CN115281146B - 一种鸡湿热下利证模型的构建方法 - Google Patents

一种鸡湿热下利证模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡湿热下利证模型的构建方法，将大肠埃希菌菌株CVCC1558的培养液，经泄殖腔注入SPF鸡直肠，正常饲养，可构建出鸡湿热下利证模型，模型构建成功的判断标准为：模型鸡腹泻可达7天以上，粪便色黄而臭秽，排便频繁，有努责表现，发热；剖检，肠内容物稀薄，色黄，整个肠道粘膜出现卡他性或出血性肠炎，无大肠埃希菌全身感染所致肝周炎、心包炎、腹膜炎、气囊炎的病理变化。该方法简单、快速，构建的病证模型完全符合中兽医湿热下利证的病机和证候特征，临床症状明显，剖检特征典型，病程时间长，模型稳定，重复性好，适用于鸡湿热下利证的中兽医防治研究，为其防治药物的药效评价奠定了基础。

Description

一种鸡湿热下利证模型的构建方法
技术领域
本发明属于中兽医病证模型构建技术领域，涉及一种鸡湿热下利证模型的构建方法。
背景技术
家禽腹泻是一种常见病，既影响家禽的生产性能,又影响家禽的健康和环境卫生,可导致饲料转化率低、成活率下降，成为制约家禽业生产效益的重要因素。其发病原因复杂，细菌、病毒、球虫感染、饲料霉变、饲养环境等多种因素均可引起本病发生。腹泻，中兽医称之为下利，中兽医在腹泻的治疗中，根据病因和症状的不同，可分为许多不同的证型，如湿热下利、寒湿下利、脾虚泄泻、食滞肠胃等。腹泻的治疗，必须要针对不同的病因、证型，灵活选用不同治法和药物，才能取得好的疗效。在家禽养殖生产中，因湿热而引起的腹泻占比最高，危害也最大。
湿热下利证是指大肠湿热下注而引起的一种急性腹泻病证，其临床特征为：泄泻，泻下急迫，泻而不爽，粪便色黄而臭秽。还常常伴有身热不扬，口渴，舌苔黄腻，脉滑数或濡数等临床表现，严重时湿热伤及肠中血络，大便中可带脓血。感受湿热邪气是本证的病因，湿邪下注大肠，则大便溏泄。湿热互结于肠，热性急，暴注下迫，故泻下急迫；湿性粘滞，阻滞大肠气机，排出不畅，则泻而不爽。肠内湿热蕴积，故粪便色黄而臭秽。机体抗邪则发热，因热蕴湿中，热不能完全发越于外，故虽发热但不是高热，表现为身热不扬。舌苔黄腻、脉濡数均为湿热表现。
中医病证模型是评价药效及研究中医药作用机制的有效工具，对研发有效的新型中兽药产品，促进中兽药现代化发展具有重要作用，然而病证模型研究却一直是中医药现代化进程中的一个瓶颈。在中医湿热下利病证模型的构建上，文献中多采用小鼠或大鼠使用内毒素攻毒的方法，但使用内毒素方法具有病程短、药效不宜评价的弊端，同时小鼠、大鼠与家禽类差异太大，也不适合禽用药物的研究。在家禽湿热下利证研究中，有人采用大肠埃希菌腹腔注射或肌肉注射的方法，进行了探讨，但试验鸡多表现为高热、全身败血症的病理变化，并不符合湿热下利证的中医特点；也有人采用点眼、滴鼻或口腔灌服大肠埃希菌进行人工感染的方法，可能是由于菌株选择不当或是胃液酸性环境的原因，均未出现明显的临床症状。目前还没有发现家禽湿热下利证模型成功构建的报道。因此，亟待成功构建出符合中兽医特点的鸡湿热下利证模型，对研究防治本类病证的中兽药新制剂，并对其药效进行客观评价，具有重要意义。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种鸡湿热下利证模型的构建方法。该方法采用大肠埃希菌菌株CVCC1558的培养液经泄殖腔灌肠感染的方式，构建出典型的湿热下利证模型，可用于鸡湿热下利证防治药物的药效评价，为新型中兽药的研发奠定了基础。
本发明的技术方案是：一种鸡湿热下利证模型的构建方法，其特征是，将大肠埃希菌菌株CVCC1558的培养液，经泄殖腔注入SPF鸡直肠，正常饲养，构建鸡湿热下利证模型。
具体为：制备大肠埃希菌菌株CVCC1558含量为(1.0-2.0)×109个/ml的培养液，经泄殖腔注入SPF鸡直肠0.5-1cm，攻毒剂量为2-5ml/只，正常饲养，构建鸡湿热下利证模型。
模型构建成功的判断标准为：模型鸡腹泻可达7天以上，粪便色黄而臭秽，排便频繁，有努责表现，发热(热势不是很高，平均升高不足0.5℃)；剖检，肠内容物稀薄，色黄，整个肠道粘膜出现卡他性或出血性肠炎。无大肠埃希菌全身感染所致肝周炎、心包炎、腹膜炎、气囊炎的病理变化。
除以上典型症状外，模型鸡还具有肠粘膜脱落，肠壁变薄症状，以及白细胞增加症状，还可能有精神不振，采食下降，生长缓慢等一般症状。
优选的，所述培养液的制备方法为：将大肠埃希菌菌株CVCC1558接种于营养肉汤培养基(NB)中，36-38℃摇床培养18-24h，经测定细菌含量为(1.0-2.0)×109个/ml，4℃冷藏备用。普通营养肉汤培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，pH值7.2±0.2。
优选的，经泄殖腔注入SPF鸡直肠具体为：使用注射器吸取新鲜的大肠埃希菌营养肉汤培养液，拨去针头，将SPF鸡倒置，将注射器经泄殖腔插入直肠0.5-1cm，注入大肠埃希菌。
优选的，所述SPF鸡选择20-32日龄的SPF雏鸡。
优选的，所述大肠埃希菌营养肉汤培养液的攻毒剂量为3ml/只，菌液中细菌含量为(1.0-1.3)×109个/ml。
鸡湿热下利证辨证分析：本证为外感病邪所致，病位为肠腑。腹泻，便溏色黄而臭秽，为湿热下注大肠而致。排便频繁，有努责现象，是泻下急迫、泻而不爽的表现。肠腑湿热互结，肠中有热，故泻下急迫；湿性粘滞，阻滞气机，排便困难，故出现泻而不爽。肠内容物稀薄色黄，也是湿热下注大肠的表现。卡他性或出血性肠炎，为湿热腐破肠道肌肉血络所致。模型鸡发热，但体温不是高热，也正反映了湿热致病身热不扬的特点，热蕴湿中，不能发越于外，所以有发热症状，但热势不是很高。病程较长，也符合湿邪传变较慢，病势缠绵的特点。试验鸡所具有的上述表现完全符合中兽医湿热下利的证候和病机特点，表明所构建的鸡湿热下利模型是成功的。
此外，湿热下利在辨证时，需要特别与寒湿下利相区别。寒湿下利，也具有腹泻的症状，但它是由寒邪和湿邪引起的，粪便清稀、臭味轻是其特征，可与湿热下利证相鉴别。
本发明的有益效果是：该方法简单、快速，构建的病证模型完全符合中兽医湿热下利证的病机和证候特征，临床症状明显，剖检特征典型，病程时间长，模型稳定，重复性好，适用于鸡湿热下利证的中兽医防治研究，为其防治药物的药效评价奠定了基础。该方法为鸡湿热下利证模型的构建提供了一种独特的方法和思路。
附图说明
图1为实施例2模型鸡的粪便，从图中可以看出：模型鸡腹泻，排黄色稀粪；
图2为实施例2空白对照鸡的粪便，从图中可以看出：空白对照鸡粪便正常，呈黑灰色，成形；
图3为实施例2模型鸡的肠道，从图中可以看出：模型鸡肠炎病变，肠粘膜脱落，肠壁变薄，内容物黄色稀薄；
图4为实施例2空白对照鸡的内脏器官，从图中可以看出：空白对照鸡内脏器官无明显病变；
图5中A为模型鸡血涂片，B为空白对照鸡血涂片，从血涂片中可以看出模型鸡白细胞较空白对照鸡数量增多；
图6为组织病理学检查，从图中可以看出：模型鸡十二指肠粘膜绒毛脱落；
图7为组织病理学检查，从图中可以看出：空白对照鸡肠粘膜绒毛完整，无脱落。
具体实施方式
以下结合实施例来说明其效果。
实施例1：
为验证本发明所构建的鸡湿热下利证模型的效果，本发明进行了以下试验。选用不同的大肠埃希菌菌株，采用不同的攻菌方法，对SPF雏鸡进行了人工感染，观察鸡群的临床表现，尤其是死亡情况和拉稀情况，测定体温、增重率，剖检并进行病理学检查，通过比较试验结果进一步阐述本发明的实际效果。
1试验材料
1.1试验动物：SPF雏鸡，21日龄；
1.2大肠埃希菌：09-29菌株，本实验室以前从自然发病鸡分离；CVCC1558菌株，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，鸡源，消化道感染，致病痢疾。
2试验方法
2.1试验分组：共分为7组，每组5只。
2.2菌液培养：分别取大肠埃希菌09-29菌株和CVCC1558菌株各0.2ml，接种于50ml营养肉汤中，37℃摇床培养18h，经测定，09-29菌株细菌含量为3.2×109/ml；CVCC1558菌株细菌含量为1.126×109/ml。置4℃保存备用。
2.3攻毒方法
一组：胸部肌肉注射09-29菌株新鲜营养肉汤培养液，0.2ml/只；
二组：经口腔灌服09-29菌株新鲜营养肉汤培养液，3ml/只；
三组：胸部肌肉注射CVCC1558菌株新鲜营养肉汤培养液，0.2ml/只；
四组：胸部肌肉注射CVCC1558菌株新鲜营养肉汤培养液，0.4ml/只；
五组：经口腔灌服CVCC1558新鲜营养肉汤培养液，3ml/只；
六组：泄殖腔灌肠CVCC1558菌株新鲜营养肉汤培养液，3ml/只；
七组：空白对照组，不攻毒。
2.4临床观察：每天随时观察各组鸡群的临床表现，包括精神状况、粪便情况及死亡数。
2.5体温测定：每天定时测定每只鸡的体温，并记录。
2.7剖检：试验结束时，剖杀所有试验鸡，对内脏器官的病理变化进行检查。
3试验结果
3.1临床表现：
一组(肌注大肠埃希菌09-29株0.2ml)，攻毒后4h，开始出现明显的临床症状，表现为扎堆，发热，精神沉郁，缩头，拉黄绿色稀粪，共死亡3只。
二组(经口腔灌服09-29菌株3ml)，始终没有出现任何临床症状，体温始终正常，粪便正常。
三组(肌注CVCC1558菌株0.2ml)，攻毒后4h，开始出现明显的临床症状，表现为扎堆，发热，精神沉郁，缩头，拉黄绿色稀粪，共死亡1只。
四组(肌注CVCC1558菌株0.4ml)，攻毒后4h，开始出现明显的临床症状，表现为扎堆，发热，精神沉郁，缩头，拉黄绿色稀粪，共死亡2只。
五组(灌服CVCC1558菌株组)，攻毒后24h后，出现发热，精神沉郁，羽毛逆立，缩头，拉黄绿色稀粪。
六组(泄殖腔灌肠CVCC1558菌株)，精神无明显异常，次日开始，拉黄色稀便，具有努责现象，出现发热。
七组(空白对照组)，精神正常，粪便正常，体温正常。
3.2体温测定结果
与空白对照组(七组)相比，二组攻毒后，体温基本正常，没有出现体温升高现象。而一组、三组、四组、五组、六组体温均升高，表明具有发热现象，具体体温情况见表1。
表1攻毒后各组不同天数平均体温(℃)
Figure BDA0003737708800000051
3.3剖检结果
随时剖检病死鸡，存活鸡于攻毒后第7天，全部颈部放血处死，进行剖检。
一组，5只均表现为典型的心包炎、肝周炎、气囊炎。所有鸡均有肠炎病变，肠粘膜脱落，肠壁变薄。
二组：5只鸡均无明显病变，无心包炎、肝周炎、气囊炎、肠炎。
三组：3只具有轻微的心包炎、肝周炎病变。所有鸡均具有肠炎变化，肠粘膜脱落，肠壁变薄。
四组：4只具有轻微的心包炎、肝周炎病变。所有鸡均具有肠炎变化，肠粘膜脱落，肠壁变薄。
五组：2只有心包炎、肝周炎，1只轻微肝周炎。所有鸡均有肠炎病变，肠粘膜脱落，肠壁变薄。
六组：5只均无心包炎、肝周炎、气囊炎病变。所有鸡肠炎明显，肠粘膜脱落，肠壁变薄，内容物稀薄、色黄，其中2只肠粘膜出血。
七组：5只鸡均无明显病理变化，无心包炎、肝周炎、气囊炎、肠炎。
4试验结论
从试验结果看，六组泄殖腔灌肠CVCC1558菌株，3ml/只，试验鸡24h后，出现拉黄色稀便的典型症状；无明显缩头闭眼等全身性症状；体温升高，出现低热；剖检肠道病变明显，内容物黄色稀薄；从病证病机来看，便溏色黄而臭秽，出现努责，符合湿热下利特征。发热，热势不高，符合湿热致病身热不扬的特点。肠炎明显，肠粘膜脱落或出血，说明湿热结于肠腑，损伤肠道。攻毒后7天，腹泻依然严重，病程长，也符合湿邪传变较慢，病势缠绵，病程长的特点。综上分析，此方法构建的模型符合湿热下利证的病机病证特征。表明采用本方法成功构建出了鸡的湿热下利证模型。而其它5种攻毒方法，试验鸡临床表现均不符合单纯的湿热下利证特征。
试验表明，不同的攻毒方法，试验鸡可表现出不同的临床病症。采用肌肉注射时，试验鸡以全身败血症变化为主，死亡率高，全身症状明显，虽也有湿热下利的表现，并不符合单纯的湿热下利证。采用CVCC1558菌株经口灌服时，则表现出了心包炎、肝周炎、气囊炎等全身败血症变化，虽有排黄绿色稀便的症状，但也并不是单纯的湿热下利证。
试验结果也表明，大肠埃希菌菌株的选择非常重要，09-29菌株与CVCC1558菌株同样经口灌服攻毒时，试验鸡表现完全不同，09-29株感染鸡无任何发病症状，但CVCC1558株感染鸡则出现了明显的症状。
实施例2：
1试验材料和方法
1.1材料
SPF鸡：25日龄，山东昊泰实验动物有限公司提供。
大肠埃希菌菌株：菌种保藏编号CVCC1558，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，鸡源，可经消化道感染，致病痢疾。
SPF鸡饲养隔离器：苏州市冯氏实验动物设备有限公司生产。
电子体温计：古氏软头数字温度计，精度±0.1℃。
其它：血细胞计数板、载玻片、瑞氏染色液、显微镜等。
1.2方法
1.2.1试验分组：将试验动物随机分为2组，一组为模型组，另一组为空白对照，每组10只，分别称重编号，体重均匀度在90％以上，分别饲养在不同的SPF鸡隔离器中，控制统一的温度和风速。
1.2.2大肠埃希菌菌液培养：取保存的菌种0.2ml，接种于50ml普通营养肉汤中，37℃摇床培养18h，测定菌液浓度达1.1×109/ml，置4℃保存备用。
1.2.3模型构建方法：用10ml注射器吸取以上新鲜培养的细菌培养液，拨去针头后，倒置SPF鸡，将注射器插入泄殖腔0.5-1cm，每只缓缓注入3ml。
1.2.4评价指标
1.2.4.1临床症状：每天随时观察各组鸡群的临床表现，包括精神状况、粪便情况。
1.2.4.2体温：每天定时测定体温，并记录。
1.2.4.3血液中白细胞测定：攻毒后4天，每只鸡翅静脉采血，置EDTA-K2抗凝采血管中，将一小滴血液置于载玻片上，将推片与载玻片形成30度夹角，用均匀的速度制成分布均匀的薄血片，瑞氏染色后，置显微镜下观察。在油镜下，从左向右选取6个不同的视野，保存图片于计算机中，将保存的图片于image J软件中进行红细胞和白细胞计数，计算白细胞与红细胞的百分比。
红细胞计数：用5ml吸管吸取红细胞稀释液3.98ml置于试管中。用沙利吸血管吸取全血样品至20μL刻度处。擦去吸管外壁粘附的血液，将血液吹入试管底部，再吹吸数次，以洗净沙利管内粘附的血细胞，然后试管颠倒混合数次。用毛细吸管吸取已稀释好的血液，放于计数室与盖玻片接触处，让血液稀释液自然流入计数室中静置1～2min。先用低倍镜，光线要稍暗些，找到计数室的格后，把中央的大方格置于视野之中，然后转用高倍镜。在中央大方格内选择四角与最中间的五个中方格，数取五个中方格内的红细胞总数，按公式X/80×400×200×10×106计算出1L血液中红细胞个数，其中X为五个中方格内的红细胞总数。通过红细胞总数×白细胞与红细胞的百分比，间接计算出试验鸡血液中白细胞的数量。
1.2.4.4剖检变化：试验结束时，剖杀所有试验鸡，对内脏器官的病理变化进行检查。
1.2.4.5小肠粘膜组织病理学检查：取剖杀鸡的十二指肠和盲肠，固定，染色，封蜡，切片，镜检，观察病理变化。
1.2.5模型判断标准：若试验鸡出现腹泻可达7天以上，粪便色黄而臭秽，排便频繁，有努责表现，发热。剖检，肠内容物稀薄色黄，整个肠道粘膜出现卡他性或出血性肠炎。无大肠埃希菌全身感染所致肝周炎、心包炎、腹膜炎、气囊炎病理变化。表明模型构建成功。
2结果
2.1临床症状：模型组攻毒1d后，鸡群精神无明显异常，全部出现拉黄色稀粪，见图1。排便频繁，有努责现象。直至第7天剖杀时，模型鸡仍然具有相同的腹泻症状。而空白对照组粪便正常，黑灰色成形，见图2。
2.2体温：从攻毒后次日起，直至第7天剖杀时，模型组鸡体温均高于空白对照组，表明模型鸡具有发热症状，但热势不高。具体体温测定情况见表2。
表2攻毒后不同天数两组鸡平均体温(℃)
Figure BDA0003737708800000071
Figure BDA0003737708800000081
2.3剖检变化：第7天时，处死试验鸡并进行剖检。模型组鸡肠炎明显，肠壁变薄，粘膜脱落，有的肠粘膜出血，内容物稀薄，黄色，均无肝周炎、心包炎、气囊炎病变，见图3。而空白对照组各内脏器官均无明显异常，见图4。
2.4白细胞测定：白细胞数与空白对照组相比增加，白细胞增加表明，模型组具有炎症表现。白细胞平均计数结果见表3。模型鸡血涂片油镜下观察结果见图5(A)，空白对照组鸡血涂片见图5(B)，从血涂片中也可以大致看出，模型鸡白细胞较空白对照鸡数量增加。
表3血液白细胞平均计数结果
Figure BDA0003737708800000082
2.5小肠粘膜组织病理学检查：模型组十二指肠粘膜绒毛脱落(图6)，空白对照组肠粘膜绒毛完整，无脱落(图7)。
3结论：25日龄SPF鸡，采用经泄殖腔灌肠的方法，感染大肠埃希菌CVCC1558菌株培养18小时的新鲜营养肉汤培养物，剂量为3ml/只，24小时后，模型鸡表现出了以下特征：腹泻，粪便色黄而臭秽，排便频繁，有努责表现，发热，症状可持续7天以上；剖检，肠内容物稀薄，色黄，整个肠道粘膜出现卡他性或出血性肠炎，肠粘膜脱落，肠壁变薄。表明本方法成功构建出了鸡的湿热下利证模型。
实施例3：
1试验材料和方法
1.1材料
SPF鸡：32日龄，山东昊泰实验动物有限公司提供。
大肠埃希菌菌株：菌种保藏编号CVCC1558，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，鸡源，消化道感染，致病痢疾。
SPF鸡饲养隔离器：苏州市冯氏实验动物设备有限公司生产。
电子体温计：古氏软头数字温度计，精度±0.1℃。
1.2方法
1.2.1试验分组：将试验动物随机分为2组，一组为模型组，另一组为空白对照，每组15只，分别称重编号，体重均匀度在90％以上，分别饲养在不同的SPF鸡隔离器中，控制统一的温度和风速。
1.2.2大肠埃希菌菌液培养：取保存的菌种0.2ml，接种于50ml营养肉汤中，37℃摇床培养18h，测定菌液浓度达1.2×109/ml，置4℃保存备用。
1.2.3模型构建方法：用10ml玻璃注射器吸取以上新鲜培养的细菌培养液，拨去针头后，倒置SPF鸡，将注射器插入泄殖腔1cm，每只缓缓注入4ml。
1.2.4评价指标
1.2.4.1临床症状：每天随时观察各组鸡群的临床表现，包括精神状况、粪便情况。
1.2.4.2体温：每天定时测定体温，并记录。
1.2.4.4剖检变化：试验结束时，剖杀所有试验鸡，对内脏器官的病理变化进行检查。
1.2.5模型判断标准：若试验鸡出现腹泻可达7天以上，粪便色黄或黄绿而臭秽，排便频繁，有努责表现，发热。剖检，肠内容物稀薄，色黄，整个肠道粘膜出现卡他性或出血性肠炎，肠粘膜脱落，肠壁变薄。无大肠埃希菌全身感染所致肝周炎、心包炎、腹膜炎、气囊炎等病理变化。表明模型构建成功。
2结果
2.1临床症状：模型组攻毒1d后，鸡群精神无明显异常，每只均出现拉黄色稀粪，排便频繁，有努责现象。
2.2体温：从攻毒后次日起，直至第7天剖杀时，模型组鸡体温均高于空白对照组，表明模型组鸡群具有发热症状。
2.3剖检变化：第7天时，处死试验鸡并进行剖检，肠炎明显，肠壁变薄，粘膜脱落，有的肠粘膜出血，内容物稀薄，黄色，均无肝周炎、心包炎、气囊炎病变。而空白对照组各内脏器官均无明显异常。
3结论：32日龄SPF鸡，采用经泄殖腔灌肠的方法，感染大肠埃希菌CVCC1558菌株培养18小时的新鲜营养肉汤培养物，剂量为4ml/只，24小时后，模型鸡表现出了以下特征表现：腹泻，粪便色黄或黄绿而臭秽，排便频繁，努责，体温升高，症状可持续7天以上；剖检，肠内容物稀薄，色黄，整个肠道粘膜出现卡他性或出血性肠炎，肠粘膜脱落，肠壁变薄。表明本方法成功构建出了鸡的湿热下利模型。

Claims (5)

1.一种鸡湿热下利证模型的构建方法，其特征是，制备大肠埃希菌菌株CVCC1558含量为（1.0-2.0）×109个 /ml的培养液，经泄殖腔注入20-32日龄的SPF鸡直肠0.5-1cm，攻毒剂量为2-5ml/只，正常饲养，构建鸡湿热下利证模型；
所述模型构建成功的判断标准为：模型鸡腹泻达7天以上，粪便色黄而臭秽，排便频繁，有努责表现，发热；剖检，肠内容物稀薄，色黄，整个肠道粘膜出现卡他性或出血性肠炎，无大肠埃希菌全身感染所致肝周炎、心包炎、腹膜炎、气囊炎的病理变化；所述发热的热势不高，平均升高不足0.5℃。
2.如权利要求1所述的一种鸡湿热下利证模型的构建方法，其特征是，模型鸡还具有肠粘膜脱落，肠壁变薄症状，以及白细胞增加症状。
3.如权利要求1所述的一种鸡湿热下利证模型的构建方法，其特征是，所述培养液的制备方法为：将大肠埃希菌菌株CVCC1558接种于营养肉汤培养基中，36-38℃摇床培养18-24h。
4.如权利要求3所述的一种鸡湿热下利证模型的构建方法，其特征是，所述大肠埃希菌CVCC1558营养肉汤培养液的攻毒剂量为3ml/只，菌液中细菌含量为（1.0-1.3）×109个 /ml。
5.如权利要求1所述的一种鸡湿热下利证模型的构建方法，其特征是，所述经泄殖腔注入SPF鸡直肠具体为：使用注射器吸取新鲜的培养液，拨去针头，将SPF鸡倒置，将注射器经泄殖腔插入直肠0.5-1cm，注入大肠埃希菌CVCC1558。
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