CN115343431A - 一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法 - Google Patents

一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法 Download PDF

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CN115343431A CN202211040817.2A CN202211040817A CN115343431A CN 115343431 A CN115343431 A CN 115343431A CN 202211040817 A CN202211040817 A CN 202211040817A CN 115343431 A CN115343431 A CN 115343431A
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Abstract

本发明公开了一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，包括以下步骤：S1、确定待检测乳剂样品的细菌内毒素限值L，确定鲎试剂的灵敏度；S2、根据细菌内毒素限值L、鲎试剂的灵敏度、供试品溶液的浓度C计算乳剂样品的最大有效稀释倍数；S3、将非离子型表面活性剂溶解于细菌内毒素检查用水中制备成稀释液；S4、将待检测的乳剂样品采用步骤S3制备的稀释液，并根据步骤S2计算的最大有效稀释倍数进行稀释处理，获得供试品溶液；S5、将步骤S4获得的供试品溶液采用鲎试剂进行检测。本发明用含0.05‑4％非离子型表面活性剂的细菌内毒素检查用水进行稀释处理，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂进行细菌内毒素检查，能够降低干扰，提高乳剂样品中细菌内毒素检查的准确率。

Description

一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法
技术领域
本发明涉及细菌内毒素检测技术领域，具体涉及一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法。
背景技术
现有对乳剂产品中细菌内毒素的检测主要是通过稀释后采用鲎试剂进行检测，稀释液采用细菌内毒素检查用水。但是，乳剂产品的细菌内毒素检测干扰较强，导致，乳剂产品中细菌内毒素的检测结果准确率低。例如：乳剂产品中的中/长链脂肪乳注射液(C6～24)，中/长链脂肪乳注射液(C6～24)为肠外营养药，成分较复杂，细菌内毒素检查干扰作用较强，通过简单的稀释方法无法排除干扰作用使用低灵敏度的鲎试剂检测，导致检测结果准确率低。
因此，有必要设计一种能够排出干扰的乳剂产品中细菌内毒素的检测方法，以提高乳剂产品中细菌内毒素检测的准确率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，用于中/长链脂肪乳注射液(C6～24)细菌内毒素检测，排除样品的干扰作用，提高检查的准确率。
本发明通过下述技术方案实现：
一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，将乳剂样品采用稀释液进行稀释后，用鲎试剂检测，所述稀释液为含0.05wt％-4wt％非离子型表面活性剂的细菌内毒素检查用水。
非离子型表面活性剂包括乳百灵、吐温60、西土马哥1000或吐温80，非离子型表面活性剂能促进乳剂样品在稀释液中均匀分散；本发明用含0.05wt％-4wt％非离子型表面活性剂的细菌内毒素检查用水进行稀释处理，能够降低干扰，提高乳剂样品中细菌内毒素检查的准确率。
进一步地，鲎试剂采用高灵敏度试剂。
采用高灵敏度的鲎试剂能够在一定程度上排除干扰。
进一步地，鲎试剂的灵敏度大于等于0.06EU/ml。
进一步地，包括以下步骤：
S1、确定待检测乳剂样品的细菌内毒素限值L，确定鲎试剂的灵敏度；
S2、根据细菌内毒素限值L、鲎试剂的灵敏度和供试品溶液的浓度计算乳剂样品的最大有效稀释倍数；
S3、将非离子型表面活性剂溶解于细菌内毒素检查用水中制备成稀释液；
S4、将待检测的乳剂样品采用步骤S3制备的稀释液，并根据步骤S2计算的最大有效稀释倍数进行稀释处理，获得供试品溶液；
S5、将步骤S4获得的供试品溶液采用鲎试剂进行检测。
进一步地，步骤S1中，乳剂样品的细菌内毒素限值L为：
100ml及以上装量的大输液类制剂的细菌内毒素限值L小于等于0.50EU/ml。
进一步地，最大有效稀释倍数的计算公式为：
MVD＝CL/λ；
式中，MVD为最大有效稀释倍数，C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml，L为细菌内毒素限值；λ为标示灵敏度，EU/ml。
进一步地，步骤S3中，非离子型表面活性剂在稀释液中的质量百分占比为0.25％。
进一步地，步骤S5中，鲎试剂的灵敏度大于等于0.06EU/ml。
进一步地，步骤S5中，至少采用两个品牌相同灵敏度的鲎试剂进行确认。
进一步地，乳剂样品包括中/长链脂肪乳注射液(C6～24)。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
与现有技术通过简单的稀释方法处理检测乳剂样品中细菌内毒素，本发明用含0.05wt％-4wt％非离子型表面活性剂的细菌内毒素检查用水进行稀释处理，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂进行细菌内毒素检查，能够降低干扰，提高乳剂样品中细菌内毒素检查的准确率。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，包括以下步骤：
S1、确定待检测乳剂样品的细菌内毒素限值L，确定鲎试剂的灵敏度；
根据9251细菌内毒素检查法应用指导原则：100ml及以上装量的大输液类制剂，其细菌内毒素限值一般不得超过0.50EU/ml，最终确定限值为小于0.50EU/ml；优选鲎试剂的灵敏度大于等于0.06EU/ml；
S2、根据细菌内毒素限值L、鲎试剂的灵敏度和供试品溶液的浓度计算乳剂样品的最大有效稀释倍数；
最大有效稀释倍数的计算公式为：
MVD＝CL/λ；
式中，MVD为最大有效稀释倍数，C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml，L为细菌内毒素限值；λ为标示灵敏度，EU/ml；
S3、将吐温80溶解于细菌内毒素检查用水中制备成稀释液；
S4、将待检测的乳剂样品采用步骤S3制备的稀释液，并根据步骤S2计算的最大有效稀释倍数进行稀释处理，获得供试品溶液；
S5、将步骤S4获得的供试品溶液采用鲎试剂进行检测。
本实施例以中/长链脂肪乳注射液(C6～24)的细菌内毒素检测进行说明：
采用本实施例的检查方法分别对中/长链脂肪乳注射液(C6～24)进行干扰试验、供试品制备加标回收试验(干扰试验)和供试品细菌内毒素检查。
试验材料及仪器
鲎试剂(TAL)采用以下两种：
1)湛江博康海洋生物有限公司，规格：0.1ml/支，批号：2107092，灵敏度：0.06EU/ml；
2)福州新北生化工业有限公司，规格：0.1ml/支，批号：21012012，灵敏度：0.06EU/ml。
细菌内毒素工作标准品：湛江安度斯生物有限公司，效价：10EU/支，批号：2105281。
细菌内毒素检查用水(BET):湛江博康海洋生物有限公司,规格：50ml/瓶，批号：2109070。
吐温80：成都市科隆化学品化学品有限公司，规格：500ml/瓶，批号：2020041601。
仪器：洁净工作台、电热恒温鼓风干燥箱、内毒素凝胶法测定仪、旋涡混合仪、可调移液器、无热原吸头、反应试管、稀释管、试管架、时钟、75％乙醇棉、剪刀、砂轮、封口膜。
方法和结果：
按照中国药典2020年版附录细菌内毒素检查法规定进行鲎试剂的标示灵敏度复核，2批鲎试剂经检查结果均符合规定，如表1所示：
表1
Figure BDA0003820895370000031
注：表中的“+”和“-”表示检测结果，“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性，一个“+”或一个“-”表示一个测试结果。
1、干扰试验：
由于中/长链脂肪乳注射液(C6～24)属于乳剂产品，干扰较强，试验采用较高的灵敏度入为0.06EU/ml的鲎试剂检测，根据计算公式最大有效稀释倍数(MVD)＝CL/入＝8倍。
因此取3批中/长链脂肪乳注射液(C6～24)，用含0.25％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，作为供试品溶液，再用供试品溶液和BET水分别将细菌内毒素工作标准品稀释制备成含内毒素0.125EU/ml(2λ)、0.06EU/ml(λ)、0.03EU/ml(0.5λ)、0.015EU/ml(0.25λ)的溶液，作为溶液B和溶液C，分别与2个厂家灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂反应，溶液B每一浓度重复4管和溶液C每一浓度重复2管，供试品溶液重复2管(溶液A)，阴性对照(BET水)重复2管(溶液D)，按照中国药典2020年版附录细菌内毒素检查法干扰试验项进行试验。
(x)mL的含0.25％吐温80的细菌内毒素检查用水的制备：称取吐温80(0.0025x)
g，置于除热原的容器中，加入细菌内毒素检查用水(x)mL混合均匀即得。(此试验配制量为50ml，批号为N211021001)
根据公式溶液C＝antilg(∑XC/2)，溶液B＝antilg(∑XB/4)，式中：XC、XB分别为溶液C和溶液B反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003820895370000041
备注：表中的数字1、2、3代表不同的样品批号。
由表2的数据可知：
干扰试验结果表明：3批中/长链脂肪乳注射液(C6～24)，用含0.25％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，作为供试品溶液，用2个厂家灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂进行试验，结果溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求，系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求,符合药典规定。说明中/长链脂肪乳注射液(C6～24)用含0.25％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，已排除干扰作用，可在此稀释倍数下使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂对供试品进行细菌内毒素检查。
2、供试品制备加标回收试验(干扰试验)
取1批中/长链脂肪乳注射液(C6～24)，用含0.25％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，作为供试品溶液。对该供试品制样方法进行供试品制备加标回收试验(干扰试验)。
溶液A的制备：取1批中/长链脂肪乳注射液(C6～24)，用含0.25％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，作为供试品溶液。
溶液B的制备：取10EU/ml的内毒素标准溶液0.1ml与供试品原液0.9ml混合制备成含内毒素为1EU/ml的供试品溶液，作为溶液1；再取0.5ml溶液1与3.5ml含0.25％吐温80的细菌内毒素检查用水混合制备成含内毒素为0.125EU/ml(2λ)的供试品溶液，作为溶液2；再用供试品溶液将溶液2稀释制备成含内毒素0.06EU/ml(λ)、0.03EU/ml(0.5λ)、0.015EU/ml(0.25λ)的溶液。
溶液C的制备：用BET水分别将细菌内毒素工作标准品稀释制备成含内毒素0.125EU/ml(2λ)、0.06EU/ml(λ)、0.03EU/ml(0.5λ)、0.015EU/ml(0.25λ)的溶液。
溶液D的制备：即细菌内毒素检查用水。
将以上溶液A、B、C、D分别与2个厂家灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂反应，溶液A重复2管，溶液B每一浓度重复4管，溶液C每一浓度重复2管，溶液D重复2管，按照中国药典2020年版附录细菌内毒素检查法干扰试验项进行试验。
根据公式溶液C＝antilg(∑XC/2)，溶液B＝antilg(∑XB/4)，式中：XC、XB分别为溶液C和溶液B反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。结果如表3所示：
表3
Figure BDA0003820895370000051
备注：表中的数字3代表样品批号。
由表3的数据可知：
供试品制备加标回收试验(干扰试验)结果表明：中/长链脂肪乳注射液(C6～24)，用含0.25％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，作为供试品溶液，用2个厂家灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂进行试验，结果溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求，系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求,符合药典规定。说明中/长链脂肪乳注射液(C6～24)用含0.25％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，该供试品制样方法对试验无干扰作用，该供试品制样方法对检测结果无影响，可对供试品用含0.25％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂对供试品进行细菌内毒素检查。
3、供试品细菌内毒素检查
按照中国药典2020年版附录细菌内毒素检查法，取3批中/长链脂肪乳注射液(C6～24)，用含0.25％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，作为供试品溶液，用2个厂家灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂进行细菌内毒素检查，结果如表4所示：
表4
Figure BDA0003820895370000061
由表4的数据可知：
中/长链脂肪乳注射液(C6～24)细菌内毒素检查结果表明：3个批号的中/长链脂肪乳注射液(C6～24)使用2个厂家相同灵敏度的鲎试剂进行细菌内毒素检查，结果3批中/长链脂肪乳注射液((C6～24)内毒素含量均小于限值0.50EU/ml，该样品细菌内毒素检查符合规定。
综上，根据上述试验数据分析，对中/长链脂肪乳注射液(C6～24)用含0.25％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂进行细菌内毒素检查是可行的，具有准确率高的优点。
实施例2：
本实施例以同类脂肪乳品种：中/长链脂肪乳注射液(C8～24Ve)的细菌内毒素检测进行说明。
本实施例的稀释液为含0.05％吐温80的细菌内毒素检查用水。
采用本实施例的检查方法分别对中/长链脂肪乳注射液(C8～24Ve)进行干扰试验和供试品制备加标回收试验(干扰试验)。
1、干扰试验：取供试品，用含0.05％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，作为供试品溶液，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂进行干扰试验，具体制备同实施例1干扰试验，结果如表5所示：
表5
Figure BDA0003820895370000071
干扰试验结论：供试品8倍稀释液，鲎试剂使用0.06EU/ml的灵敏度进行干扰试验，结果无干扰。
2、供试品制备加标回收试验(干扰试验)：取供试品，用含0.05％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，作为供试品溶液。对该供试品制样方法进行供试品制备加标回收试验(干扰试验)。具体制备同实施例1供试品制备加标回收试验(干扰试验)，结果如表6所示：
表6
Figure BDA0003820895370000072
供试品制备加标回收试验(干扰试验)结论：中/长链脂肪乳注射液(C8～24Ve)用含0.05％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，该供试品制样方法对试验无干扰作用，该供试品制样方法对检测结果无影响，可对供试品用含0.05％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂对供试品进行细菌内毒素检查。
实施例3：
本实施例以同类脂肪乳品种：中/长链脂肪乳注射液(C8～24Ve)的细菌内毒素检测进行说明。
本实施例的稀释液为含4％吐温80的细菌内毒素检查用水。
采用本实施例的检查方法分别对中/长链脂肪乳注射液(C8～24Ve)进行干扰试验和供试品制备加标回收试验(干扰试验)。
1、干扰试验：取供试品，用含4％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，作为供试品溶液，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂进行干扰试验，具体制备同实施例1干扰试验，结果如表7所示：
表7
Figure BDA0003820895370000081
干扰试验结论：供试品8倍稀释液，鲎试剂使用0.06EU/ml的灵敏度进行干扰试验，结果无干扰。
2、供试品制备加标回收试验(干扰试验)：取供试品，用含4％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，作为供试品溶液。对该供试品制样方法进行供试品制备加标回收试验(干扰试验)。具体制备同实施例1供试品制备加标回收试验(干扰试验)，结果如表8所示：
表8
Figure BDA0003820895370000082
供试品制备加标回收试验(干扰试验)结论：中/长链脂肪乳注射液(C8～24Ve)用含4％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，该供试品制样方法对试验无干扰作用，该供试品制样方法对检测结果无影响，可对供试品用含4％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂对供试品进行细菌内毒素检查。
对比例1：
本对比例的稀释液为细菌内毒素检查用水。
同类脂肪乳品种：中/长链脂肪乳注射液(C8～24)
1、干扰预试验：取供试品，用细菌内毒素检查用水稀释2倍、4倍、8倍、16倍，其中1倍(原液)、2倍稀释液、4倍稀释液、8倍稀释液、16倍稀释液作为一系列供试品溶液，使用灵敏度为0.5EU/ml的鲎试剂进行干扰预试验，结果如表9所示：
表9
Figure BDA0003820895370000083
Figure BDA0003820895370000091
干扰预试验结论：初步确定供试品最小不干扰稀释倍数为16倍。因此选择供试品16倍稀释液，使用灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂进行干扰试验。
2、干扰试验：取供试品，用细菌内毒素检查用水稀释16倍，作为供试品溶液，使用灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂进行干扰试验，结果如表10所示：
表10
Figure BDA0003820895370000092
干扰试验结论：供试品16倍稀释液，鲎试剂使用0.03EU/ml的灵敏度进行干扰试验，结果无干扰。
综上试验结果，结合《中国药典》2020版四部9251细菌内毒素检查法应用指导原则(建立产品细菌内毒素检查法时，若无法排除供试品对细菌内毒素检查的干扰作用，或只能使用最高灵敏度鲎试剂(凝胶法为0.03EU/ml，光度法为0.001EU/ml)才能排除干扰，则该品种不宜建立细菌内毒素检查项)。因此，对该类乳剂产品进行细菌内毒素检查用水稀释无法使用凝胶法建立细菌内毒素检测方法，如果进行使用光度法建立，此方法需要配置相应的仪器、鲎试剂等，操作等较凝胶法繁琐，因此继续考虑对供试品进行前处理使用凝胶法建立细菌内毒素检测方法。
对比例2：
本对比例以同类脂肪乳品种：中/长链脂肪乳注射液(C8～24Ve)的细菌内毒素检测进行说明。
本对比例的稀释液为含5％吐温80的细菌内毒素检查用水。
采用本对比例的检查方法分别对中/长链脂肪乳注射液(C8～24Ve)进行干扰试验和供试品制备加标回收试验(干扰试验)。
1、干扰试验：取供试品，用含5％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，作为供试品溶液，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂进行干扰试验，具体制备同实施例1干扰试验，结果如表11所示：
表11
Figure BDA0003820895370000101
干扰试验结论：供试品8倍稀释液，鲎试剂使用0.06EU/ml的灵敏度进行干扰试验，结果无干扰。
2、供试品制备加标回收试验(干扰试验)：取供试品，用含5％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，作为供试品溶液。对该供试品制样方法进行供试品制备加标回收试验(干扰试验)。具体制备同实施例1供试品制备加标回收试验(干扰试验)，结果如表12所示：
表12
Figure BDA0003820895370000102
供试品制备加标回收试验(干扰试验)结论：中/长链脂肪乳注射液(C8～24Ve)用含5％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，该供试品制样方法对试验有干扰作用，该供试品制样方法对检测结果有影响，对供试品不能用含5％吐温80的细菌内毒素检查用水稀释8倍，使用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂对供试品进行细菌内毒素检查。
综上实施例和对比例结果，所述稀释液为含0.05wt％-4wt％吐温80的细菌内毒素检查用水均能满足试验需求，但考虑到引入吐温80的量越多有引入其他成分越多的风险，影响试验结果，同时其余浓度相较于常用的0.25wt％外，带来更多配制操作，因此试验选择实验室优选常用的浓度(0.25wt％)对乳剂样品进行建立细菌内毒素检测方法。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，其特征在于，将乳剂样品采用稀释液进行稀释后，用鲎试剂检测，所述稀释液为含0.05wt％-4wt％非离子型表面活性剂的细菌内毒素检查用水。
2.根据权利要求1所述的一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，其特征在于，鲎试剂采用高灵敏度试剂。
3.根据权利要求2所述的一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，其特征在于，鲎试剂的灵敏度大于等于0.06EU/ml。
4.根据权利要求1所述的一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、确定待检测乳剂样品的细菌内毒素限值L，确定鲎试剂的灵敏度；
S2、根据细菌内毒素限值L、鲎试剂的灵敏度和供试品溶液的浓度计算乳剂样品的最大有效稀释倍数；
S3、将非离子型表面活性剂溶解于细菌内毒素检查用水中制备成稀释液；
S4、将待检测的乳剂样品采用步骤S3制备的稀释液，并根据步骤S2计算的最大有效稀释倍数进行稀释处理，获得供试品溶液；
S5、将步骤S4获得的供试品溶液采用鲎试剂进行检测。
5.根据权利要求4所述的一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，其特征在于，步骤S1中，乳剂样品的细菌内毒素限值L为：
100ml及以上装量的大输液类制剂的细菌内毒素限值L小于等于0.50EU/ml。
6.根据权利要求4所述的一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，其特征在于，最大有效稀释倍数的计算公式为：
MVD＝CL/λ；
式中，MVD为最大有效稀释倍数，C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml，L为细菌内毒素限值；λ为标示灵敏度，EU/ml。
7.根据权利要求4所述的一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，其特征在于，步骤S3中，非离子型表面活性剂在稀释液中的质量百分占比为0.25％。
8.根据权利要求4所述的一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，其特征在于，步骤S5中，鲎试剂的灵敏度大于等于0.06EU/ml。
9.根据权利要求4所述的一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，其特征在于，非离子型表面活性剂包括乳百灵、吐温60、西土马哥1000或吐温80。
10.根据权利要求1-9任一项所述的一种乳剂样品中细菌内毒素的检查方法，其特征在于，所述乳剂样品包括中/长链脂肪乳注射液。
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