CN115286602A - 一种基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针及其制备方法和应用，属于铜离子荧光探针技术领域。本发明的技术方案要点为：一种基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针，其结构式为：
Figure DDA0003750732500000011
本发明还具体公开了该荧光探针的制备方法及其在Hela活细胞中进行铜离子检测的应用。在金属选择性实验中，该荧光探针的荧光增强只能由铜离子(超过200倍)诱导，而不能由其它金属和生物硫醇诱导。因此，该荧光探针对铜离子表现出良好的选择性。基于此建立了一种快速、简便的检测铜离子的荧光检测方法。

Description

一种基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探 针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于铜离子检测荧光探针技术领域，具体涉及一种基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
铜(Cu)是人体必需的微量元素，在许多代谢过程中起着关键作用，主要以金属酶的形式参与电子传递、小分子活化、底物氧化、信号转导等一系列过程。铜缺乏症在日常饮食可直接或间接导致DNA的氧化损伤，甚至导致一些心血管疾病，如血压升高、心脏和血管结构改变、脂质过氧化作用、葡萄糖代谢受损等等。然而，过量摄入铜也会对人体造成严重后果。例如，长时间接触过量的铜离子会诱发一些神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病、威尔逊病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)等。此外，铜是工业生产活动中使用最广泛、最常见的重金属之一。含铜废水的排放不仅会造成资源的严重浪费，而且会对环境造成极大的污染。因此，高选择性、高灵敏度的铜离子原位检测在生命科学和环境领域具有重要意义。
荧光分子成像技术是近年发展迅速的一种新兴的分子成像技术，它利用具有特异性的荧光分子探针标记特定的分子或细胞，从分子和细胞水平上对正常或异常的生物过程进行空间和时间上的视觉描述，是一种非侵入式的成像方式。荧光探针具有高的荧光量子产率、长的分析波长、良好的生物兼容性、稳定性、选择性、灵敏度以及动态响应范围宽等诸多优点，尤其是荧光法能够实现对活体的灵敏、原位、实时成像，近年来在生物化学、细胞生物学、环境科学、分子生物学等科学领域有着广泛的应用。香豆素类荧光团分子摩尔吸光系数较大，荧光量子产率较高，因此香豆素类染料常被用作为发色基团来合成高效的荧光探针。香豆素分子易于衍生和修饰，而且激发波长在可见区，这些特点使其成为了荧光探针设计和合成中优秀的候选荧光团。
目前，荧光探针作为一种高灵敏度、高选择性的非侵入性检测方法，已广泛应用于生物医学领域，用于检测生物体中的金属离子、活性物质、生物小分子等物质。许多基于铜活度的探针被设计和生产来检测各种生物活性物质，如氨基酸、硫醇、活性氮或生物体中的活性氧物种。它们的设计主要基于铜离子的配位能力和催化能力。例如，铜离子可以诱导酰肼、酯、内酯、酰胺、内酰胺和其他物质的催化水解。此外，还报道了基于铜催化氧化反应的探针，如基于氧化脱氢反应、氧化环化反应、有机胺氧化反应、苯醚C-O键断裂反应等的探针，其中仅有少数基于铜催化氧化环化反应的探针被报道，如氧化环化生成恶二唑、苯并三唑和奎宁化合物。基于铜介导的氧化环化合成类黄酮类中间体的探针法尚未见报道。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针及其制备方法，该方法制得的荧光探针能够用于Hela活细胞中进行铜离子检测。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案：一种基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构式为：
Figure BDA0003750732480000021
本发明所述的基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针的制备方法，其特征在于具体步骤为：
步骤S1：将POCl3的N,N-二甲基甲酰胺溶液加入到7-(二乙基氨基)香豆素的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于60℃搅拌反应，反应完成后加水并过滤沉淀，得到暗黄色固体即香豆醛类化合物2；
步骤S2：将步骤S1得到的香豆醛类化合物2溶于体积比为1:1的二氯甲烷/乙醇的混合溶剂中，再加入四氢吡咯作为催化剂，然后加入化合物3，在氮气保护下于常温搅拌反应，有沉淀析出，点板检测反应，反应完全后所得沉淀抽滤，并用乙醇洗涤数次，得到荧光探针1；
制备过程中的合成路线为：
Figure BDA0003750732480000022
进一步限定，步骤S1中所述POCl3与7-(二乙基氨基)香豆素的投料摩尔比为10.7:1，步骤S2中所述香豆醛类化合物2与1-羟基-2-乙酰萘的投料摩尔比为0.1:0.18。
本发明所述的基于铜离子催化烯烃氧化反应的荧光探针在Hela活细胞中进行铜离子检测的应用。
进一步限定，所述基于铜离子催化烯烃氧化反应的荧光探针具有较弱荧光，作为反应性荧光探针，其在铜离子存在下的荧光增强设计铜离子催化环化生成强荧光黄酮类化合物，该荧光探针具有良好的水溶性和pH适应性，能够作为生物相容性荧光探针使用。
本发明中铜离子诱导荧光探针1的荧光增强可能涉及铜介导的氧化过程，机理如图3所示，在这个过程中，荧光探针1被铜离子先配位，之后在水的参与下发生催化环化生成强黄色荧光黄酮类化合物FI。因此，荧光探针1在铜离子的存在下可以增强溶液中的荧光。基于此本发明建立了一种快速、简便的检测铜离子的方法。
荧光探针1在体积比为1:1的CH3CN/H2O混合溶剂中对铜离子水溶液具有良好的选择性，其它金属离子对荧光探针1的荧光影响很小，共存时除了Ag+外，几乎不会干扰铜离子对荧光探针1的增强效应，并成功用于Hela细胞中进行了检测铜离子的细胞成像实验。
铜离子催化探针1环化生成强黄色荧光黄酮类化合物可能是其实现荧光增强识别的机制，从而实现了该荧光探针1对铜离子的检测，是一种选择性好、抗干扰能力强的铜离子荧光探针。此外，荧光探针1具有细胞膜渗透性和低细胞毒性，还具有良好的光化学稳定性。因此，该荧光探针1适用于检测在活细胞中铜离子化合物的水平，有望用于生物体内铜离子的检测。
附图说明
图1为荧光探针1(10.0μM)在溶液(CH3CN：HEPES＝1:1，v/v，pH＝7.2-7.4)中的紫外-可见吸收光谱及其加入1.5当量Cu2+后的变化；
图2为荧光探针1(10.0μM)在溶液中加入1.5当量的Cu2+超过2.0h后的荧光强度变化(540nm，λex＝440nm)；
图3为荧光探针1与Cu2+相互作用的可能反应机制；
图4为荧光探针1(10.0μM)与不同等量的Cu2+的荧光强度(540nm)随时间的变化；
图5为荧光探针1(10.0μM)在溶液(CH3CN：HEPES＝1:1，v/v，pH＝7.2-7.4)中加入1.5当量不同金属离子和硫醇后荧光强度(540nm)的变化直方图；
图6为荧光探针1(10.0μM)与1.5当量Cu2+在溶液中(CH3CN：HEPES＝1:1，v/v， pH＝7.2-7.4)存在等价金属离子的竞争性荧光实验，第一排为加入不同金属离子后荧光探针1的荧光变化，后排表示在前排溶液中进一步加入1.5当量的Cu2+后的荧光强度；
图7为荧光探针1孵育的Hela细胞的荧光图像(10.0μM)，(a)添加Cu(ClO4)2(1.5当量)后孵育的Hela细胞的荧光图像(b)，以及相应的明场图像(c，d)；
图8为荧光探针1在DMSO-d6溶液(400MHz，298K)中的1H NMR；
图9为荧光探针1在DMSO-d6溶液(400MHz，298K)中的13C NMR；
图10为荧光探针1的负离子模式ESI-MS谱图；
图11为荧光探针1(10.0μM)及其含有1.5当量Cu2+的混合溶液在CH3CN和HEPES (pH＝7.2-7.4)不同配比溶液中的荧光强度变化(540nm，λex＝440nm)；
图12在不同pH范围(CH3CN：HEPES＝1:1，v/v)的溶液中，荧光探针1(10.0μM)及其含有1.5当量Cu2+的混合溶液的荧光强度变化(540nm，λex＝440nm)；
图13为黄酮类中间体FI的的正离子(左)和负离子(右)模式ESI-MS谱图；
图14为黄酮类中间体FI在DMSO-d6溶液(400MHz，298K)中的1H NMR谱图1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝9.61(s,1H),8.53(d,J＝6.4,1H),8.45(s,1H),8.12(d, J＝7.9,1H),8.06(d,J＝8.7,1H),7.91(d,J＝8.8,1H),7.85–7.75(m,2H),7.63–7.58(m,1H), 6.81(d,J＝5.7,1H),6.67(s,1H),3.50(dd,J＝13.6,7.0,4H),1.17(t,J＝6.9,6H)；
图15为荧光探针1与黄酮类中间体FI在DMSO-d6溶液(400MHz，298K)中的1H NMR对比图；
图16为荧光探针1和黄酮类中间体FI的二维COSY核磁谱图；
图17为黄酮类中间体FI与探针1加1.5当量铜离子后的紫外吸收(440nm)和荧光发射谱图(540nm)对比。
图18为荧光探针1(10.0μM)与1.0当量Cu2+(CH3CN：HEPES＝1:1，v/v，pH＝7.2-7.4)的拟一级动力学线性曲线，按Ln((Fmax-Ft)/Fmax)＝-kobs t方程，斜率为-0.02711min-1；
图19为荧光探针1(10.0μM)在溶液(CH3CN：HEPES＝1:1，v/v，pH＝7.2-7.4)中的紫外-可见吸收光谱及其加入1.5当量不同金属离子后的变化(插入：荧光探针1 在可见光和365nm紫外光下的颜色变化)；
图20为荧光探针1(10.0μM)在溶液中(CH3CN：HEPES＝1:1，v/v，pH＝7.2-7.4)与1.5当量Cu2+、Fe3+、H2O2作用后荧光强度对比图；
图21为荧光探针1(10.0μM)及加入1.5倍当量Cu2+、Fe3+、H2O2后的细胞荧光成像对比图；
图22为探针1(10.0μM)在0.1mM，1.0mM，10.0mM浓度GSH和EDTA存在下与铜离子的响应荧光强度变化图；
图23为细胞活力值(％)通过MTT试验与探针1孵育浓度进行评估，Hela细胞在 0.0～50.0μM荧光探针1存在下37℃培养24h，存活率(％)＝处理组平均吸光度值/ control×100％平均吸光度值。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明。
本发明所用仪器和试剂在无特别说明时均为商业途径获得。
1实验部分
1.1材料与试剂
实验所用试剂均为分析纯，购买后直接使用。7-(二乙基胺)香豆素、1-羟基-2-乙酰萘等化学试剂从试剂公司采购。在水溶液中制备了各种金属离子的高氯酸盐溶液(2.0×10-2M)。在光谱测量中，荧光探针1的原液在CH3CN：HEPES(1:1，v/v，pH＝7.2-7.4)溶液中制备。每次向光程为1cm的石英电池中填充3mL荧光探针1溶液，用微注射器逐渐向石英电池中加入不同的金属离子储备溶液。
1.2主要仪器
三用紫外分析仪，紫外-可见分光光度计，荧光分光光度计，高效液相色谱/高分辨质谱联用仪，核磁共振波谱仪，荧光倒置显微镜，高速台式冷冻离心机，CO2细胞培养箱，恒温水浴振荡器，-80℃超低温冰箱，超净工作台，循环水式真空泵，旋转蒸发仪，超声波清洗器，真空干燥箱，电热恒温鼓风干燥箱，集热式恒温加热磁力搅拌器。
1.3方法
1.3.1荧光探针1的制备
合成路线
Figure BDA0003750732480000051
荧光探针1是根据上述所示的合成路线合成得到的。
荧光探针1的具体制备方法如下：将两滴四氢吡咯加入化合物2(24.5mg，0.1mmol)和化合物3(33.7mg，0.18mmol)的混合溶液中，再加入3.0mL二氯甲烷/乙醇(1/1， v/v)混合溶剂，然后在室温条件下搅拌反应20小时，得到红紫色固体即荧光探针1(30.0 mg，产率72.5％)。
荧光探针1的结构表征：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ15.22(s,1H),8.59(s,1H),8.36(d,J＝8.2Hz,1H),8.24(d,J＝15.2Hz,1H),8.04(d,J＝9.1Hz,1H),7.92(dd,J＝15.8,11.7Hz,2H),7.73(t,J＝7.0Hz,1H),7.61(t,J＝7.4Hz,1H),7.50(dd,J＝16.6,9.0Hz,2H),6.82(dd,J＝9.0,2.3Hz,1H),6.63(d,J＝2.1Hz,1H),3.56–3.42(m,4H),1.15(t,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ193.03,163.19,160.09,156.76,152.30,146.32,140.83,136.96,131.02,130.45,127.69,126.27,124.60,124.35,123.67,119.10,118.38,113.37,112.89,110.20,108.55,96.34,44.44,12.42.ESI-MS,(m/z),Calcd for[C26H22NO4]-, 412.1554；found,412.1555。
化合物2的具体合成方法如下，在10ml圆底烧瓶中，向1.0mL DMF中加入POCl3(1.0mL，10.7mmol)，搅拌0.5小时，然后将混合溶液加入到2.0mL含有7-(二乙基氨基)香豆素(217mg，1.0mmol)的DMF溶液中，将混合溶液在60℃条件下搅拌反应2.0小时，然后加入合适的水，过滤沉淀，得到暗黄色固体即化合物2(102.7mg，产率41.9％)。
化合物2的结构表征：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.89(s,1H),8.41(s,1H),7.68(d, J＝9.1Hz,1H),6.83(dd,J＝9.1,2.4Hz,1H),6.61(d,J＝2.3Hz,1H),3.51(q,J＝7.0Hz,1H),1.14(t,J＝7.0Hz,6H).ESI-MS,(m/z),Calcd for[C14H15NO3]+,246.1125；found,246.1093。
1.3.2细胞培养
培养：Hela细胞在DMEM培养基中进行培养，并加入10wt％胎牛血清(FBS)和 1wt％青霉素-链霉素。细胞体积分数5％CO2，37℃的环境下进行孵育，当细胞饱和度超过70％后进行细胞传代。
接种：加含10wt％FBS的DMEM完全培养基于24孔板，于37℃，体积分数5％CO2孵箱中常规培养12h。
计数和照相：通过倒置生物显微镜观察24孔板细胞数量和状态。
2结果与讨论
2.1水溶性和pH依赖性实验
荧光探针优异的水溶性是其在体内应用的前提。因此，我们首先测试了荧光探针1的水溶性。记录荧光强度在乙腈与HEPES溶液不同配比下的变化，并用于选择合适的溶剂体系。这些结果表明，在不同比例的乙腈和HEPES溶液中荧光探针1只有微弱的荧光被观察到(10.0μM，pH＝7.2-7.4，Ex＝440nm，Em＝540nm)，溶液中不同浓度HEPES 对荧光强度无显著影响。
然而，当加入1.5当量的Cu2+时，进一步研究了混合溶液的荧光变化。结果表明，当HEPES的比值为0.4和0.5时，可以观察到强荧光(图11)，其它比值仅检测到弱荧光。为了模拟实验条件接近生理条件，除另有说明外，在后续实验中选择乙腈与 HEPES溶液(1:1，v/v)为最佳溶剂条件。
此外，选择合适的pH缓冲液是其生物应用的关键要求。为了确定荧光探针1在溶液中的最佳pH条件(CH3CN-HEPES，1:1，v/v)，我们研究了pH对荧光探针1及其与1.5当量Cu2+混合物在CH3CN-HEPES溶液中荧光强度的影响。这些结果表明，荧光探针1在不同pH值(3.0-12.0)下荧光微弱，几乎没有变化，但加入1.5等量的Cu2+后，不同pH下混合溶液的荧光强度发生了明显变化。在7.0-11.0pH范围内检测到强荧光。这表明该荧光探针1可以在较宽的pH范围内工作。为了适用于生理条件，除另有说明外，其它实验均选用pH条件(7.2-7.4)。
2.2紫外可见光谱和荧光光谱实验
在获得合适的溶剂条件和pH条件后，进一步进行紫外-可见光谱实验，如图1所示。在10.0μM，CH3CN：HEPES＝1:1，v/v，pH＝7.2-7.4的溶液中，荧光探针1的最大吸收峰在490nm处。加入1.5等量的Cu2+后，最大吸收峰在5.0min内迅速移至400nm，随后该峰逐渐消失，2.0h后出现一个新的主峰(440nm)。这个变化过程在约411nm 处产生等吸收点。以上结果表明，荧光探针1和1.5当量Cu2+混合后，可能是先配位，然后在溶液中立即生成铜的配合物(对应于最大吸收峰在5.0min内从490nm移到400 nm)，随着时间的推移，产生一种新的物质，随着时间的推移，新物质的浓度逐渐增加(对应于最大吸收峰从400nm移到440nm，440nm处的峰强度在2.0h内逐渐增强)。
随后，还进行了荧光探针1与Cu2+的荧光实验，发现荧光探针1在650nm溶液中只观察到非常微弱的发射(10.0μM，CH3CN：HEPES＝1:1，v/v，pH＝7.2-7.4，Ex＝490nm)，随着时间的推移，强度几乎没有变化。在溶液中加入1.5当量的Cu2+后，在540nm处观察到明显的发光现象(在440nm处激发)，溶液的荧光强度在5.0分钟内仅微弱增强，随后显著增强。2.0h后基本平衡，增强程度达200倍以上。这些结果表明荧光探针1可以作为“打开”的荧光探针来检测Cu2+。在Cu2+存在的情况下，荧光探针1可能与Cu2+发生催化环化反应并产生新的荧光物质。随着其浓度的增加，混合溶液的荧光增强。
2.3可能的荧光增强机制
为了进一步揭示Cu2+离子对该探针的荧光增强机理，尝试对生成的中间体进行分离。首先将探针1(16.5mg/0.04mmo1)和1.5当量的CuSO4·5H2O(15.0mg/0.06mmo1)溶于0.8L溶剂(CH3CN：HEPES＝1：1，v/v，pH＝7.2～7.4)，得到澄清的混合溶液(50μ M，较高的浓度导致Cu2+配合物沉淀生成)。搅拌1d后，发现一种黄绿色的强荧光物质。通过制备TLC方法(洗脱液：EA：PE＝1：1)分离得到黄绿色中间体，并通过ESI-MS 和核磁共振实验对其进行了表征(图13,14,15)。例如，在电喷雾质谱结果中，正模式的峰([M+H]+＝428.1488，计算值：428.1492，[M+Na]+＝450.1288，计算值：450.1312)和负模式的峰([M-H]-＝426.1332，计算值：426.1336)都可以归因于一个新的黄酮类中间体 FI。正如文献报道的那样，作为荧光染料的类黄酮类物质通常是在碱性环境中通过过氧化氢氧化探针1的结构类似物来制备的。在本文中，Cu2+离子可能起到了与过氧化氢相同的作用。此外，探针1及中间体FI的准确氢归属还被一维核磁氢谱和二维COSY谱进一步证实(如图14、15、16)。如探针1中OH质子(13)和双键氢(5和6)峰的消失以及 FI中间体中OH质子(K)峰的出现，都表明FI中间体确实形成了。此外，还研究了黄酮类中间体FI的UV-Vis和荧光实验，其吸收峰(440nm)和荧光发射峰(540nm)与与1.5 当量的Cu2+离子探针溶液相似，而且与文献报道的黄酮类类似物的吸收和发生峰也相似(图17)。因此，上述结果表明，在Cu2+存在的情况下，该探针的荧光增强肯定是由类黄酮中间体FI的形成引起的。
2.4动态试验
为了进一步研究荧光探针1与Cu2+的最佳结合浓度，我们还进行了不同Cu2+浓度下荧光探针1的时间依赖性荧光实验。如图4所示，在荧光探针1的溶液(10.0μM， CH3CN：HEPES＝1:1，v/v，pH＝7.2-7.4)中分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0、5.0等不同当量Cu2+并记录了荧光强度的变化(λEx＝440nm，λEm＝540nm)。结果表明，在0.5-1.0当量Cu2+的存在下，荧光探针1的荧光增强速率逐渐增大。当铜离子浓度为1.0-1.5时，荧光增强速率最高，约2.0h后荧光强度达到最大。相反，当铜离子加入量继续增加时(在铜离子浓度为1.5-5.0时)，荧光增强速率和强度均降低。原因可能是新生成的荧光化合物FI与铜离子进一步相互作用，该作用导致荧光强度降低。此外，在1.0当量Cu2+存在时，Ln((Fmax-Ft)/Fmax)与t(时间)呈线性关系(图18)。根据Ln((Fmax-Ft)/Fmax)＝-kobs t，计算得到反应的准一级反应速率常数(kobs)为 2.71×10-2(min-1)。结果表明，铜离子催化荧光探针1的分解反应速率适中。
2.5选择性实验
随后，我们还研究了荧光探针1是否可以用于检测其他金属离子。在荧光探针1 溶液中分别加入1.5当量的各种金属离子，如Hg2+、Ni2+、Ag+、Co2+、Zn2+、Cr3+、Mg2+、 Na+、Cd2+、Mn2 +、Pb2+、K+、Ca2+、Cu2+、GSH、Hcy和Cys(10.0μM，CH3CN：HEPES ＝1:1，v/v，pH＝7.2-7.4)。2小时后进行紫外-可见光和荧光测试。如图19所示，荧光探针1的最大吸收峰仅在铜离子存在时发生位移(从490nm蓝移到440nm)，而其它金属离子只引起的吸收强度的轻微变化。肉眼可以观察到从粉红色到浅黄色的明显颜色变化。此外，如图5所示，荧光实验还表明，荧光探针1的荧光增强只能由Cu2+(超过200倍)诱导产生，而不能由其它金属和生物硫醇诱导。因此，荧光探针1对Cu2+表现出良好的选择性。
2.6竞争性实验
此外，还进行了竞争性荧光实验，研究荧光探针1对Cu2+的选择性是否受到其它金属离子的干扰。如图6所示，在荧光探针1(10.0μM)的溶液(CH3CN：HEPES＝1:1， v/v，pH＝7.2-7.4)中加入等当量的Cu2+，搅拌2.0h，记录混合溶液的荧光。结果表明，除Ag+外，其它金属离子对Cu2+诱导的荧光增强效应影响不大。原因可能是Ag+对荧光探针1的亲和力强于Cu2 +，干扰了荧光探针1与Cu2+离子的相互作用。因此，这些结果表明除Ag+外荧光探针1可以选择性地检测Cu2+。
2.7细胞荧光成像实验
同时进行细胞荧光成像实验，验证其在生理条件下的生物学应用(图7)。Hela细胞在徕卡DMI8倒置荧光显微镜下进行荧光成像实验。首先将细胞置于24孔细胞培养板中，37℃孵育24h，培养基为含10wt％胎牛血清的RPMI-1640。加入荧光探针1(10.0 μM)，连续孵育4.0h，PBS缓冲液洗涤后，取出培养基，显微镜观察。结果表明，细胞内未见明显荧光。加入1.5当量的Cu2+，持续培养3.0小时。显微镜下可见清晰的绿色荧光。为了进一步验证探针在高浓度GSH、H2O2、Fe3+存在下是否与铜离子响应，做了相应的体外竞争实验和体内细胞成像实验。结果表明，探针1无论是在体外还是细胞内都不与活性氧类物质H2O2、Fe3+反应，没有观察到明显的绿色荧光产生(图20,21)。探针1能够在毫摩尔浓度级别的GSH或EDTA存在下与铜离子反应(图22)。因此这些结果说明荧光探针1可作为生理环境中Cu2+的“打开”荧光探针。
此外，还进行了MTT实验，以证明荧光探针1的细胞毒性。在96-孔板的Hela细胞在37℃培养24小时，然后不同的探针浓度1如2.0μM，10.0μM，20.0μM，30.0μM， 40.0μM和50.0μM分别添加并继续孵化24.0h。每个浓度进行了5个平行测试。记录不同浓度下的细胞存活率如图23所示，结果表明，荧光探针1为10.0μM时，细胞存活率可达95％。总的来说，即使在生理条件下，荧光探针1对细胞的毒性也很低。
本发明以香豆醛类化合物与1-羟基-2-乙酰萘的缩合反应为基础，设计并合成了一种新型的Cu2+“打开”荧光探针。作为反应性探针，其在Cu2+存在下的荧光增强涉及铜介导的氧化环化生成类黄酮类中间体的过程。该荧光探针具有良好的水溶性和pH适应性，可作为生物相容性探针使用。选择性实验表明，该荧光探针对铜离子具有良好的选择性。竞争性实验表明，该荧光探针几乎不受其他金属离子的干扰。动力学实验表明，铜催化氧化反应为中等速率的准一级反应。此外，荧光探针具有细胞膜渗透性和低细胞毒性，还具有良好的光化学稳定性。因此，该荧光探针可于生理条件下检测活细胞中铜离子的水平。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构式为：
Figure FDA0003750732470000011
2.一种权利要求1所述的基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针的制备方法，其特征在于具体步骤为：
步骤S1：将POCl3的N,N-二甲基甲酰胺溶液加入到7-(二乙基氨基)香豆素的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于60℃搅拌反应，反应完成后加水并过滤沉淀，得到暗黄色固体即香豆醛类化合物2；
步骤S2：将步骤S1得到的香豆醛类化合物2溶于体积比为1:1的二氯甲烷/乙醇的混合溶剂中，再加入四氢吡咯作为催化剂，然后加入化合物3(1-羟基-2-乙酰萘)，在氮气保护下于常温搅拌反应，有沉淀析出，点板检测反应，反应完全后所得沉淀抽滤，并用乙醇洗涤数次，得到荧光探针1；
制备过程中的合成路线为：
Figure FDA0003750732470000012
3.根据权利要求2所述的基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤S1中所述POCl3与7-(二乙基氨基)香豆素的投料摩尔比为10.7:1，步骤S2中所述香豆醛类化合物2与1-羟基-2-乙酰萘的投料摩尔比为0.1:0.18。
4.权利要求1所述的基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针在Hela活细胞中进行铜离子检测的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述基于铜离子催化环化生成黄酮类中间体的反应型荧光探针具有较弱荧光，作为反应性荧光探针，其在铜离子存在下的荧光增强，该过程设计铜离子催化环化生成强荧光黄酮类化合物，该荧光探针具有良好的水溶性和pH适应性，能够作为生物相容性荧光探针使用。
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