CN115282150A - 防己诺林碱在制备抗心力衰竭药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药技术领域，具体涉及防己诺林碱在制备抗心力衰竭药物中的应用，防己诺林碱的制备是利用溶剂对防己回流提取、吸附柱分离、收集35‑60％乙醇洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，经液相色谱分离得到防己诺林碱，作为活性成分对心肌细胞肥大具有较显著的抑制作用，并能缓解心肌纤维化、改善射血分数和左室短轴缩短率、提高心输出量，在制备治疗心力衰竭药物方面具有一定的开发潜力。

Description

防己诺林碱在制备抗心力衰竭药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药技术领域，具体涉及防己诺林碱在制备抗心力衰竭药物中的应用。

背景技术

心力衰竭(Heart failure)是许多心血管疾病发生发展的一个终末阶段。机体在受到外界刺激时，心脏激活自身代偿机制，表现为室壁压力增加、心肌收缩增强、心腔扩张和心肌适应性肥大。起初心肌肥大是有益的适应性代偿反应，能够适当延缓心功能的降低，但长期持续性心肌肥大会引起失代偿反应。心脏一旦触发失代偿，就会造成心肌细胞缺血，心肌组织营养障碍，继而使纤维组织增生而发生心肌纤维化，诱使心脏结构改变及心功能紊乱，形成不可逆的心室重构，最终导致心力衰竭。因此，改善心肌细胞肥大、缓解心肌纤维化、改善射血分数和左室短轴缩短率、提高心输出量对于延缓心室重构引发的心力衰竭恶化有重要作用。

临床上，常规治疗药物主要包括利尿剂、ACE抑制剂、β受体阻滞剂、洋地黄类强心剂等。这些药物大多针对单一靶点起效，长期服用还存在多种副作用。中药治疗具有毒副作用小，不良反应少等独特的优势，故在中药领域中研究筛选发现抗心力衰竭作用的药效物质对预防心衰和改善心衰症状具有重大的现实意义与临床参考价值。

防己始载于《神农本草经》，为防己科千金藤属植物粉防己(Stephania tetrandraS.Moore)的干燥根，味苦，性寒，归膀胱、肺经，具有祛风止痛、利水消肿之功效。现代药理研究表明防己及其主要成分具有抗炎、抗肿瘤、降血压、抗心肌损伤等药理活性。

如CN110179859A中公开了防己提取物及防己诺林碱用作乙酰胆碱酯酶抑制剂的组分，乙酰胆碱酯酶抑制剂用于制备防治阿尔茨海默症的药物，为预防和治疗阿尔茨海默症提供了新的药物候选来源，在提高阿尔茨海默症临床治疗效果、降低药物毒副作用等方面具有重要意义。

CN112138011A公开了防己诺林碱在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的应用，其中防己诺林碱是作为唯一的活性成分用于制备所述防治溃疡性结肠炎的药物，可用于制备防治溃疡性结肠炎的药物。

目前，作为防己中主要生物碱之一的防己诺林碱，关于其抗心力衰竭的药理作用及机制尚无明确的相关报道。

发明内容

本发明目的在于研究防己在抗心力衰竭方面的效力，提供一种防己中主要生物碱—防己诺林碱，在制备抗心力衰竭药物中的应用，可为心力衰竭相关疾病提供一种全新的治疗手段或方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

防己诺林碱在制备抗心力衰竭药物中的应用，本发明首先公开了防己诺林碱在抗心力衰竭中的应用，通过减小原代心肌细胞相对面积，缓解心肌纤维化、改善射血分数和左室短轴缩短率、提高心输出量等途径发挥其抗心力衰竭作用，因此可将其应用于治疗心力衰竭药物中的制备。

所述的防己诺林碱在制备抗心力衰竭药物中的应用中，防己诺林碱的制备包括步骤：

步骤1，利用溶剂对防己回流提取，过滤收集滤液，去除溶剂得到防己提取浓缩液；

步骤2，将防己提取浓缩液经大孔吸附树脂柱分离，依次用水、15-25％乙醇、35-60％乙醇和90-100％乙醇洗脱，收集35-60％乙醇洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，经液相色谱分离得到所述防己诺林碱。

本发明中从防己中提取防己诺林碱，所述防己回流提取前粉碎，采用水或乙醇进行回流提取，乙醇可为任意浓度；在提取的过程中，为了将防己诺林碱充分提取出来，回流提取的次数为1-3次，每次1-2h。所述回流提取的次数优选为2次，每次1h。

优选地，步骤2中，本发明将上述提取得到的浓缩物继续进行后续的分离，先将提取浓缩液混悬于水中，去除不溶物，得大孔吸附树脂上样液，防己提取浓缩液经大孔吸附树脂柱分离时依次用水、18～22％乙醇、35～45％乙醇和90～95％乙醇洗脱，收集35～45％乙醇洗脱液。

本发明中的乙醇浓度均指体积分数，如18-22％乙醇表示体积分数为18-22％的乙醇。

进一步优选，所述的大孔吸附树脂上样液和洗脱液的流速优选为0.5～3BV/h(柱体积/小时)，所述洗脱液的用量优选为2～6BV(柱体积)。

本发明将大孔吸附树脂收集得到的洗脱液浓缩并干燥，最后利用制备液相色谱分离收集24.5min的色谱峰，减压回收溶剂得防己诺林碱。

为了进一步保证最终收集的防己诺林碱的含量和纯度，所述的制备液相色谱分离的条件优选为：色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18柱(250×21.2mm,7μm)；流动相：A相为水，B相为乙腈；

线性洗脱梯度：0min，5％B；35min，60％B；40min，100％B；45min，100％B；流速：8mL/min；柱温：30℃。

所述心力衰竭主要临床表现包括心肌肥大、心肌纤维化、射血分数下降、左室短轴缩短率下降、心输出量下降等。

所述防己诺林碱制备适用于临床的药物剂型。所述药物剂型包括片剂、口服液、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、缓控释剂中任一种。

本发明还提供一种药物，其配方中活性成分包括防己诺林碱。

所述药物具有如下功能中的至少一种：

(1)预防和/或治疗心力衰竭；

(2)预防和/或治疗心肌肥大；

(3)减小肥大心肌细胞相对面积；

(4)减少或缓解心肌纤维化；

(5)改善心输出量；

(6)改善心脏射血分数；

(7)改善左室短轴缩短率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明首次提出防己诺林碱在预防和/或治疗心力衰竭相关疾病中的应用，防己诺林碱作为活性成分对心肌细胞肥大具有较显著的抑制作用，并能缓解心肌纤维化、改善射血分数和左室短轴缩短率、提高心输出量，在制备治疗心力衰竭药物方面具有一定的开发潜力。

(2)本发明的防己诺林碱提取方法简单，原料防己为中药材中的常见药材，来源广泛、安全低毒，作为制备抗心力衰竭药物的一种新原料，其使用剂量小，疗效显著，毒副作用小。因此，防己诺林碱在制备治疗心力衰竭药物中具有潜在的医用价值和良好的社会效益。

附图说明

图1为应用例1中对照组、模型组、防己诺林碱组、汉防己碱组、异紫堇定碱组的原代乳鼠心肌细胞的相对面积占比。

图2为应用例2中对照组、模型组、防己诺林碱组小鼠左心室心功能参数。(^***P<0.001vs Control,^****P<0.0001vs Control,^#P<0.05vs Model,^##P<0.01vs Model,^####P<0.0001vs Model,n＝10)

图3为应用例2中对照组、模型组、防己诺林碱组小鼠心肌组织胶原纤维沉积百分比。(^##P<0.01vs Control,^**P<0.01vs Model,n＝3)

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。

以下具体实施方式中所采用的原料均购于市场。

实施例1防己诺林碱的提取制备

将原料防己粉碎后，用水回流提取2次，每次1小时，滤去药渣，合并滤液，浓缩得防己提取浓缩液；

将提取浓缩液混悬在水中后，以2BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱；用4BV的水以2BV/h的流速冲洗；用4BV的20％(体积分数)乙醇以2BV/h的流速冲洗；用4BV的40％乙醇以2BV/h的流速冲洗；用4BV的95％乙醇以2BV/h的流速冲洗；收集40％乙醇洗脱液浓缩并干燥，再利用制备液相色谱分离收集24.5min的色谱峰，减压回收溶剂得到纯度大于95％的防己诺林碱。

其中，制备液相色谱分离条件为：

仪器：Agilent 1200制备液相色谱仪配以DAD检测器。

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C₁₈柱(250×21.2mm,7μm)。

流动相：A相为水；B相为乙腈。

线性洗脱梯度：0min，5％B；35min，60％B；40min，100％B；45min，100％B；流速：8mL/min；柱温：30℃。

实施例2原代乳鼠心肌细胞(CMs)的提取与培养

取新生SD乳鼠经75％酒精消毒后，开胸，剪取心脏置于装有含1％双抗的PBS培养皿内，多次清洗除去血液并剪去血管等多余组织。剪取心尖部位至空培养皿内，每10只乳鼠心脏为一批。剪碎心脏组织至1mm³大小，加入少许含有1％双抗的PBS，将心脏组织小块转移至50mL离心管，稍静置后尽可能吸去PBS。向含心脏组织小块的50mL离心管中加入2.5mL混匀后的消化液，将离心管置于37℃摇床，200rpm振荡45min，平均每15min用弯管吹打多次混匀。消化至无明显组织块后，加入等量中和液终止消化，混匀后经70μm滤网过滤，并用适量中和液冲洗滤网，收集含有细胞的滤液于50mL离心管内。将含有滤液的离心管置于4℃，600g离心5min，弃上清。在细胞沉淀中加入高糖DMEM完全培养液重悬细胞，混匀后接种于75cm²培养瓶内。置于培养箱内差速贴壁30min后，成纤维细胞贴壁于培养瓶内，未贴壁的细胞悬液即为心肌细胞悬液。吸取培养瓶内心肌细胞悬液于离心管内，加入0.1％Brdu(0.1mM)抑制成纤维细胞生长，种板后置于恒温培养箱内孵育至心肌细胞贴壁并有自发性搏动，用于后续实验。为了使细胞更稳定的贴壁，在种板前用0.5％明胶均匀预铺于各孔板底部，于37℃培养箱内孵育1h后吸弃明胶，用于细胞铺板。

应用例1防己诺林碱对肥大的心肌细胞的影响

将原代心肌细胞以5000个/孔密度接种于96孔黑板中间60孔，其余孔内加入100μLPBS，避免边缘效应。96孔黑板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱内孵育48h。取出96孔黑板，弃去培养液，每孔加入100μL含0.1％Brdu的高糖DMEM培养基，同步化培养24h，吸尽培养基后备用。

实验设立对照组、模型组、防己诺林碱组、汉防己碱组、异紫堇定碱组，其中模型组加入含100μM去氧肾上腺素(PE)的高糖DMEM培养基，防己诺林碱组加入含100μM PE和1μM防己诺林碱的高糖DMEM培养基，汉防己碱组加入含100μM PE和1μM汉防己碱的高糖DMEM培养基，异紫堇定碱组加入含100μM PE和5μM异紫堇定碱的高糖DMEM培养基，处理后将孔板置于细胞培养箱内孵育48h。

取出96孔黑板，吸去培养液，加入PBS漂洗3遍，5min/次。每孔加入100μL多聚甲醛，室温固定20min。吸去多聚甲醛，加入PBS漂洗3遍，5min/次。室温避光条件下，每孔加入50μL鬼笔环肽(Alexa Fluor 488 Phalloidin-FITC)标记心肌细胞肌动蛋白F-actin(1:20)，孵育30min。回收吸净鬼笔环肽后，每孔加入50μL Hoechst(1:10000)标记细胞核，孵育15min，吸弃Hoechst后加入PBS漂洗3遍，10min/次。每孔加入适量PBS保持细胞滋润。将96孔黑板置于Image

Pico个人型高内涵成像分析系统进行荧光图像自动采集，采用该系统CellReporter

软件对图片进行自动化分析，统计心肌细胞面积。

如图1所示，相对于模型组，防己诺林碱组中心肌细胞相对面积降低了37.90％，汉防己碱组中心肌细胞相对面积降低了25.76％；异紫堇定碱组中心肌细胞相对面积降低了6.89％。

从结果中可以看出，相比于汉防己碱、异紫堇定碱，防己诺林碱显著能够减小心肌细胞面积，具有优异的防治效果。

应用例2防己诺林碱对ISO致小鼠心力衰竭的保护作用

1、ISO致小鼠心力衰竭模型的建立及给药方法

通过超声心动图结果筛选心功能正常(EF％＞45)的C57/BL6小鼠，随机分为对照组(Control组)、模型组(Model组)和防己诺林碱组(FJNLJ组)，每组10只。Model组和FJNLJ组连续皮下注射ISO(5mg/kg/d)3周构建心力衰竭模型，Control组皮下注射同等体积的0.9％氯化钠注射液。在注射ISO的同时FJNLJ组灌胃给予由纯净水配制的防己诺林碱混悬液(19.4g/kg/d)，灌胃体积为0.2mL/10g，对照组及模型组灌胃给与同等体积纯净水，连续灌胃3周。给药结束后所有小鼠进行超声心动图检测。

2、超声心动图检测与数据采集

小鼠剔除左胸部位鼠毛，吸入异氟烷麻醉后固定于超声检测台，于左侧心脏部位涂抹适量医用超声耦合剂，应用Vevo2100超高分辨小动物超声影像系统采集心超图像。使用高频矩阵探头与小鼠胸骨约呈75度角，超声影像显示心脏沿二尖瓣至心尖方向的左室长轴图像，截取垂直于左室长轴的左室短轴图像，从中随机选取3个连续心动周期计算平均值，测量各个心功能参数。造模与给药结束后进行超声心动图检测与数据采集，分析给药前后动物心功能变化。

3、动物取材

实验结束后，每组小鼠称重并记录，腹腔注射15mg/mL戊巴比妥钠进行麻醉(0.7mL/100g)。取3只小鼠心脏用于病理组织切片的观察，先用0.9％氯化钠的冲洗，再用4％多聚甲醛灌流，然后剪取小鼠心脏，去除心脏表面血管及多余组织，置于4％多聚甲醛溶液中固定。

4、心脏组织病理学

采用苏木素伊红(H.E)染色观察小鼠心肌组织病理形态改变；采用Masson染色观察心肌组织中胶原纤维沉积情况。

(1)组织脱水

将用4％多聚甲醛固定过的心脏组织放于脱水机内，用不同浓度乙醇依次进行梯度脱水，具体步骤如下：75％乙醇4h-85％乙醇2h-90％乙醇2h-95％乙醇1h-无水乙醇I30min-无水乙醇II 30min-醇苯10min-二甲苯I10min-二甲苯II 10min-蜡I1h-蜡II 1h-蜡III 1h。

(2)组织包埋

首先将融化的蜡填充包埋框，待蜡凝固之前将脱水后的心肌组织放入包埋框内，置于-20°冰箱冷却凝固。

(3)切片

对包埋的石蜡块进行切片，厚4μm/片。切片展平漂浮于40℃温水后平铺于载玻片，置于60℃烘箱内烤片烘干。

(4)脱蜡至水

将烘干的切片依次放入不同浓度乙醇中进行梯度脱蜡：二甲苯I 20min-二甲苯II20min-无水乙醇I10min-无水乙醇II 10min-95％乙醇5min-90％乙醇5min-80％乙醇5min-70％乙醇5min-蒸馏水洗脱。

4.1H.E染色

(1)苏木素染细胞核

脱蜡后将切片浸入Harris苏木素染料中，染色10min，蒸馏水漂洗，1％盐酸酒精分化10秒，蒸馏水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。

(2)伊红染细胞质

脱蜡后将切片浸入伊红染液中染色5min，蒸馏水漂洗。

(3)脱水封片

将染色后的切片依次浸入95％乙醇I 5min-95％乙醇II 5min-无水乙醇I5min-无水乙醇II 5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯II 5min中脱水至透明，取出晾干后用中性树胶封片至载玻片上。

4.2Masson染色

(1)染色

脱蜡后将切片浸润于重铬酸钾溶液中过夜，蒸馏水漂洗。切片浸入铁苏木素A、B混合液中染色3min，蒸馏水漂洗，1％盐酸酒精分化后再次蒸馏水漂洗，0.6％氨水返蓝后流水冲洗。切片浸入丽春红酸性品红溶液中染色10min，蒸馏水漂洗。再将切片于磷钼酸水溶液中浸染1-3min，后浸入苯胺蓝染液中染色3-6min。

(2)分化封片

将染色后的切片用1％冰醋酸分化，依次用两皿无水乙醇脱水，至第三皿无水乙醇中浸泡5min，二甲苯透明5min，用中性树胶封片至载玻片上。

4.3病理切片图像采集与分析

染色结束后，在显微镜下观察病理切片，每张切片分别随机选取3个视野进行拍照(H.E染色：200x；Masson染色：200x)，采用Image J软件进行图像处理分析。

5.防己诺林碱对心衰小鼠心功能的影响

防己诺林碱对心衰小鼠心功能的影响情况如图2所示，超声心动图结果表明Model组小鼠射血分数(EF)、心输出量(CO)、左室短轴缩短率(FS)与Control组相比均显著降低，防己诺林碱给药后小鼠EF、CO、FS与Model组相比显著升高；与Control组相比，Model组收缩末期左心室内径(LVID；s)及收缩末期左心室容积(LV Vol；s)明显增大，防己诺林碱给药后均显著减小，表明防己诺林碱能明显改善ISO所致心力衰竭小鼠的心功能水平。

6防己诺林碱对心衰小鼠心脏组织病理学的影响

如图3所示，HE染色结果显示，Model组心肌细胞排列紊乱，心肌细胞间隙扩大，局灶性炎细胞浸润，基质增生；给予防己诺林碱干预后心肌病变明显减轻。Masson染色结果显示，Model组小鼠心肌组织内胶原纤维明显增生，给予防己诺林碱后胶原纤维沉积明显减少。表明防己诺林碱可改善心力衰竭小鼠心肌纤维化程度，达到抗心力衰竭的作用。

Claims (9)

1.防己诺林碱在制备抗心力衰竭药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的防己诺林碱在制备抗心力衰竭药物中的应用，其特征在于，所述防己诺林碱的制备包括步骤：

步骤1，利用溶剂对防己回流提取，过滤收集滤液，去除溶剂得到防己提取浓缩液；

步骤2，将防己提取浓缩液经大孔吸附树脂柱分离，依次用水、15-25％乙醇、35-60％乙醇和90-100％乙醇洗脱，收集35-60％乙醇洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，经液相色谱分离得到所述防己诺林碱。

3.根据权利要求2所述的防己诺林碱在制备抗心肌肥大心力衰竭药物中的应用，其特征在于，所述防己回流提取前粉碎，采用水或乙醇进行回流提取；回流提取的次数为1-3次，每次1-2h。

4.根据权利要求2所述的防己诺林碱在制备抗心力衰竭药物中的应用，其特征在于，步骤2中，防己提取浓缩液经大孔吸附树脂柱分离时依次用水、18-22％乙醇、35-45％乙醇和90-95％乙醇洗脱，收集35-45％乙醇洗脱液。

5.根据权利要求1所述的防己诺林碱在制备抗心力衰竭药物中的应用，其特征在于，所述心力衰竭包括心肌肥大、心肌纤维化、射血分数下降、左室短轴缩短率下降、心输出量下降中任一种情况。

6.根据权利要求1所述的防己诺林碱在制备抗心力衰竭药物中的应用，其特征在于，所述防己诺林碱制备成适用于临床的药物剂型。

7.根据权利要求1所述的防己诺林碱在制备抗心力衰竭药物中的应用，其特征在于，所述药物剂型包括片剂、口服液、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、缓控释剂中任一种。

8.一种药物，其特征在于，其活性成分包括防己诺林碱。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物具有如下功能中的至少一种：

(1)预防和/或治疗心力衰竭；

(2)预防和/或治疗心肌肥大；

(3)减小肥大的心肌细胞相对面积；

(4)减少或缓解心肌纤维化；

(5)改善心输出量；

(6)改善心脏射血分数；

(7)改善左室短轴缩短率。

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