CN115349495A - 一种颅脑损伤合并急性肾损伤模型及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种颅脑损伤合并急性肾损伤模型及其构建方法与应用。成功构建了颅脑损伤合并急性肾损伤模型，且该模型在注入磁珠分选人外周血CD4+T细胞组明显得到改善，为临床采用人外周血CD4+T细胞修复颅脑损伤合并急性肾损伤提供了重要参考。
Description
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，涉及一种颅脑损伤合并急性肾损伤模型及其构建方法与应用。
背景技术
随着社会经济快速发展，创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)日益多发，极高的致死致残率严重危害着人类生命健康。TBI发生后，患者病情变化迅速，尤其是非手术治疗者，病程中容易出现进展性出血损伤(Progressive hemorrhagic injury，PHI)，其病理生理基础是继发性脑缺血脑出血和脑水肿肾功损伤，文献报道颅脑外伤后PHI发生率约为8％～67％，可使颅脑损伤危险性增加5倍。临床医生若不充分认识和重视，将延误伤者病情诊治，以致错过最佳治疗时机，给患者带来无法挽回的后果。
而借助于动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。
发明内容
本发明的目的在于提供一种颅脑损伤合并急性肾损伤模型及其构建方法与应用。
为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种颅脑损伤合并急性肾损伤模型的构建方法，包括：
将大鼠麻醉后，颅顶部局部备皮、消毒、铺巾，定位于右侧颅顶旁正中切口，手术刀片划开头皮3cm，眼科剪剪切游离软组织、剥离骨膜暴露0.5cm大小的颅骨，定位于前囟后1.5mm、矢状缝右侧2.5mm为中心，电动磨钻颅骨开窗，蚊式钳将其扩大至5mm×5mm的正方形骨窗，操作过程中保持硬脑膜完整，25g砝码沿高25cm的自由落体直接撞击进行一次打击。
本发明还提供了上述方法构建的颅脑损伤合并急性肾损伤模型。
本发明又提供了CD4+T细胞在上述颅脑损伤合并急性肾损伤模型修复中的应用。
优选地，所述应用包括：将CD4+T细胞稀释至1×105/μL，于术后3d在脑立体定位仪定位下于前囟左侧3.5mm、前0.5mm、深4.5mm处用微量进样器注入10μl CD4+T细胞。
优选地，还包括分离人外周血CD4+T细胞并进行磁珠分选，具体包括：
1)向人外周血添加人外周血淋巴细胞分离液后离心；
2)使用buffer清洗分离所得的细胞，500g 5min离心后，弃上清，之后进行孵育，孵育完后，加入2000μl buffer重悬混合物；
3)保持分选柱湿润，先加3ml buffer滴完后立即缓慢滴加步骤2)中重悬的混合物进行磁珠分选，而后缓慢滴加3ml buffer洗涤柱子；
4)收集细胞。
优选地，步骤1)中，所述人外周血为离体24h内的人外周血。
优选地，步骤1)中，1000g离心30min，离心温度：26±2℃。
优选地，步骤2)和3)中的“buffer”采用不含钙镁和酚红的D-PBS缓冲液。
优选地，步骤2)中，孵育采用的培养基为：含L-GLU的R1640培养基+10％人血浆+0.01μg/ml rIL-2+5μg/ml PHA。
更优选地，所述人血浆来自于步骤1)中的血浆层。
本发明的有益效果在于：
本发明成功构建了颅脑损伤合并急性肾损伤模型，且该模型在注入磁珠分选人外周血CD4+T细胞组明显得到改善，为临床采用人外周血CD4+T细胞修复颅脑损伤合并急性肾损伤提供了重要参考，有望发展出利用细胞治疗法对颅脑损伤合并急性肾损伤进行治疗的一种新的疗法。
附图说明
图1是本发明实施例磁珠分选人外周血CD4+T细胞的流式鉴定结果。
图2是本发明实施例刚分选出来的细胞图。
图3是本发明实施例分选后增殖1代的细胞图。
图4是本发明实施例扩增后流式鉴定图。
图5是本发明实施例SD大鼠颅骨打孔(左图)及自由落体打击(右图)的照片。
图6是本发明实施例正常组与模型组的HE染色结果图。
图7是本发明实施例正常组与模型组的ELISA结果图。
图8是本发明实施例正常组、模型组与CD4+T细胞治疗组的HE染色结果图。
图9是本发明实施例正常组、模型组与CD4+T细胞治疗组的ELISA结果图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例
一、磁珠分选人外周血淋巴细胞
分离液：人外周血淋巴细胞分离液(品牌：Solarbio|货号：P8610)；洗涤液/稀释液：D-PBS缓冲液(不含钙镁和酚红)(品牌：Solarbio|货号：D1040)，步骤2和3中的“buffer”均采用该D-PBS缓冲液。
1.人外周血淋巴细胞分离
正常人外周血25ml：血液当天的最好，要求离体24h内的，分离时不用稀释。
添加人外周血淋巴细胞分离液后1000g离心30min，离心温度：26±2℃；25ml新鲜外周血大概能分离6×10^6个淋巴细胞。
2.收集分离所得的人外周血淋巴细胞进行磁珠分选
使用buffer清洗分离所得的细胞，500g，5min，弃上清，之后按照步骤a-e进行孵育。孵育完后，加入2000μl buffer重悬混合物。(整个磁珠分选过程均保持4℃)
3.过柱子
一直保持柱子(本实施例中采用Miltenyi美天旎磁珠分选柱，货号130-042-401)湿润，先加3ml buffer滴完后立即缓慢滴加步骤2中重悬的混合物进行磁珠分选，而后洗涤柱子：缓慢滴加3ml buffer。
4.收集细胞进行流式鉴定(CD3/CD4)，结果如图1所示；流式反馈：纯度：93％(满足实验要求)。
a.培养基改良为：R1640(L-GLU+，GIBCO 11875-093)+10％人血浆(来自于步骤1中的血浆层)+0.01μg/ml rIL-2+5μg/ml PHA。
b.改良成a中培养基后，CD4+T在培养的第三天后出现较为明显增殖现象。
c.此后根据培养基的颜色判断传代的时间(悬浮细胞传代方法)，大约3天传一次代；细胞增殖过程中部分细胞是单个增殖成单个细胞，部分增殖成团状细胞(居多)，如图2和3；
扩培一月后送流式鉴定，鉴定样本处理：离心，弃上清，D-PBS洗涤一遍，加入2倍体积的T-E消化2-3min，轻轻吹打1min，致使细胞成单个细胞后送检，防止细胞团影响流式鉴定；
CD4+T细胞纯度95.44％，结果如图4。
d.目前观察来看，此种方法下，CD4+T细胞体外增殖大约可以维持一个月，一月后停止增殖。
e.在进行步骤1淋巴细胞分离的时候，所使用的血液需要单人分开，即：A和B的血液不能混合在一起分离，以防出现血液凝集现象(溶血)或者其他现象，血液凝集很不利于后面淋巴细胞的分离。
二、颅脑损伤合并急性肾损伤模型
1.实验动物：SD大鼠，雄，6-8w。
2.实验材料：2-0缝合线，角针和圆针，生理盐水，中号和小号手术剪，弯镊，棉签，纱布，络合碘消毒液，手术剪刀，持针器，注射器，缝合线、脑立体定位仪，10μL微量注射器，微型手持式颅钻-国标。
3.操作规程
3.1实验动物分组：将实验SD大鼠随机分为2组，正常组，模型组。
3.2模型建立(颅脑损伤手术)：大鼠适应性饲养7天后开始颅脑损伤模型。将大鼠麻醉后，颅顶部局部备皮、消毒、铺巾，定位于右侧颅顶旁正中切口，手术刀片划开头皮约3cm，眼科剪游离软组织、剥离骨膜暴露，0.5cm大小的颅骨，定位于前囟后1.5mm、矢状缝右侧2.5mm为中心，电动磨钻颅骨开窗，蚊式钳将其扩大至5mm×5mm的正方形骨窗，操作过程中保持硬脑膜完整，25g砝码沿高25cm的自由落体直接撞击进行一次打击，如图5所示。
3.3观察和取样：
如图6所示，与正常组相比模型组海马CA1区，GD区神经元细胞排列疏松，结构紊乱，胞质深染核固缩。肾脏组织肾小球充血肿胀，肾小球基底膜增厚；肾小管管腔狭窄，肾间质水肿并伴炎性细胞浸润，模型成功。
如图7所示，在CREA和NGAL两个指标上，模型组比正常组呈上升趋势，模型成功。
三、颅脑损伤合并急性肾损伤CD4+T细胞修复模型
把培养分离好的CD4+T细胞利用脑立体定位仪注射到脑缺血部位作用3天。
方法：将细胞稀释至1×105/μL。实验组动物于术后3d在脑立体定位仪定位下于前囟左侧3.5mm、前0.5mm、深4.5mm处用微量进样器注入10μl细胞。
结果检测：
如图8所示，与正常组相比模型组海马CA1区，GD区神经元细胞排列疏松，结构紊乱，胞质深染核固缩。肾脏组织肾小球充血肿胀，肾小球基底膜增厚；肾小管管腔狭窄，肾间质水肿并伴炎性细胞浸润；与模型组相比，注入CD4+T细胞的治疗组明显得到改善。
如图9所示，在CREA和NGAL两个指标上，模型组比正常组呈上升趋势；与模型组相比，注入CD4+T细胞的治疗组的CREA和NGAL明显下降。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种颅脑损伤合并急性肾损伤模型的构建方法，包括：
将大鼠麻醉后，颅顶部局部备皮、消毒、铺巾，定位于右侧颅顶旁正中切口，手术刀片划开头皮3cm，眼科剪剪切游离软组织、剥离骨膜暴露0.5cm大小的颅骨，定位于前囟后1.5mm、矢状缝右侧2.5mm为中心，电动磨钻颅骨开窗，蚊式钳将其扩大至5mm×5mm的正方形骨窗，操作过程中保持硬脑膜完整，25g砝码沿高25cm的自由落体直接撞击进行一次打击。
2.权利要求1所述的一种颅脑损伤合并急性肾损伤模型的构建方法构建的颅脑损伤合并急性肾损伤模型。
3.CD4+T细胞在权利要求2所述的颅脑损伤合并急性肾损伤模型修复中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括：将CD4+T细胞稀释至1×105/μL，于术后3d在脑立体定位仪定位下于前囟左侧3.5mm、前0.5mm、深4.5mm处用微量进样器注入10μlCD4+T细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，还包括分离人外周血CD4+T细胞并进行磁珠分选，具体包括：
1)向人外周血添加人外周血淋巴细胞分离液后离心；
2)使用buffer清洗分离所得的细胞，500g 5min离心后，弃上清，之后进行孵育，孵育完后，加入2000μl buffer重悬混合物；
3)保持分选柱湿润，先加3ml buffer滴完后立即缓慢滴加步骤2)中重悬的混合物进行磁珠分选，而后缓慢滴加3ml buffer洗涤柱子；
4)收集细胞。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤1)中，所述人外周血为离体24h内的人外周血。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤1)中，1000g离心30min，离心温度：26±2℃。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)和3)中的“buffer”采用不含钙镁和酚红的D-PBS缓冲液。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中，孵育采用的培养基为：含L-GLU的R1640培养基+10％人血浆+0.01μg/ml rIL-2+5μg/ml PHA。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述人血浆来自于步骤1)中的血浆层。
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