CN115282299B - TGFβ示踪剂、抗体探针制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向转化生长因子‑β(TGFβ)的示踪剂，通过抗体标记正电子核素进行探针制备，并通过正电子发射型计算机断层显像(PET)技术进行活体分子检测。所述TGFβ示踪剂包括：[18F‑AlF3/68Ga]‑NOTA‑Tz‑TCO‑TGFβ抗体探针，可用于PET/CT显像诊断TGFβ在肿瘤组织等病理或正常组织中的表达水平。探针的载体是靶向人源或鼠源TGFβ的单克隆抗体，分子示踪的原理是生物正交化学‑点击化学和反式环辛烯反应。基于本发明提供的TGFβ示踪剂可以利用PET分子影像技术在体内检测出TGFβ在肿瘤等组织中的表达水平，具有制备工艺简单、特异性高、辐射剂量低、生物安全性及体内稳定性高等优势，因此，基于本发明提供的TGFβ示踪剂可以检测出TGFβ在活体肿瘤等组织中的表达水平，从而可以基于此对肿瘤进行分类。
Description
技术领域
本发明涉及核医学领域，其主要涉及TGFβ正电子示踪剂、制备方法及应用。
背景技术
TGFβ可促进癌细胞转移、免疫细胞浸润、DNA损伤反应等重要癌症生物学功能，因此TGFβ正在成为抗癌药物研发的热门方向。另外，TGFβ作为肿瘤生物标志物与癌症的治疗预后相关。高表达TGFβ的肿瘤往往有着较差的预后，需要优先考虑更为激进的疗法。因此TGFβ诊断有着重要的临床转化价值。
正电子发射型计算机断层显像技术(PET)作为目前用于临床诊断的高端分子成像设备，利用可以发射正电子的核素为示踪剂，可通过三维可视化的医学成像跟踪并定量研究靶点分子的表达与分布，对肿瘤的早期发现、生物学特征评估、治疗决策等临床应用有着确定的价值。
基于抗体与抗原特异性结合的免疫PET显像技术正在受到越来越多的重视，可用于TGFβ活体诊断。免疫PET抗体探针的研发主要包括三个方面：分子靶标的筛选、分子探针的设计与合成、以及成像质量研究。然而，尽管TGFβ是决定肿瘤放疗反应的关键因子，可用于TGFβ显像的PET核素探针还很稀缺。
因此，目前亟需一种TGFβ示踪剂，以检测TGFβ在肿瘤中的表达水平。
发明内容
为了解决上述问题本发明提供一种TGFβ示踪剂、抗体探针制备方法及应用，用于检测TGFβ在活体肿瘤组织及其他组织中的表达水平。
本发明第一方面提供了一种TGFβ示踪剂，通过生物正交反应-点击化学技术制备氟-18或镓-68标记的TGFβ抗体探针，所述TGFβ示踪剂包括：氟-18标记的[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针，或者，镓-68标记的[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针，所述TGFβ示踪剂用于PET/CT显像诊断TGFβ在肿瘤组织及其他病理或正常组织中的表达水平；
其中，表示TGFβ抗体。
本发明第二方面提供了一种抗体探针的制备方法，所述方法包括：
步骤1：在TGFβ抗体上修饰TCO-PEG4-NHS，得到TGFβ抗体-TCO；
步骤2：在四嗪小分子Tz上修饰NOTA，获得NOTA-Tz；
步骤3：将18F、AlCl3与NOTA-Tz反应获得[18F-AlF3]-NOTA-Tz，
或者，将68Ga、NaOAc与NOTA-Tz反应获得[68Ga]-NOTA-Tz，
步骤4：将TGFβ抗体-TCO和[18F-AlF3]-NOTA-Tz配体共孵育，发生生物正交反应，生成[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针；
或者，将TGFβ抗体-TCO和[68Ga]-NOTA-Tz配体共孵育，发生生物正交反应，生成[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针；
可选地，所述步骤1包括：
将TGFβ抗体溶于磷酸盐缓冲液中，得到第一溶液，用饱和碳酸钾溶液调节所述第一溶液的pH值至8.8-9.0；
向调节pH后的第一溶液中加入反式环辛烯-四聚乙二醇-活性脂的DMSO溶液，得到第二溶液，在室温下摇动孵育所述第二溶液30分钟；
使用PD-10脱盐柱对孵育后的第二溶液进行纯化，得到TGFβ抗体-TCO；
其中，所述反式环辛烯-四聚乙二醇-活性脂的DMSO溶液的浓度为10mg/mL。
可选地，所述步骤2包括：
利用盐酸酸化的乙酸乙酯脱去四嗪小分子Tz上叔丁氧羰基保护的氨基，并与NOTA双功能螯合剂混合加热，经过缩合脱水反应，得到NOTA-Tz。
可选地，所述步骤3包括：
获得18F-AlF3离子溶液，加入5-10nM预先制备的修饰双功能螯合剂的四嗪小分子配体NOTA-Tz，充分混匀后在100摄氏度反应15分钟；将产物吸附在C18柱上，再用水淋洗C18柱两次除去C18柱中残留的18F-AlF3离子；用50％的乙醇洗脱C18柱中产物到含10mL生理盐水的中转瓶中获得[18F-AlF3]-NOTA-Tz；
或者，获得68Ga离子溶液后，通过醋酸钠调节68Ga离子溶液的pH值至4，加入5-10nM预先制备的NOTA-Tz；充分混匀后在50摄氏度反应15分钟制得[68Ga]-NOTA-Tz粗制品；将产物吸附在C18柱上，再用水淋洗C18柱，除去C18柱中残留的68Ga离子；用50％的乙醇洗脱C18柱中产物到生理盐水中，经无菌滤膜过滤后得到镓-68核素标记的四嗪小分子配体[68Ga]-NOTA-Tz。
可选地，所述步骤4包括：
将[18F-AlF3]-NOTA-Tz或[68Ga]-NOTA-Tz与TGFβ抗体-TCO混匀后在室温下混匀反应20分钟；
反应完成后将标记混合物经PD-10脱盐柱纯化，通过生物正交-点击化学反应获得的最终产物[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针或[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针。
可选地，所述方法还包括：
取40微升所述抗体探针进样HPLC，采用乙腈水溶液作为流动相，通过C18半制备柱分析；
对比放射性检测仪的出峰时间，如抗体探针出峰时间与放射性检测仪出峰时间同时发生，确定抗体探针的氟-18离子或镓-68离子标记成功。
本发明第三方面提供了一种TGFβ示踪剂在制备PET/CT显像剂中的应用，所述TGFβ示踪剂包括：[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针及[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针，所述TGFβ示踪剂用于PET/CT显像诊断TGFβ在活体肿瘤组织或其他组织中的表达水平。
相关研究发现，肿瘤中TGFβ高表达导致高效的DNA损伤反应和浸润性肿瘤微环境，是肿瘤对放疗耐受的重要原因。因此，基于本发明提供的TGFβ示踪剂可以检测出TGFβ在肿瘤中的表达水平，从而可以基于此对肿瘤进行分类，得到个性化的治疗方案。
相关技术中，采用体外实验技术检测TGFβ在肿瘤中的表达或活性，如免疫荧光染色法、基因组测序技术、免疫印迹分析技术，但是，TGFβ是受肿瘤微环境影响较大的细胞因子，因此，体外实验结果对临床的参考价值不高，在活体动物模型中检测TGFβ是保证检测结果客观和准确的必要条件。基于本发明提供的TGFβ示踪剂可以利用PET分子影像技术在体内检测出TGFβ在肿瘤中的表达水平，因此，本发明提供TGFβ示踪剂，可以更好地服务临床应用。
相关技术中，多采用长半衰期核素如锆-89(半衰期78.4小时)，导致受试者辐射剂量较大。本发明实施例采用的镓-68(半衰期68分钟)和氟-18(半衰期110分钟)的半衰期均在2小时以内，大大减少了TGFβ抗体探针的辐射剂量，有利于向临床转化。
本发明实施例提供了一种靶向转化生长因子-β(TGFβ)的示踪剂，通过抗体标记正电子核素进行探针制备，并通过正电子发射型计算机断层显像(PET)技术进行活体分子检测。所述TGFβ示踪剂包括：[18F-AlF3/68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针，可用于PET/CT显像诊断TGFβ在肿瘤组织等病理或正常组织中的表达水平。
本发明实施例中，探针的载体是靶向人源或鼠源TGFβ的单克隆抗体，分子示踪的原理是生物正交化学-点击化学(四嗪(tetrazine，Tz)和反式环辛烯(TCO))反应。基于本发明提供的TGFβ示踪剂可以利用PET分子影像技术在体内检测出TGFβ在肿瘤等组织中的表达水平，具有制备工艺简单、特异性高、辐射剂量低、生物安全性及体内稳定性高等优势，因此，基于本发明提供的TGFβ示踪剂可以检测出TGFβ在活体肿瘤等组织中的表达水平，从而可以基于此对肿瘤进行分类，得到个性化的治疗方案，更好地服务于临床应用。
附图说明
图1示出了本发明实施例提供的抗体探针的制备路线及应用的示意图；
图2示出了本发明实施例提供的抗体探针的制备方法的流程示意图；
图3示出了本发明通过PET进行肿瘤TGFβ表达检测的示意图；
图4示出了[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针在小鼠模型中的成像质量示意图。
具体实施方式
放射通过激活细胞因子TGFβ调控一系列信号通路，进而影响癌细胞转移、免疫细胞浸润、DNA损伤反应等重要癌症生物学特征。因此肿瘤微环境中TGFβ表达水平深刻影响癌症的放疗反应及预后。相关技术中，通常采用多种体外实验技术检测TGFβ的表达或活性，如免疫荧光染色法、基因组测序技术、免疫印迹分析技术等。
然而这些方法需要通过一系列复杂的流程处理样本，然后进行相关信号的检测，多用于肿瘤生物学研究。这些体外实验技术一方面缺少临床使用价值，另一方面也缺少研究TGFβ活体分布及动态追踪的科研价值。
基于此，本发明提出以下技术构思：制备一种TGFβ示踪剂，用于在体内，通过PET/CT显像诊断TGFβ在肿瘤中的表达水平。
基于该发明构思，本发明实施例提出了一种TGFβ示踪剂，所述TGFβ示踪剂包括：[18F-AlF3/68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针，所述TGFβ示踪剂用于PET/CT显像诊断TGFβ在肿瘤中的表达水平；
其中，表示TGFβ抗体。
基于该发明构思，本发明实施例还提供了一种抗体探针的制备路线及应用，如图1所示，图1示出了本发明实施例提供的抗体探针的制备路线及应用示意图，具体地，本发明实施例中，基于点击化学反应，得到抗体探针，其中，点击化学底物1为：TGFβ抗体-TCO，可以在生物体内结合TGFβ，点击化学底物2为：[18F-AlF3]-NOTA-Tz或者[68Ga]-NOTA-Tz。从而可以分别得到产物1：[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针，产物2：[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针。这两种抗体探针均可以作为TGFβ示踪剂用于PET/CT显像诊断TGFβ在肿瘤等疾病组织或正常组织中的表达水平。
本发明实施例还提供了一种抗体探针的制备方法，如图2所示，图1示出了本发明实施例提供的抗体探针的制备方法的流程示意图，所述方法包括：
步骤1：在TGFβ抗体上修饰TCO-PEG4-NHS，得到TGFβ抗体-TCO。
具体地，本发明实施例中，所述步骤1包括：
S11，将TGFβ抗体溶于磷酸盐缓冲液中，得到第一溶液，用饱和碳酸钾溶液调节所述第一溶液的pH值至8.8-9.0。
S12，向调节pH后的第一溶液中加入反式环辛烯-四聚乙二醇-活性脂的DMSO溶液，得到第二溶液，在室温下摇动孵育所述第二溶液30分钟；其中，所述反式环辛烯-四聚乙二醇-活性脂的DMSO溶液的浓度为10mg/mL。
S13使用PD-10脱盐柱对孵育后的第二溶液进行纯化，得到TGFβ抗体-TCO。
本发明实施例中，TGFβ抗体(R&D Systems，#MAB1835，IgG1 mAb，Clone#1D11)能够结合肿瘤微环境中的TGFβ细胞因子。本发明实施例中，在TGFβ抗体上修饰TCO-PEG4-NHS，得到TGFβ抗体-TCO，从而TGFβ抗体-TCO可以结合核素载体分子。
步骤2：在四嗪小分子Tz上修饰NOTA，获得NOTA-Tz。
具体地，本发明实施例中，所述步骤2包括：
利用盐酸酸化的乙酸乙酯脱去四嗪小分子Tz上叔丁氧羰基保护的氨基，并与NOTA双功能螯合剂混合加热，经过缩合脱水反应，得到NOTA-Tz。
步骤3：将18F、AlCl3与NOTA-Tz反应获得[18F-AlF3]-NOTA-Tz，
或者，将68Ga、NaOAc与NOTA-Tz反应获得[68Ga]-NOTA-Tz；
具体地，本发明实施例中，所述步骤3包括：
获得18F-AlF3离子溶液，加入5-10nM预先制备的修饰双功能螯合剂的四嗪小分子配体NOTA-Tz，充分混匀后在100摄氏度反应15分钟；将产物吸附在C18柱上，再用水淋洗C18柱两次除去C18柱中残留的18F-AlF3离子；用50％的乙醇洗脱C18柱中产物到含10mL生理盐水的中转瓶中获得[18F-AlF3]-NOTA-Tz。
或者，获得68Ga离子溶液后，通过醋酸钠调节68Ga离子溶液的pH值至4，加入5-10nM预先制备的NOTA-Tz；充分混匀后在50摄氏度反应15分钟制得[68Ga]-NOTA-Tz粗制品；将产物吸附在C18柱上，再用水淋洗C18柱，除去C18柱中残留的68Ga离子；用50％的乙醇洗脱C18柱中产物到生理盐水中，经无菌滤膜过滤后得到镓-68核素标记的四嗪小分子配体[68Ga]-NOTA-Tz。
本发明实施例中，铝离子的物理化学性质和配位化学，使其与聚氨基羧酸盐形成异常强的Al-F键，因此铝螯合物具备较高的热力学稳定和动力学惰性，在体内环境中稳定，适合抗体分子探针的制备。
本发明实施例中，双功能螯合剂NOTA的空腔尺寸与放射性核素镓-68及[18F-AlF3]的铝离子半径相容，从而获得高热力学稳定性和动力学惰性的抗体探针，因此本发明可选择性标记镓-68或[18F-AlF3]进行探针制备和显像。
本发明实施例中，选用氟-18核素载体分子，具有生物相容性好、成像质量高、易获得和易标记等优点。
步骤4：将TGFβ抗体-TCO和[18F-AlF3]-NOTA-Tz配体共孵育，发生生物正交反应，生成[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针；
或者，将TGFβ抗体-TCO和[68Ga]-NOTA-Tz配体共孵育，发生生物正交反应，生成[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针；
具体地，本发明实施例中，所述步骤4包括：
S41，将[18F-AlF3]-NOTA-Tz或[68Ga]-NOTA-Tz与TGFβ抗体-TCO混匀后在室温下混匀反应20分钟。
S42，反应完成后将标记混合物经PD-10脱盐柱纯化，通过生物正交-点击化学反应获得的最终产物[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针或[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针。
本发明实施例中，通过标记核素的载体分子[18F-AlF3]-NOTA-Tz或[68Ga]-NOTA-Tz与TGFβ抗体-TCO进行点击化学-生物正交反应形成[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针或者[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针。
本发明实施例得到的抗体探针可以在体内结合肿瘤微环境中TGFβ细胞因子，并通过标记核素在PET/CT显像中显示PET探针信号，从而，利用本发明实施例提供的制备方法制备得到的[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针或者[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针可以作为TGFβ示踪剂，用于PET/CT显像诊断TGFβ在肿瘤中的表达水平。
本发明实施例中，在制备得到[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针或者[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针之后，还可以对氟-18离子或镓-68离子标记情况进行检测，具体包括：
S51，取40微升所述抗体探针进样HPLC，采用乙腈水溶液作为流动相，通过C18半制备柱分析；
S52，对比放射性检测仪的出峰时间，在抗体探针出峰时间与放射性检测仪出峰时间同时发生的情况下，确定抗体探针的氟-18离子或镓-68离子标记成功。
本发明实施例中，制备得到的抗体探针通过连接放射性检测模块的HPLC进行分析和纯化。
本发明实施例中，采用预靶向技术，可以在免疫PET显像检测过程中，提高探针在靶点部位的聚集浓度，增加靶点特异性信号水平，降低非特异性信号对显像的干扰。基于生物正交反应的Diels-Alder“点击化学”反应有着较好的灵敏度、特异性及体内相容性。
本发明实施例中，[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ或者[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针抗体探针在体内的代谢较慢，因此可以在数天内跟踪观察抗体的分布，从而，在氟-18或镓-68标记Tz后可在多个时间点检测TGFβ的表达和分布的变化。
基于该发明构思，本发明实施例还提供了一种TGFβ示踪剂在制备PET/CT显像剂中的应用，所述TGFβ示踪剂包括：[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针或[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针，所述TGFβ示踪剂用于PET/CT显像诊断TGFβ在肿瘤中的表达水平。
本发明实施例中，TGFβ示踪剂可用于制备PET/CT显像剂，从而实现在体内检测TGFβ在肿瘤中的表达水平，进而作为肿瘤分类及确定治疗方案的参考指标。
为使本领域技术人员更好地理解本发明，以下通过多个具体的实施例来说明本发明提供的TGFβ示踪剂、抗体探针制备方法及应用。
实施例1制备实施例：
本发明实施例中，[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针的合成路径分为四步：
1)取500μl共500μg的TGFβ抗体(R&D Systems，#MAB1835，IgG1mAb，Clone#1D11)溶于2ml的磷酸盐缓冲液中，然后用饱和碳酸钾溶液将溶液的pH值调为8.8-9.0；按照10mg/mL的终浓度计算，加入适量反式环辛烯-四聚乙二醇-活性脂(TCO-PEG4-NHS)的DMSO溶液；在室温下将上述混合液轻轻摇动孵育20分钟；使用PD-10脱盐柱纯化后，获得715μl的TCO-TGFβ单克隆抗体；使用NanoDrop测定TGFβ抗体-TCO的浓度为0.5mg/ml；产物分装并置于4摄氏度冰箱备用。
2)称量1克4-(1,2,4,5-四嗪-3)叔丁基苄基甲酸酯(Tz-Boc)；利用1M盐酸酸化的乙酸乙酯(EA)脱去叔丁氧羰基(Boc)保护的氨基；加入5μM双功能螯合剂NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid)，在75℃加热2分钟脱水进行缩合反应生成NOTA-Tz；通过质谱分析，NOTA-Tz分子量为557.61，与理论分子量一致。
3)取10mCi的18F-AlF3溶液，利用2mol/L的盐酸调pH值至4，加入10nM预先制备的NOTA-Tz；溶解混匀后混合物在100℃反应15分钟，制得氟-18核素标记的四嗪小分子配体粗制品；将产物吸附在C18柱上，再用纯水淋洗C18柱两次，每次20mL，除去C18柱中残留的18F-AlF3离子；用2mL的50％的乙醇洗脱C18柱中的产物，至2mL生理盐水中，经无菌滤膜过滤后得到4.3mCi的[18F-AlF3]-NOTA-Tz。
4)按照1:1的配比，将[18F-AlF3]-NOTA-Tz和TGFβ抗体-TCO溶液持续振荡混匀，在室温下反应20min后经PD-10脱盐柱纯化，通过点击化学-生物正交反应获得2.3mCi的[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针。
通过薄层色谱法和高效液相色谱法开展[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针的质控测试。
薄层色谱法：在层析硅胶板上点样2μL的[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针溶液，流动相采用0.1M柠檬酸钠溶液(pH＝5)，通过放射性薄层色谱仪(Eckert&Ziegler)测定探针的放射化学纯度>95％。
高效液相色谱法：使用连接放射性检测模块和紫外检测器的高效液相色谱仪(安捷伦1260)；采用0.1M磷酸盐-0.1M硫酸钠作为流动相，用流动相将抗体稀释至0.3mg/mL，进样10μL至高效液相色谱仪；采用TSKgel G3000SWXL色谱分析柱(7.8mm×30cm，5μm)进行样品成分分析，柱温25℃，流速1.0mL/min，等度洗脱20min；对照抗体出峰时间为7.5分钟，[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体出峰时间为7.8分钟；放射性检测仪出峰时间与抗体探针出峰时间同时发生，确定抗体探针标记成功；通过峰面积计算，抗体探针的放射化学纯度>95％。
实施例2应用实施例：
如图3所示，[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针的使用流程为小鼠肿瘤模型的活体检测；通过BALB/c裸鼠制备头颈癌皮下移植瘤模型，包括通过基因调控技术制备的TGFβ高表达或低表达肿瘤；待肿瘤长大至0.5cm时注射TGFβ抗体-TCO；24-48小时后抗体聚集在肿瘤分子靶点上，而未结合的抗体得到部分清除；注射200μCi的[18F-AlF3]-NOTA-Tz配体，在体内与TGFβ抗体-TCO发生生物正交反应；2小时后未发生生物正交反应得[18F-AlF3]-NOTA-Tz配体被清除，然后进行PET/CT显像。该实验中，小鼠模型分为3组；无抗体对照组没有注射TGFβ抗体-TCO，只注射了[18F-AlF3]-NOTA-Tz；TGFβ低表达和高表达组注射了TGFβ抗体-TCO和[18F-AlF3]-NOTA-Tz配体。图4所示，A是三组小鼠肿瘤模型的横切面PET/CT显像结果；B是三组小鼠肿瘤模型的纵向PET/CT显像结果；圆形白线区域为肿瘤部位，通过Amide软件进行探针信号定量和组织分布分析。如图所示，当未注射TCO-TGFβ时，单独注射[18F-AlF3]-NOTA-Tz后肿瘤部位无显像；当肿瘤高表达TGFβ时，PET显像时肿瘤部位有着较高的信号。
本发明通过以上实施例确认[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针可以通过PET/CT成像技术检测活体小鼠肿瘤组织中TGFβ分子的表达。
对于方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。
以上对本发明所提供的一种TGFβ示踪剂、抗体探针制备方法及应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (8)
1.一种TGFβ示踪剂，其特征在于，通过生物正交反应-点击化学技术制备氟-18或镓-68标记的TGFβ抗体探针，所述TGFβ示踪剂包括：[18F-AlF3/68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针，所述TGFβ示踪剂用于PET/CT显像诊断TGFβ在肿瘤疾病组织或正常组织中的表达水平；
其中，表示TGFβ抗体。
2.一种抗体探针的制备方法，其特征在于，所述抗体探针为权利要求1所述的[18F-AlF3/68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针，所述方法包括：
步骤1：在TGFβ抗体上修饰TCO-PEG4-NHS，得到TGFβ抗体-TCO；
步骤2：在四嗪小分子Tz上修饰NOTA，获得NOTA-Tz；
步骤3：将18F、AlCl3与NOTA-Tz反应获得[18F-AlF3]-NOTA-Tz，
或者，将68Ga、NaOAc与NOTA-Tz反应获得[68Ga]-NOTA-Tz；
步骤4：将TGFβ抗体-TCO和[18F-AlF3]-NOTA-Tz配体共孵育，发生生物正交反应，生成[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针；
或者，将TGFβ抗体-TCO和[68Ga]-NOTA-Tz配体共孵育，发生生物正交反应，生成[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针；
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1包括：
将TGFβ抗体溶于磷酸盐缓冲液中，得到第一溶液，用饱和碳酸钾溶液调节所述第一溶液的pH值至8.8-9.0；
向调节pH后的第一溶液中加入反式环辛烯-四聚乙二醇-活性脂的DMSO溶液，得到第二溶液，在室温下摇动孵育所述第二溶液30分钟；
使用PD-10脱盐柱对孵育后的第二溶液进行纯化，得到TGFβ抗体-TCO；
其中，所述反式环辛烯-四聚乙二醇-活性脂的DMSO溶液的浓度为10mg/mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2包括：
利用盐酸酸化的乙酸乙酯脱去四嗪小分子Tz上叔丁氧羰基保护的氨基，并与NOTA双功能螯合剂混合加热，经过缩合脱水反应，得到NOTA-Tz。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3包括：
获得18F-AlF3离子溶液，加入5-10nM预先制备的修饰双功能螯合剂的四嗪小分子配体NOTA-Tz，充分混匀后在100摄氏度反应15分钟；将产物吸附在C18柱上，再用水淋洗C18柱两次除去C18柱中残留的18F-AlF3离子；用50％的乙醇洗脱C18柱中产物到含10mL生理盐水的中转瓶中获得[18F-AlF3]-NOTA-Tz；
或者，获得68Ga离子溶液后，通过醋酸钠调节68Ga离子溶液的pH值至4，加入5-10nM预先制备的NOTA-Tz；充分混匀后在50摄氏度反应15分钟制得[68Ga]-NOTA-Tz粗制品；将产物吸附在C18柱上，再用水淋洗C18柱，除去C18柱中残留的68Ga离子；用50％的乙醇洗脱C18柱中产物到生理盐水中，经无菌滤膜过滤后得到镓-68核素标记的四嗪小分子配体[68Ga]-NOTA-Tz。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4包括：
将[18F-AlF3]-NOTA-Tz或[68Ga]-NOTA-Tz与TGFβ抗体-TCO混匀后在室温下混匀反应20分钟；
反应完成后将标记混合物经PD-10脱盐柱纯化，通过生物正交-点击化学反应获得的最终产物[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针或[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针。
7.根据权利要求2-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：
取40微升所述抗体探针进样HPLC，采用乙腈水溶液作为流动相，通过C18半制备柱分析；
对比放射性检测仪的出峰时间，在抗体探针出峰时间与放射性检测仪出峰时间同时发生的情况下，确定抗体探针的氟-18离子或镓-68离子标记成功。
8.一种TGFβ示踪剂在制备PET/CT显像剂中的应用，其特征在于，所述TGFβ示踪剂包括：[18F-AlF3]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针或[68Ga]-NOTA-Tz-TCO-TGFβ抗体探针，所述TGFβ示踪剂用于PET/CT显像诊断TGFβ在肿瘤等疾病组织或正常组织中的表达水平。
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