色透明96孔板外侧一圈，后将含细胞和药物的培养基按照顺序加入孔板中，每孔100μL。最后一列中加入相同数量细胞但不含化合物的培养基作为空白对照。放入培养箱中孵育7天。
(4)加CCK8：取出孵育结束的孔板，每孔加入20μL质量浓度为5mg/mL的CCK8溶液。放回培养箱孵育4～5h。随后，将九十六孔板置入酶标仪中，读取450nm波长处的光吸收值。数据处理：使用公式抑制率(％)＝[1-(实验组-背景)/(空白组-背景)]×100计算化合物抑制率，使用GraphPad prism6.0中XY table→Nonlinear regression→Dose-response-Inhibition→log(inhibitor)vs.normalized response-Variable slope模块计算IC50。
表1化合物结合EED活性和对KARPAS422细胞和Pfeiffer细胞的抗增殖活性
由表1结果可知本发明实施例提供的8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物I-2～I-28均对EED具有较好的抑制活性，本发明提供的8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物具有较好的EED结合活性和对KARPAS422细胞和Pfeiffer细胞的有显著的抗增殖活性。
抗异种移植肿瘤生长的活性评价
本发明针对衍生物I-27进行了抗异种移植肿瘤生长的活性评价，实验方法如下所示。
(1)购买21只4周龄的BALB/c-nu小鼠，在动物房喂养使其适应6d。同时开始进行大规模的KARPAS422细胞培养，每个100mm细胞培养皿最终可扩增至大约1×107个细胞，准备4个大皿的接种细胞量，当细胞总数基本达到接种数量时换液。
(2)次日，收集悬浮细胞，使用细胞计数板进行计数，用预冷的PBS根据细胞接种数配制细胞悬液并放在冰上，每只小鼠接种体积为200μL。
(3)处理完细胞后尽量在30min内完成进行细胞皮下接种，使用1mL无菌注射器把细胞悬液接种在小鼠腋窝中后部。
(4)接种KARPAS422细胞后观察并记录肿瘤的生长情况，等到瘤体积达到110mm3左右时，将荷瘤小鼠随机分为Control组、25mg/kg组及50mg/kg组，每组7只，进行灌胃给药。将衍生物I-27溶解于溶剂中配制不同质量浓度的药液，所述药液中衍生物I-27的浓度为0、25mg/kg和50mg/kg；所述溶剂由无水乙醇、药用级蓖麻油和生理盐水组成，无水乙醇、药用级蓖麻油和生理盐水的质量比为2:1:7。
(5)Control组：给予空白药液(浓度为0)300μL/20g，灌胃给药，每日一次，连续28天；25mg/kg组：给予化合物I-27质量浓度为25mg/kg的药液300μL/20g，灌胃给药，每日一次，连续28天；50mg/kg组：给予化合物I-27质量浓度为50mg/kg的药液，300μL/20g，灌胃给药，每日一次，连续28天。
(6)每2天称量一次体重并记录，每3天使用游标卡尺测量瘤体的最长径和最短径，计算肿瘤体积并记录。肿瘤体积的计算公式为：V＝π/6×a×b2(其中a为最长轴，b为最短轴)。
(7)给药28d后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，取血，剥离肿瘤组织并分析数据，其结果列于表2中。
表2化合物I-27治疗的小鼠移植瘤体积及体重变化
根据表2绘制曲线图如图1和图2所示。结合表2和图1～2可知，与Control组相比，使用I-27质量浓度为50mg/kg和25mg/kg药液不会影响BALB/c-nu小鼠的正常生长，而且对KARPAS422细胞异种移植的肿瘤生长具有非常明显的抑制作用，并可导致移植瘤的完全消退，证明I-27起到了EED抑制剂的作用。
对衍生物I-2～I-26和I-28进行抗异种移植肿瘤生长的活性检测，得到与I-27相同的结果。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (11)
1.一种8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物，具有式Ⅰ所示结构：
其中，R包括
R1包括-H、碳原子数为1～5的烷基、碳原子数为3～6的环烷基、苯基、苄基、取代苄基或对甲苯磺酰基；
R2包括-H、-CH3或-CN；
R3包括-H、-CH3或对甲苯磺酰基；
R4包括-H、-F、-CH3或甲氧基；
R5包括-H或-CH3；
R6包括-H或叔丁氧羰基。
2.根据权利要求1所述8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物，其特征在于，所述烷基包括甲基、乙基或异丙基。
3.根据权利要求1所述8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物，其特征在于，所述环烷基包括环丙基或环己基。
4.根据权利要求1所述8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物，其特征在于，所述取代苄基包括
5.根据权利要求1～4任一项所述8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物，其特征在于，R为
6.权利要求1～5任一项所述8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物的制备方法，包括：
将第一原料、第二原料、第一过渡金属催化剂、第一强碱弱酸盐和第一有机溶剂混合，进行偶联反应，得到式I所示结构的衍生物；
所述第一原料具有如式1所示结构：
所述第二原料具有如式2～式4中任一结构：
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述具有式1所示结构的第一原料的制备方法包括以下步骤：
将5-溴-2,4-二氯嘧啶、水合肼溶解于有机溶剂中进行亲核取代反应，得到
将
和原甲酸三甲酯混合进行环化反应，得到
将
2-氨甲基呋喃、碱性物质和有机溶剂混合进行取代反应，得到所述第一原料。
8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述具有式2所示结构的第二原料的制备方法包括以下步骤：
将
R1-I和碱性物质溶解于有机溶剂进行亲核取代反应，得到
将
双联频哪醇硼酸酯、过渡金属催化剂、碱性物质和有机溶剂混合，进行偶联反应，得到
9.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述具有式3所示结构的的第二原料的制备方法包括以下步骤：
将
卤素单质、强碱和有机溶剂进行卤代反应，得到
R7为-Br或-I；
将
双联频哪醇硼酸酯、过渡金属催化剂和强碱弱酸盐溶解于有机溶剂进行偶联反应，得到
10.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述具有式4所示结构的第二原料的制备方法包括以下步骤：
将
卤素单质、强碱和有机溶剂进行卤代反应，得到
R8为-Br或-I；
将
双联频哪醇硼酸酯、过渡金属催化剂和强碱弱酸盐溶解于有机溶剂进行偶联反应，得到
11.权利要求1～5任一项所述8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物或权利要求6～10任一项所述制备方法制备得到的8-吲哚[4,3-c]嘧啶并[1,2,4]三氮唑类衍生物在制备EED抑制剂的应用。
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