CN115349083A - 流式细胞仪 - Google Patents

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今井亨
户田圭亮
太田祯生
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New Xite Corp
University of Tokyo NUC
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Abstract

本流式细胞仪包括：流路，观察对象与流体一起在该流路中流动；光学照明系统，包括空间光学调制装置和第一光学元件；以及光学检测系统，包括第一光检测器，其中光学照明系统还包括第一空间滤光片，第一空间滤光片布置在光源和在流路中通过第一光学元件成像的光的图像位置之间的第一光路中，并且具有阻碍从光源发出的光朝向观察对象传播的第一区域，光学检测系统还包括第二空间滤光片，该第二空间滤光片布置在第一光检测器和图像位置之间的第二光路中并且具有指引由观察对象所调制的光朝向第一光检测器的第二区域，且第一区域的位置和第二区域的位置处于基本上光学共轭的关系。

Description

流式细胞仪
技术领域
本发明涉及流式细胞仪。
本申请要求2020年4月1日提交的日本专利申请第2020-065940号的优先权，其内容通过引用并入本文。
背景技术
近年来，面向实际使用新的治疗方法例如使用干细胞(例如诱导性多能干细胞(iPS))的再生医学和使用嵌合抗原受体T细胞的免疫疗法等的行动已经很活跃，对包含在细胞群中的各个细胞进行逐个细胞分析的需求很强烈。
作为利用一个细胞(单细胞)进行这种分析的情况下的细胞测定技术，已经提出了流式细胞测定方法。流式细胞测定方法是用于将各个细胞分散在流体中、允许流体微细地向下流动并执行光学分析的技术，使用该技术的装置被称为流式细胞仪(专利文献1)。在流式细胞测定方法中，可以通过在待观察的细胞等微粒在流路中高速向下流动的同时照射激发光，并获得从每个细胞发出的荧光亮度或散射光的总量来评价观察对象。
然而，在基于有限的信息例如荧光亮度或散射光的总量的测量方法中，难以捕捉和评价观察对象的二维空间特征，例如细胞形态信息和细胞内分子定位。作为能够获取可更详细地描述细胞形态的高分辨率信息的流式细胞测定方法，已经提出了一种将结构化照明(结构化的(编码的)照明)照射到细胞等观察对象以检测从观察对象发出的具有光学特性的荧光或其他调制信号。与获得荧光亮度和散射光的总量的传统流式细胞术相比，通过使用该方法可以获得更丰富和更详细的细胞形态信息。作为这种方法的一个示例，例如，已知鬼影细胞测定技术(专利文献2)。
众所周知，在调制信号中，特别是从被光照射过的细胞发出的散射光与细胞形状和内部结构等形态信息相关，并且根据散射光被散射的方向可以获得一条形态信息。因此，同样在流式细胞术中，已知一种利用荧光和散射光的组合来测量细胞并且基于测量结果识别和分拣样品中包含的所需细胞的方法(专利文献3)。
引用列表
专利文献
专利文献1：日本特开2011-99848号公报
专利文献2：国际公开第WO2017/073737号
专利文献3：日本特开2016-73210号公报
发明内容
技术问题
本发明是鉴于上述几点而做出的并且提供了一种用于使用比在过去在流式细胞术中使用的结构化照明更简单的机制来检测由观察对象例如散射光调制的光的方法。在使用如上所述的结构化照明的流式细胞术中，由于需要用结构化照明来照射观察对象，因此难以在避免入射到检测器的直射光或反射光的同时检测在每个方向上散射的散射光。因此，迄今为止，还没有提出通过在使用结构化照明的流式细胞术中的简单机制来实现信噪比足够高的散射光检测方法。
问题的解决方案
本发明是为了解决上述问题而做出的，本发明的一个方面是一种流式细胞仪，包括：流路，观察对象与流体一起在该流路中流过；光学照明系统，包括：光源；空间光学调制装置，被配置为调制从所述光源发出的光；以及第一光学元件，被配置为在所述流路中形成由所述空间光学调制装置所调制的光的图像；以及光学检测系统，包括第一光检测器，该第一光检测器被配置为检测由所述第一光学元件成像并由在所述流路中流动的观察对象调制的光，其中，所述光学照明系统还包括第一空间滤光片，该第一空间滤光片被布置在所述光源和在所述流路中由所述第一光学元件成像的光的图像位置之间的第一光路中并且具有阻碍从所述光源发出的光朝向所述观察对象传播的第一区域，所述光学检测系统还包括第二空间滤光片，该第二空间滤光片被布置在所述第一光检测器和所述图像位置之间的第二光路中且具有指引由所述观察对象所调制的光朝向所述第一光检测器的第二区域，且所述第一区域的位置和所述第二区域的位置处于基本上光学共轭的关系。
此外，根据本发明的一个方面，在流式细胞仪中，当未设置所述第一空间滤光片时，所述第二区域与由所述空间光学调制装置所调制的光穿过所述观察对象并照射所述第二空间滤光片的区域发生重叠的区域可以基本上相同于由在所述第二空间滤光片中形成的区域的图像在所述第二空间滤光片上占据的区域或被包含在该区域中，其中，在所述第二空间滤光片中形成的区域是如下区域，在该区域中所述第一区域与所述第一空间滤光片被由所述空间光学调制装置所调制的光照射的区域发生重叠。
此外，根据本发明的一个方面，在流式细胞仪中，由在所述流路中流动的观察对象所调制并由所述第一光检测器所检测的光可以是散射光或衍射光。
此外，根据本发明的一个方面，在流式细胞仪中，所述第一区域通过可以使用所述光的透过透射、阻挡、衍射和反射中的一种来阻碍从所述光源发出的光朝向所述观察对象的传播。
此外，根据本发明的一个方面，在流式细胞仪中，在所述第一空间滤光片的表面中的位于面向所述图像位置的一侧的表面上，与所述第一区域对置的区域的全部或一部分可以由对从所述光源发出的光被所述观察对象散射的散射光进行反射的构件构成，且所述光学检测系统还可以包括第二光检测器，该第二光检测器检测被所述构件反射的散射光。
此外，根据本发明的一个方面，在流式细胞仪中，在所述第一空间滤光片的表面中的位于面向所述图像位置的一侧的表面上，与所述第一区域对置的区域的全部或一部分可以由使从所述光源发出的光被所述观察对象散射的散射光透过的构件构成，且所述光学检测系统还可以包括第二光检测器，该第二光检测器检测由所述构件透过的散射光。
此外，根据本发明的一个方面，在流式细胞仪中，所述第一空间滤光片和所述空间光学调制装置可以被集成设置。
此外，根据本发明的一个方面，在流式细胞仪中，所述第一空间滤光片可以用作所述第二空间滤光片。
此外，根据本发明的一个方面，在流式细胞仪中，当所述光穿过所述第二空间滤光片中的除所述第二区域之外的区域的全部或一部分时，透过所述观察对象的光的强度或相位被调制，并且所述第一光检测器可以检测被所述观察对象调制的光中的已经穿过除所述第二区域之外的区域的相位被调制的光与已经穿过所述第二区域的光之间的相位差。
此外，根据本发明的一个方面，流式细胞仪还可以包括分束器，被布置在所述第二光路中并且被配置为提取由所述观察对象调制的光的一部分；第三空间滤光片，具有第三区域，该第三区域被配置为使被所述分束器提取的所述调制光透过；以及第二光检测器，被配置为检测已经穿过所述第三区域的调制光。
有利效果
根据本发明，在使用结构化照明的流式细胞术中，可以通过比传统情况下更简单的机制来检测由观察对象调制的光。根据本发明，可以以高信噪比检测通过照明照射从观察对象发出的散射光等调制光，并且可以以比传统情况下更高的分辨率获取观察对象的详细形态信息。因此，可以在不使用荧光标记等标记观察对象(以下也称为无标记)的情况下基于形态信息以非侵入的方式高速分离观察对象例如目标细胞。
附图说明
图1示出根据本发明的第一实施方式的流式细胞仪的配置示例图。
图2示出根据本发明的第一实施方式的流式细胞仪所包括的第一空间滤光片的配置示例图。
图3示出根据本发明的第一实施方式的流式细胞仪所包括的第二空间滤光片的配置示例图。
图4示出根据本发明的第一实施方式的变形示例的流式细胞仪的配置示例图。
图5示出根据本发明的第一实施方式的变形示例的流式细胞仪所包括的第一空间滤光片的配置示例图。
图6示出根据本发明的第一实施方式的变形示例的流式细胞仪所包括的第二空间滤光片的配置示例图。
图7示出根据本发明的第二实施方式的流式细胞仪的配置示例图。
图8示出根据本发明的第二实施方式的流式细胞仪所包括的第一空间滤光片的配置示例图。
图9示出根据本发明的第二实施方式的变形例的流式细胞仪的配置的示例的图。
图10示出根据本发明的第三实施方式的流式细胞仪的配置示例图。
图11示出根据本发明的第三实施方式的变形示例的流式细胞仪的配置示例图。
图12示出根据本发明的每个实施方式的变形示例的集成有空间光学调制装置的第一空间滤光片的配置示例图。
图13示出根据本发明的每个实施方式的变形示例的由集成有空间光学调制装置的第一空间滤光片在空间上分离的光所走的光路的示例图。
图14示出根据本发明的每个实施方式的变形示例的包括反射镜的第一空间滤光片的配置示例图。
图15示出根据本发明的每个实施方式的变形示例的由包括反射镜的第一空间滤光片在空间上分离的光所走的光路的示例图。
图16示出根据本发明的第四实施方式的流式细胞仪的配置示例图。
图17示出根据本发明的第四实施方式的变形示例的流式细胞仪的配置示例图。
具体实施方式
(第一实施方式)
以下，参照附图详细描述本发明的实施方式。
图1示出根据本实施方式的流式细胞仪1的配置的示例图。流式细胞仪1包括流路(未示出)、光学照明系统2和光学检测系统3。观察对象5可以与流体一起在流路中流动。观察对象5是用于获取形态信息的对象，例如细胞。观察对象5可以是细菌等微粒。
这里，图1示出了作为三维笛卡尔坐标系的xyz坐标系。x轴方向是流路的长度方向。此外，y轴方向是流路的宽度方向。此外，z轴方向是与流路正交的方向并且是流路的高度方向。
光学照明系统2是用于在流路中用结构化照明4照射观察对象5的光学系统。在流式细胞仪1中，通过光学检测系统3检测结构化照明4被观察对象5散射的前向散射光。前向散射光是在来自观察对象5的散射光中沿z轴的正方向被散射的光。在流式细胞仪1中，散射光是基于所谓的暗场观察原理检测的。
光学照明系统2中的照明光的光路被称为第一光路24。该第一光路与z轴平行。在图1中，作为第一光路24的示例，示出了第一光路24-1和第一光路24-2。光学照明系统2包括光源20、空间光学调制装置21、第一空间滤光片22和第一物镜23。光源20、空间光学调制装置21、第一空间滤光片22和第一物镜23沿照明光被指引朝向流路中流动的观察对象5的方向依次设置在第一光路24上。
光源20例如是激光光源。作为示例，光源20发出作为相干光的照明光。光源20可以是发出非相干光的光源。光源20的另一示例是半导体激光光源和发光二极管(LED)光源。
空间光学调制装置21对从光源20发出的光进行调制。空间光学调制装置21具有光学特性不同的多个区域。关于入射光的光学特性，空间光学调制装置21在光学特性不同的多个区域中的两个或更多个区域中进行不同的调制。入射光的光学特性例如是与强度、波长、相位和偏振态中的任何一个或多个有关的特性。光学特性不限于此。此外，调制是为了改变上述光学特性。空间光学调制装置21例如包括衍射光学元件(DOE)、空间光调制器(SLM)、数字微镜装置(DMD)、在表面上印刷有光学特性不同的多个区域的膜等。当由光源20发出的照明光是非相干光时，空间光学调制装置21是DMD。
第一空间滤光片22具有阻挡从光源20发出的光的阻挡区域和使从光源20发出的光透过的透过区域。第一空间滤光片22布置在第一光路24上，该第一光路是光源20与流路中的图像位置25之间的光路。这里，图像位置25是通过第一物镜23在流路中形成的光的图像的位置。通过第一物镜23形成的光的图像的位置是结构化照明4被成像的位置。向观察对象照射的结构化照明光的照明图案是恒定的并且在一个观察对象的测量周期期间不改变。结构化照明4是结构化照明图案，在该结构化照明图案中由空间光学调制装置21调制的照明光通过第一物镜23成像。
在本实施方式中，第一空间滤光片22在第一光路24中例如设置空间光学调制装置21和图像位置25之间。作为示例，第一空间滤光片22布置为基本上垂直于第一光路24(即，在z轴方向上)。
第一空间滤光片22可以在第一光路24中设置在空间光学调制装置21和图像位置25之间的任何位置处，只要是除图像位置25以外的位置。当第一空间滤光片22设置在图像位置25时，由于结构化照明4自身缺失，因此是不优选的。
这里，参考图2，描述第一空间滤光片22的配置。图2示出根据本实施方式的第一空间滤光片22的配置的示例图。作为示例，第一空间滤光片22的形状是四边形且是板状形状。图2示出了沿z轴方向从光源20侧观察板状的第一空间滤光片22时的平面222。第一空间滤光片22的光源20侧的表面位于平面222上。
照射区域R1表示在平面222上照射结构化照明光的区域，结构化照明光是由空间光学调制装置21调制的来自光源20的光。
位于平面222上的第一空间滤光片22的表面被划分为透过(透射)区域220和阻挡区域221。在图2中，第一空间滤光片22的透过区域220被阻挡区域221分隔开并且由两个不相连的区域组成，即透过区域220-1和透过区域220-2。
作为示例，透过区域220通过在第一空间滤光片22中设置间隙来配置。透过区域220是使从光源20发出的光透过的区域。
阻挡区域221是阻挡从光源20发出的光的掩模。在本实施方式中作为示例，阻挡区域221的形状为矩形。阻挡区域221的形状不限于矩形并且可以是任何形状，只要其占据照射区域R1的一部分。也就是说，第一空间滤光片22中的阻挡区域221的形状和排布不必是如图2所示将透过区域220分成两个或更多个区域的形状和排布。例如，阻挡区域221的形状可以是直径小于照射区域R1的直径的圆形并且可以被布置在第一空间滤光片22的中心。作为另一示例，阻挡区域221可以布置在照射区域R1的端部，使得向照射区域R1照射的光中的、向端部照射的一部分光被阻挡区域221阻挡。作为再一示例，阻挡区域221可以同心地布置在照射区域R1的端部，且透过区域220的形状可以是直径小于照射区域R1的直径的圆形结构并且在该圆形结构中透过区域220被布置在中心部。
阻挡区域221是阻碍从光源20发出的光朝向观察对象5传播的第一区域的示例。因此，第一空间滤光片22具有阻碍从光源10发出的光朝向观察对象5传播的第一区域。
由于第一空间滤光片22具有阻挡区域221，作为结构化照明4而发出的光的频率的一部分会缺失。另一方面，随着照射区域R1中照射光被阻挡区域221阻挡的区域的面积变大，在信噪比保持恒定的情况下可以获得更丰富的信息作为观察对象5的形态信息。换言之，照射区域R1中的照射光被阻挡区域221阻挡的区域是照射区域R1和阻挡区域221彼此重叠的区域。
然而，当照射区域R1和阻挡区域221重叠的区域的面积过大时，作为结构化照明4而发出的光也可能被阻挡。另一方面，当照射区域R1和阻挡区域221重叠的区域的面积过小时，被观察对象5散射的光的量可能不足以进行暗场观察，并且可能无法以足够的精度获取观察对象5的形态信息。由于这些原因，照射区域R1和阻挡区域221重叠的区域的面积是考虑观察对象的结构、结构化照明光的结构等来确定的，并且阻挡区域与照射区域R1之比优选在5％至70％的范围内。
返回图1，继续描述流式细胞仪1的配置。
第一物镜23形成由空间光学调制装置21调制的光的图像。第一物镜23在流路的图像位置25处形成由空间光学调制装置21调制的光的图像。通过第一物镜23成像的光作为结构化照明4向在流路中流动的观察对象5照射。第一物镜23是在流路中形成由空间光学调制装置21调制的光的图像的第一光学元件的示例。
随后，将描述光学检测系统3的配置。光学检测系统3是检测被在流路中流动的观察对象5调制的光的光学系统。光学检测系统3包括第二物镜30、第二空间滤光片31、成像透镜32和第一光检测器33。在光学检测系统3中，散射光的光路被称为第二光路34。在流式细胞仪1中，作为被对象5调制的光的前向散射光由第一光检测器33检测。
第二空间滤光片31具有阻挡透过观察对象5的光的阻挡区域和使被观察对象5调制的光透过的透过区域。透过观察对象5的光是从光源20发出的光透过观察对象5的直射光。也就是说，第二空间滤光片31阻挡透过观察对象5的直射光。另一方面，被观察对象5调制的光是散射光，其中从光源20发出的光被观察对象5散射。也就是说，第二空间滤光片31使被观察对象5散射的散射光透过。
第二空间滤光片31布置在第二光路34中。
第二空间滤光片31所布置的位置和第一空间滤光片22所布置的位置处于基本上光学共轭的关系。这里，布置位置处于基本上光学共轭的关系的事实意味着第一空间滤光片22和第二空间滤光片31布置在彼此基本上光学共轭的位置处。此外，在本实施方式中，第一空间滤光片22和第二空间滤光片31基本上彼此平行地布置。
这里，参考图3，将描述第二空间滤光片31的配置。图3示出根据本实施方式的第二空间滤光片31的配置的示例图。第二空间滤光片31的形状例如是四边形且是板状形状。图3示出了从光源20侧沿z轴方向观察板状的第二空间滤光片31时的平面312。第二空间滤光片31的光源20侧的表面位于平面312上。照射区域R2表示当流式细胞仪1中未设置第一空间滤光片22时，作为结构化照明4向观察对象5照射的光穿过第二物镜30在平面312上照射的区域。
位于平面312上的第二空间滤光片31的表面被划分为阻挡区域310和透过区域311。在图3中，第二空间滤光片31的阻挡区域310被透过区域311分隔开并由两个不相连的区域组成，即阻挡区域310-1和阻挡区域310-2。
阻挡区域310是阻挡透过观察对象5的光的掩模。透过观察对象5的光是透过第一空间滤光片22中包含的透过区域220的直射光。
作为示例，透过区域311通过在第二空间滤光片31中提供间隙来配置。透过区域311和照射区域R2在平面312上重叠的区域与第一空间滤光片中阻挡区域221和照射区域R1重叠的区域在第二空间滤光片31上形成图像并且占据平面312上的区域基本上相同。这里，如上所述，由于在本实施方式中阻挡区域221的形状是矩形的，所以透过区域311的形状也是矩形的。透过区域311是使被观察对象5散射的散射光透过的区域。
照射区域R2和透过区域311在第二空间滤光片31的平面312上重叠的区域与照射区域R1和阻挡区域221在第一空间滤光片22的平面222上重叠的区域彼此处于图像形成关系。
照射区域R2和透过区域311重叠的区域的形状和排布可以是这样的形状和排布，其中，该区域被包含在照射区域R1和阻挡区域221重叠的区域在平面312上形成的图像中。
透过区域311是使被观察对象5调制的光透过的第二区域的示例。如上所述，当在流式细胞仪1中未设置第一空间滤光片22时，作为结构化照明4向观察对象5照射的光穿过第二物镜30在平面312上照射的照射区域R2和透过区域311彼此重叠的区域基本上相同于从光源20发出的光所照射的区域和第一区域在第一空间滤光片22上重叠的区域在第二空间滤光片31上形成的图像在第二空间滤光片31上占据的区域或被包含在该区域中。
如上所述，第二空间滤光片31所布置的位置和第一空间滤光片22所布置的位置处于基本上光学共轭的关系。因此，关于第一空间滤光片22中包含的阻挡区域221和第二空间滤光片31中包含的透过区域311之间的位置关系，阻挡区域221的位置和透过区域311的位置处于基本上光学共轭的关系。
在本实施方式中，作为示例，描述了第一空间滤光片22中包含的透过区域220和第二空间滤光片31中包含的透过区域311由间隙形成的情况，但本发明不限于此。透过区域220和透过区域311可以由具有透过率为预定值或大于预定值的物质制成。
返回图1，将继续描述流式细胞仪1的配置。
第二物镜30将被观察对象5调制的光转换成平行光。这里，第二光路34是用于散射光的光路，该光路是第一光检测器33和图像位置25之间的光路。如上所述，第二空间滤光片31所布置的位置和第一空间滤光片22所布置的位置处于基本上光学共轭的关系。第二物镜30可以在第二光路34中布置在结构化照明4在流路中成像的图像位置25和第二空间滤光片31之间的任何位置，只要第二物镜30所布置的位置不阻碍第一空间滤光片22和第二空间滤光片31之间的基本上光学共轭的关系。
成像透镜32在第二光路34中布置在第二空间滤光片31和第一光检测器33之间的位置处。在本实施方式中，成像透镜32布置在已穿过第二物镜30的被观察对象5调制的光通过成像透镜32在第一光检测器33的检测表面上成像的位置处。
第一光检测器33检测由成像透镜32成像的散射光。这里，由成像透镜32所成像的散射光是由观察对象5产生的前向散射光，并且是通过第一物镜23在流路中成像的结构化照明被在流路中流动的观察对象5调制、然后被第二物镜30平行化并透过第二空间滤光片31的光。第一光检测器33是检测由光学元件成像并被在流路中流动的观察对象5调制的光的第一光检测器的示例。第一光检测器33例如具有光电倍增管(PMT)、线型PMT元件、光电二极管、雪崩光电二极管(APD)或半导体光传感器等光学传感器。
在本实施方式中，虽然已经描述了由第一光检测器33检测到的散射光经由第二物镜30和成像透镜32在第一光检测器32的检测表面上成像的示例，但是本发明不限于此。优选地，由第一光检测器33检测到的散射光在第一光检测器32的检测表面上成像，但也可以不在第一光检测器33的检测表面上成像，只要预定量的光或更多的光被收集在第一光检测器33的检测表面上即可。类似地，在其他实施例中，由光检测器检测到的散射光也可以不在检测表面上成像，只要预定量的光或更多的光被收集在光检测器的检测表面上即可。
第一光检测器33将检测到的散射光转换为电信号脉冲，并将电信号脉冲输出到数据采集(DAQ)装置(未示出)等。DAQ装置将电信号脉冲逐个脉冲地转换为电子数据。DAQ装置将电子数据输出到分析装置(未示出)等。通过分析装置分析电子数据，并获取观察对象5的形态信息。
如上所述，根据本实施方式的流式细胞仪1包括：光学照明系统2；流路，观察对象5可与流体一起在流路中流动；以及光学检测系统3。
光学照明系统2包括光源20、空间光学调制装置21和第一光学元件(在本实施方式中为第一物镜23)。空间光学调制装置21调制从光源20发出的光。第一光学元件(在本实施方式中为第一物镜23)在流路中形成由空间光学调制装置21调制的光的图像。
光学检测系统3包括第一光检测器33，该第一光检测器33检测通过第一光学元件(在本实施方式中为第一物镜23)成像并被在流路中流动的观察对象5调制的光。
光学照明系统2还包括第一空间滤光片22。第一空间滤光片22布置在光源20和流路中通过第一光学元件(在本实施方式中为第一物镜23)形成的图像的图像位置25之间的第一光路24中。第一空间滤光片22具有第一区域(在本实施方式中为阻挡区域221)，该第一区域阻碍从光源20发出的光朝向观察对象5传播。
光学检测系统3还包括第二空间滤光片31。第二空间滤光片31布置在第一光检测器33和流路中的图像位置25之间的第二光路34中。第二空间滤光片31具有使被观察对象5调制的光(在本实施方式中为前向散射光)透过的第二区域(在本实施方式中为透过区域311)。
第一区域(在本实施方式中为阻挡区域221)的位置和第二区域(在本实施方式中为透过区域311)的位置处于基本上光学共轭的关系。
通过这种配置，在根据本实施方式的流式细胞仪1中，在使用结构化照明光的流式细胞仪中，由于第一空间滤光片22和第二空间滤光片31设置在光路上的简单配置，与传统的流式细胞仪相比，可以通过简单的机制检测被观察对象调制的光。这里，传统的流式细胞仪例如是使用线形照明光通过荧光亮度的总量或散射光的总量来评价细胞特性的流式细胞仪。如上所述，被观察对象调制的光包括散射光和衍射光。
在根据本实施方式的流式细胞仪1中，由于可以检测来自观察对象5的散射光，该散射光透过布置在与第一区域(在本实施方式中为阻挡区域221)的位置具有基本上光学共轭的关系的位置处的第二区域(在本实施方式中为透过区域311)，因此可以检测实现比传统情况下信噪比更高的散射光。信噪比是由第一光检测器33检测到的光中的散射光与除散射光之外的光之比。除散射光之外的光例如是直射光。
在根据本实施方式的流式细胞仪1中，可以分析以比传统情况下更高的信噪比检测到的散射光。在根据本实施方式的流式细胞仪1中，由于照明光由调制装置调制并且结构化照明可以向观察对象照射以基于散射光提取分辨率更高的形态信息，可以在不使用荧光物质进行标记(无标记)的情况下获得关于观察对象5的详细形态信息，并且可以以非侵入方式对观察对象5进行测量和分类。
(第一实施方式的变形示例)
这里，将描述本实施方式的变形示例。图4示出根据本实施方式的变形示例的流式细胞仪1a的示例图。流式细胞仪1a包括流路(未示出)、光学照明系统2a和光学检测系统3a。
与上述第一实施方式中相同的配置和操作由相同的附图标记表示，并且将省略其描述。
光学照明系统2a包括光源20a、空间光学调制装置21a、第一空间滤光片22a和第一物镜23。光学照明系统2a的照明光的光路被称为第一光路24a。在图4中，作为第一光路24a的示例，示出了第一光路24a-1、第一光路24a-2和第一光路24a-3。第一光路24a在从光源20a到第一空间滤光片22a的区段中平行于x轴。在第一光路24a中，由于照明光被第一空间滤光片22a反射，第一光路24a-1和第一光路24a-3在第一空间滤光片22a的位置处以大致直角弯曲。结果，第一光路24a-1和第一光路24a-3在从第一空间滤光片22a到观察对象5的区段中平行于z轴。光源20a、空间光学调制装置21a、第一空间滤光片22a和第一物镜23沿照明光被指引朝向流路中流动的观察对象5的方向依次设置在第一光路24a上。
除了设置有光源20a和空间光学调制装置21a的第一光路24a的方向平行于x轴之外，光源20a和空间光学调制装置21a的配置与第一实施方式的光源20和空间光学调制装置21的配置相同。
第一空间滤光片22a具有反射从光源20a发出的光的反射区域和使从光源20a发出的光透过的透过区域。作为示例，第一空间滤光片22a布置为相对于基本上垂直于第一光路24a的方向(即，x轴方向)仅倾斜预定角度。这里，当沿-y方向观察时该预定角度例如是顺时针45度。
这里，参考图5，将描述第一空间滤光片22a的配置。图5示出根据变形示例的第一空间滤光片22a的配置的示例图。在图5中，示出了平面222a，该平面222a是板状的第一空间滤光片22a在光源20a侧的平面，也就是当在图4中从光源20a一侧沿x轴方向观察第一空间滤光片22a时的平面。第一空间滤光片22a的光源20侧的表面位于平面222a上。
位于平面222a上的第一空间滤光片22a的表面被划分为反射区域220a和透过区域221a。在图5中，第一空间滤光片22a的反射区域220a被透过区域221a分隔开并且由两个不相连的区域组成，即反射区域220a-1和反射区域220a-2。反射区域220a是反射来自光源20a的照明光的反射镜。透过区域221a使来自光源20a的照明光透过。
这里，在从光源20a发出的光中的透过了透过区域221a的光不向观察对象5照射。在这个意义上，透过区域221a是阻碍从光源20a发出的光朝向观察对象5传播的第一区域的示例。
返回图4，将继续描述流式细胞仪1a的配置。
光学检测系统3a包括第二物镜30、第二空间滤光片31a、成像透镜32a和第一光检测器33a。在光学检测系统3a中，前向散射光的光路被称为第二光路34a。第二光路34a在从观察对象5到第二空间滤光片31a的区段中平行于z轴。由于前向散射光被第二空间滤光片31a反射，第二光路34a在第二空间滤光片31a的位置处以基本上直角弯曲。结果，第二光路34a在从第二空间滤光片31a到第一光检测器33a的区段中平行于x轴。第二物镜30、第二空间滤光片31a、成像透镜32a和第一光检测器33a沿前向散射光从在流路中流动的观察对象5被指引朝向第一光检测器33a的方向依次设置在第二光路34a上。
第二空间滤光片31a具有反射被观察对象5调制的光的反射区域和阻挡已穿过观察对象5的光的阻挡区域。在该变形示例中，被观察对象5调制的光是如上所述的前向散射光。第二空间滤光片31a布置为相对于基本上垂直于第二光路34a的方向(即，z轴方向)仅倾斜预定角度。这里，当沿-y方向观察时该预定角度例如是逆时针45度。此外，第二空间滤光片31a所布置的位置和第一空间滤光片22a所布置的位置处于基本上光学共轭的关系。
这里，参照图6将描述第二空间滤光片31a的配置。图6示出根据该变形示例的第二空间滤光片31a的配置的示例图。在图6中，示出了板状的第二空间滤光片31a在观察对象侧的表面，也就是当在图4中从观察对象5一侧沿z轴方向观察第二空间滤光片31a时的平面312a。第二空间滤光片31a的观察对象5侧(光源20侧)的表面位于平面312a上。
位于平面312a上的第二空间滤光片31a的表面被划分为阻挡区域310a和反射区域311a。在图6中，第二空间滤光片31a的阻挡区域310a被反射区域311a隔开并且由两个不相连的区域组成，即阻挡区域310a-1和阻挡区域310a-2。反射区域311a例如是反射镜。
返回图4，将继续描述流式细胞仪1a的配置。
除了设置有成像透镜32a和第一光检测器33a的第二光路34a的方向平行于x轴之外，成像透镜32a和第一光检测器33a的配置分别与图1所示的成像透镜32和第一光检测器33的配置相同。
在流式细胞仪1a中，可以设置图1所示的光学检测系统3来代替光学检测系统3a。此外，在第一实施方式的流式细胞仪1中，可以设置图4所示的光学检测系统3a来代替光学检测系统3。
(第二实施方式)
以下，将参照附图详细描述本发明的第二实施方式。
在上述第一实施方式中，已经描述了流式细胞仪检测被观察对象散射的前向散射光的情况。在本实施方式中，将描述流式细胞仪检测被观察对象散射的后向散射光的情况。
图7示出根据本实施方式的流式细胞仪1b的配置的示例图。流式细胞仪1b包括流路(未示出)、光学照明系统2b和光学检测系统3b。
与上述第一实施方式相同的配置和操作由相同的附图标记表示，并且将省略其描述。
根据本实施方式的流式细胞仪被称为流式细胞仪1b。
流式细胞仪1b检测后向散射光作为被观察对象调制的光。在流式细胞仪1b中，光学检测系统3b检测结构化照明4被观察对象5散射的后向散射光。后向散射光是来自观察对象5的散射光中沿z轴的负方向散射的光。
光学照明系统2b包括光源20、空间光学调制装置21、第一空间滤光片22b和第一物镜23。光学照明系统2b中的照明光的光路被称为第一光路24b。在图7中，作为第一光路24b的示例，示出了第一光路24b-1、第一光路24b-2和第一光路24b-3。
第一空间滤光片22b具有阻挡从光源20发出的光的阻挡区域和使从光源20发出的光透过的透过区域。此外，在阻挡区域的背侧，第一空间滤光片22b具有反射来自观察对象5的后向散射光的反射区域。第一光路24b-1和第一光路24b-3是照明光中穿过第一空间滤光片22b的透过区域的光的光路。第一光路24b-2是照明光中被第一空间滤光片22b的阻挡区域阻挡的光的光路。
作为示例，第一空间滤光片22b被布置为相对于基本上垂直于第一光路24b的方向(即，z轴方向)仅倾斜预定角度。这里，当沿-y方向看时该预定角度例如是顺时针方向45度。
这里，参考图8，将描述第一空间滤光片22b的配置。图8示出根据本实施方式的第一空间滤光片22b的配置的示例图。在图8中，示出了平面222b，该平面222b是板状的第一空间滤光片22b在光源20侧的平面，也就是当在图7中从光源20侧沿z轴方向观察第一空间滤光片时的平面。第一空间滤光片22b在光源20侧的表面位于平面222b上。
位于平面222b上的第一空间滤光片22b的表面被划分为透过区域220b和阻挡区域221b。在图8中，在第一空间滤光片22b中，透过区域220b被阻挡区域221b分隔开并且由两个不相连的区域组成，即透过区域220b-1和透过区域220b-2。
在第一空间滤光片22b的背面(第一空间滤光片22b在图像位置25侧的表面)上，第一空间滤光片22b在与阻挡区域221b对置的区域中具有反射区域223b。反射区域223b是反射来自观察对象5的后向散射光的反射镜。该反射镜是反射从观察对象5发出的散射光的构件的一个例子。也就是说，阻碍从光源20发出的光朝向观察对象5传播的第一区域的全部或一部分由在构成第一空间滤光片22b的表面中的面向图像位置25的表面的一侧(即面向与光源20相反侧的那一侧)反射从光源20发出并被观察对象5向后散射的散射光的构件构成。
如上所述，第一空间滤光片22b在光源20侧的表面上具有阻挡从光源20发出的光的阻挡区域221b，并且在与光源20相反的表面上具有对从观察对象5发出的光散射光进行反射的反射区域223b。
返回图7，将继续描述流式细胞仪1b的配置。
光学检测系统3b包括成像透镜32a和第一光检测器33a。成像透镜32a和第一光检测器33a的配置分别与图4所示的成像透镜32a和第一光检测器33a的配置相同。作为图7中的示例，第一空间滤光片22b也用作第二空间滤光片。第一空间滤光片22b在光源20侧的表面上具有阻碍光源光向观察对象5照射的第一区域(在本实施方式中为阻挡区域221b)，并且在与光源20相反的表面上具有如下结构，该结构具有对来自观察对象5的后向散射光进行反射的构件(在本实施方式中为反射区域223b)，并且第一区域(在本实施方式中为阻挡区域221b)和第二区域(在本实施方式中为反射区域223b)布置在具有基本上光学共轭的关系的位置处。
在光学检测系统3b中，后向散射光的光路被称为第二光路34b。第二光路34b在从观察对象5到第一空间滤光片22b的区段中平行于z轴。由于后向散射光被第一空间滤光片22b(在第一空间滤光片的面向图像位置25的一侧)反射，第二光路34b在第一空间滤光片22b的位置处以基本上直角弯曲。结果，第二光路34b在从第一空间滤光片22b到第一光检测器33a的区段中变得平行于x轴。
在本实施方式中，作为示例，已经描述了第一空间滤光片22b也用作第二空间滤光片的情况，但本发明不限于此。第一空间滤光片22b可以不用作第二空间滤光片。在这种情况下，与第一空间滤光片22b不同的空间滤光片作为第二空间滤光片布置在第二光路34b中的与第一空间滤光片22b所布置的位置不同的位置处，并且也是布置在第一区域的位置和第二区域的位置处于基本上光学共轭的关系的位置处。
(第二实施方式的变形示例)
这里，将描述本实施方式的变形示例。图9示出根据本实施方式的变形示例的流式细胞仪1c的示例图。流式细胞仪1c包括流路(未示出)、光学照明系统2c和光学检测系统3c。
与上述第二实施方式中相同的配置和操作由相同的附图标记表示，并且将省略其描述。
光学照明系统2c包括光源20c、空间光学调制装置21c、第一空间滤光片22c和第一物镜23。光学照明系统2c的照明光的光路被称为第一光路24c。在图9中，作为第一光路24c的示例，示出了第一光路24c-1和第一光路24c-2。第一光路24c在从光源20c到第一空间滤光片的区段中平行于x轴。由于照明光被第一空间滤光片22c反射，第一光路24c-1和第一光路24c-2在第一空间滤光片22c的位置处以大致直角弯曲。结果，第一光路24c-1和第一光路24c-2在从第一空间滤光片22c到观察对象5的区段中平行于z轴。光源20c、空间光学调制装置21c、第一空间滤光片22c和第一物镜23沿照明光被指引朝向流路中流动的观察对象5的方向依次设置在第一光路24c上。
除了设置有光源20c和空间光学调制装置21c的第一光路24c的方向平行于x轴之外，光源20c和空间光学调制装置21c的配置分别与第一实施方式的光源20和空间光学调制装置21的配置相同。第一空间滤光片22c的配置与图4所示的第一空间滤光片22的配置相同。
光学检测系统3c包括成像透镜32c和第一光检测器33c。在光学检测系统3c中，后向散射光的光路被称为第二光路34c。第二光路34c平行于z轴。第二光路34c是在后向散射光中穿过第一空间滤光片22c的光所走的光路。成像透镜32c和第一光检测器33c沿散射光从在流路中流动的观察对象5被指引朝向第一光检测器33c的方向依次设置在第二光路34c上。
除了图中所示的第二光路34c的方向和z轴的方向彼此相反之外，成像透镜32c和第一光检测器33c的配置分别与图1所示的成像透镜32和第一光检测器33的配置相同。
在图9中，作为本实施方式的变形示例，描述了第一空间滤光片22c也用作第二空间滤光片的示例，但本发明不限于此。类似于本实施例，当第一空间滤光片22c不用作第二空间滤光片时，与第一空间滤光片22c不同的空间滤光片可以作为第二空间滤光片布置在第二光路34c中的与第一空间滤光片22c所布置的位置不同的位置处，并且也是布置在第一区域的位置和第二区域的位置处于基本上光学共轭的关系的位置处。
(第三实施方式)
以下，将参照附图详细描述本发明的第三实施方式。
在第一实施方式和第二实施方式中，已经描述了流式细胞仪检测被观察对象散射的前向散射光或后向散射光的情况。在本实施方式中，描述流式细胞仪同时检测被观察对象散射的前向散射光和后向散射光的情况。
根据本实施方式的流式细胞仪被称为流式细胞仪1d。
图10示出根据本实施方式的流式细胞仪1d的配置的示例图。
流式细胞仪1d包括流路(未示出)、光学照明系统2d和光学检测系统3d。
与上述第一实施方式相同的配置和操作由相同的附图标记表示，并且将省略其描述。
在流式细胞仪1d中，结构化照明4被观察对象5散射的前向散射光和后向散射光由光学检测系统3d检测。作为示例，图10示出了第二空间滤光片也被第一空间滤光片22d用于检测后向散射光的情况，但本发明不限于此。与前面的例子类似，当第一空间滤光片22d不用作第二空间滤光片来检测后向散射光时，与第一空间滤光片22d不同的空间滤光片作为第二空间滤光片布置在第三光路37d中的与第一空间滤光片22d所布置的位置不同的位置处，并且也是布置在第一区域的位置和第二区域的位置处于基本上光学共轭关系的位置处。
光学照明系统2d包括光源20、空间光学调制装置21、第一空间滤光片22d和第一物镜23。光学照明系统2d的照明光的光路也被称为第一光路24d。在图10中，作为第一光路24d的示例，示出了第一光路24d-1和第一光路24b-2。
图10所示的第一空间滤光片22d的配置与图8所示的第一空间滤光片22b的配置相同。也就是说，第一空间滤光片22d在光源20侧的表面上具有阻挡从光源20发出的光的阻挡区域221d(对应于图8中的阻挡区域221b)，并且在与光源20相反的表面上具有反射从观察对象5发出的光的散射光的反射区域223d(对应图8中的反射区域223b)。第一光路24d-1和第一光路24d-2是在照明光中穿过第一空间滤光片22d的透过区域220d的光的光路。
作为示例，第一空间滤光片22d被布置为相对于基本上垂直于第一光路24d的方向(即，z轴方向)仅倾斜预定角度。这里，当沿-y方向看时该预定角度例如是顺时针方向45度。
为了检测前向散射光，布置第二空间滤光片31d作为第二空间滤光片。第二空间滤光片31d的配置与图3所示的第二空间滤光片31的配置相同。也就是说，第二空间滤光片31d在光源20侧的表面上具有使从观察对象5发出的散射光透过的透过区域311d(对应于图3中的透过区域311)、以及阻挡从光源20发出的直射光的阻挡区域310d(对应于图3中的阻挡区域310)。由于第一空间滤光片22d被布置为相对于与第一光路24d基本上垂直的方向(即，相对于从光源20发出的光的方向基本上垂直的方向)仅倾斜预定角度，因此阻挡区域221d中包含的点的图像相对于光轴方向位于不同的位置。相应地，第二空间滤光片31d是倾斜的，并且照射区域R1和阻挡区域221d在第一空间滤光片22d上重叠的区域的图像相对于光轴方向在第二空间滤光片31d的不同位置形成。因此，照射区域R1和阻挡区域221d在第一空间滤光片22d上重叠的区域以及照射区域R2和透过区域311d在第二空间滤光片31d上重叠的区域被布置在具有基本上光学共轭的关系的位置处。
第一物镜23在流路上的图像位置25处形成由空间光学调制装置21调制的光的图像。此外，第一物镜23使来自观察对象5的后向散射光平行。这里，来自观察对象5的后向散射光被第一空间滤光片22d的反射区域223d反射、沿-x方向传播、穿过第二成像透镜35d且然后聚集在第二光检测器36d的检测表面上。
随后，将描述光学检测系统3d的配置。光学检测系统3d包括第二物镜30、第二空间滤光片31d、成像透镜32、第一光检测器33、第二成像透镜35d和第二光检测器36d。
在光学检测系统3d中，前向散射光的光路被称为第二光路34d。第二光路34d与图1所示的第二光路34一样平行于z轴。
此外，在光学检测系统3d中，后向散射光的光路被称为第三光路37d。第三光路37d在从观察对象5到第一空间滤光片22d的区段中平行于z轴。由于后向散射光被第一空间滤光片22d反射，第三光路37d在第一空间滤光片22d的位置处以大致直角弯曲。结果，第三光路37d在从第一空间滤光片22d到第二光检测器36d的区段中平行于x轴。
第二空间滤光片31d具有阻挡透过观察对象5的直射光的阻挡区域310d和使来自观察对象5的前向散射光透过的透过区域311d。第二空间滤光片31d被布置为相对于基本上垂直于第二光路34d的方向(即z轴方向)仅倾斜预定角度。这里，当沿-y方向观察时该预定角度例如是逆时针45度。除了第二空间滤光片31d被布置为相对于基本上垂直于第二光路34d的方向仅倾斜预定角度之外，第二空间滤光片31d的配置与第二空间滤光片31(图3)的配置相同。
如上所述，第一空间滤光片22d和第二空间滤光片31d被布置为相对于基本上垂直于第一光路24d的方向(即，z轴方向)仅倾斜预定角度。第二空间滤光片31d所布置的位置位于与第一空间滤光片22d具有共轭关系的位置处，并且由第一空间滤光片22d的阻挡区域221生成的阴影区域(被阻挡区域221阻挡的照射区域R1的区域)的图像与照射区域R2和透过区域311d在第二空间滤光片31d的平面上重叠的区域基本上相同。
第二成像透镜35d形成由第一空间滤光片22d反射的后向散射光的图像。这里，第一空间滤光片22d还用作用于检测后向散射光的第二空间滤光片。在本实施方式中，第一空间滤光片22d具有第一区域(光源侧的表面上的阻挡区域221d)和第二区域(图像位置25侧的表面上的反射区域223d)。
第二光检测器36d检测由第二成像透镜35d成像的后向散射光。这里，由第二成像透镜35d成像的后向散射光是由通过第一空间滤光片22d的构件构成的反射区域223d反射的光，该第一空间滤光片22d反射从观察对象5发出的散射光。因此，第二光检测器36d通过反射构件反射散射光来检测从观察对象5发出的散射光。
流式细胞仪1d可以仅检测后向散射光。在这种情况下，从光学检测系统3d中省略第二物镜30、第二空间滤光片31d、成像透镜32和第一光检测器33。
如上所述，在根据本实施方式的流式细胞仪1d中，在构成第一空间滤光片22d的表面中的面向图像位置25的一侧(与光源20相反的一侧)上，第一区域(在本实施方式中为阻挡区域221d)的全部或一部分由反射散射光的构件(在本实施方式中为构成反射区域223d的反射镜)构成。在流式细胞仪1d中，作为光学检测系统3d的一部分，设置有第二光检测器36d，该第二光检测器36d检测由构件(在本实施方式中为反射区域223d的反射镜)反射的散射光，该构件反射从光源20发出的光被观察对象5散射的散射光。
在根据本实施方式的流式细胞仪1d中，第一空间滤光片22d在光源20侧的表面上具有阻碍向观察对象5照射光源光的第一区域(在本实施方式中为阻挡区域221d)，并且在与光源20相反的表面上具有如下结构，该结构具有对来自观察对象5的后向散射光进行反射的构件(在本实施方式中为构成反射区域223d的反射镜)。此外，在根据本实施方式的流式细胞仪1d中，阻碍向观察对象5照射光源光的第一区域(在本实施方式中为第一空间滤光片22d的阻挡区域221d)被布置在与透过来自观察对象5的前向散射光的第二区域(在本实施方式中为第二空间滤光片31d的透过区域311d)具有基本上光学共轭的关系的位置处。因此，附加于前向散射光，还可以检测后向散射光作为实现比传统的散射光信噪比更高的散射光。在根据本实施方式的流式细胞仪1d中，照明光由调制装置调制，并且将结构化照明向观察对象照射并且作为前向和后向散射光同时获取。因此，可以在不使用荧光物质进行标记(无标记)的情况下获得观察对象5的更高分辨率的形态信息，并且可以以非侵入方式对观察对象5进行测量和分类。
(第三实施方式的变形示例)
这里，将描述本实施方式的变形示例。图11是示出根据本实施方式的流式细胞仪1e的配置的示例图。流式细胞仪1e包括流路(未示出)、光学照明系统2e和光学检测系统3e。
与上述实施方式及其变示形例中相同的配置和操作由相同的附图标记表示，并且将省略其描述。
光学照明系统2e包括光源20c、空间光学调制装置21c、第一空间滤光片22c和第一物镜23。光学照明系统2e的照明光的光路被称为第一光路24e。在图11中，作为第一光路24e的示例，示出了第一光路24e-1、第一光路24e-2和第一光路243e-3。第一光路24e在从光源20c到第一空间滤光片22c的区段中平行于x轴。由于照明光被第一空间滤光片22c反射，第一光路24e-1和第一光路24e-3在第一空间滤光片22c的位置处以大致直角弯曲。结果，第一光路24e-1和第一光路24e-3在从第一空间滤光片22c到观察对象5的区段中平行于z轴。另一方面，在第一光路24e-2中，照明光穿过第一空间滤光片22c。光源20c、空间光学调制装置21c和第一空间滤光片22c沿+x方向依次设置在第一光路24e上。
第一空间滤光片22c具有反射从光源20c发出的光的反射区域和使从光源20c发出的光和来自观察对象5的后向散射光透过的透过区域。与根据第二实施例的变形示例的第一空间滤光片22c(图9)类似地，第一空间滤光片22c被布置为相对于基本上垂直于z轴方向的方向仅倾斜预定角度。第一空间滤光片22c的配置与图4所示的第一空间滤光片22a的配置相同，并且在中央部具有作为透过区域的透过区域221c和在两端部具有作为反射区域的反射区域220c。
调制后的照明光被第一空间滤光片22c的反射区域220c反射，并且结构化照明光的图案在流路中的图像位置25处被成像。此外，第一物镜23使来自观察对象5的后向散射光平行，并照射第一空间滤光片22c。向第一空间滤光片22c照射的后向散射光穿过第一空间滤光片22b的透过区域221c并沿-z方向传播。
随后，将描述光学检测系统3e的配置。光学检测系统3e包括第二物镜30、第二空间滤光片31a、成像透镜32a、第一光检测器33a、第二成像透镜35c和第二光检测器36c。
在光学检测系统3e中，前向散射光的光路被称为第二光路34e。第二光路34e在从观察对象5到第二空间滤光片31a的区段中平行于z轴。由于前向散射光被第二空间滤光片31a反射，第二光路34e在第二空间滤光片31a的位置处以基本上直角弯曲。结果，第二光路34e在从第二空间滤光片31a到第一光检测器33a的区段中平行于x轴。
此外，在光学检测系统3e中，后向散射光的光路被称为第三光路37e。第三光路37e在从观察对象5经由第一空间滤光片22c到第二光检测器36c的区段中平行于z轴。
第二空间滤光片31a、成像透镜32a和第一光检测器33a的配置分别与图4所示的第二空间滤光片31a、成像透镜32a以及第一光检测器33a的配置相同。
第二成像透镜35c和第二光检测器36c的配置分别与图9所示的成像透镜32c和第一光检测器33c的配置相同。
在流式细胞仪1e中，可以用图10所示的光学检测系统3d中的用于检测前向散射光的配置来代替用于检测光学检测系统3e中的前向散射光的配置。也就是说，光学检测系统3e中的第二空间滤光片31a、成像透镜32a和第一光检测器33a可以由图10所示的光学检测系统3d中的第二空间滤光片31d、成像透镜32和第一光检测器33代替。
此外，在第三实施方式的流式细胞仪1d中，可以用图11所示的光学检测系统3e中的用于检测前向散射光的配置来代替光学检测系统3d中的用于检测前向散射光的配置。也就是说，光学检测系统3d中的第二空间滤光片31d、成像透镜32和第一光检测器33可以由图11所示的光学检测系统3e中的第二空间滤光片31a、成像透镜32a和第一光检测器33a代替。
此外，在图11中，作为第三实施方式的变形示例，虽然已经描述了当已检测到后向散射光时第一空间滤光片22d也用作第二空间滤光片的示例，但是本发明不限于此。与前面的例子类似，当在检测到后向散射光时第一空间滤光片22c不用作第二空间滤光片时，与第一空间滤光片22c不同的空间滤光片作为第二空间滤光片被布置为与在第三光路37e中的第一空间滤光片22c所布置的位置不同的位置处，并且也被布置在第一区域的位置和第二区域的位置处于基本上光学共轭的关系的位置处。
如上所述，在本实施方式的流式细胞仪1e中，第一物镜23在流路中的图像位置25处形成结构化照明光的图案的图像，并用结构化照明4照射观察对象5。第一空间滤光片22c被布置在第一光路24e中并且作为第一区域(在本实施方式中为透过区域221c)发挥作用，该第一区域使从光源20c发出的一部分光穿过第一空间滤光片22c并阻碍光朝向观察对象5的传播。来自观察对象5的后向散射光透过第一空间滤光片22c的透过区域221c的全部或一部分，并由第二光检测器36c检测。在流式细胞仪1e中，在流路中布置在第一空间滤光片22c的面向图像位置25的一侧的透过区域221c由使光透过的构件(在本实施方式中构成透过区域221c的间隙)构成。透过区域221c使从光源20c发出的照明光的一部分透过并阻碍光朝向观察对象5的传播。在流式细胞仪1e中，来自观察对象5的后向散射光再次穿过在流路中布置在第一空间滤光片22c的面向像位置25的一侧的透过区域221c，然后由第二光检测器36c检测。流式细胞仪1e包括第二成像透镜35c和第二光检测器36c，作为与来自观察对象5的后向散射光的检测相关的光学检测系统3e。
通过这种配置，在根据本实施方式的流式细胞仪1e中，当由第二光检测器36c检测到来自观察对象5的后向散射光时，能够降低从光源20c发出的直射光的影响。此外，在根据本实施方式的流式细胞仪1e中，来自观察对象5的后向散射光经由第一物镜23被平行化，并且由第二光检测器36c仅检测已经穿过第一空间滤光片22c的透过区域221c的后向散射光。结果，在根据本实施方式的流式细胞仪1e中，附加于前向散射光，还可以检测后向散射光作为实现比传统的信噪比更高的散射光。在根据本实施方式的流式细胞仪1e中，可以通过调制装置调制照明光，并且可以将结构化照明光向观察对象照射以同时获取前向和后向散射光。因此，可以在不使用荧光物质进行标记(无标记)的情况下获得关于观察对象5的高分辨率的形态信息，并且可以以非侵入方式对观察对象5进行测量和分类。
在上述每种实施方式中，虽然已经描述了在第一空间滤光片的第一区域中使用光透过或阻挡作为阻碍从光源发出的光朝向观察对象传播的方法的示例，但是本发明不限于此。
当第一空间滤光片具有阻挡区域作为第一区域时，阻挡区域对不用作向观察对象照射的光的光的传播进行阻挡。在这种情况下，阻挡区域可以利用光的吸收或偏振来阻挡光的传播。在第一空间滤光片中，除了阻挡区域之外的区域由透过区域构成，透过区域允许入射光保持不变地穿过。
第一空间滤光片可以通过改变用于照射观察对象的光与未使用的光之间的传播方向来将用作照明光的光与未使用的光在空间上分离并且仅将用作照明光的光朝向观察对象传播。例如，第一空间滤光片包括唯一的光学元件(光学滤光片)，其在第一区域和其他区域中具有不同的光学特性。第一空间滤光片使用该光学元件沿不同方向传播入射在第一区域和其他区域上的入射光。这里，不同的光学特性包括反射特性、衍射特性、折射特性等。
第一空间滤光片可以使用衍射来阻碍从光源发出的照明光朝向观察对象的传播。此外，第一空间滤光片可以使用反射来阻碍从光源发出的照明光朝向观察对象的传播。下面将描述使用这些不同于上述实施方式中的第一空间滤光片的示例。
这里，参照如12和如13，描述第一空间滤光片包括在第一区域和其他区域中具有不同的光学特性的唯一的光学元件的情况。图12示出根据每种实施方式的变形示例的第一空间滤光片22f的示例图。在图12所示的示例中，第一空间滤光片22f和空间光学调制装置被集成设置，并且第一空间滤光片22具有用于生成由上述每种实施方式的空间光学调制装置所具有的结构化照明光的功能。也就是说，第一空间滤光片22f是在其非调制区域和其他区域中具有不同光学特性的唯一的光学元件。由于该配置，第一空间滤光片22f同时具有类似于空间光学调制装置的调制元件的功能。
图12示出了当沿z轴方向从光源侧观察板状的第一空间滤光片22f时的平面222f。沿z轴方向从光源侧观察的空间光学调制装置的调制元件的表面位于平面222f上。
位于平面222f上的第一空间滤光片22f的表面被划分为结构化照明区域220f和非调制区域221f。在图12中，第一空间滤光片22f的结构化照明区域220f被非调制区域221f分隔开并且由两个不相连的区域组成，即结构化照明区域220f-1和结构化照明区域220f-2。
结构化照明区域220f和非调制区域221f由调制元件实现，并且具有彼此不同的光学特性。结构化照明区域220f例如通过设计用于在调制元件的表面上生成结构化照明的衍射图案来实现。如图13所示，第一空间滤光片22f通过衍射已经穿过结构化照明区域220f的调制光来改变光的传播方向。穿过结构化照明区域220f被改变传播方向的光被第一物镜23f聚集并用作向观察对象照射的结构化照明。
另一方面，已经穿过第一空间滤光片22f的非调制区域221f的光以不被调制的方式直接从光源直行(即，透过)。非调制区域221f和照射区域R1彼此重叠的区域的图像在设置于后级(subsequent stage，后续阶段)的第二空间滤光片中产生阴影。
根据第一空间滤光片22f，用于照射观察对象的光可以与未使用的光在空间上分离。同时，第一空间滤光片22f具有用于生成由上述每种实施方式的空间光学调制装置所具有的结构化照明的功能。如图13所示，根据第一空间滤光片22f，仅要使用的光能够作为对观察对象的照射光被传播到后级。光路24f-1是向观察对象照射的照射光的光路。第一光路24f-2是不用于向观察对象照射的照射光所走的光路。
在第一空间滤光片包括在第一区域和其他区域中具有不同光学特性的唯一的光学元件的情况下，第一空间滤光片和空间光学调制装置可以分开设置。即使在这种情况下，通过使用衍射元件作为第一空间滤光片，也可以将用于照射观察对象的光与不使用的光在空间上分离。
当衍射元件用作第一空间滤光片并且第一空间滤光片与空间光学调制装置分开设置时，优选第一空间滤光片设置在光源和空间光调制器之间。也就是说，当第一空间滤光片利用光透过、阻挡或反射作为阻碍从光源发出的光朝向观察对象传播的方法时，第一空间滤光片优选地设置在空间光学调制装置和流路中的图像位置之间，结构化照明在第一光路中被照射到该图像位置，并且在每种实施方式中以这些情况为例已进行了说明。然而，即使在光透过、阻挡或反射被用作阻碍这种光的传播的方法的实施方式中，第一空间滤光片也可以设置在光源和空间光学调制装置之间，并且在这种情况下，优选与空间光学调制装置距离更近。另一方面，作为第一空间滤光片阻碍光源的照明光朝向观察对象传播的另一种方法，也可以将衍射元件用作第一空间滤光片。在这种情况下，当将第一空间滤光片和空间光学调制装置分开设置时，第一空间滤光片优选地在第一光路中设置在光源和空间光调制器之间，并且更优选地与空间光学调制装置距离更近。
随后参照图14和图15，将描述第一空间滤光片以与上述每种实施方式不同的方法阻碍光朝向观察对象的传播的实施方式的变形示例。在本实施方式的变形示例中，第一空间滤光片具有反射区域。图14示出根据每种实施方式的变形示例的第一空间滤光片22g的示例图。在图14中，示出了沿z轴方向从光源观察板状的第一空间滤光片22g时的平面222g。第一空间滤光片22g在光源侧的表面位于平面222g上。
第一空间滤光片22g在平面222g上的表面被划分为透过区域220g和反射区域221g。在图14中，第一空间滤光片22g的透过区域220g被反射区域221g分隔开并且由两个不相连的区域组成，即透过区域220g-1和透过区域220g-2。如图15所示，反射区域221g具有突起223g。突起223g在相对于平面222g倾斜预定角度的表面上具有反射镜，并且通过对入射光进行反射来使入射光在不进入后级的光学系统的方向上传播。图15中的第一光路24g-2是不用于向观察对象照射的照射光所走的光路。
在图15的示例中，示出了后级的光学系统中的第一物镜23g。透过区域220g使来自光源20a的照明光的一部分透过。(光路24g-1是照射光到观察对象的光路。)这样，在第一空间滤光片22g中，代替阻挡入射到第一区域上的光的传播，布置对入射光进行反射的反射镜，以使入射光在不进入后级的光学系统的方向上传播。
在上述每种实施方式中，已经描述了光学照明系统2包括第一光学元件(第一物镜23)的情况的示例，但本发明不限于此。附加于第一光学元件，光学照明系统2还可以包括一个或多个第二光学元件。第二光学元件在第一光路中形成被空间光学调制装置调制的光的图像。在这种情况下，第一空间滤光片在第一光路中设置在除了多个图像位置之外的位置处，所述图像位置包括由第一光学元件所形成的结构化照明图案的图像位置和由一个或多个第二光学元件所形成的一个或多个图像位置。
(第四实施方式)
在每种实施方式中，作为从光源发出的照明光被观察对象调制的光的示例，描述了由光检测器检测被观察对象向前或向后散射的光的情况，但是本发明不限于此。作为由光检测器检测照明光被观察对象调制的光的另一示例，可以由光检测器检测由提供相变的结构产生的衍射光。在下面的示例中，将描述如下示例，设置在流路中的图像位置和光检测器之间的第二空间滤光片的第二区域将被观察对象衍射或散射的光指引朝向光检测器，当光穿过第二空间滤光片中的除第二区域之外的照射区域R2的全部或一部分时，透过观察对象的光的强度和/或相位被调制，并且通过使这两者的光在光检测器上干涉来获得相位差信息。
图16示出根据本实施方式的流式细胞仪1h的示例图。流式细胞仪1h包括流路(未示出)、光学照明系统2h和光学检测系统3h。
与上述实施方式中相同的配置和操作由相同的附图标记表示，并且将省略其描述。
光学照明系统2h的照明光的光路被称为第一光路24h。第一光路24h平行于z轴。在图16中，作为第一光路24h的示例，示出了第一光路24h-1和第一光路24h-2。光学照明系统2h包括光源20、空间光学调制装置21、第一空间滤光片22和第一物镜23。光源20、空间光学调制装置21、第一空间滤光片22和第一物镜23沿照明光被指引朝向流路中流动的观察对象5的方向依次设置在第一光路24h上。第一光路24h是在第一空间滤光片22和观察对象5之间的区段中穿过第一空间滤光片22的透过区域的光所走的光路。
光学检测系统3h包括第二物镜30、第二空间滤光片31h、成像透镜32和第一光检测器33h。在光学检测系统3中，前向散射光或衍射光的光路被称为第二光路34h。第二光路34h平行于z轴。
第二空间滤光片31h具有使被观察对象5调制的光透过的透过区域和调制透过观察对象5的光的强度和/或相位的调制区域。透过观察对象5的光是直射光。被观察对象5调制并由透过区域透过的光例如是被观察对象5散射的前向散射光，但也可以是由提供相变的结构产生的衍射光。在下面的描述中，由第二空间滤光片31h通过透过区域透过的前向散射光或衍射光被称为第一光，并且由第二空间滤光片31h透过且通过调制区域被调制的光也被称为第二光。第二空间滤光片31h的透过区域是第二区域的示例。上述第一光和第二光由第一光检测器33h检测。
成像透镜32在第一光检测器33h的检测表面上形成第一光和第二光的图像。成像透镜32可以将第一光和第二光聚集在第一光检测器33h的检测表面上并且可以不严格地形成图像。
第一光检测器33h检测关于通过使成像透镜32在检测表面上成像的第一光和第二光彼此干涉而获得的第一光与第二光之间的相位差的信息。这里，向观察对象5照射的光是由空间光学调制装置21构成的光。因此，第一光检测器33h针对结构化光检测直射光和前向散射光(或衍射光)之间的相位差的信息。也就是说，光学检测光学3h针对结构化光检测光的相位差。如上所述，当光穿过第二空间滤光片31h中的除第二区域(在本实施方式中为透过区域)之外的区域(在本实施方式中为调制区域)的全部或一部分时，穿过观察对象5的光的光的强度或相位被调制，并且第一光检测器33h检测相位被调制的光与被观察对象5调制的光的已穿过第二区域(在本实施方式中为透过区域)的光之间的相位差。
根据流式细胞仪1h，可以检测针对结构化光的光的相位差。
(第四实施方式的变形示例)
接下来，参照图17，作为第四实施方式的变形示例的示例，描述对被观察对象调制的光不仅作为相位差信息而且作为调制光本身同时进行检测的情况。图17示出了检测前向散射光或衍射光作为被观察对象调制的光的情况。
图17示出根据本实施方式的变形示例的流式细胞仪1i的示例的图。流式细胞仪1i包括流路(未示出)、光学照明系统2i和光学检测系统3i。
与上述实施方式中相同的配置和操作由相同的附图标记表示，并且将省略其描述。
光学照明系统2i的照明光的光路被称为第一光路24i。第一光路24i平行于z轴。在图16中，作为第一光路24i的示例，示出了第一光路24i-1和第一光路24i-2。光学照明系统2i包括光源20、空间光学调制装置21、第一空间滤光片22和第一物镜23。光源20、空间光学调制装置21、第一空间滤光片22和第一物镜23沿照明光被指引朝向流路中流动的观察对象5的方向依次设置在第一光路24i上。第一光路24i是在第一空间滤光片22和观察对象5之间的区段中穿过第一空间滤光片22的透过区域的光所走的光路。
光学检测系统3i包括第二物镜30、半透半反镜38i、第二空间滤光片31h、成像透镜32、第一光检测器33h、第三空间滤光片39i、第二成像透镜35d和第二光检测器36i。
在光学检测系统3i中，前向散射光或衍射光被指引朝向第一光检测器以检测相位差信息的光路被称为第二光路34i。第二光路34i平行于z轴。在图17中，作为第二光路34i的示例，示出了第二光路34i-1、第二光路34i-2和第二光路34i-3。第二光路34i-1和第二光路34i-3是透过观察对象5的光透过半透半反镜38i的光的光路。第二光路34i-2是被观察对象5散射的前向散射光或衍射光穿过半透半反镜38i的光所走的光路。
半透半反镜38i提取被观察对象5调制的光的一部分。半透半反镜38提取光的一部分意味着使入射到半透半反镜387i上的光的一部分透过，光的一部分被反射，并且使透过光或反射光在预定方向上传播。半透半反镜38i布置在第二光路34i中。半透半反镜38i是分束器的示例，分束器是布置在第二光路中并提取被观察对象调制的光的一部分的光学装置。
第二空间滤光片31h、成像透镜32和第一光检测器33h的配置分别与图16所示的第二空间滤光片31h、成像透镜32和第一光检测器33h的配置相同。
此外，在光学检测系统3i中，由第二光检测器检测前向散射光或衍射光的光路被称为第三光路37i。第三光路37i是被观察对象5散射的前向散射光或衍射光被半透半反镜38i反射的光所走的光路。第三光路37i平行于x轴。
第三空间滤光片39i、第二成像透镜35d和第二光检测器36i沿被观察对象5散射的前向散射光或衍射光传播的方向依次设置在第三光路37i上。
第三空间滤光片39i包括使被观察对象5散射的前向散射光或衍射光透过的透过区域，以及阻挡透过观察对象5的光(即，直射光)的阻挡区域。被第三空间滤光片39i的阻挡区域阻挡的直射光是在透过观察对象5的直射光中的在x轴方向上被半透半反镜38i反射的光。第三空间滤光片39i的透过区域是第三区域的示例。
第二成像透镜35d在第二成像透镜35d的成像表面上形成透过第三空间滤光片39i的前向散射光或衍射光的图像。第二成像透镜35d可以将前向散射光或衍射光聚集在第二成像透镜35d的检测表面上并且可以不形成图像。
第二光检测器36i检测通过第二成像透镜35d在检测表面上成像的前向散射光或衍射光。通过第二成像透镜35d在检测表面上成像的前向散射光或衍射光如上所述是由半透半反镜38i提取的调制光穿过第三空间滤光片39i的透过区域的光。因此，第二光检测器36i检测由观察对象5调制的已经穿过第三区域的光。
根据流式细胞仪1i，对于结构化光，附加于光的相位差，还可以同时检测被观察对象5散射的前向散射光和衍射光。
在根据上述每种实施方式的流式细胞仪中，由于可以以比使用传统的用于来自细胞的散射光的线形照明光的流式细胞仪更高的分辨率获得包括形态信息在内的信息，因此可以在不使用荧光标记等进行标记(即，无标记)的情况下以非侵入方式基于形态信息来高速分离观察对象(例如，目标细胞)。
虽然已经参考附图详细描述了本发明的一个实施方式，但是具体配置不限于上述，并且可以在不脱离本发明的主旨的情况下进行各种设计变化等。
附图标记说明：
1、1a、1b、1c、1d、1e、1h、1i：流式细胞仪
2、2a、2b、2c、2d、2e、2h、2i：光学照明系统
3、3a、3b、3c、3d、3e、3h、3i：光学检测系统
20、20a、20c：光源
21、21a、21c：空间光学调制装置
22、22a、22b、22c、22d：第一空间滤光片
221、221b、310a：阻挡区域
220a、223a、311a、221g：反射区域
220、220b、220g、221a、311：透过区域
220f：结构化照明区域
221f：非调制区域
23：第一物镜
31、31a、31d、31h：第二空间滤光片
33、33a、33c、33h：第一光检测器
36d、36c、36i：第二光检测器
39i：第三空间滤光片
24、24a、24b、24c、24d、24e、24h、24i：第一光路
34、34a、34b、34c、34d、34e、34h、34i：第二光路
25：图像位置
5：观察对象

Claims (10)

1.一种流式细胞仪，包括：
流路，观察对象与流体一起在该流路中流过；
光学照明系统，所述光学照明系统包括：光源；空间光学调制装置，所述空间光学调制装置被配置为调制从所述光源发出的光；以及第一光学元件，所述第一光学元件被配置为在所述流路中形成由所述空间光学调制装置所调制的光的图像；以及
光学检测系统，包括第一光检测器，所述第一光检测器被配置为检测由所述第一光学元件成像并由在所述流路中流动的观察对象所调制的光，
其中，所述光学照明系统还包括第一空间滤光片，所述第一空间滤光片被布置在所述光源和在所述流路中由所述第一光学元件成像的光的图像位置之间的第一光路中并且具有第一区域，所述第一区域阻碍从所述光源发出的光朝向所述观察对象传播，
所述光学检测系统还包括第二空间滤光片，所述第二空间滤光片被布置在所述第一光检测器和所述图像位置之间的第二光路中并且具有第二区域，所述第二区域将由所述观察对象所调制的光朝向所述第一光检测器指引，并且
所述第一区域的位置以及所述第二区域的位置处于基本上光学共轭的关系。
2.根据权利要求1所述的流式细胞仪，其中，当未设置所述第一空间滤光片时，所述第二区域与由所述空间光学调制装置所调制的光穿过所述观察对象并照射所述第二空间滤光片的区域发生重叠的区域基本上相同于或被包含于由在所述第二空间滤光片中形成的区域的图像在所述第二空间滤光片上所占据的区域，其中，在所述第二空间滤光片中形成的区域是所述第一区域与所述第一空间滤光片被所述空间光学调制装置调制的光照射的区域重叠的区域。
3.根据权利要求1或2所述的流式细胞仪，其中，由在所述流路中流动的观察对象所调制并由所述第一光检测器所检测的光是散射光或衍射光。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的流式细胞仪，其中，所述第一区域通过使用所述光的透过、阻挡、衍射和反射中的一种来阻碍从所述光源发出的光朝向所述观察对象的传播。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的流式细胞仪，其中，在所述第一空间滤光片的表面中的位于面向所述图像位置的一侧的表面上，与所述第一区域对置的区域的全部或一部分由一构件构成，所述构件对从所述光源发出的光由所述观察对象所散射的散射光进行反射，且
所述光学检测系统还包括第二光检测器，所述第二光检测器检测被所述构件反射的散射光。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的流式细胞仪，其中，在所述第一空间滤光片的表面中的位于面向所述图像位置的一侧的表面上，与所述第一区域对置的区域的全部或一部分由一构件构成，所述构件使从所述光源发出的光由所述观察对象所散射的散射光透过，且
所述光学检测系统还包括第二光检测器，所述第二光检测器检测由所述构件透过的散射光。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的流式细胞仪，其中，所述第一空间滤光片和所述空间光学调制装置被集成设置。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的流式细胞仪，其中，所述第一空间滤光片用作所述第二空间滤光片。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的流式细胞仪，其中，当光穿过所述第二空间滤光片中的除所述第二区域之外的区域的全部或一部分时，透过所述观察对象的光的强度或相位被调制，并且所述第一光检测器检测由所述观察对象所调制的光中的已经穿过除所述第二区域之外的区域的相位被调制的光与已经穿过所述第二区域的光之间的相位差。
10.根据权利要求9所述的流式细胞仪，还包括：
分束器，所述分束器被布置在所述第二光路中并且被配置为提取由所述观察对象所调制的光的一部分；
第三空间滤光片，所述第三空间滤光片具有第三区域，所述第三区域被配置为使由所述分束器提取的调制光透过；以及
第二光检测器，所述第二光检测器被配置为检测已经穿过所述第三区域的调制光。
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