CN115349639A - 一种提高免疫力的益生菌缓释体系及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种提高免疫力的益生菌缓释体系及其制备方法和应用，属于益生菌技术领域。由以下原料按重量份制备而成：益生元组合物7‑12份、藻肽提取物5‑10份、短链脂肪酸组合物2‑3份、凝结芽孢杆菌TQ33 1‑2份、甘蔗纤维素水凝胶13.5‑37.5份。不仅能改善肠道健康，平衡菌群，提升机体的抗病能力、新陈代谢能力和消化吸收能力，可以有效地改善消化道菌群的平衡，能实现将益生菌在肠道中靶向输送和控制释放，被人体直接吸收，提高机体免疫力，刺激免疫应答，同时，大量重新利用了生物废渣甘蔗渣，变废为宝，具有极好的环境效益。

Description

一种提高免疫力的益生菌缓释体系及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种提高免疫力的益生菌缓释体系及其制备方法和应用。
背景技术
益生菌是一类当摄入充足数量时能对宿主产生一种或多种经过论证的功能性健康益处的活性微生物。益生菌通过定植于宿主的肠道内，从而调节肠道菌群，改善宿主微生态平衡、发挥有益作用。人体和动物体内有益的细菌包括：乳杆菌、双歧杆菌等。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌，起广泛应用于生物工程、工农业、食品安全及生命健康领域。
凝结芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，属厚壁菌门，营养细胞呈杆状，两端钝圆，单个、成对、少数呈短链状，芽孢端生，无鞭毛，最适生长温度为45℃-50℃，最适pH为6.6-7.0，其能分解小分子糖类生成L-1乳酸，为同型乳酸发酵菌，过氧化氢酶阳性。凝结芽孢杆菌除具有和乳酸菌及双歧杆菌同样的保健功效外，还具有耐胃酸、耐热、耐胆碱盐、降解亚硝酸盐、容易培养和保存等特点。
益生菌能够提高免疫系统的免疫能力，增强吞噬细胞的活性，增加胃肠道等器官对病原微生物的抵抗能力。体外试验表明，凝结芽孢杆菌的发酵上清液及细胞壁成分可通过调节细胞因子、抑制活性氧和增强细胞吞噬作用来提高肠道免疫能力，另外凝结芽孢杆菌能促进消化道粘膜发生免疫反应。
另外，为了让益生菌产品进入宿主肠道前能保持休眠状态，益生菌产品的剂型或填充剂的选择和配比至关重要，若剂型或填充剂选择不当，产品中水分含量过高，或者益生菌过早释放，益生菌会快速失去活性，进入宿主肠道后也无法发挥最佳作用。现有技术中对益生菌的填充剂的选择和配比还具有缺陷，如中国发明专利申请CN103478530A中公开了一种低聚糖益生菌组合物以及应用，该文献主要采用低聚糖粉、羟丙级甲基纤维素组成，中国发明专利申请CN103478530A中主要采用益生元、膳食纤维、氨基酸以及维生素B来作为填充剂，但都存在容易失活的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提出一种提高免疫力的益生菌缓释体系及其制备方法和应用，不仅能改善肠道健康，平衡菌群，提升机体的抗病能力、新陈代谢能力和消化吸收能力，可以有效地改善消化道菌群的平衡，能实现将益生菌在肠道中靶向输送和控制释放，被人体直接吸收，提高机体免疫力，刺激免疫应答，同时，大量重新利用了生物废渣甘蔗渣，变废为宝，具有极好的环境效益。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种提高免疫力的益生菌缓释体系，由以下原料按重量份制备而成：益生元组合物7-12份、藻肽提取物5-10份、短链脂肪酸组合物2-3份、凝结芽孢杆菌TQ33 1-2份、甘蔗纤维素水凝胶13.5-37.5份。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.藻多糖提取物的制备：将葛仙米藻粉、珊瑚藻藻粉、富硒螺旋藻藻粉混合后，加入水中，加入水解酶和柠檬酸，酶解，然后加热至沸腾，提取，过滤，滤渣留用；滤液中加入乙醇，沉淀，离心，洗涤固体物，得到藻多糖提取物；
S2.益生元组合物的制备：将步骤S1制得的藻多糖提取物、半乳甘露聚糖、羧甲基茯苓多糖混合均匀，制得益生元组合物；
S3.发酵菌的活化：将加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌接种于高氏培养基中，活化培养成菌种种子液；
S4.藻肽提取物的制备：将步骤S1中的滤渣加入水中，加入复合蛋白酶，酶解，然后接种步骤S3中制得的加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌菌种种子液，发酵培养第一时间段，然后加入含有金属离子和维生素的水溶液，继续发酵培养第二时间段，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到藻肽提取物；
S5.短链脂肪酸组合物的制备：将乙酸、丙酸、丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；
S6.活性物脂化物悬浮液的制备：将步骤S2制得的益生元组合物、步骤S4制得的藻肽提取物、步骤S5制得的短链脂肪酸组合物和凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，得到活性组合物；蛋黄卵磷脂和胆固醇溶于乙酸乙酯-乙醇溶液中，除去溶剂，干燥，加入磷酸缓冲液中，加入活性组合物，搅拌混合均匀，用SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，得到活性物脂化物悬浮液；
S7.提高免疫力的益生菌缓释体系的制备：将经过榨汁处理后的甘蔗渣浸泡在水中，加热提取，过滤，固体干燥，粉碎后得到甘蔗粉，加入碱溶液中搅拌反应，过滤，洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素；将甘蔗纤维素加入离子液体中，惰性气体保护下加热至90-100℃溶解，冷却至50-60℃后，加入引发剂，搅拌，加入丙烯酸类单体，搅拌反应，冷却至室温后，用水浸泡并洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素水凝胶；加入步骤S6制得的活性物脂化物悬浮液中，浸泡，冷冻干燥，粉碎，得到提高免疫力的益生菌缓释体系。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述葛仙米藻粉、珊瑚藻藻粉、富硒螺旋藻藻粉的质量比为3-5:1-3:3-7；所述水解酶为纤维素酶、木聚糖酶按照质量比为3-5:1-3混合制得的复配混合物；所述酶解温度为45-55℃，时间为1-3h；所述水解酶的添加量为体系总质量的2-4%；所述提取时间为0.5-1h；所述乙醇的添加量为加至乙醇的含量为80-85wt%。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述藻多糖提取物、半乳甘露聚糖、羧甲基茯苓多糖的质量比为7-10：1-3：2-4；步骤S3中活化培养的条件为在微缺氧条件下，36-38℃下培养18-24h；所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；所述菌种种子液的含菌量为107-109cfu/mL。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，质量比为3-5:2；所述滤渣、复合蛋白酶的质量比为50:1-2；所述酶解的温度为40-50℃，时间为2-3h；所述加氏乳杆菌、短乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的接种量分别为1-3%、3-5%和2-4%；所述发酵培养的条件为在微缺氧条件下，36-38℃下培养；所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；所述第一时间段为18-24h；所述第二时间段为24-36h；所述含有金属离子和维生素的水溶液为含有3-5wt%的金属离子和3-5wt%维生素的水溶液。
作为本发明的进一步改进，所述金属离子选自钙离子、铁离子、锌离子、铜离子中的至少一种；所述维生素选自维生素B1、维生素B6、维生素B12、维生素C中的至少一种，优选地，所述金属离子为铁离子；所述维生素为维生素B1和维生素B6的组合物，质量比为1:2-3。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述乙酸、丙酸、丁酸的质量比为3-5:1:5-7；步骤S6中所述益生元组合物、藻肽提取物、短链脂肪酸组合物和凝结芽孢杆菌TQ33的质量比为7-12:5-10:2-3:1-2；所述蛋黄卵磷脂和胆固醇的质量比为3-5:1；所述蛋黄卵磷脂和活性组合物的质量比为3-5:10；所述SPG膜的孔隙为5-10µm。
作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述甘蔗渣浸泡的时间为20-30min；所述加热提取的温度为70-80℃，提取时间为10-20min；所述碱溶液为5-10wt%的NaOH或KOH溶液，搅拌反应30-40min；所述甘蔗纤维素、离子液体、引发剂、丙烯酸类单体的质量比为1:5-10：0.01-0.02：2-4；所述活性物脂化物悬浮液和甘蔗纤维素水凝胶的质量比为20:3-5；所述丙烯酸类单体选自甲基丙烯酸、丙烯酸中的至少一种；所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐；所述惰性气体选自氮气、氩气、氦气中的至少一种；所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.藻多糖提取物的制备：将3-5重量份葛仙米藻粉、1-3重量份珊瑚藻藻粉、3-7重量份富硒螺旋藻藻粉混合后，加入50重量份的水中，加入体系总质量的2-4%水解酶和3-7wt%的柠檬酸，所述水解酶为纤维素酶、木聚糖酶按照质量比为3-5:1-3混合制得的复配混合物，45-55℃酶解1-3h，然后加热至沸腾提取0.5-1h，过滤，滤渣留用；滤液中加入乙醇至乙醇的含量为80-85wt%，沉淀，离心，洗涤固体物，得到藻多糖提取物；
S2.益生元组合物的制备：将7-10重量份步骤S1制得的藻多糖提取物、1-3重量份半乳甘露聚糖、2-4重量份羧甲基茯苓多糖混合均匀，制得益生元组合物；
S3.发酵菌的活化：将加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌接种于高氏培养基中，在微缺氧条件下，36-38℃下培养18-24h，得到菌种种子液，含菌量为107-109cfu/mL；
S4.藻肽提取物的制备：将50重量份步骤S1中的滤渣加入水中，加入1-2重量份复合蛋白酶，所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，质量比为3-5:2；40-50℃酶解2-3h，然后接种步骤S3中制得的加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌菌种种子液，接种量分别为1-3%、3-5%和2-4%，在微缺氧条件下，36-38℃下发酵培养18-24h，然后加入含有3-5wt%的铁离子和3-5wt%维生素组合物的水溶液，其中维生素组合物为维生素B1和维生素B6的混合物，质量比为1:2-3，继续发酵培养24-36h，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到藻肽提取物；
S5.短链脂肪酸组合物的制备：将3-5重量份乙酸、1重量份丙酸、5-7重量份丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；
S6.活性物脂化物悬浮液的制备：将7-12重量份步骤S2制得的益生元组合物、5-10重量份步骤S4制得的藻肽提取物、2-3重量份步骤S5制得的短链脂肪酸组合物和1-2重量份凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，得到活性组合物；将3-5重量份蛋黄卵磷脂和1重量份胆固醇溶于乙酸乙酯-乙醇溶液中，所述乙酸乙酯-乙醇的体积比为3-5:2，除去溶剂，干燥，加入50重量份pH=7.2-7.4的磷酸缓冲液中，加入10重量份活性组合物，搅拌混合均匀，用孔隙为5-10µm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，得到活性物脂化物悬浮液；
S7.提高免疫力的益生菌缓释体系的制备：将经过榨汁处理后的甘蔗渣浸泡在水中20-30min，70-80℃加热提取10-20min，过滤，固体干燥，粉碎后得到的5-10重量份甘蔗粉，加入50重量份的5-10wt%的NaOH或KOH溶液中搅拌反应30-40min，过滤，洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素；将1重量份甘蔗纤维素加入5-10重量份1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐中，惰性气体保护下加热至90-100℃溶解，冷却至50-60℃后，加入0.01-0.02重量份引发剂，搅拌15-20min，加入2-4重量份丙烯酸类单体，搅拌反应2-3h，冷却至室温后，用水浸泡并洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素水凝胶；将3-5重量份甘蔗纤维素水凝胶加入到20重量份步骤S6制得的活性物脂化物悬浮液中，浸泡，冷冻干燥，粉碎，得到提高免疫力的益生菌缓释体系；
所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比。
本发明进一步保护一种上述提高免疫力的益生菌缓释体系在制备提高免疫力的产品中的应用。
本发明具有如下有益效果：葛仙米藻、珊瑚藻藻和富硒螺旋藻都是富含多糖、蛋白质的藻类物质，珊瑚藻含有多糖、水溶性膳食纤维、脂肪酸、核黄素、蛋白质等活性成分，其中多糖含量最为丰富；葛仙米富含多糖和蛋白质，其中，多糖含量占比大于30%，蛋白质占比大于35%；富硒螺旋藻是一种营养丰富均衡的健康食品富含优质蛋白质和多糖，且蛋白质含量高达其干重的50-71%，富硒螺旋藻中通过将螺旋藻培养在含硒的营养液中从而得到，其中主要以硒蛋白、硒多糖等有机硒形式存在，起到增强免疫力的效果，具有很强的抗氧化、抗肝损伤和纤维化及抑制肿瘤细胞生长活性；
首先将复合藻粉经过水解酶酶解后提取出多糖物质，进一步加热提取醇沉，得到的藻多糖，是一种很好的益生元，能明显促进肠道益生菌的增殖，调节肠道菌群，增强免疫应答；与半乳甘露聚糖、羧甲基茯苓多糖一同，促进双歧杆菌、乳酸菌丰度显著增加，促进有益菌的增殖，抑制有害菌的生长；
益生菌可以改善肠道健康，平衡菌群，提升机体的抗病能力、新陈代谢能力和消化吸收能力，可以有效地改善消化道菌群的平衡，从而产生有益的作用，从而达到了防治消化道疾病以及提高免疫能力的双重作用的微生物添加剂。运用益生菌制剂可以防治致病菌感染，具有改善肠道功能、增强免疫力、抗高血压，调控泌尿系统健康等功能。
藻蛋白质在木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解作用下，在加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等菌剂的发酵作用下，可以产生大量的有益副产物，包括短蛋白肽、寡肽、小分子多肽等易于被人体直接吸收的营养物质，提高机体免疫力，刺激免疫应答。另外，发酵菌剂还可以在人体内定植的益生菌群及其代谢产物可以通过淋巴结、粘膜等刺激淋巴细胞，促使机体产生能抗同类病原菌的抗体及一些有抑制作用的产物，通过诱导干扰素，促进细胞分裂，产生体液及细胞免疫，并通过血液循环分布到全身，从而调节机体的免疫应答作用。
凝结芽胞杆菌是一种兼性厌氧菌，能适应肠道内低氧环境，进入肠道后，在肠道内定植，通过消耗游离氧，抑制需氧型有害菌的生长提高免疫系统的免疫能力，增强吞噬细胞的活性，增加胃肠道等器官对病原微生物的抵抗能力。凝结芽孢杆菌通过调节细胞因子、抑制活性氧和增强细胞吞噬作用来提高肠道免疫能力，另外凝结芽孢杆菌还能够能促进消化道粘膜发生免疫反应，提高 T 细胞中肿瘤坏死因子（TNF-α）的含量，用来防治病毒感染。
短链脂肪酸可以驱动宿主与肠道微生物之间的相互作用，并与G蛋白偶联受体结合提高宿主免疫力，为上皮细胞提供能量以刺激细胞增殖、分化和成熟，减少细胞的凋亡。包括乙酸、丙酸和丁酸，其中，乙酸可以被吸收入血液，进入肝中代谢，用于脂质和胆固醇的合成并作为周边组织的能源。丙酸经结肠吸收后可作为糖异生的底物，并能抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的活性而降低胆固醇的合成，调节血脂。丁酸能被结肠上皮细胞吸收利用，是结肠、盲肠能量的首选来源，刺激肠道蠕动。三者的合适比例下，可以有效抑制肠道炎症，维持结肠上皮细胞屏障功能，起到抗炎、免疫调节及抗肿瘤等作用。
本发明通过将益生元组合物、藻肽提取物、短链脂肪酸组合物和凝结芽孢杆菌TQ33混合并包埋于蛋黄卵磷脂脂化物内，进一步，通过将甘蔗渣提前出纤维素，纤维素表面富含大量的羟基，形成大量的分子内和分子间氢键，从而构成高度有序的结晶区，这些高度结晶区使得纤维素对水的亲和作用变小，因此其在常规溶剂中的溶解度极低，本发明通过将其溶解于离子液体中，制备得到水凝胶，并将纤维素表面羧基化，使得其对pH敏感，在高pH环境下溶胀度远远高于低pH环境下，从而使得其在胃酸存在时释放量极少，而进入肠道后，在高pH条件下，大量释放包埋有活性物质的脂化物，实现对功能性成分的靶向输送和控制释放。另一方面，本发明大量重新利用了生物废渣甘蔗渣，变废为宝，具有极好的环境效益。
本发明制得的提高免疫力的益生菌缓释体系不仅能改善肠道健康，平衡菌群，提升机体的抗病能力、新陈代谢能力和消化吸收能力，可以有效地改善消化道菌群的平衡，能实现将益生菌在肠道中靶向输送和控制释放，被人体直接吸收，提高机体免疫力，刺激免疫应答，同时，大量重新利用了生物废渣甘蔗渣，变废为宝，具有极好的环境效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制得的甘蔗纤维素水凝胶的SEM图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
葛仙米藻粉由湖南炎帝生物工程有限公司提供；珊瑚藻藻粉购于荣成市崖头润玉贸易行；富硒螺旋藻藻粉藻种由暨南大学水生生物研究所藻种室提供，按文献（黄峙，杨芳，郑文杰．高等学校化学学报）方法委托湖南炎帝生物工程有限公司培养制得，硒含量为450-500µg/g。纤维素酶，2.5万U/mL，试剂级，购于上海阿拉丁公司；木聚糖酶，5万U/g，食品级，购于北京麦瑞博生物科技有限公司；木瓜蛋白酶，10万U/g，中性蛋白酶，20万U/g，均购于南宁东恒华道生物科技有限责任公司。凝结芽孢杆菌TQ33，由天津科技大学应用微生物教研室提供，其为该教研室在进行乳酸芽胞菌的研究中，从脱脂奶粉中分离到的同型乳酸发酵的芽胞杆菌，经鉴定为凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans，TQ33)；羧甲基茯苓多糖，含量大于60%，购于湖南补天药业有限公司；半乳甘露聚糖，含量大于99%，购于山东谷康生物工程有限公司；加氏乳杆菌，为加氏乳杆菌BC12，购于上海莼试生物技术有限公司；短乳杆菌，为冻干粉，ATCC183，购于上海晅科生物科技有限公司；罗伊氏乳杆菌，为罗伊氏乳杆菌DSM17938，纯度大于98%，购于兰州沃特莱斯生物科技有限公司；蛋黄卵磷脂，纯度大于90%，胆固醇，纯度>95%，购于上海阿拉丁公司。
1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐购于浙江蓝德能源科技发展有限公司，结构式如下：
Figure 317013DEST_PATH_IMAGE001
。
实施例1
本实施例提供一种提高免疫力的益生菌缓释体系，制备方法具体包括以下步骤：
S1.藻多糖提取物的制备：将3g葛仙米藻粉、1g珊瑚藻藻粉、3g富硒螺旋藻藻粉混合后，加入50g的水中，加入体系总质量的2%水解酶和3wt%的柠檬酸，所述水解酶为纤维素酶、木聚糖酶按照质量比为3:1混合制得的复配混合物，45℃酶解1h，然后加热至沸腾提取0.5h，过滤，滤渣留用；滤液中加入乙醇至乙醇的含量为80wt%，沉淀，离心，洗涤固体物，得到藻多糖提取物；
S2.益生元组合物的制备：将7g步骤S1制得的藻多糖提取物、1g半乳甘露聚糖、2g羧甲基茯苓多糖混合均匀，制得益生元组合物；
S3.发酵菌的活化：将加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌接种于高氏培养基中，在微缺氧条件下，36℃下培养18h，得到菌种种子液，含菌量为107cfu/mL；
S4.藻肽提取物的制备：将50g步骤S1中的滤渣加入水中，加入1g复合蛋白酶，所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，质量比为3:2；40℃酶解2h，然后接种步骤S3中制得的加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌菌种种子液，接种量分别为1%、3%和2%，在微缺氧条件下，36℃下发酵培养18h，然后加入含有3wt%的铁离子和3wt%维生素组合物的水溶液，其中维生素组合物为维生素B1和维生素B6的混合物，质量比为1:2，继续发酵培养24h，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到藻肽提取物；
S5.短链脂肪酸组合物的制备：将3g乙酸、1g丙酸、5g丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；
S6.活性物脂化物悬浮液的制备：将7g步骤S2制得的益生元组合物、5g步骤S4制得的藻肽提取物、2g步骤S5制得的短链脂肪酸组合物和1g凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，得到活性组合物；将3g蛋黄卵磷脂和1g胆固醇溶于乙酸乙酯-乙醇溶液中，所述乙酸乙酯-乙醇的体积比为3:2，除去溶剂，干燥，加入50g pH=7.2的磷酸缓冲液中，加入10g活性组合物，搅拌混合均匀，用孔隙为5µm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，得到活性物脂化物悬浮液；
S7.提高免疫力的益生菌缓释体系的制备：将经过榨汁处理后的甘蔗渣浸泡在水中20min，70℃加热提取10min，过滤，固体干燥，粉碎后得到的5g甘蔗粉，加入50g的5wt%的NaOH溶液中搅拌反应30min，过滤，洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素；将10g甘蔗纤维素加入50g1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐中，氮气保护下加热至90℃溶解，冷却至50℃后，加入0.1g过硫酸铵，搅拌15min，加入20g丙烯酸，搅拌反应2h，冷却至室温后，用水浸泡并洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素水凝胶；图1为制得的甘蔗纤维素水凝胶的SEM图。由图可知该体系内部呈现三维网状结构，均匀分布着致密的孔隙，从而提供更多的吸附位点并改善水凝胶的吸附性能。将3g甘蔗纤维素水凝胶加入到20g步骤S6制得的活性物脂化物悬浮液中，浸泡，冷冻干燥，粉碎，得到提高免疫力的益生菌缓释体系；
所述微缺氧条件为氧气含量为7%，二氧化碳含量为3%，余量为氮气，其中，%为体积百分比。
实施例2
本实施例提供一种提高免疫力的益生菌缓释体系，制备方法具体包括以下步骤：
S1.藻多糖提取物的制备：将5g葛仙米藻粉、3g珊瑚藻藻粉、7g富硒螺旋藻藻粉混合后，加入50g的水中，加入体系总质量的4%水解酶和7wt%的柠檬酸，所述水解酶为纤维素酶、木聚糖酶按照质量比为5:3混合制得的复配混合物，55℃酶解3h，然后加热至沸腾提取1h，过滤，滤渣留用；滤液中加入乙醇至乙醇的含量为85wt%，沉淀，离心，洗涤固体物，得到藻多糖提取物；
S2.益生元组合物的制备：将10g步骤S1制得的藻多糖提取物、3g半乳甘露聚糖、4g羧甲基茯苓多糖混合均匀，制得益生元组合物；
S3.发酵菌的活化：将加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌接种于高氏培养基中，在微缺氧条件下，38℃下培养24h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S4.藻肽提取物的制备：将50g步骤S1中的滤渣加入水中，加入2g复合蛋白酶，所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，质量比为5:2；50℃酶解3h，然后接种步骤S3中制得的加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌菌种种子液，接种量分别为3%、5%和4%，在微缺氧条件下，38℃下发酵培养24h，然后加入含有5wt%的铁离子和5wt%维生素组合物的水溶液，其中维生素组合物为维生素B1和维生素B6的混合物，质量比为1:3，继续发酵培养36h，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到藻肽提取物；
S5.短链脂肪酸组合物的制备：将5g乙酸、1g丙酸、7g丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；
S6.活性物脂化物悬浮液的制备：将12g步骤S2制得的益生元组合物、10g步骤S4制得的藻肽提取物、3g步骤S5制得的短链脂肪酸组合物和2g凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，得到活性组合物；将5g蛋黄卵磷脂和1g胆固醇溶于乙酸乙酯-乙醇溶液中，所述乙酸乙酯-乙醇的体积比为5:2，除去溶剂，干燥，加入50g pH=7.4的磷酸缓冲液中，加入10g活性组合物，搅拌混合均匀，用孔隙为10µm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，得到活性物脂化物悬浮液；
S7.提高免疫力的益生菌缓释体系的制备：将经过榨汁处理后的甘蔗渣浸泡在水中30min，80℃加热提取20min，过滤，固体干燥，粉碎后得到的10g甘蔗粉，加入50g的10wt%的KOH溶液中搅拌反应40min，过滤，洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素；将10g甘蔗纤维素加入100g 1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐中，氮气保护下加热至100℃溶解，冷却至60℃后，加入0.2g过硫酸钾，搅拌20min，加入40g甲基丙烯酸，搅拌反应3h，冷却至室温后，用水浸泡并洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素水凝胶；将5g甘蔗纤维素水凝胶加入到20g步骤S6制得的活性物脂化物悬浮液中，浸泡，冷冻干燥，粉碎，得到提高免疫力的益生菌缓释体系；
所述微缺氧条件为氧气含量为12%，二氧化碳含量为5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比。
实施例3
本实施例提供一种提高免疫力的益生菌缓释体系，制备方法具体包括以下步骤：
S1.藻多糖提取物的制备：将4g葛仙米藻粉、2g珊瑚藻藻粉、5g富硒螺旋藻藻粉混合后，加入50g的水中，加入体系总质量的3%水解酶和5wt%的柠檬酸，所述水解酶为纤维素酶、木聚糖酶按照质量比为4:2混合制得的复配混合物，50℃酶解2h，然后加热至沸腾提取1h，过滤，滤渣留用；滤液中加入乙醇至乙醇的含量为82wt%，沉淀，离心，洗涤固体物，得到藻多糖提取物；
S2.益生元组合物的制备：将8g步骤S1制得的藻多糖提取物、2g半乳甘露聚糖、3g羧甲基茯苓多糖混合均匀，制得益生元组合物；
S3.发酵菌的活化：将加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌接种于高氏培养基中，在微缺氧条件下，37℃下培养22h，得到菌种种子液，含菌量为108cfu/mL；
S4.藻肽提取物的制备：将50g步骤S1中的滤渣加入水中，加入1.5g复合蛋白酶，所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，质量比为4:2；45℃酶解2.5h，然后接种步骤S3中制得的加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌菌种种子液，接种量分别为2%、4%和3%，在微缺氧条件下，37℃下发酵培养22h，然后加入含有4wt%的铁离子和4wt%维生素组合物的水溶液，其中维生素组合物为维生素B1和维生素B6的混合物，质量比为1:2.5，继续发酵培养30h，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到藻肽提取物；
S5.短链脂肪酸组合物的制备：将4g乙酸、1g丙酸、6g丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；
S6.活性物脂化物悬浮液的制备：将10g步骤S2制得的益生元组合物、7g步骤S4制得的藻肽提取物、2.5g步骤S5制得的短链脂肪酸组合物和1.5g凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，得到活性组合物；将4g蛋黄卵磷脂和1g胆固醇溶于乙酸乙酯-乙醇溶液中，所述乙酸乙酯-乙醇的体积比为4:2，除去溶剂，干燥，加入50g pH=7.3的磷酸缓冲液中，加入10g活性组合物，搅拌混合均匀，用孔隙为7µm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，得到活性物脂化物悬浮液；
S7.提高免疫力的益生菌缓释体系的制备：将经过榨汁处理后的甘蔗渣浸泡在水中25min，75℃加热提取15min，过滤，固体干燥，粉碎后得到的7g甘蔗粉，加入50g的7wt%的NaOH溶液中搅拌反应35min，过滤，洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素；将10g甘蔗纤维素加入75g1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐中，氮气保护下加热至95℃溶解，冷却至55℃后，加入0.15g过硫酸钾，搅拌17min，加入30g甲基丙烯酸，搅拌反应2.5h，冷却至室温后，用水浸泡并洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素水凝胶；将4g甘蔗纤维素水凝胶加入到20g步骤S6制得的活性物脂化物悬浮液中，浸泡，冷冻干燥，粉碎，得到提高免疫力的益生菌缓释体系；
所述微缺氧条件为氧气含量为10%，二氧化碳含量为4%，余量为氮气，其中，%为体积百分比。
实施例4
与实施例3相比，步骤S1中未添加纤维素酶酶解，其他条件均不改变。
实施例5
与实施例3相比，步骤S1中未添加木聚糖酶酶解，其他条件均不改变。
实施例6
与实施例3相比，步骤S4中复合蛋白酶由单一的木瓜蛋白酶替代，其他条件均不改变。
实施例7
与实施例3相比，步骤S4中复合蛋白酶由单一的中性蛋白酶替代，其他条件均不改变。
对比例1
与实施例3相比，步骤S1中未添加葛仙米藻粉，其他条件均不改变。
对比例2
与实施例3相比，步骤S1中未添加珊瑚藻藻粉，其他条件均不改变。
对比例3
与实施例3相比，步骤S1中未添加富硒螺旋藻藻粉，其他条件均不改变。
对比例4
与实施例3相比，步骤S1中未进行酶解，其他条件均不改变。
对比例5
与实施例3相比，步骤S2中未添加步骤S1制得的藻多糖提取物，其他条件均不改变。
对比例6
与实施例3相比，步骤S4中未进行复合酶酶解，其他条件均不改变。
对比例7
与实施例3相比，步骤S4中未接种加氏乳杆菌，其他条件均不改变。
对比例8
与实施例3相比，步骤S4中未接种短乳杆菌，其他条件均不改变。
对比例9
与实施例3相比，步骤S4中未接种罗伊氏乳杆菌，其他条件均不改变。
对比例10
与实施例3相比，步骤S4中未添加含有4wt%的铁离子和4wt%维生素组合物的水溶液，其他条件均不改变。
对比例11
与实施例3相比，步骤S6中未添加步骤S5制得的短链脂肪酸组合物，其他条件均不改变。
对比例12
与实施例3相比，步骤S6中未添加步骤S4制得的藻肽提取物，其他条件均不改变。
对比例13
与实施例3相比，步骤S6中未添加凝结芽孢杆菌Q33，其他条件均不改变。
对比例14
与实施例3相比，步骤S6未将活性组合物制备成活性物脂化物悬浮液，且未进行步骤S7，其他条件均不改变。
对比例15
与实施例3相比，步骤S7中甘蔗纤维素未羧酸化，其他条件均不改变。
测试例1 缓控释试验
将1g本发明实施例1-3和对比例14、15制得的提高免疫力的益生菌缓释体系分别加入到9mL人工模拟胃液和9mL人工模拟肠液中，在37℃、70r/min条件下分别反应2h和3h，另外，取等量的提高免疫力的益生菌缓释体系加入到9mL人工模拟胃液中，先置于摇床中，在37℃、70r/min条件下反应2h后，离心，再加入9mL人工模拟肠液继续反应3h。反应结束后进行益生菌群细胞计数。按照以下公式计算存活率：
存活率(%)=Nt/N0×100%
式中，Nt为在体外人工模拟胃液或人工模拟肠液中孵育一定时间后存活的益生菌浓度(cfu/g)，N0为人工模拟胃液或人工模拟肠液中添加的益生菌原始浓度(cfu/g)。
按照以下公式计算释放率：
释放率(%)=（Wt-W0）/W0×100%
式中，Wt为样品起始重量；W0为样品在体外模拟人工模拟胃液和人工模拟肠液中孵育一定时间后重量。
结果见表1。
表1
Figure 562050DEST_PATH_IMAGE002
由上表可知，本发明实施例1-3制得的提高免疫力的益生菌缓释体系在人工模拟胃液中能保持较好的完整性，转移至人工模拟肠液中后，大量释放活性物质，说明该提高免疫力的益生菌缓释体系具有pH响应性和抵抗模拟胃液的特性，在高pH环境下溶胀度远远高于低pH环境下，从而使得其在胃酸存在时释放量极少，而进入肠道后，在高pH条件下，大量释放包埋有活性物质的脂化物，具有较好的在肠道中靶向输送和控制释放活性组分的效果。
测试例2 免疫调节小鼠试验
试验动物：雄性SPF级BABL/C小鼠，6-7周龄，平均体重（22±2）g。
动物模型建立与分组：实验小鼠在适应喂养一周后，随机分为24组（每组10只），分别为正常组、模型组、实施例1-7组、对比例1-15组。从实验第1天开始，实施例1-7组、对比例1-15组小鼠每天灌胃给与1g/kg实施例1-7或对比例15制得的提高免疫力的益生菌缓释体系，连续喂养28d；从第25天开始，连续4d给小鼠腹腔注射环磷酰胺（正常组除外），试验期间正常给水喂食。
体重与脏器指数检测：最后一次灌胃结束后当晚给小鼠禁食12h，第2天称量各组小鼠空腹体重，计为最终体重。之后，处死小鼠进行组织取材与称重。
脏器指数（mg/g）=脏器质量（mg）/最终体重（g）
脏器指数结果见表2。
血清免疫球蛋白、细胞因子及内毒素含量检测：最后一次灌胃结束后当晚给小鼠禁食12h，次日，对小鼠进行摘取眼球采血。所有血样在室温下静置60min，离心，吸取上层血清，按照试剂盒说明书步骤，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清中脂多糖（LPS），干扰素（IFN）-γ，肿瘤坏死因子（TNF）-α，白介素（IL）-4，免疫球蛋白（Ig）G的质量浓度。
结果见表3。
表2
组别 脾脏指数（mg/g） 胸腺指数（mg/g）
正常组 3.24±0.32 1.83±0.41
模型组 1.33±0.28# 0.35±0.22#
实施例1 2.45±0.12* 1.32±0.31*
实施例2 2.52±0.14* 1.35±0.27*
实施例3 2.57±0.11* 1.37±0.35*
实施例4 2.40±0.17 1.27±0.32
实施例5 2.38±0.14 1.28±0.33
实施例6 2.46±0.19 1.30±0.37
实施例7 2.43±0.21 1.29±0.35
对比例1 2.18±0.12 1.16±0.31
对比例2 2.13±0.14 1.14±0.29
对比例3 2.05±0.13 1.02±0.25
对比例4 2.34±0.16 1.25±0.31
对比例5 2.02±0.18 0.98±0.22
对比例6 2.39±0.14 1.27±0.34
对比例7 2.32±0.22 1.22±0.36
对比例8 2.30±0.19 1.23±0.27
对比例9 2.31±0.21 1.20±0.24
对比例10 2.37±0.17 1.27±0.21
对比例11 2.45±0.15 1.29±0.17
对比例12 2.10±0.19 1.13±0.32
对比例13 2.06±0.22 1.09±0.19
对比例14 1.56±0.14 0.57±0.25
对比例15 1.78±0.17 0.72±0.29
注释：#为与正常组相比，P<0.05；*为与模型组相比，P<0.05。
与正常组相比较，模型组小鼠的体重增量、脾脏指数和胸腺指数显著下降（P<0.05），表明环磷酰胺对小鼠免疫造成了严重损害，成功构建了小鼠免疫低下模型；经本发明实施例1-3制得的提高免疫力的益生菌缓释体系干预后，体重增量、脾脏指数和胸腺指数明显提高。
表3
组别 LPS（EU/L） IFN-γ（pg/mL） TNF-α（pg/mL） IL-4（pg/mL） IgG（mg/mL）
正常组 34.5±3.21 1322±128.5 975±98.2 278.5±22.1 22.4±2.13
模型组 42.7±4.13# 987±142.1# 1324±113.5# 189.2±15.2# 16.7±2.42#
实施例1 36.5±3.29* 1220±124.2* 1012±105.2* 244.4±24.2* 20.1±2.33*
实施例2 36.2±3.41* 1232±103.2* 1003±104.5* 245.5±23.5* 20.7±2.31*
实施例3 35.4±3.64* 1278±88.9* 988±110.2* 247.7±23.1* 21.6±2.26*
实施例4 37.6±3.53 1134±123.1 1132±115.2 230.5±23.8 19.4±2.25
实施例5 37.7±3.61 1146±118.4 1141±131.2 234.2±22.4 19.2±2.40
实施例6 37.1±3.72 1110±105.7 1095±124.2 236.7±22.7 19.6±2.39
实施例7 37.4±3.54 1107±98.2 1112±127.3 235.1±23.7 19.5±2.44
对比例1 39.2±3.48 1042±95.3 1235±114.4 212.4±21.4 18.2±2.30
对比例2 39.6±3.11 1051±88.5 1248±109.4 211.7±22.1 18.4±2.13
对比例3 39.9±3.04 1039±92.4 1257±142.1 208.6±19.5 18.0±2.22
对比例4 38.0±2.98 1180±104.2 1197±138.2 226.1±24.1 19.0±2.15
对比例5 39.5±3.10 1052±125.7 1238±132.4 214.4±26.5 18.2±2.29
对比例6 38.2±3.46 1099±118.3 1210±125.2 220.5±25.6 18.7±2.43
对比例7 38.6±2.78 1072±120.1 1212±126.4 225.4±26.4 18.6±2.37
对比例8 38.9±2.95 1064±131.2 1207±129.3 223.2±25.3 18.4±2.15
对比例9 39.1±3.12 1084±129.5 1211±111.4 222.1±22.1 18.5±2.07
对比例10 37.7±3.56 1202±132.5 1178±105.2 229.2±21.0 19.4±2.11
对比例11 37.2±3.82 1110±114.2 1107±107.3 234.2±20.4 19.3±2.14
对比例12 39.7±3.94 1047±105.2 1242±92.4 210.8±21.6 18.1±2.05
对比例13 40.0±3.71 1049±100.9 1252±100.7 207.6±20.9 18.2±2.56
对比例14 41.5±3.85 998±94.5 1297±99.2 193.2±18.8 17.2±2.34
对比例15 40.7±3.56 1010±89.7 1270±102.5 201.2±19.3 17.7±2.18
注释：#为与正常组相比，P<0.05；*为与模型组相比，P<0.05。
经本发明实施例1-3制得的提高免疫力的益生菌缓释体系干预后，小鼠血清中lgG、IL-4、IFN-γ水平显著增高，TNF-α和LPS水平显著下降（P<0.05），说明本发明实施例1-3制得的提高免疫力的益生菌缓释体系可以有效缓解环磷酰胺对小鼠的免疫抑制，减轻炎症，提高免疫低下小鼠的免疫功能。
实施例4、5与实施例3相比，步骤S1中未添加纤维素酶酶解或木聚糖酶酶解。对比例4与实施例3相比，步骤S1中未进行酶解。体重增量下降，脏器指数下降，LPS、TNF-α含量提高，IFN-γ、IL-4、IgG含量下降，本发明将复合藻粉经过水解酶酶解后提取出多糖物质，进一步加热提取醇沉，得到的藻多糖，是一种很好的益生元，能明显促进肠道益生菌的增殖，调节肠道菌群，增强免疫应答；与甘露聚糖、羧甲基茯苓多糖一同，促进双歧杆菌、乳酸菌丰度显著增加，促进有益菌的增殖，抑制有害菌的生长。
实施例6、7与实施例3相比，步骤S4中复合蛋白酶由单一的木瓜蛋白酶或中性蛋白酶替代。对比例6与实施例3相比，步骤S4中未进行复合酶酶解。对比例7、8、9与实施例3相比，步骤S4中未接种加氏乳杆菌、短乳杆菌或罗伊氏乳杆菌，体重增量下降，脏器指数下降，LPS、TNF-α含量提高，IFN-γ、IL-4、IgG含量下降。对比例12与实施例3相比，步骤S6中未添加步骤S4制得的藻肽提取物，体重增量下降，脏器指数明显下降，LPS、TNF-α含量明显提高，IFN-γ、IL-4、IgG含量明显下降。益生菌可以改善肠道健康，平衡菌群，提升机体的抗病能力、新陈代谢能力和消化吸收能力，可以有效地改善消化道菌群的平衡，从而产生有益的作用，从而达到了防治消化道疾病以及提高免疫能力的双重作用的微生物添加剂。运用益生菌制剂可以防治致病菌感染，具有改善肠道功能、增强免疫力、抗高血压，调控泌尿系统健康等功能。藻蛋白质在木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解作用下，在加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等菌剂的发酵作用下，可以产生大量的有益副产物，包括短蛋白肽、寡肽、小分子多肽等易于被人体直接吸收的营养物质，提高机体免疫力，刺激免疫应答。另外，发酵菌剂还可以在人体内定植的益生菌群及其代谢产物可以通过淋巴结、粘膜等刺激淋巴细胞，促使机体产生能抗同类病原菌的抗体及一些有抑制作用的产物，通过诱导干扰素，促进细胞分裂，产生体液及细胞免疫，并通过血液循环分布到全身，从而调节机体的免疫应答作用。
对比例10与实施例3相比，步骤S4中未添加含有4wt%的铁离子和4wt%维生素组合物的水溶液，脏器指数下降，LPS、TNF-α含量提高，IFN-γ、IL-4、IgG含量下降。加入含有铁离子和维生素组合物的水溶液，一方面，铁离子能明显提高益生菌的抗逆性从而促进其发酵和增殖；另一方面，维生素组合物能延长益生菌在稳定期的时间，增加有益产物的生成，提高产量。
对比例1、2、3与实施例3相比，步骤S1中未添加葛仙米藻粉、珊瑚藻藻粉或富硒螺旋藻藻粉，体重增量下降，脏器指数明显下降，LPS、TNF-α含量提高，IFN-γ、IL-4、IgG含量明显下降。对比例5与实施例3相比，步骤S2中未添加步骤S1制得的藻多糖提取物。葛仙米藻、珊瑚藻藻和富硒螺旋藻都是富含多糖、蛋白质的藻类物质，珊瑚藻含有多糖、水溶性膳食纤维、脂肪酸、核黄素、蛋白质等活性成分，其中多糖含量最为丰富；葛仙米富含多糖和蛋白质，其中，多糖含量占比大于30%，蛋白质占比大于35%；富硒螺旋藻是一种营养丰富均衡的健康食品富含优质蛋白质和多糖，且蛋白质含量高达其干重的50-71%，富硒螺旋藻中通过将螺旋藻培养在含硒的营养液中从而得到，其中主要以硒蛋白、硒多糖等有机硒形式存在，起到增强免疫力的效果，具有很强的抗氧化、抗肝损伤和纤维化及抑制肿瘤细胞生长活性。
对比例11与实施例3相比，步骤S6中未添加步骤S5制得的短链脂肪酸组合物，体重增量下降，脏器指数明显下降，LPS、TNF-α含量提高，IFN-γ、IL-4、IgG含量下降。短链脂肪酸可以驱动宿主与肠道微生物之间的相互作用，并与G蛋白偶联受体结合提高宿主免疫力，为上皮细胞提供能量以刺激细胞增殖、分化和成熟，减少细胞的凋亡。包括乙酸、丙酸和丁酸，其中，乙酸可以被吸收入血液，进入肝中代谢，用于脂质和胆固醇的合成并作为周边组织的能源。丙酸经结肠吸收后可作为糖异生的底物，并能抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的活性而降低胆固醇的合成，调节血脂。丁酸能被结肠上皮细胞吸收利用，是结肠、盲肠能量的首选来源，刺激肠道蠕动。三者的合适比例下，可以有效抑制肠道炎症，维持结肠上皮细胞屏障功能，起到抗炎、免疫调节及抗肿瘤等作用。
对比例13与实施例3相比，步骤S6中未添加凝结芽孢杆菌Q33，体重增量下降，脏器指数明显下降，LPS、TNF-α含量明显提高，IFN-γ、IL-4、IgG含量明显下降。凝结芽胞杆菌进入肠道后，在肠道内定植，通过消耗游离氧，抑制需氧型有害菌的生长提高免疫系统的免疫能力，增强吞噬细胞的活性，增加胃肠道等器官对病原微生物的抵抗能力，通过调节细胞因子、抑制活性氧和增强细胞吞噬作用来提高肠道免疫能力，另外凝结芽孢杆菌还能够能促进消化道粘膜发生免疫反应，提高 T 细胞中肿瘤坏死因子（TNF-α）的含量，用来防治病毒感染。
对比例14与实施例3相比，步骤S6未将活性组合物制备成活性物脂化物悬浮液，且未进行步骤S7。对比例15与实施例3相比，步骤S7中甘蔗纤维素未羧酸化，体重增量明显下降，脏器指数明显下降，LPS、TNF-α含量明显提高，IFN-γ、IL-4、IgG含量明显下降。对比例14中活性物质未被包埋，进入在人工胃液和人工肠液中均存活率较低，大量释放；对比例15中甘蔗纤维素未进行羧基化改性，对pH不敏感，从而使得其在人工胃液和人工肠液中均大量释放，无法实现靶向输送的效果。本发明通过将益生元组合物、藻肽提取物、短链脂肪酸组合物和凝结芽孢杆菌Q33混合并包埋于蛋黄卵磷脂脂化物内，进一步，通过将甘蔗渣提前出纤维素，纤维素表面富含大量的羟基，形成大量的分子内和分子间氢键，从而构成高度有序的结晶区，这些高度结晶区使得纤维素对水的亲和作用变小，因此其在常规溶剂中的溶解度极低，本发明通过将其溶解于离子液体中，制备得到水凝胶，并将纤维素表面羧基化，使得其对pH敏感，在高pH环境下溶胀度远远高于低pH环境下，从而使得其在胃酸存在时释放量极少，而进入肠道后，在高pH条件下，大量释放包埋有活性物质的脂化物，实现对功能性成分的靶向输送和控制释放。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高免疫力的益生菌缓释体系，其特征在于，由以下原料按重量份制备而成：益生元组合物7-12份、藻肽提取物5-10份、短链脂肪酸组合物2-3份、凝结芽孢杆菌TQ33 1-2份、甘蔗纤维素水凝胶13.5-37.5份。
2.根据权利要求1所述提高免疫力的益生菌缓释体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.藻多糖提取物的制备：将葛仙米藻粉、珊瑚藻藻粉、富硒螺旋藻藻粉混合后，加入水中，加入水解酶和柠檬酸，酶解，然后加热至沸腾，提取，过滤，滤渣留用；滤液中加入乙醇，沉淀，离心，洗涤固体物，得到藻多糖提取物；
S2.益生元组合物的制备：将步骤S1制得的藻多糖提取物、半乳甘露聚糖、羧甲基茯苓多糖混合均匀，制得益生元组合物；
S3.发酵菌的活化：将加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌接种于高氏培养基中，活化培养成菌种种子液；
S4.藻肽提取物的制备：将步骤S1中的滤渣加入水中，加入复合蛋白酶，酶解，然后接种步骤S3中制得的加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌菌种种子液，发酵培养第一时间段，然后加入含有金属离子和维生素的水溶液，继续发酵培养第二时间段，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到藻肽提取物；
S5.短链脂肪酸组合物的制备：将乙酸、丙酸、丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；
S6.活性物脂化物悬浮液的制备：将步骤S2制得的益生元组合物、步骤S4制得的藻肽提取物、步骤S5制得的短链脂肪酸组合物和凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，得到活性组合物；蛋黄卵磷脂和胆固醇溶于乙酸乙酯-乙醇溶液中，除去溶剂，干燥，加入磷酸缓冲液中，加入活性组合物，搅拌混合均匀，用SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，得到活性物脂化物悬浮液；
S7.提高免疫力的益生菌缓释体系的制备：将经过榨汁处理后的甘蔗渣浸泡在水中，加热提取，过滤，固体干燥，粉碎后得到甘蔗粉，加入碱溶液中搅拌反应，过滤，洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素；将甘蔗纤维素加入离子液体中，惰性气体保护下加热至90-100℃溶解，冷却至50-60℃后，加入引发剂，搅拌，加入丙烯酸类单体，搅拌反应，冷却至室温后，用水浸泡并洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素水凝胶；加入步骤S6制得的活性物脂化物悬浮液中，浸泡，冷冻干燥，粉碎，得到提高免疫力的益生菌缓释体系。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述葛仙米藻粉、珊瑚藻藻粉、富硒螺旋藻藻粉的质量比为3-5:1-3:3-7；所述水解酶为纤维素酶、木聚糖酶按照质量比为3-5:1-3混合制得的复配混合物；所述酶解温度为45-55℃，时间为1-3h；所述水解酶的添加量为体系总质量的2-4%；所述提取时间为0.5-1h；所述乙醇的添加量为加至乙醇的含量为80-85wt%。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述藻多糖提取物、半乳甘露聚糖、羧甲基茯苓多糖的质量比为7-10：1-3：2-4；步骤S3中活化培养的条件为在微缺氧条件下，36-38℃下培养18-24h；所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；所述菌种种子液的含菌量为107-109cfu/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，质量比为3-5:2；所述滤渣、复合蛋白酶的质量比为50:1-2；所述酶解的温度为40-50℃，时间为2-3h；所述加氏乳杆菌、短乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的接种量分别为1-3%、3-5%和2-4%；所述发酵培养的条件为在微缺氧条件下，36-38℃下培养；所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比；所述第一时间段为18-24h；所述第二时间段为24-36h；所述含有金属离子和维生素的水溶液为含有3-5wt%的金属离子和3-5wt%维生素的水溶液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述金属离子选自钙离子、铁离子、锌离子、铜离子中的至少一种；所述维生素选自维生素B1、维生素B6、维生素B12、维生素C中的至少一种；所述维生素为维生素B1和维生素B6的组合物，质量比为1:2-3。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述乙酸、丙酸、丁酸的质量比为3-5:1:5-7；步骤S6中所述益生元组合物、藻肽提取物、短链脂肪酸组合物和凝结芽孢杆菌TQ33的质量比为7-12:5-10:2-3:1-2；所述蛋黄卵磷脂和胆固醇的质量比为3-5:1；所述蛋黄卵磷脂和活性组合物的质量比为3-5:10；所述SPG膜的孔隙为5-10µm。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S7中所述甘蔗渣浸泡的时间为20-30min；所述加热提取的温度为70-80℃，提取时间为10-20min；所述碱溶液为5-10wt%的NaOH或KOH溶液，搅拌反应30-40min；所述甘蔗纤维素、离子液体、引发剂、丙烯酸类单体的质量比为1:5-10：0.01-0.02：2-4；所述活性物脂化物悬浮液和甘蔗纤维素水凝胶的质量比为20:3-5；所述丙烯酸类单体选自甲基丙烯酸、丙烯酸中的至少一种；所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐；所述惰性气体选自氮气、氩气、氦气中的至少一种；所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠中的至少一种。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.藻多糖提取物的制备：将3-5重量份葛仙米藻粉、1-3重量份珊瑚藻藻粉、3-7重量份富硒螺旋藻藻粉混合后，加入50重量份的水中，加入体系总质量的2-4%水解酶和3-7wt%的柠檬酸，所述水解酶为纤维素酶、木聚糖酶按照质量比为3-5:1-3混合制得的复配混合物，45-55℃酶解1-3h，然后加热至沸腾提取0.5-1h，过滤，滤渣留用；滤液中加入乙醇至乙醇的含量为80-85wt%，沉淀，离心，洗涤固体物，得到藻多糖提取物；
S2.益生元组合物的制备：将7-10重量份步骤S1制得的藻多糖提取物、1-3重量份半乳甘露聚糖、2-4重量份羧甲基茯苓多糖混合均匀，制得益生元组合物；
S3.发酵菌的活化：将加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌接种于高氏培养基中，在微缺氧条件下，36-38℃下培养18-24h，得到菌种种子液，含菌量为107-109cfu/mL；
S4.藻肽提取物的制备：将50重量份步骤S1中的滤渣加入水中，加入1-2重量份复合蛋白酶，所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，质量比为3-5:2；40-50℃酶解2-3h，然后接种步骤S3中制得的加氏乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌菌种种子液，接种量分别为1-3%、3-5%和2-4%，在微缺氧条件下，36-38℃下发酵培养18-24h，然后加入含有3-5wt%的铁离子和3-5wt%维生素组合物的水溶液，其中维生素组合物为维生素B1和维生素B6的混合物，质量比为1:2-3，继续发酵培养24-36h，过滤，浓缩，冷冻干燥，得到藻肽提取物；
S5.短链脂肪酸组合物的制备：将3-5重量份乙酸、1重量份丙酸、5-7重量份丁酸混合均匀，制得短链脂肪酸组合物；
S6.活性物脂化物悬浮液的制备：将7-12重量份步骤S2制得的益生元组合物、5-10重量份步骤S4制得的藻肽提取物、2-3重量份步骤S5制得的短链脂肪酸组合物和1-2重量份凝结芽孢杆菌TQ33混合均匀，得到活性组合物；将3-5重量份蛋黄卵磷脂和1重量份胆固醇溶于乙酸乙酯-乙醇溶液中，所述乙酸乙酯-乙醇的体积比为3-5:2，除去溶剂，干燥，加入50重量份pH=7.2-7.4的磷酸缓冲液中，加入10重量份活性组合物，搅拌混合均匀，用孔隙为5-10µm的SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，得到活性物脂化物悬浮液；
S7.提高免疫力的益生菌缓释体系的制备：将经过榨汁处理后的甘蔗渣浸泡在水中20-30min，70-80℃加热提取10-20min，过滤，固体干燥，粉碎后得到的5-10重量份甘蔗粉，加入50重量份的5-10wt%的NaOH或KOH溶液中搅拌反应30-40min，过滤，洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素；将1重量份甘蔗纤维素加入5-10重量份1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐中，惰性气体保护下加热至90-100℃溶解，冷却至50-60℃后，加入0.01-0.02重量份引发剂，搅拌15-20min，加入2-4重量份丙烯酸类单体，搅拌反应2-3h，冷却至室温后，用水浸泡并洗涤，干燥，得到甘蔗纤维素水凝胶；将3-5重量份甘蔗纤维素水凝胶加入到20重量份步骤S6制得的活性物脂化物悬浮液中，浸泡，冷冻干燥，粉碎，得到提高免疫力的益生菌缓释体系；
所述微缺氧条件为氧气含量为7-12%，二氧化碳含量为3-5%，余量为氮气，其中，%为体积百分比。
10.一种如权利要求1所述提高免疫力的益生菌缓释体系在制备提高免疫力的产品中的应用。
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