CN115290802B - 纽甜标准溶液及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纽甜标准溶液及其制备方法与应用。一种纽甜标准溶液的制备方法包括，在用蒸馏水将纽甜标准品配制成浓度为1000μg/mL的纽甜标准溶液的过程中，加入磷酸和二丁基羟基甲苯；其中，所述纽甜标准溶液的pH值为3.5‑6.3，二丁基羟基甲苯的质量浓度为0.5‑2.0g/100mL。本发明的纽甜标准溶液具有优异的贮存稳定性，在常温下稳定期长达2年。同时，该纽甜标准溶液用于纽甜含量检测时，量值准确且在不确定度评定范围内，稳定性与适用性良好。本发明的纽甜标准溶液为行业检测工作提供更好的实验标物，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于标准溶液制备技术领域，具体涉及一种纽甜标准溶液及其制备方法与应用。
背景技术
纽甜(NTM)，学名为N-[N-(3,3-二甲基丁)-L-a-天冬氨酸]-L-苯丙氨酸1-甲酯，是美国孟山都(Monsanto)公司和法国里昂大学合作开发的新型、高效、安全、非营养型甜味剂。纽甜有降低产品成本的特性且甜味纯正，清新自然，安全性较高；等甜度成本比阿斯巴甜低；所含的营养物质很容易被人体吸收；低能量或无能量，可供糖尿病人食用，不致龋齿，可促进双歧杆菌增殖等。纽甜是保健型食品的首选甜味剂。但是其稳定性较差。
目前，被大家所用的纽甜标准溶液的配制及标定按照国家标准GB5009.247—2016《食品安全国家标准食品中纽甜的测定》，其中通过采用pH值为4.5左右的甲酸和三乙胺的混合提取液配制的标准储备液能兼顾较好的贮存稳定性和测试稳定性，但其贮存稳定性仍不能满足行业的需求。
发明内容
为此，本发明提供一种纽甜标准溶液及其制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，提供一种纽甜标准溶液的制备方法，所述方法包括：
在用蒸馏水将纽甜标准品配制成浓度为1000μg/mL的纽甜标准溶液的过程中，加入磷酸和二丁基羟基甲苯；其中，所述纽甜标准溶液的pH值为3.5-6.3，二丁基羟基甲苯的质量浓度为(0.5-2.0)g/100mL。
在一些优选的实施例中，所述纽甜标准品的纯度为89.0％-99.9％。
在一些优选的实施例中，所述磷酸为色谱纯。
在一些优选的实施例中，所述二丁基羟基甲苯为分析纯。
在一些优选的实施例中，所述方法包括：
称取按纯度折算为100％质量的纽甜0.10000g、0.3-0.6mL磷酸、0.5-2.0g二丁基羟基甲苯；
用蒸馏水定容到100mL的容量瓶中，得浓度为1000μg/mL、pH值为4.0-5.5的纽甜标准溶液。
根据本发明实施例的第二方面，提供一种纽甜标准溶液，由如上任一所述的方法制得。
根据本发明实施例的第三方面，提供如上所述的纽甜标准溶液在纽甜样品检测中的应用。
在一些优选的实施例中，采用液相色谱-紫外检测器进行检测，所述检测条件包括：
色谱柱：C18，250mm×4.6mm×5μm；
流动相：以乙腈为流动性A，离子对试剂缓冲液为流动性B，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0.00-10.00min，25.0％-65.0％流动性A；10.00-20.00min，65.0％-100.0％流动性A；20.00-24.00min，100.0％流动性A；24.00-24.10min，100.0％-25.0％流动性A；24.10-30.00min，25.0％流动性A；其中，所述离子对试剂缓冲液的配制方法：称取2.00g辛烷磺酸钠，用500mL水溶解，加入1.0mL磷酸，加水定容至1000mL。
在一些优选的实施例中，所述检测条件还包括：
检测波长：218nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：50μL。
本发明具有如下优点：
(1)本发明的纽甜标准溶液具有优异的贮存稳定性，在常温下稳定期长达2年。同时，该纽甜标准溶液用于纽甜含量检测时，具有良好的检测稳定性。
(2)本发明的纽甜标准溶液为行业检测工作提供更好的实验标物，具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例1制备的纽甜标准溶液的色谱图；
图2为本发明实施例2制备的纽甜标准溶液的色谱图；
图3为本发明实施例3制备的纽甜标准溶液的色谱图；
图4为本发明对比例1制备的纽甜标准溶液的色谱图；
图5为本发明对比例2制备的纽甜标准溶液的色谱图；
图6为本发明对比例3制备的纽甜标准溶液的色谱图；
图7为本发明对比例4制备的纽甜标准溶液的色谱图；
图8为本发明测试例2提供的纽甜标准曲线；
图9为本发明提供的长期稳定性数据比对结果；
图10为本发明提供的短期稳定性数据比对结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下内容中：
纽甜标准品：纯度为93.70％，购自德国Dr.Ehrenstorfer纯品标准物质；
磷酸：色谱纯，购自Innochem(伊诺卡)，水中含体积比85％；
二丁基羟基甲苯：分析纯，购自中检院；
辛烷磺酸钠：Acros，纯度98％；
盐酸：Acros，水溶液中37％；
没食子酸十二酯：Alfa，纯度98％；
甲酸：Innochem，水溶液中85％；
三乙胺：Innochem，色谱纯；
乙腈：Innochem，99.9％。
实施例1纽甜标准溶液的制备
本实施例提供一种纽甜标准溶液的制备方法：
1)准确称量纽甜标准品0.10682g、磷酸0.3mL、二丁基羟基甲苯1.0g；
2)用蒸馏水定容到100mL的容量瓶中，得到浓度为1000μg/mL、pH值为4.0的纽甜标准溶液。
实施例2
本实施例提供一种纽甜标准溶液的制备方法：
1)准确称量纽甜标准品0.10682g、磷酸0.4mL、二丁基羟基甲苯0.5g；
2)用蒸馏水定容到100mL的容量瓶中，得到浓度为1000μg/mL、pH值为4.8的纽甜标准溶液。
实施例3
本实施例提供一种纽甜标准溶液的制备方法：
1)准确称量纽甜标准品0.10682g、磷酸0.6mL、二丁基羟基甲苯1.5g；
2)用蒸馏水定容到100mL的容量瓶中，得到浓度为1000μg/mL、pH值为5.4的纽甜标准溶液。
对比例1
本对比例提供的纽甜标准溶液的制备方法与实施例1的区别在于，未添加二丁基羟基甲苯。具体地，该制备方法包括：
1)准确称量纽甜标准品0.10682g、磷酸0.3mL；
2)用蒸馏水定容到100mL的容量瓶中，得到浓度为1000μg/mL、pH值为4.0的纽甜标准溶液。
对比例2
按照GB5009.247-2016配制纽甜标准溶液。配制方法包括：
1)混合提取液：分别吸取0.8mL甲酸和2.5mL三乙胺，加水定容至1000mL，pH为4.5；
2)准确称取纽甜标准品0.10682g，加混合提取液溶解定容至100mL，得浓度为1000μg/mL的纽甜标准溶液。
对比例3
本对比例提供的纽甜标准溶液的制备方法与实施例1的区别在于，使用抗氧化剂没食子酸十二酯。具体方法包括：
1)准确称量纽甜标准品0.10682g、磷酸0.3mL、没食子酸十二酯1.0g；
2)用蒸馏水定容到100mL的容量瓶中，得到浓度为1000μg/mL、pH值为4.0的纽甜标准溶液。
对比例4
本对比例提供的纽甜标准溶液的制备方法与实施例1的区别在于，使用盐酸。具体方法包括：
1)准确称量纽甜标准品0.10682g、盐酸0.3mL、二丁基羟基甲苯1.0g；
2)用蒸馏水定容到100mL的容量瓶中，得到浓度为1000μg/mL、pH值为4.3的纽甜标准溶液。
测试例1色谱条件
色谱条件如下：
色谱柱：C18，250mm×4.6mm，5μm；
流动相：以乙腈为流动性A，离子对试剂缓冲液为流动性B。离子对试剂缓冲液的配制方法：称取2.00g辛烷磺酸钠，用500mL水溶解，加入1.0mL磷酸，加水定容至1000mL。采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下表1。
表1梯度洗脱程序
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0.00 | 25.0 | 75.0 |
| 10.00 | 65.0 | 35.0 |
| 20.00 | 100.0 | 0.0 |
| 24.00 | 100.0 | 0.0 |
| 24.10 | 25.0 | 75.0 |
| 30.00 | 25.0 | 75.0 |
检测波长：218nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：50μL。
按照上述色谱条件对实施例1-3及对比例1-4制备的纽甜标准溶液进行测定，色谱图见图1-7。其中：
图1是实施例1的色谱图，该色谱图响应值高，峰形较好，且与二丁基羟基甲苯(BHT)分离度较好；
图2是实施例2的色谱图，与图1相比，目标物质的出峰时间靠前，节约检测时间，目标物质与BHT分离度有稍微的减少，但是分离度良好。
图3是实施例3的色谱图，与图1相比，目标物质的出峰时间靠后，目标物质与BHT分离度减少，但是分离度可以，表明该色谱方法适用且加入的BHT计量可用。
图4是对比例1的色谱图，与图1相比，目标物质的出峰时间相同，但目标物质响应值明显降低。
图5是对比例2的色谱图，与图1相比，目标物质的出峰时间靠后且检测时间较长。
图6是对比例3的色谱图，与图1相比，目标物质的出峰时间一致，检测时间较短，可以节省检测时间，但是目标物质与没食子酸十二酯的分离度较差，不能对其做定量处理；表明该色谱方法不适用。
图7是对比例4的色谱图，与图1相比，目标物质的出峰时间靠前，节省检测时间，但是目标物质的响应值较低。
测试例2标准曲线的建立
以实施例1制备的浓度值1000μg/mL的纽甜标准溶液为例，本测试例描述标准曲线的建立方法：
混合提取液的配制方法：分别吸取0.8mL甲酸和2.5mL三乙胺，加水定容至1000mL，pH为4.5。
用上述混合提取液对实施例1制备的浓度值1000μg/mL的纽甜标准溶液进行稀释，配制成浓度分别为0.2μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL的标准系列工作液。
将标准系列工作液分别注入液相色谱仪中，在测试例1记载的色谱条件下，记录峰面积。以标准工作液的浓度为纵坐标，以峰面积为横坐标进行线性回归，得回归方程y＝1.84896e-005x+0.000000。纽甜标准曲线见图8。
根据实施例2-3的纽甜标准溶液绘制的标准曲线与图8无显著差异。
测试例3均匀性检验
根据JJG 1006—1994《一级标准物质技术规范》及JJF1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》规定，标准物质均匀性检测结果的统计处理通常采用方差分析法，此种方法是采用组间方差和组内方差进行比较，如果两者的比小于统计检验的临界值则认为样品是均匀的。
稳定性检验：采用t检验。
本测试例以实施例1为例，对其均匀性进行分析，结果见表2。
表2纽甜溶液标准物质均匀性检验单位：(μg/mL)
实施例2-3与对比例1、2、4的纽甜溶液标准物质的均匀性检验方法同实施例1，检验结果见表3。
表3纽甜溶液标准物质均匀性检验
结果显示，实施例1-3和对比例1、2、4的统计量F值均小于临界值Fα，组内组间未见明显差异，样品均匀性良好。
测试例4稳定性检验
标准物质的稳定性研究通常包括长期稳定性研究和短期稳定性研究。长期稳定性是指在标准物质证书中所要求的特定存储条件下，标准物质特性量的稳定性，与其生产研制、使用保存条件相关。
短期稳定性是指在指定的运输条件下，运输期间标准物质特性量的稳定性，与标准物质运送引起的额外影响和包装有关。
根据JJF1343-2012，采用经典的趋势分析来检验标准物质的稳定性。稳定性研究数据评估的第一步是检查所观测数据是否有趋势性变化。
稳定性检验：采用t检验
存储条件为：常温避光保存。
按照测试例1的色谱条件对实施例1-3、对比例1、2、4的纽甜标准溶液进行色谱分析，同时根据测试例2获得的标准曲线计算纽甜含量，测试数据见表4、监测数据见表5、长期稳定性数据对比结果见图9。
表4纽甜标准溶液稳定性
| 样品 | 0月 | 1月 | 3月 | 6月 | 12月 | 18月 | 24月 |
| 实施例1 | 998 | 999 | 1002 | 994 | 1000 | 1003 | 998 |
| 实施例2 | 1003 | 1001 | 999 | 1002 | 1005 | 997 | 1000 |
| 实施例3 | 1002 | 997 | 1005 | 1001 | 999 | 1003 | 996 |
| 对比例1 | 998 | 999 | 1001 | 994 | 972 | 950 | 933 |
| 对比例2 | 997 | 1001 | 1000 | 998 | 995 | 990 | 989 |
| 对比例4 | 990 | 999 | 1003 | 993 | 990 | 986 | 976 |
注：表中数据为6组数据的平均值，单位为μg/mL
表5稳定性监测数据
从表5监测数据可以看出，实施例1-3的纽甜标准溶液稳定性可以保存至24个月，对比例1、2、4的纽甜标准溶液保存日期可达到6个月。
短期稳定性检验：采用t检验
短期稳定性考察温度60℃和-20℃。使用恒温恒湿箱设定湿度为73％RH、温度为60℃，随机抽取35支样品于该试验条件下存放；设置冰箱温度-20℃，随机抽取35支样品于该试验条件下存放。
按0、1、2、3、5、9、14天的间隔，每次取5支样品。检测方法同均匀性检验。短期稳定性检验采用直线拟合法(同长期稳定性)，测定数据见下表6、监测数据见表7，短期稳定性数据比对结果见图10。
表6短期稳定性的数据统计结果单位：(μg/mL)
表7短期稳定性统计数据
从表5、表7中可以看出，实施例1-3的纽甜标准溶液的长期、短期稳定性均未观察到不稳定性，表明本发明提供的标准物质在监测时间内是稳定的。
测试例5不确定度评价
溶液标准物质浓度的不确定度主要来源如下：
(1)原料纯度引起的不确定度；
(2)溶液配制过程引起的不确定度；
(3)样品的不均匀性和不稳定性引起的不确定度。
结果见表8。
表8纽甜溶液标准物质的各项不确定度及相对扩展不确定度(％)
测试例6适用性评估
为了对本发明提供的纽甜标准物质的适用性进行评估，公司A采用安捷伦1200(色谱柱：C18，250mm×4.6mm×5μm)，公司B采用安捷伦1220(色谱柱：C18，250mm×4.6mm×5μm)按照本发明测试例1的色谱条件分别对本发明实施例1制备的纽甜标准溶液的纽甜进行测试，结果见表9。
表9纽甜标准溶液市场适用情况表
| 测定次数 | 公司A(μg/mL) | 公司B(μg/mL) |
| 1 | 998 | 999 |
| 2 | 1003 | 1001 |
| 3 | 998 | 996 |
| 4 | 999 | 998 |
| 5 | 1001 | 999 |
| 6 | 1000 | 1002 |
以上结果表明：不同仪器的测试结果准确且在不确定度范围内，本发明提供的纽甜标准溶液使纽甜的检测工作更加规范化。
综上所述：经过对纽甜溶液标准物质进行均匀性检验、稳定性(长期稳定性、短期稳定性)检验、不确定度评价以及适用性评估，本发明实施例提供的纽甜标准溶液均匀性较好且具有优异的贮存稳定性，在常温下稳定期长达2年，同时，对纽甜含量进行检测时，量值准确且在不确定度评定范围内，稳定性与适用性良好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.纽甜标准溶液在纽甜样品检测中的应用，其特征在于，所述纽甜标准溶液的制备方法包括：在用蒸馏水将纽甜标准品配制成浓度为1000μg/mL的纽甜标准溶液的过程中，加入磷酸和二丁基羟基甲苯；其中，所述纽甜标准溶液的pH值为3.5-6.3，二丁基羟基甲苯的质量浓度为(0.5-2.0)g/100mL；
采用液相色谱-紫外检测器进行检测，检测条件包括：
色谱柱：C18，250mm×4.6mm×5μm；
流动相：以乙腈为流动性A，离子对试剂缓冲液为流动性B，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0.00-10.00min，25.0%-65.0%流动性A；10.00-20.00min，65.0%-100.0%流动性A；20.00-24.00min，100.0%流动性A；24.00-24.10min，100.0%-25.0%流动性A；24.10-30.00min，25.0%流动性A；其中，所述离子对试剂缓冲液的配制方法：称取2.00g辛烷磺酸钠，用500mL水溶解，加入1.0mL磷酸，加水定容至1000mL。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测条件还包括：
检测波长：218nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：50μl。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纽甜标准品的纯度为89.0%-99.9%。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述磷酸为色谱纯。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述二丁基羟基甲苯为分析纯。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纽甜标准溶液的制备方法包括：
称取按纯度折算为100%质量的纽甜0.10000g、0.3-0.6mL磷酸、0.5-2.0g二丁基羟基甲苯；
用蒸馏水定容到100mL的容量瓶中，得浓度为1000μg/mL、pH值为4.0-5.5的纽甜标准溶液。
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