CN115287278A - 一种枯草芽孢杆菌纤溶酶及其制备方法和抗氧化溶血栓组合物 - Google Patents
一种枯草芽孢杆菌纤溶酶及其制备方法和抗氧化溶血栓组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种枯草芽孢杆菌纤溶酶及其制备方法和抗氧化溶血栓组合物，属于枯草芽孢杆菌技术领域，由枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ZF01发酵制得，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2022132。本发明利用β‑烟酰胺单核苷酸与枯草杆菌纤溶酶组合物应用于角叉菜胶诱导小鼠血栓模型试验证明，β‑烟酰胺单核苷酸具有抗氧化效果，可降低角叉菜胶对血管的氧化损伤程度，缓解血栓形成。同时枯草杆菌纤溶酶也具有一定抗氧化水平，并且可以溶解因血管氧化损伤而已经形成的血栓，显著降低血栓积累程度，二者组合可协同作用于血管损伤诱发的血栓，且效果显著优于单一成分应用。
Description
技术领域
本发明涉及枯草芽孢杆菌技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌纤溶酶及其制备方法和抗氧化溶血栓组合物。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸(β-烟酰胺单核苷酸)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体物质。NAD+在哺乳动物体内起到非常关键的作用。其中最为人们所知的是抗衰老方面的研究。主要表现在调控能量代谢、基因表达和修复。此外，研究证明通过口服β-烟酰胺单核苷酸可增加NAD+含量，促进血管再生、抗氧化、抗炎症等功效。
枯草杆菌纤溶酶是由枯草芽孢杆菌发酵产生的一种丝氨酸蛋白酶，具有口服溶解血栓的功效，在心血管疾病领域具有非常广阔的应用价值。其中被人们所熟悉的是纳豆菌发酵产生的纳豆激酶，纳豆菌隶属于枯草芽孢杆菌种，纳豆亚种。
众所周知，血栓性疾病是心血管疾病最主要表现，是治病率和致死率最高的疾病。其中脑卒中、冠心病最为严峻。而血栓性疾病的致病因素是各种内因和外因引起的血管壁损伤导致血液凝血引起的。而血管损伤便伴随着内皮细胞氧化，从而进一步加剧损伤和血栓积累。基于β-烟酰胺单核苷酸抗衰老抗氧化功效，以及本公司枯草杆菌纤溶酶的纤溶作用和溶栓功效。通过两种成分的组合应用能够协同防治血栓性疾病，一方面可以预防或延缓血管壁氧化和损伤，预防血栓形成；另一方面还可以溶解血管内已经形成的血栓，达到溶栓功效。通过β-烟酰胺单核苷酸和枯草杆菌纤溶酶的组合应用，协同解决血栓性疾病，既能预防又能治疗。对心血管疾病的防治具有重要的社会意义，并且具备广阔的市场应用前景和价值。
发明内容
本发明的目的在于提出一种枯草芽孢杆菌纤溶酶及其制备方法和抗氧化溶血栓组合物，β-烟酰胺单核苷酸与枯草杆菌纤溶酶组合物可相互协同作用防控血栓性疾病，一方面抗氧化抗损伤，预防血栓形成和积累；另一方面同时还可以溶解已经形成的血栓，达到预防和治疗的双重目的并且安全无副作用。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种枯草芽孢杆菌纤溶酶，由枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZF01发酵制得，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2022132。
作为本发明的进一步改进，所述发酵包括固体发酵和液体发酵，发酵干燥后所得枯草杆菌纤溶酶活性不低于10000FU/g。
本发明进一步保护一种上述枯草芽孢杆菌纤溶酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备蛋白胨培养基，110-120℃灭菌20-40min，备用；
(2)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZF01菌种按重量比2-4％接种到蛋白胨培养基中，35-38℃发酵18-30h；
(3)将发酵液经过离心、微滤、浓缩后喷雾干燥即得枯草芽孢杆菌纤溶酶，枯草芽孢杆菌纤溶酶活性＞10000FU/g。
作为本发明的进一步改进，所述蛋白胨培养基的成分与质量百分比含量为：蛋白胨2％、葡萄糖3％、磷酸氢二钠1％、磷酸二氢钠0.1％、硫酸镁0.05％、无水氯化钙0.02％、消泡剂0.1％、余量为水。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
(1)制备蛋白胨培养基，向培养基中加入以下质量百分比成分：蛋白胨2％、葡萄糖3％、磷酸氢二钠1％、磷酸二氢钠0.1％、硫酸镁0.05％、无水氯化钙0.02％、消泡剂0.1％、余量为水，115℃灭菌30min，备用；
(2)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZF01菌种按重量比3％接种到蛋白胨培养基中，37℃发酵24h；
(3)将发酵液经过离心、微滤、浓缩后喷雾干燥即得枯草芽孢杆菌纤溶酶，枯草芽孢杆菌纤溶酶活性＞10000FU/g。
本发明进一步保护一种抗氧化溶血栓组合物，由以下原料制备而成：β-烟酰胺单核苷酸和权利要求1所述枯草芽孢杆菌纤溶酶。
作为本发明的进一步改进，由以下原料按质量百分比制备而成：β-烟酰胺单核苷酸5-20％、权利要求1所述枯草芽孢杆菌纤溶酶80-95％。
作为本发明的进一步改进，所述β-烟酰胺单核苷酸来源于植物提取、化学合成或者生物酶催化。
本发明进一步保护一种上述的抗氧化溶血栓组合物在制备预防及治疗血管氧化损伤、血栓性疾病的食品、保健食品和药品中的应用。
本发明进一步保护一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZF01菌种，所述菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2022132。
本发明具有如下有益效果：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZF01菌株为本公司特有菌株，从发酵性豆制品中分离获得，隶属于枯草亚种。发酵亦可以产生一种新型枯草杆菌纤溶酶，命名为枯草杆菌纤溶酶ZF。本发明经研究证明纤溶酶ZF具有纤溶和溶栓作用。纤溶酶ZF可通过刺激血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，t-PA将纤溶酶原激活为纤溶酶，溶解纤维蛋白，能够直接溶解血栓。并且纳豆激酶还能抑制血小板的聚集，降低血液的粘稠度，保护血管内皮，预防动脉粥样硬化等。
各种原因引起的血管氧化损伤是血栓形成的根本原因，而血栓又是心血管疾病最主要诱因。小鼠腹腔注射角叉菜胶可氧化损伤血管内皮细胞，从而导致血栓积累。本发明中，利用β-烟酰胺单核苷酸与枯草杆菌纤溶酶组合物应用于角叉菜胶诱导小鼠血栓模型试验证明，β-烟酰胺单核苷酸具有抗氧化效果，可降低角叉菜胶对血管的氧化损伤程度，从而缓解血栓形成。同时枯草杆菌纤溶酶也具有一定抗氧化水平，并且可以溶解因血管氧化损伤而已经形成的血栓，显著降低血栓积累程度。二者组合应用，可协同作用于血管损伤诱发的血栓，且效果显著优于单一成分应用。
本发明β-烟酰胺单核苷酸与枯草杆菌纤溶酶组合物可相互协同作用防控血栓性疾病，一方面抗氧化抗损伤，预防血栓形成和积累；另一方面同时还可以溶解已经形成的血栓，达到预防和治疗的双重目的并且安全无副作用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis QK02菌种，所述菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国武汉武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M 2022132，保藏日期为2022年2月18日。
β-烟酰胺单核苷酸原料来源于本公司重组生物酶催化并纯化后获得，纯度超过90％。
实施例1
原料组成(质量百分比)：β-烟酰胺单核苷酸占比5％，枯草芽孢杆菌纤溶酶粉占比95％。
枯草芽孢杆菌纤溶酶按以下发酵过程制备。
(1)制备蛋白胨培养基，向培养基中加入以下质量百分比成分：蛋白胨2％、葡萄糖3％、磷酸氢二钠1％、磷酸二氢钠0.1％、硫酸镁0.05％、无水氯化钙0.02％、消泡剂0.1％、余量为水，115℃灭菌30min，备用；
(2)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZF01菌种按重量比3％接种到蛋白胨培养基中，37℃发酵24h；
(3)将发酵液经过离心、微滤、浓缩后喷雾干燥即得枯草芽孢杆菌纤溶酶，枯草芽孢杆菌纤溶酶活性＞10000FU/g。
实施例2
与实施例1的不同之处在于原料配比不同。
β-烟酰胺单核苷酸占比10％，枯草芽孢杆菌纤溶酶粉占比90％。
实施例3
与实施例1的不同之处在于原料配比不同。
β-烟酰胺单核苷酸占比15％，枯草芽孢杆菌纤溶酶粉占比85％。
实施例4
与实施例1的不同之处在于原料配比不同。
β-烟酰胺单核苷酸占比20％，枯草芽孢杆菌纤溶酶粉占比80％。
对比例1
与实施例1的不同之处在于原料配比不同。
枯草芽孢杆菌纤溶酶粉占比100％。
对比例2
与实施例1的不同之处在于原料配比不同。
β-烟酰胺单核苷酸占比100％。
试验例1
本发明实施例以β-烟酰胺单核苷酸与枯草杆菌纤溶酶组合物对角叉菜胶损伤小鼠诱导尾静脉血栓的治疗为例。小鼠腹腔注射角叉菜胶可氧化损伤血管，从而诱导血管内血栓的形成。小鼠尾部可以观察到血栓，尾部变成黑色。可以通过尾部血栓引起的黑色长度所占全部尾长的比例反应血栓的严重程度。具体过程如下：
选取健康小鼠120只，体重20±5g，雌雄各半，在开始实验前，将购买的大鼠适应性喂养一周后，随机将小鼠分为8组，每组15只。第一组为正常组；第二组为模型组；第三组为枯草芽孢杆菌纤溶酶组；第四组为β-烟酰胺单核苷酸组；第五组为实施例1组；第六组为实施例2组；第七组为实施例3组；第八组为实施例4组。除第一组腹腔注射生理盐水外，其余组别小鼠腹腔注射50mg/kg的角叉菜胶导致血管氧化损伤，诱导血栓形成。
注射角叉菜胶后，第一组正常组，第二组模型组，灌胃生理盐水。其余组别分别按照分组说明灌胃单一原料或不同比例组合物，灌胃剂量为1000mg/只小鼠，连续灌胃1周，第7天统计小鼠尾部血栓长度所占全部尾长比例(％)。同时眼眶采血检测血清丙二醛(MDA)含量。
表1
注：*P<0.05、**P<0.01vs模型组。
通过表1数据可知，正常组与模型组相比尾部血栓长度占比与MDA含量都达到极显著差异(p＜0.01)，说明动物模型组实验成功。角叉菜胶导致血管壁氧化损伤，从而诱发血栓形成。
第三组MDA含量小于模型组(p＜0.05)，说明枯草杆菌纤溶酶也具有一定的抗氧化水平，血管内皮保护功效。第六、七、八组MDA含量与模型组相比都达到极显著差异(p＜0.01)，且含量均低于单独灌胃β-烟酰胺单核苷酸和纤溶酶的第三、四组。说明组合物灌胃效果好于单一成分灌胃，具有协同抗氧化效果。
尾部血栓长度占比能够反映血管内血栓积累的严重程度。单独灌胃β-烟酰胺单核苷酸成分的第四组与模型组相比虽然可显著降低MDA含量，从而降低有血管壁的氧化损伤引起的血栓积累程度(p＜0.05)。单独灌胃纤溶酶成分的第三组与模型组相比，尾部血栓长度占比达到显著差异水平(p＜0.01)。且第五、六、七、八组的血栓积累严重程度低于单独灌胃纤溶酶的第三组。说明β-烟酰胺单核苷酸与纤溶酶组合应用优于单一成分应用。
综上，β-烟酰胺单核苷酸与枯草杆菌纤溶酶组合应用对于因血管氧化损伤诱发的血栓形成具有显著的治疗效果，且效果优于单一成分应用。且当β-烟酰胺单核苷酸与纤溶酶比例达到15:85时效果更显著。上述结果说明两种组分组合应用具有协同的抗氧化、抗血栓、溶血栓效果，对于心血管疾病的防控具有重要意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌纤溶酶，其特征在于，由枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZF01发酵制得，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2022132。
2.根据权利要求1所述枯草芽孢杆菌纤溶酶，其特征在于，所述发酵包括固体发酵和液体发酵，发酵干燥后所得枯草杆菌纤溶酶活性不低于10000FU/g。
3.一种如权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌纤溶酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备蛋白胨培养基，110-120℃灭菌20-40min，备用；
(2)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZF01菌种按重量比2-4％接种到蛋白胨培养基中，35-38℃发酵18-30h；
(3)将发酵液经过离心、微滤、浓缩后喷雾干燥即得枯草芽孢杆菌纤溶酶，枯草芽孢杆菌纤溶酶活性＞10000FU/g。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白胨培养基的成分与质量百分比含量为：蛋白胨2％、葡萄糖3％、磷酸氢二钠1％、磷酸二氢钠0.1％、硫酸镁0.05％、无水氯化钙0.02％、消泡剂0.1％、余量为水。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)制备蛋白胨培养基，向培养基中加入以下质量百分比成分：蛋白胨2％、葡萄糖3％、磷酸氢二钠1％、磷酸二氢钠0.1％、硫酸镁0.05％、无水氯化钙0.02％、消泡剂0.1％、余量为水，115℃灭菌30min，备用；
(2)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZF01菌种按重量比3％接种到蛋白胨培养基中，37℃发酵24h；
(3)将发酵液经过离心、微滤、浓缩后喷雾干燥即得枯草芽孢杆菌纤溶酶，枯草芽孢杆菌纤溶酶活性＞10000FU/g。
6.一种抗氧化溶血栓组合物，其特征在于，由以下原料制备而成：β-烟酰胺单核苷酸和权利要求1所述枯草芽孢杆菌纤溶酶。
7.根据权利要求6所述抗氧化溶血栓组合物，其特征在于，由以下原料按质量百分比制备而成：β-烟酰胺单核苷酸5-20％、权利要求1所述枯草芽孢杆菌纤溶酶80-95％。
8.根据权利要求5所述抗氧化溶血栓组合物，其特征在于，所述β-烟酰胺单核苷酸来源于植物提取、化学合成或者生物酶催化。
9.一种如权利要求6-8任一项所述的抗氧化溶血栓组合物在制备预防及治疗血管氧化损伤、血栓性疾病的食品、保健食品和药品中的应用。
10.一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZF01菌种，其特征在于，所述菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2022132。
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