CN112972488B - 一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112972488B
CN112972488B CN202110228618.3A CN202110228618A CN112972488B CN 112972488 B CN112972488 B CN 112972488B CN 202110228618 A CN202110228618 A CN 202110228618A CN 112972488 B CN112972488 B CN 112972488B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fucoidan
hyperuricemia
activity
oligosaccharide
fucoidin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110228618.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112972488A (zh
Inventor
王莹
陈芊汝
李昀
牛德军
陈铁军
朱昱兴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Agricultural University
Original Assignee
Qingdao Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Agricultural University filed Critical Qingdao Agricultural University
Priority to CN202110228618.3A priority Critical patent/CN112972488B/zh
Publication of CN112972488A publication Critical patent/CN112972488A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112972488B publication Critical patent/CN112972488B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/38—Other non-alcoholic beverages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖及其制备方法和应用，其中，所述制备方法是通过采用岩藻多糖酶降解岩藻多糖，制备具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖，该方法制备的岩藻寡糖可应用于制备抑制高尿酸血症、抗痛风产品，本发明提供的岩藻寡糖制备方法为生物酶法降解，该降解条件温和过程可控，并且在降解过程中不会有化学等有害副产物的产生，得到的岩藻寡糖安全绿色。所述岩藻寡糖具有抗高尿酸血症活性，能够有效地控制尿酸的合成，同时还能够有效地降低体内肌酐以及尿素氮的含量，从而有效地保护肾脏功能。

Description

一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及岩藻寡糖技术领域，尤其涉及一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖及其制备方法和应用。
背景技术
高尿酸血症是因为长期的嘌呤代谢受阻，导致血液尿酸含量高出正常范围的(血尿酸含量≥416μmol/L)，并能够引起痛风这一种造成组织损伤的异质性疾病。痛风临床表现为关节疼痛，变形而且还容易累及肾脏和心血管系统。同时高尿酸血症与肥胖症、高脂血症、高血压病、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的发生呈显著正相关。因此，高尿酸血症是危害人类健康的一种严重的代谢性疾病。
近年来，随着人们生活水平的提高，饮食结构发生变化，糖、脂肪、蛋白质的摄入量明显增加，高尿酸血症和痛风的发病率日益增高，这类疾病己成为一种常见病。为了避免关节炎反复发作和肾脏病变形成，痛风患者需要长期服用有降低血尿酸作用的药物。但是目前的降血尿酸药物具有较大副作用，长时间摄入会对肝肾等器官造成严重损伤。因此，寻找新型安全且高效的降尿酸成分具有重要的意义。
岩藻多糖(又称岩藻聚糖硫酸酯)是海洋褐藻细胞壁外层含有的特殊藻胶，是一种含有硫酸基团的高分子量的杂多糖。近些年，欧洲、美国、澳洲、日本、韩国、俄罗斯以及中国的科学家们对岩藻多糖表现出浓厚的研究兴趣，并发现其具有卓越的生物学活性。
但是目前，岩藻寡糖的制备通常采用物理、化学等降解方法，此类方法存在降解过程不可控、产生有害副产物等缺点，成为岩藻寡糖工业化制备的巨大障碍。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种利用岩藻多糖酶酶解方法制备岩藻寡糖的方法、以及该方法制备的岩藻寡糖及其在抑制高尿酸血症、抗痛风的应用。该岩藻多糖酶由申请人团队自主生产，其技术已经获得专利授权 (ZL201711390815.5)。本申请利用岩藻寡糖来抑制人体中尿酸的生成，防止痛风的发展与恶化，提供了一种新型安全且高效的降尿酸成分。
本发明提供以下的技术方案：
第一方面，本发明提供一种利用岩藻多糖酶酶解方法制备的岩藻寡糖在抑制高尿酸血症、抗痛风产品中的应用。
申请人在研究中发现，用酶法降解获得的特定分子量的岩藻寡糖具有很强的抑制黄嘌呤氧化酶的活性，而黄嘌呤氧化酶是人体中尿酸合成的关键酶，因此岩藻寡糖可以作为控制尿酸合成的有效成分。为此，申请人还进行了大量进一步的体内试验，试验结果也证实了酶法降解获得的特定分子量的岩藻寡糖具有抗高尿酸血症活性，可将其应用于抑制高尿酸血症、抗痛风，可用于制备新型安全且高效的降尿酸产品，所述产品包括相关的药物或保健品或其原料。
优选地，所述应用为，岩藻寡糖在制备抗高尿酸血症药物、抗痛风症药物或保健品、功能性食品、食品和饮料中的应用。
优选地，所述应用包括：所述岩藻寡糖在制备抑制黄嘌呤氧化酶、降低体内尿酸含量、降低腺苷脱氨酶活性、降低体内黄嘌呤氧化酶活性、降低体内尿素氮含量、降低体内肌酐含量等方面产品中的应用。所述产品包括药物、保健品、功能性食品、食品、饮料等。
优选地，所述应用中采用的岩藻寡糖的分子量为小于5kDa、5～10kDa、 10～30kDa、30-50kDa、50-100kDa或大于100kDa。这些不同分子量的岩藻寡糖都具有抗高尿酸血症活性，只是活性高低有差异。可对这些不同分子量的岩藻寡糖进行充分利用。
更优选地，所述应用中采用分子量小于5kDa的岩藻寡糖。通过实验证明，以小于5kDa的岩藻寡糖抑制黄嘌呤氧化酶的活性最高，从而具有显著的抑制尿酸形成的活性；同时该分子量的岩藻寡糖具有显著控制肌酐、尿素氮等指标的活性，证明该成分还具有显著的肾脏保护作用。
第二方面，本发明提供一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖的制备方法，其通过采用岩藻多糖酶降解岩藻多糖，制备具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖。
优选地，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将岩藻多糖溶于缓冲溶液中，制备质量体积浓度为0.1％-10％的岩藻多糖溶液；
S2、将岩藻多糖酶用缓冲液溶解，使其活性浓度为400～1000U/mL；
S3、将质量体积浓度为0.1％-10％的岩藻多糖溶液与500U/mL岩藻多糖酶以(8-12):1的体积比进行混合，恒温反应1-3h后，进行沸水浴处理以终止反应；冷却后离心，取上清液备用；
S4、利用超滤膜系统将上述上清液进行分级处理，得到不同分子量段的降解产物，再对降解产物分别进行冷冻干燥，得到的冻干粉即为岩藻寡糖。
对岩藻寡糖进行纯化和结构分析：
(1)利用葡聚糖凝胶柱SephadexG-25对＜5kDa的组分进一步纯化，以进行结构分析。将分子量小于5kDa的岩藻寡糖配置成浓度为200mg/mL的溶液，然后装载到葡聚糖凝胶柱中进行分离纯化。具体条件设置如下：以蒸馏水作为流动相，流速设置为0.5mL/min，上样量为5mL，每1.5mL收集一管，利用苯酚硫酸法测定每管的糖含量，收集后冻干于-4℃下储存。
(2)利用核磁共振和质谱的方法测定纯化后的岩藻寡糖的结构，具体条件设置入下：将100mg酶解后的岩藻寡糖样品溶于250μLD2O中，用超导核磁共振波谱仪进行检测，条件为60℃，500MHz。利用质谱在负电喷雾电离模式下进行检测，雾化气体压力43.5psi，干气12L/min，干温度250℃，毛细管电压4000V。干燥后的样品为溶解的蒸馏水(样品浓度为0.1mg/mL)。样品以 5μL/min的流速直接注入质谱仪。
优选地，S3步骤中，岩藻多糖溶液与岩藻多糖酶的体积比为10:1。在这种体积比的条件下，岩藻多糖的降解率最高。
优选地，S3步骤的具体方法为：在37℃120r/min水浴锅中恒温反应2h，在100℃中水浴10min，以终止反应。冷却后在8000r/min条件下离心10min，取上清备用。
优选地，S4步骤中，利用超滤膜系统分级处理得到小于5kDa，5～10kDa， 10～30kDa，30-50kDa，50-100kDa，大于100kDa的分子量段的降解产物，再分别处理得到相应的冻干粉。
优选地，S1和S2的步骤中，所述缓冲溶液为24mM的PBS或Tris-HCl， pH值为8.0。
第三方面，本发明还提供一种岩藻寡糖，其采用上述方法制备得到。
本发明具有以下有益效果：
1、基于岩藻多糖结构的复杂多样性，不同的降解方法产生的岩藻寡糖的结构和功效是不同的，而传统物理化学方法降解方法存在一定随机性，存在降解过程不可控。而本发明提供的岩藻寡糖制备方法为生物酶法降解，该降解条件温和过程可控(基于酶对酶切位点的识别特异性)，并且在降解过程中不会有化学等有害副产物的产生，得到的岩藻寡糖安全绿色。
2、申请人发现，采用黄杆菌RC2-3mut发酵产生的独特的岩藻多糖酶酶解产生的岩藻寡糖能够有效地控制尿酸的合成，对黄嘌呤氧化酶(XOD)的抑制率可高达67.3％，能够有效缓解高尿酸血症的发展，同时还能够有效地降低体内肌酐以及尿素氮的含量，从而有效地保护肾脏功能。因此，本发明的岩藻寡糖能够避免市面上常用的降尿酸药物(别嘌呤醇)对肾脏的损害，具有更好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的分子量＜5kDa的岩藻寡糖经过葡聚糖凝胶柱分离纯化示意图；
图2为本发明实施例1制备的寡糖经纯化分离后的核磁共振示意图；
图3为本发明实施例1制备的岩藻寡糖经纯化分离后的质谱结果图；
图4为本发明实施例1制备的岩藻寡糖的结构图；
图5为本发明实施例1制备的不同分子量的岩藻寡糖对黄嘌呤氧化酶的抑制活性测定结果；
图6为本发明实施例1制备的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)影响体内尿酸生成的测定结果；
图7为本发明实施例1制备的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)影响体内腺苷脱氨酶生成的测定结果；
图8为本发明实施例4制备的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)影响体内黄嘌呤氧化酶生成的测定结果；
图9为本发明实施例5制备的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)影响体内尿素氮生成的测定结果；
图10为本发明实施例6制备的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)影响体内肌酐生成的测定结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
下述实验中采用的岩藻多糖酶由申请人团队自主生产，其是由黄杆菌(Flavobacteriaceae sp.)RC2-3mut发酵制备而成，该技术已经获得专利授权(ZL201711390815.5)。该菌株已于2017年11月03日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14855。
岩藻多糖酶的制备
(1)产酶微生物
本发明首先制备岩藻多糖酶，所使用的微生物为黄杆菌株 (Flavobacteriaceaesp.)RC2-3mut，该菌株RC2-3mut菌落呈黄色，圆形隆起状，边缘整齐，不运动，细胞革兰氏染色阴性，接触酶阴性，氧化酶阳性，在海水中生长，1％NaCl中生长。
(2)RC2-3mut的产酶方法
将微生物为黄杆菌(Flavobacteriaceae sp.)RC2-3mut株接种于液体培养基中，30-35℃下，180-250rpm摇床培养12-24h得种子液；再将种子液按10％接种量接种于发酵培养基中，在5L发酵罐(装料3-4L)内发酵，30-35℃， 150-200rpm条件下培养24-72h；发酵液在4℃10000rpm离心5min，弃上清液取沉淀，再用5倍体积20mM、pH8.0的Tris-HCl溶液溶解沉淀，在冰浴保护下， 500-1000w条件进行超声波破碎细胞，时间为5-15min，4℃下离心5分钟，取上清液，得岩藻多糖酶，冷冻干燥，冰箱保存。
所述液体培养基的组分包括：岩藻多糖1％(占培养基的质量比)、蛋白胨 1-2％(质量比)和硝酸铵5-10mg/mL，用过膜海水配制，pH自然；所述发酵培养基包括：岩藻多糖0.5-1％(质量比)，牛肉膏1-2％(质量比)，用过膜海水配制， pH自然。
(3)酶学性质
利用上述方法将RC2-3mut进行培养，制备获得的岩藻多糖酶具有下述特性：酶的最适温度为60℃，显著高于已经报道的岩藻多糖酶；最适pH值为9.5，在没有NaCl存在的时候，不显示酶活力，当NaCl浓度为0.8-1.0mol/L时具有最大酶活力。上述性质显著不同于已经报道的岩藻多糖酶，说明该酶是一种新的岩藻多糖酶。
实施例1岩藻寡糖的酶解制备方法
本实施例提供一种岩藻寡糖的酶解制备方法，其包括以下步骤：
(1)岩藻多糖溶液的配置：缓冲溶液为24mM的PBS，pH值为8.0，或者选用24mM的Tris-HCl，pH值为8.0，将岩藻多糖溶于上述缓冲液中，配成0.1％-1％的岩藻多糖溶液。
(2)岩藻多糖酶的配置：缓冲溶液为24mM的PBS，pH值为8.0，或者选用24mM的Tris-HCl，pH值为8.0。将按照前述方法制备得到的岩藻多糖酶溶于上述缓冲溶液中，配置成活性浓度为500～1000U/mL。
(3)酶法制备岩藻寡糖：在10mL的0.1％-10％的岩藻多糖溶液中加入 1mL500U/mL岩藻多糖酶，在25～35℃的条件下，50～180r/min水浴锅中恒温反应0.5～2h，在100℃中水浴10min，以终止反应。冷却后在8000r/min条件下离心10min，取上清备用。
(4)超滤系统分离岩藻寡糖：利用超滤膜系统，将降解混合物分成小于 5kDa，5～10kDa，10～30kDa，30-50kDa，50-100kDa，大于100kDa的分子量段，并分别进行冷冻干燥，得到岩藻寡糖粉末。
设置三个试验组A1、A2和A3，分别按照下表1的条件和上述制备方法进行试验。
表1岩藻寡糖的制备实验设置及结果
Figure BDA0002957908510000071
(5)对岩藻寡糖降解产物的分析
A、实验方法：采用重量分析法和十八角度激光光谱散射仪对实验组A1、 A2、A3制备的岩藻寡糖降解产物进行分析。
①重量分析法为降解后的样品真空冻干后恒重的质量占降解前的样品恒重后质量的百分比。
②十八角度激光法的条件：采用TSK-gelPW系列色谱柱，流动相为0.2％的NaCl溶液，等度洗脱，流速为0.5ml/min，进样量为50μL，计算平均分子量。
③对＜5kDa岩藻寡糖组进行分离纯化：利用葡聚糖凝胶柱SephadexG-25 进行分离纯化，将分子量小于5kDa的岩藻寡糖配置成浓度为200mg/mL的溶液，然后装载到葡聚糖凝胶柱中进行分离纯化。具体条件设置如下：以蒸馏水作为流动相，流速设置为0.5mL/min，上样量为5mL，每1.5mL收集一管，利用苯酚硫酸法测定每管的糖含量，收集后冻干于-4℃下储存。
④核磁共振的方法：将100mg酶解后的岩藻寡糖样品溶于250μLD2O (99.9％，Sigma-Aldrich)中，用超导核磁共振波谱仪(JNM-ECP600M)进行检测，条件为60℃，500MHz。
⑤质谱方法的条件设置：在负电喷雾电离模式下进行。雾化气体压力 43.5psi，干气12L/min，干温度250℃，毛细管电压4000V。干燥后的样品为溶解的蒸馏水(样品浓度为0.1mg/mL)。样品以5μL/min的流速直接注入质谱仪。
⑥黄嘌呤氧化酶抑制率：与实施例2的实验方法相同。
B：实验结果及分析：
结合表1的结果可知，岩藻寡糖的总产率为85％～92.7％，不同分子量的岩藻寡糖的占比分别为：小于5kDa占57％～65.2％，5～10kDa占15％～20％， 10～30kDa占8～10％，30-50kDa占8～5％，50-100kDa占1％～2％，大于100kDa 的分子量段占3％～1％。
其中，分子量小于5kDa的岩藻寡糖对黄嘌呤氧化酶的抑制率为67.3％，明显优于其他分子量段的寡糖，因此将小于5kDa的岩藻寡糖进行体内试验。
将分子量在＜5kDa的岩藻寡糖组分在葡聚糖凝胶柱纯化后得到三个不同组分，如图1所示，三个不同的组分的分子量经过十八角度激光光散射仪测定后分子量分别为17kDa、4kDa和1.4kDa。
将纯化得到的上述三种分子量的岩藻寡糖分别按照实施例2的方法进行黄嘌呤氧化酶抑制活性的检测，发现三种分子量的岩藻寡糖对于黄嘌呤氧化酶的抑制率都处于60-72％，其中，1.4kDa的岩藻寡糖的活性最高，其对于黄嘌呤氧化酶的抑制率达到72％。因此选择对1.4kDa的岩藻寡糖进行后续的核磁共振和质谱分析。
结合图2所得，酶解前后相比，岩藻糖特有的-CH3质子共振峰出现在 1.21ppm，峰面积的比值从岩藻多糖的2.25显著增加到岩藻寡糖的9.26，表明寡糖中的岩藻糖含量显著增加；同时，图3的质谱结果表明，酶解后岩藻寡糖成分复杂，质谱结果在535出现一个峰，结合核磁共振的结果，表明该组分的岩藻寡糖的主要岩藻糖结构为F3S1，即岩藻三糖链接一个硫酸根，并且在551以及697出现强烈的峰，因此表明该组分岩藻寡糖含有葡萄糖，结合分子离子峰的分子量为1005，因此结构中还含有一个鼠李糖结构。因此根据上述检测结果分析，可推测得出上述组分的岩藻寡糖的结构中应带有以下的结构片段：一个硫酸基团的岩藻三糖+两个葡萄糖+一个鼠李糖，此片段的结构式见图4。
对比例
本对比例采用以下方法制备岩藻寡糖：
1、将海带经过洗涤后，在蒸馏水中漂洗三次，沥干水分，60℃恒温烘干，粉碎过40目筛，并低温密封保存。
2、将海带干粉加入蒸馏水中进行超声处理40min，80w；再向混合液中加入复合酶液，进行酶解。酶解完成后，煮沸10min，灭活酶后，进行离心处理，收集上清后，加入处理液(氯仿：正丁醇＝4:1)，除去蛋白后，在4000r，10min 条件下离心，收集上清液后，进行乙醇沉淀后，再次离心和冷冻干燥。
其中，上述复合酶的添加量和具体的酶解温度如下所示：
纤维素酶、果胶酶、和木瓜蛋白酶的加入率分别为2.5％、2.0％和1.0％， pH为4.0，温度为55℃，水解210min。
实验结果：
对上述方法制备得到产物进行黄嘌呤氧化酶活性抑制试验，发现不同批次所获得产物抑制活性分别为12.5％、30.1％、17.4％。可见对比例的制备方法获得的产物抑制黄嘌呤氧化酶活性较低，且很不稳定，重复率低，且活性数据远低于60％，无法满足应用需求。原因可能在于：该方法采用物理方法超声波和市售的复合酶(纤维素酶、果胶酶、和木瓜蛋白酶)对海带粉进行降解，导致对岩藻多糖的降解呈现随机降解，降解过程不可控，因此，与本申请的产物相比，该降解产物的活性不同，且极不稳定。上述复合酶起到在海带中提取岩藻多糖的作用，降解岩藻多糖主要依赖于超声波这种物理降解方法。
实施例2岩藻寡糖在抑制黄嘌呤氧化酶的应用
1、本实施例提供一种生物酶解法制备的岩藻寡糖在体外抑制黄嘌呤氧化酶的应用。
本实施例基于抑制黄嘌呤氧化酶的活力抑制尿酸的生成的原理，设置以下实验，检测不同岩藻寡糖的黄嘌呤氧化酶抑制性能，方法如下：
(1)将实施例1中的生物酶解法制备的不同分子量的岩藻寡糖分别溶解于蒸馏水中，最终配置浓度为0.1％-1％的溶液。
(2)用浓度为0.05M，pH值为7.4的PBS溶解黄嘌呤，将其配置成使之终浓度为0.5mM的溶液。
(3)同时配置黄嘌呤氧化酶溶液，使其活力单位为0.5U/mL。在37℃条件下反应后于295nm波长下测定吸光值。
(4)按照表2的设置，将A，B，C，D四管中加入黄嘌呤、PBS，以及岩藻寡糖后，在37℃水浴锅中反应30min，随后按照下表加入黄嘌呤氧化酶，反应30min后，向每管加入0.05mL的1M的HCl以终止反应。最后测定各管反应液在295nm波长下的吸光值。按照此方法测定不同分子量的岩藻寡糖的黄嘌呤氧化酶抑制率。
Figure BDA0002957908510000101
表2抑制黄嘌呤氧化酶能力测定
Figure BDA0002957908510000102
Figure BDA0002957908510000111
2、实验结果及分析
从图5的结果可知，不同分子量的岩藻寡糖(大于100kDa，50-100kDa， 30-50kDa，10～30kDa，5～10kDa，小于5kDa)都具有不同程度的黄嘌呤氧化酶抑制活性。其中，分子量小于5kDa岩藻寡糖对于黄嘌呤氧化酶的抑制率最高，达到67.3％。分子量为5～10kDa的岩藻寡糖对于黄嘌呤氧化酶的抑制率次之，达到61.31％。上述结果说明：本发明提供的生物酶解法制备的岩藻寡糖可应用于抑制黄嘌呤氧化酶，可应用于体内或体外条件下对黄嘌呤氧化酶的抑制中。
实施例3岩藻寡糖在降低体内尿酸含量中的应用
1、实验方法
本实施例为了检测上述实施例1制备的岩藻寡糖在降低活体生物体内尿酸含量的效果，选取分子量小于5kDa岩藻寡糖作为代表进行下述实验：
(1)试验小鼠分组：将全部试验小鼠(SPF级，8周龄，雄性)分为空白组、模型组、阳性组、寡糖低剂量组、寡糖高剂量组总共5组，每组12只，随机均分4笼，每笼三只，分别用0.5％浓度的苦味酸标记头、背、尾。稳定适应3-5天。
(2)高尿酸血症模型建立：建模药物为酵母膏和氧嗪酸钾，酵母膏的给药方式为灌胃，氧嗪酸钾的给药方式采用腹腔注射。建模一周，七天后采取眼底静脉血，依据尿酸试剂盒说明书测定尿酸含量。酵母膏的灌胃量为10g/kg 体重；氧嗪酸钾灌胃量设置为300mg/kg体重(氧嗪酸钾用0.5％的羧甲基纤维素钠配置)以上均用生理盐水作为溶剂。每只试验小鼠灌胃0.2mL，试验组小鼠的尿酸值高出空白组40％即为模型建立成功。
(3)引入岩藻寡糖干扰尿酸形成：每天灌胃建模药物1h后给与岩藻寡糖。设置低剂量的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)灌胃量为150mg/kg体重，设置高剂量的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)灌胃量为300mg/kg体重，每次灌胃0.2mL。每五天监测血尿酸值。直至实验组相比模型组出现明显的下降，并且实验组的尿酸值在正常范围(181-146μmol/L)内，结束试验，取静脉血0.5mL测量各组小鼠的血尿酸值。
其他组的处理：
模型组：每天灌胃和腹腔注射建模药物，建立高尿酸血症模型；
空白组：每天灌胃和腹腔注射与模型组同等计量的生理盐水；
阳性组：每天给予与模型组同等计量的建模药物1h后给予阳性药物别嘌呤醇，阳性药物干预量为每只每天10mg/kg体重。
2、实验结果及分析
从图6的结果可知，相对于模型组，被给予岩藻寡糖处理的低剂量组和高剂量组的小鼠的尿酸含量显著降低，其中，高剂量组的效果最佳，尿酸含量降低了53.2％。
实施例4岩藻寡糖在降低体内腺苷脱氨酶活性中的应用
1、本实施例为了检测上述实施例1制备的岩藻寡糖在降低活体生物体内腺苷脱氨酶活性的效果，选取分子量小于5kDa岩藻寡糖作为代表进行下述实验：包括以下步骤：
(1)试验小鼠分组：将全部试验小鼠(SPF级，8周龄，雄性)分为空白组、模型组、阳性组、寡糖低剂量组、寡糖高剂量组总共5组，每组12只，随机均分4笼，每笼三只，分别用0.5％浓度的苦味酸标记头、背、尾。稳定适应3-5天。
(2)高尿酸血症模型建立：建模药物为酵母膏和氧嗪酸钾，分别采取灌胃以及腹腔注射方式。建模一周，七天后采取眼底静脉血，依据尿酸试剂盒说明书测定尿酸含量。酵母膏的灌胃量为10g/kg体重；氧嗪酸钾灌胃量设置为300mg/kg体重(氧嗪酸钾用0.5％的羧甲基纤维素钠配置)以上均用生理盐水作为溶剂。每只试验小鼠灌胃0.2mL，试验组小鼠的尿酸值高出空白组40％即为模型建立成功。
(3)引入岩藻寡糖干扰腺苷脱氨酶形成：每天灌胃建模药物1h后给予岩藻寡糖。设置低剂量的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)灌胃量为150mg/kg体重，设置高剂量的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)灌胃量为300mg/kg体重，每次灌胃 0.2mL。每五天监测血尿酸值。直至实验组相比模型组出现明显的下降，并且实验组的尿酸值在正常范围(181-146μmol/L)内，结束试验，取肝脏测量各组小鼠体内的腺苷脱氨酶活性。
其他组设置同实施例3。
2、实验结果及分析
如图7的实验结果可知，相对于模型组，被给予岩藻寡糖处理的低剂量组和高剂量组的小鼠的腺苷脱氨酶的活性显著降低，其中，高剂量组的效果最佳，腺苷脱氨酶的活性降低了47.8％。因此，本发明提供的岩藻寡糖可应用于降低体内腺苷脱氨酶活性。
实施例5岩藻寡糖在降低体内黄嘌呤氧化酶活性中的应用
1、实验方法：本实施例为了检测上述实施例1制备的岩藻寡糖在降低活体生物体内黄嘌呤氧化酶(XOD)活性的效果，选取分子量小于5kDa岩藻寡糖作为代表进行下述实验：包括以下步骤：
(1)试验小鼠分组：将全部试验小鼠(SPF级，8周龄，雄性)分为空白组、模型组、阳性组、寡糖低剂量组、寡糖高剂量组总共5组，每组12只，随机均分4笼，每笼3只，分别用0.5％浓度的苦味酸标记头、背、尾。稳定适应3-5天。
(2)高尿酸血症模型建立：建模药物为酵母膏和氧嗪酸钾，分别采取灌胃以及腹腔注射方式。建模一周，七天后采取眼底静脉血，依据尿酸试剂盒说明书测定尿酸含量。酵母膏的灌胃量为10g/kg体重；氧嗪酸钾灌胃量设置为300mg/kg体重(氧嗪酸钾用0.5％的羧甲基纤维素钠配置)以上均用生理盐水作为溶剂。每只试验小鼠灌胃0.2mL，试验组小鼠的尿酸值高出空白组40％即为模型建立成功。
(3)引入岩藻寡糖干扰黄嘌呤氧化酶形成：每天灌胃建模药物1h后给予岩藻寡糖。设置低剂量的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)灌胃量为150mg/kg体重，设置高剂量的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)灌胃量为300mg/kg体重，每次灌胃 0.2mL。每五天监测血尿酸值。直至实验组相比模型组出现明显的下降，并且实验组的尿酸值在正常范围(181-146μmol/L)内，结束试验，取肝脏通过试剂盒测量各组小鼠体内的黄嘌呤氧化酶活性。
其他组设置同实施例3。
2、实验结果及分析
如图8的实验结果可知，相对于模型组，被给予岩藻寡糖处理的低剂量组和高剂量组的小鼠的黄嘌呤氧化酶的活性显著降低，其中，高剂量组的效果最佳，黄嘌呤氧化酶的活性降低了51.3％。因此，本发明提供的岩藻寡糖可应用于降低体内黄嘌呤氧化酶活性。
实施例6岩藻寡糖在降低体内尿素氮含量中的应用
1、实验方法：本实施例为了检测上述实施例1制备的岩藻寡糖在降低活体生物体内尿素氮含量的效果，选取分子量小于5kDa岩藻寡糖作为代表进行下述实验：包括以下步骤：
(1)试验小鼠分组：将全部试验小鼠(SPF级，8周龄，雄性)分为空白组、模型组、阳性组、寡糖低剂量组、寡糖高剂量组总共5组，每组12只，随机均分4笼，每笼3只，分别用0.5％浓度的苦味酸标记头、背、尾。稳定适应3-5天
(2)高尿酸血症模型建立：建模药物为酵母膏和氧嗪酸钾，分别采取灌胃以及腹腔注射方式。建模一周，七天后采取眼底静脉血，依据尿酸试剂盒说明书测定尿酸含量。酵母膏的灌胃量为10g/kg体重；氧嗪酸钾灌胃量设置为300mg/kg体重(氧嗪酸钾用0.5％的羧甲基纤维素钠配置)以上均用生理盐水作为溶剂。每只试验小鼠灌胃0.2mL，试验组小鼠的尿酸值高出空白组40％即为模型建立成功。
(3)引入岩藻寡糖干扰尿素氮的形成：每天灌胃建模药物1h后给予岩藻寡糖。设置低剂量的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)灌胃量为150mg/kg体重，设置高剂量的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)灌胃量为300mg/kg体重，每次灌胃 0.2mL。每五天监测血尿酸值。直至实验组相比模型组出现明显的下降，并且实验组的尿酸值在正常范围(181-146μmol/L)内，结束试验，取血清通过试剂盒测量各组小鼠体内的尿素氮含量。
其他组设置同实施例3。
2、实验结果及分析
如图9的实验结果可知，相对于模型组，被给予岩藻寡糖处理的低剂量组和高剂量组的小鼠的尿素氮含量有所降低，其效果优于阳性组；而高剂量组的效果最佳，尿素氮含量降低了49.8％。因此，本发明提供的岩藻寡糖可应用于降低体内尿素氮含量。
实施例7岩藻寡糖在降低体内肌酐含量的应用
1、实验方法：本实施例为了检测上述实施例1制备的岩藻寡糖在降低活体生物体内肌酐含量的效果，选取分子量小于5kDa岩藻寡糖作为代表进行下述实验：包括以下步骤：
(1)试验小鼠分组：将全部试验小鼠(SPF级，8周龄，雄性)分为空白组、模型组、阳性组、寡糖低剂量组、寡糖高剂量组总共5组，每组12只，随机均分4笼，每笼3只，分别用0.5％浓度的苦味酸标记头、背、尾。稳定适应3-5天。
(2)高尿酸血症模型建立：建模药物为酵母膏和氧嗪酸钾，分别采取灌胃以及腹腔注射方式。建模一周，七天后采取眼底静脉血，依据尿酸试剂盒说明书测定尿酸含量。酵母膏的灌胃量为10g/kg体重；氧嗪酸钾灌胃量设置为300mg/kg体重(氧嗪酸钾用0.5％的羧甲基纤维素钠配置)以上均用生理盐水作为溶剂。每只试验小鼠灌胃0.2mL，试验组小鼠的尿酸值高出空白组40％即为模型建立成功。
(3)引入岩藻寡糖干扰肌酐的形成：每天灌胃建模药物1h后给予岩藻寡糖。设置低剂量的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)灌胃量为150mg/kg体重，设置高剂量的岩藻寡糖(分子量＜5kDa)灌胃量为300mg/kg体重，每次灌胃0.2mL。每五天监测血尿酸值。直至实验组相比模型组出现明显的下降，并且实验组的尿酸值在正常范围(181-146μmol/L)内，结束试验，取血清通过试剂盒测量各组小鼠体内的肌酐含量。
其他组设置同实施例3。
2、实验结果及分析
如图10的实验结果可知，相对于模型组，被给予岩藻寡糖处理的低剂量组和高剂量组的小鼠的肌酐的含量有所降低，其中，高剂量组的效果最佳，其该组小鼠体内肌酐含量降低了45.01％。因此，本发明提供的岩藻寡糖可应用于降低体内肌酐含量。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
S1、将岩藻多糖溶于缓冲溶液中，制备质量体积浓度为0.1%-10%的岩藻多糖溶液；
S2、将岩藻多糖酶用缓冲液溶解，使其活性浓度为400~1000U/mL；
S3、将质量体积浓度为0.1%-10%的岩藻多糖溶液与500U/mL岩藻多糖酶以10:1的体积比进行混合，水浴35℃恒温反应2h后，进行沸水浴处理以终止反应；冷却后离心，取上清液备用；所述岩藻多糖酶是由黄杆菌(Flavobacteriaceae sp.)RC2-3mut发酵而成；
S4、利用超滤膜系统将上述上清液进行分级处理，得到不同分子量段的降解产物，再对降解产物分别进行冷冻干燥，得到的冻干粉即为岩藻寡糖；利用超滤膜系统分级处理得到小于5kDa，5~10kDa，10~30kDa，30-50kDa，50-100kDa，大于100kDa的分子量段的降解产物，再分别处理得到相应的冻干粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为24mM的PBS或Tris-HCl，pH值为8.0。
3.一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖在制备抑制高尿酸血症、抗痛风产品中的应用，其特征在于，所述岩藻寡糖是利用岩藻多糖酶酶解方法制备而成；所述岩藻寡糖是采用权利要求1所述的制备方法制备得到，分子量小于5kDa。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，岩藻寡糖在制备抗高尿酸血症药物、抗痛风症药物中的应用。
5.一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖，其特征在于，采用权利要求1-2中任一项所述的方法制备得到。
CN202110228618.3A 2021-03-02 2021-03-02 一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖及其制备方法和应用 Active CN112972488B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110228618.3A CN112972488B (zh) 2021-03-02 2021-03-02 一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110228618.3A CN112972488B (zh) 2021-03-02 2021-03-02 一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112972488A CN112972488A (zh) 2021-06-18
CN112972488B true CN112972488B (zh) 2022-12-23

Family

ID=76351933

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110228618.3A Active CN112972488B (zh) 2021-03-02 2021-03-02 一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112972488B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023000263A1 (zh) * 2021-07-22 2023-01-26 海糖（江苏）生物医药科技有限公司 一种褐藻寡糖的用途
CN115671118B (zh) * 2021-07-22 2024-02-27 海糖（江苏）生物医药科技有限公司 一种褐藻寡糖的用途
CN114854778B (zh) * 2022-04-15 2023-05-30 青岛农业大学 一种岩藻多糖酶基因Fcn1及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006327995B2 (en) * 2005-12-23 2012-09-13 N.V. Nutricia Infant nutritional compositions for preventing obesity
CN109055460B (zh) * 2018-09-13 2021-06-29 青岛创通生物科技有限公司 一种低分子量岩藻多糖及其在制备化妆品中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112972488A (zh) 2021-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112972488B (zh) 一种具有抗高尿酸血症活性的岩藻寡糖及其制备方法和应用
CN103356716B (zh) 多株益生菌与复合药食两用真菌发酵组合物及制备和应用
WO2007041951A1 (fr) Procede d'extraction du polysaccharide de l'ormeau
KR20200020804A (ko) 생체활성 올리고당 제조
CN109010349B (zh) 白芨寡糖在改善肠道微生态中的应用
CN112979836B (zh) 一种活性增强型食用菌多糖的制备方法及其在减肥、增加肠道有益菌群中的应用
CN110747146A (zh) 具有降解尿酸作用的格氏乳杆菌lg08及其应用
CN116570640B (zh) 葵花盘生物碱及衍生物在降尿酸溶解痛风石产品中的应用
CN111235197A (zh) 一种高效抗敏止痒的桃胶多糖及其发酵提取方法和应用
CN114832022B (zh) 一种桑黄子实体酚类活性物质的制备及其在调节肠道菌群、尿酸代谢中的应用
US20240052390A1 (en) Fermented supernatant of bangia fusco-purpure and lactobacillus with alpha-glucosidase inhibitory activity and use thereof
CN108294224A (zh) 一种利用植物乳杆菌发酵脱除大米中重金属镉的方法
CN117946939A (zh) 一株植物乳植杆菌sm2及其在制备降胆固醇和助睡眠食品药品中的应用
CN114366760A (zh) 海蒿子多酚在制备治疗糖尿病药物中的应用及其制备方法
CN112715965A (zh) 一种椰子膳食纤维及其制备方法与应用
CN117264840A (zh) 一株短乳杆菌xy8及其在制备抗衰老和改善痛风食品药品中的应用
CN109364085B (zh) 白芨寡糖及其组合物在调节糖脂代谢紊乱中的应用
CN115010823B (zh) 一种调节肠道菌群的车前子多糖及其制备方法与应用
WO2023066163A1 (zh) 一种从德氏乳杆菌和嗜热链球菌发酵酸奶中分离出的胞外多糖及其应用
CN116375902A (zh) 一种提高免疫功能的葡萄渣多糖及其制备方法和应用
CN117286033A (zh) 裂褶菌发酵制备裂裥菌素的方法及其及在皮肤黏膜保护和舒缓中的应用
CN114317313B (zh) 酸樱桃提取物在制备降低尿酸或抑制痛风发作产品中的应用
CN113999325B (zh) 一种米糠发酵多糖，制备及应用
JP3459815B2 (ja) 大麦焼酎蒸留残液から分取した脂肪肝抑制作用を有する組成物及び該組成物の製造方法
CN111713659B (zh) 一种抑制α-葡萄糖苷酶活性羊栖菜制品制备方法和羊栖菜制品

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant