CN115343477A - 糖化血清蛋白测定试剂盒、测试糖化血清蛋白浓度的方法和应用 - Google Patents
糖化血清蛋白测定试剂盒、测试糖化血清蛋白浓度的方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及化学检测技术领域，具体而言，涉及一种糖化血清蛋白测定试剂盒、测试糖化血清蛋白浓度的方法和应用。所述试剂盒包括：pH＝10.5～10.8的第一试剂和pH4.0～5.0的第二试剂；其中，所述第二试剂包括氯化硝基四氮唑蓝。本发明所提供的糖化血清蛋白测定试剂盒与IgA型多发性骨髓瘤患者中的IgA‑白蛋白结合效果显著，可以用于筛查IgA型多发性骨髓瘤。
Description
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，具体而言，涉及一种糖化血清蛋白测定试剂盒、测试糖化血清蛋白浓度的方法和应用。
背景技术
糖化血清蛋白(也称果糖胺)是血清中各种蛋白质在高糖作用下发生的非酶促糖化反应产物，血清蛋白糖化主要发生在蛋白质分子的赖氨酸残基上，其中以白蛋白为主，血清白蛋白的半衰期为l7～19d，测定糖化血清蛋白可反映测定前2～3周的平均血糖水平。因此，在糖尿病(DM)的诊断中，在近期监控和疗效评价方面有较大的意义。
NBT法测试血清中糖化血清蛋白含量的基本原理如下：血清果糖胺是一种大分子酮胺类化合物，在碱性条件下可将四氮唑蓝还原成紫色甲臜，其生成量与血清果糖胺成正比。用比色法在540nm(530～550nm)处，以糖化血清蛋白为校准品，测定反应中甲臜的生成量，从而得出血清果糖胺的浓度。
研究发现IgA型多发性骨髓瘤患者中的IgA大多以IgA-白蛋白复合物形式存在，该复合物和葡萄糖发生非酶促糖基化反应，形成类似果糖胺的高分子酮胺结构化合物，其在碱性条件下还原NBT能力明显增强。
目前，市场上销售的糖化血清蛋白(NBT法)测IgA型多发性骨髓瘤患者样本阳性结果不显著。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种糖化血清蛋白测定试剂盒，该试剂盒与IgA-ALB复合物的具有良好的结合能力。
本发明的第二目的在于提供一种所述的糖化血清蛋白测定试剂盒在制备测试或筛查IgA型多发性骨髓瘤的试剂或医疗器械中的用途。
本发明的第三目的在于提供一种所述的糖化血清蛋白测定试剂盒在制备测试糖尿病的试剂或医疗器械中的用途。
本发明的第四目的在于提供一种利用所述的糖化血清蛋白测定试剂盒测试糖化血清蛋白浓度的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明所提供的糖化血清蛋白测定试剂盒，所述试剂盒中包括：
pH＝10.5～10.8的第一试剂和pH4.0～5.0的第二试剂；
其中，所述第二试剂包括氯化硝基四氮唑蓝。
优选地，所述试剂盒中包括：
pH＝10.5～10.7的第一试剂和pH4.2～4.8的第二试剂；
其中所述第二试剂包括氯化硝基四氮唑蓝。
优选地，所述第一试剂包括以下浓度的组分：
第一缓冲液 200～800mmol/L；
防腐剂 0.1～2g/L；
其中，所述第一缓冲溶液包括碳酸盐缓冲液。
优选地，所述第二试剂包括以下浓度的组分：
第二缓冲液 10～100mmol/L；
氯化硝基四氮唑蓝 0.5～3.5mmol/L。
其中，所述第二缓冲液包括甘氨酸缓冲液。
优选地，所述防腐剂包括包括甲基-异噻唑啉、ProClin300、万古霉素、那他霉素中的任一种。
本发明所述的糖化血清蛋白测定试剂盒在制备测试或筛查IgA型多发性骨髓瘤的试剂或医疗器械中的用途。
本发明所述的糖化血清蛋白测定试剂盒在制备测试糖尿病的试剂或医疗器械中的用途。
本发明所提供的利用所述的糖化血清蛋白测定试剂盒测试糖化血清蛋白浓度的方法，包括以下步骤：
(a)取5μl待测标本和150～200μl的第一试剂混匀，置30-45℃孵育3～5分钟后，读取吸光度A1；
(b)将步骤(a)得到的混合溶液与50～70μl的第二试剂混匀，孵育3～5分钟后，空白管调零，读取吸光度A2；
其中，测取吸光度的主波长为530～550nm，副波长700～750nm；
(c)通过公式测得：
糖化血清蛋白浓度＝ΔA测定*标准溶液的浓度/ΔA标准；
其中，ΔA＝lA2-A1l；
所述标准溶液的浓度为2.0～2.5mmol/L。
优选地，所述标准溶液为标准品复溶制得，所述标准品的制备方法，包括：
将99.2～99.6mg的1-脱氧-1-吗啉果糖，溶于100mL的牛血清白蛋白溶液中，充分混匀；混合后，通过0.22～0.30微米的滤膜过滤后，分装冻干备用。
优选地，所述牛血清白蛋白溶液的浓度为40～45g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所提供的糖化血清蛋白测定试剂盒与IgA型多发性骨髓瘤患者中的IgA-白蛋白结合效果显著，可以用于筛查IgA型多发性骨髓瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明试验例1的检测结果图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明所提供的糖化血清蛋白测定试剂盒，所述试剂盒中包括：
pH＝10.5～10.8的第一试剂和pH4.0～5.0的第二试剂；
其中，所述第二试剂包括氯化硝基四氮唑蓝。
第一试剂的pH可以为10.5、10.6、10.7、10.8以及它们组成的任一范围值。
第二试剂的pH可以为4.0、4.2、4.5、4.8、4.9、5.0以及它们组成的任一范围值。
氯化硝基四氮唑蓝为显色成分，本发明主要是通过调整第一试剂和第二试剂的pH来提高测试试剂与IgA－ALB复合物的结合能力。
一优选的实施方式中，可以对第一试剂和第二试剂的pH进行优选，具体的，所述试剂盒中包括：
pH＝10.5～10.7的第一试剂和pH4.2～4.8的第二试剂；
其中，所述第二试剂包括氯化硝基四氮唑蓝。
一优选的实施方式中，所述第一试剂包括以下浓度的组分：
第一缓冲液 200～800mmol/L；
防腐剂 0.1～2g/L；
其中，所述第一缓冲溶液包括碳酸盐缓冲液。
进一步地，第二缓冲液的浓度可以为200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L、500mmol/L、600mmol/L、700mmol/L、800mmol/L中的任一点值或任两个点值组成的范围值。
进一步地，防腐剂的浓度可以为0.1g/L、0.5g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.6g/L、1.8g/L、2.0g/L中的任一点值或任两个点值组成的范围值。
进一步地，防腐剂可以为不影响测试结果的任何现有常用的防腐剂类型。
一优选的实施方式中，通过调节氯化硝基四氮唑蓝(即NBT)的浓度，提高测试试剂与IgA-ALB复合物的结合能力，具体地，第二试剂包括以下浓度的组分：
第二缓冲液 10～100mmol/L；
氯化硝基四氮唑蓝 0.5～3.5mmol/L。
其中，所述第二缓冲液包括甘氨酸缓冲液。
进一步地，第二缓冲液的浓度可以为10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L中的任一点值或任两个点值组成的范围值。
进一步地，氯化硝基四氮唑蓝的浓度可以为0.5mmol/L、0.7mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L、1.8mmol/L、2.0mmol/L、2.3mmol/L、2.5mmol/L、2.8mmol/L、3.0mmol/L、3.2mmol/L、3.5mmol/L中的任一点值或任两个点值组成的范围值。
一优选的实施方式中，所述防腐剂包括甲基-异噻唑啉、ProClin300、万古霉素、那他霉素中的任一种。
本发明实施例所提供的利用所述的糖化血清蛋白测定试剂盒测试糖化血清蛋白浓度的方法，包括以下步骤：
(a)取5μl待测标本和150～200μl的第一试剂混匀，置30～45℃孵育3～5分钟后，读取吸光度A1；
(b)将步骤(a)得到的混合溶液与50～70μl的第二试剂混匀，孵育3～5分钟后，空白管调零，读取吸光度A2；
其中，测取吸光度的主波长为530～550nm，副波长700～750nm；
(c)通过公式测得：
糖化血清蛋白浓度＝ΔA测定*标准溶液的浓度/ΔA标准；
其中，ΔA＝lA2-A1l；
进一步地，所述标准溶液的浓度为2.0～2.5mol/L。
一优选的实施方式中，所述标准溶液为标准品复溶制得，所述标准品的制备方法，包括：
将99.2～99.6mg的1-脱氧-1-吗啉果糖，溶于100mL的牛血清白蛋白溶液中，充分混匀；混合后，通过0.22～0.30微米的滤膜过滤后，分装冻干备用。
一优选的实施方式中，所述牛血清白蛋白溶液的浓度为40～45g/L。
进一步地，在使用时，打开瓶盖，精确加入1ml纯化水，室温(20-25℃)放置30分钟以上，使冻干物完全溶解，摇匀后即可使用。
本发明所提供的试剂盒或测试方法对于糖化血清蛋白的测试范围为1.4～2.4mmol/L。
实施例1
第一试剂的pH＝10.8，其组分为：
碳酸盐缓冲液 400mmol/L；
防腐剂 0.5g/L；
第二试剂的pH＝4.5，其组分为：
甘氨酸缓冲液 20mmol/L；
氯化硝基四氮唑蓝(NBT) 1.5mmol/L。
实施例2
第一试剂的pH＝10.6，其组分为：
碳酸盐缓冲液 600mmol/L；
防腐剂 0.5g/L；
第二试剂的pH＝4.5，其组分为：
甘氨酸缓冲液 20mmol/L；
氯化硝基四氮唑蓝(NBT) 1.5mmol/L。
实施例3
第一试剂的pH＝10.6，其组分为：
碳酸盐缓冲液 400mmol/L；
防腐剂 0.5g/L；
第二试剂的pH＝4.5，其组分为：
甘氨酸缓冲液 20mmol/L；
氯化硝基四氮唑蓝(NBT) 2.5mmol/L。
实施例4
第一试剂的pH＝10.6，其组分为：
碳酸盐缓冲液 600mmol/L；
防腐剂 0.5g/L；
第二试剂的pH＝4.5，其组分为：
甘氨酸缓冲液 20mmol/L；
氯化硝基四氮唑蓝(NBT) 2.5mmol/L。
实施例5
第一试剂的pH＝10.8，其组分为：
碳酸盐缓冲液 800mmol/L；
防腐剂 2g/L；
第二试剂的pH＝4.0，其组分为：
甘氨酸缓冲液 10mmol/L；
氯化硝基四氮唑蓝(NBT) 0.5mmol/L。
实施例6
第一试剂的pH＝10.5，其组分为：
碳酸盐缓冲液 200mmol/L；
防腐剂 0.1g/L；
第二试剂的pH＝5.0，其组分为：
甘氨酸缓冲液 100mmol/L；
氯化硝基四氮唑蓝(NBT) 3.5mmol/L。
对比例1
重庆中元生物技术有限公司，糖化血清蛋白检测试剂盒(四氮唑蓝显色法)。第一试剂：碳酸盐缓冲100mmol/L，第二试剂：硝基四氮唑0.30mmol/L。
对比例2
迈克生物股份有限公司，果糖胺测定试剂盒(四氮唑蓝法)。第一试剂：碳酸盐100mmol/L，第二试剂：氯化硝基四氮唑蓝1.6mmol/L。
试验例1
选取50例IgA型多发性骨髓瘤不同浓度IgA样本，采用实施例1-4以及对比例1-2所提供的试剂盒分别对样本进行测试，测试结果如表1和图1所示。
测试方法具体包括：
(1)取5μl待测标本和150μl的第一试剂混匀，置37℃孵育5分钟后，读取吸光度A1；
(2)将步骤(1)得到的混合溶液与50μl的第二试剂混匀，孵育5分钟后，空白管调零，读取吸光度A2；
其中，测取吸光度的主波长为540nm，副波长700nm；
(c)通过公式测得：
糖化血清蛋白浓度＝ΔA测定*标准溶液的浓度/ΔA标准；
其中，ΔA＝lA2-A1l；
标准溶液的浓度为2.4mmol/L。
表1 各实施例检测结果值
图1中，以IgA浓度为横坐标，实施例1-4以及对比例1-2的测试结果为纵坐标。实验结果表明，当样本中IgA浓度超过15g/L时，本发明所提供的试剂盒检测的糖化血清蛋白浓度开始出现异常增高(糖化血清蛋白参考值1.4～2.4mmol/L)，且随着IgA浓度的增高而逐步增高；而当样本中IgA浓度超过36g/L时，对比试剂盒所测糖化血清蛋白浓度才开始出现异常。说明本发明所提供的试剂盒与IgA型多发性骨髓瘤患者血液样本的结合能力优于现有同类型试剂盒。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。
Claims (10)
1.糖化血清蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
pH＝10.5～10.8的第一试剂和pH4.0～5.0的第二试剂；
其中，所述第二试剂包括氯化硝基四氮唑蓝。
2.根据权利要求1所述的糖化血清蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
pH＝10.5～10.7的第一试剂和pH4.2～4.8的第二试剂；
其中，所述第二试剂包括氯化硝基四氮唑蓝。
3.根据权利要求1或2所述的糖化血清蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述第一试剂包括以下浓度的组分：
第一缓冲液200～800mmol/L；
防腐剂0.1～2g/L；
其中，所述第一缓冲溶液包括碳酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1或2所述的糖化血清蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述第二试剂包括以下浓度的组分：
第二缓冲液10～100mmol/L；
氯化硝基四氮唑蓝0.5～3.5mmol/L。
其中，所述第二缓冲液包括甘氨酸缓冲液。
5.根据权利要求3所述的糖化血清蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述防腐剂包括甲基-异噻唑啉、ProClin300、万古霉素、那他霉素中的至少一种。
6.如权利要求1-5任一项所述的糖化血清蛋白测定试剂盒在制备测试或筛查IgA型多发性骨髓瘤的试剂或医疗器械中的用途。
7.如权利要求1-5任一项所述的糖化血清蛋白测定试剂盒在制备测试糖尿病的试剂或医疗器械中的用途。
8.利用如权利要求1-5任一项所述的糖化血清蛋白测定试剂盒测试糖化血清蛋白浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)取5μl待测标本和150～200μl的第一试剂混匀，置30-45℃孵育3～5分钟后，读取吸光度A1；
(b)将步骤(a)得到的混合溶液与50～70μl的第二试剂混匀，孵育3～5分钟后，空白管调零，读取吸光度A2；
其中，测取吸光度的主波长为530～550nm，副波长700～750nm；
(c)通过公式测得：
糖化血清蛋白浓度＝ΔA测定*标准溶液的浓度/ΔA标准；
其中，ΔA＝lA2-A1l；
所述标准溶液的浓度为2.0～2.5mmol/L。
9.根据权利要求8所述的测试糖化血清蛋白浓度的方法，其特征在于，所述标准溶液为标准品复溶制得，所述标准品的制备方法，包括：
将99.2～99.6mg的1-脱氧-1-吗啉果糖，溶于100mL的牛血清白蛋白溶液中，充分混匀；混合后，通过0.22～0.30微米的滤膜过滤后，分装冻干备用。
10.根据权利要求9所述的测试糖化血清蛋白浓度的方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白溶液的浓度为40～45g/L。
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