CN115261506A - 检测Mukawa病毒的特异引物对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测或辅助检测Mukawa病毒的特异引物对以及基于该引物对的Mukawa病毒检测方法，可实现Mukawa病毒的准确检测，操作简单，通量高，可同时进行批量样本检测，灵敏度高，特异性强的优点避免了误检漏检情况的发生，同时借助PCR和测序技术，也避免了传统病毒分离方法检测周期长，操作步骤繁琐，技术水平要求高和血清学方法检测灵敏度低，窗口期较长等状况。本发明旨在为Mukawa病毒的检测提供技术储备以应对未来感染人类甚至暴发或流行的可能。

Description

检测Mukawa病毒的特异引物对及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及检测Mukawa病毒的特异引物对及其应用。
背景技术
Mukawa病毒(Mukawa virus,MKWV)属于布尼亚病毒目、白纤病毒科、白蛉病毒属。2018年在日本北海道雌性全沟硬蜱中分离得到的一种新型蜱传白蛉病毒，并于同地区的野生动物(野鹿和浣熊)血清样本中检出抗Mukawa病毒中和抗体。与其他白蛉病毒属成员一样，Mukawa病毒病毒是球形、有包膜、多节段的负链RNA病毒，基因组包含大(L)、中(M)和小(S)三个RNA节段，分别由6,443、3,327和1,907个核苷酸组成，三个节段分别编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(多聚糖蛋白Gn和Gc)以及核蛋白(核衣壳蛋白N和非结构蛋白NSs)。Mukawa病毒病毒粒子呈球形颗粒状，直径约100nm，病毒粒子外层有脂质双层包膜，包膜外伸出许多糖蛋白刺突。
Mukawa病毒是第一个表现与经蚊/白蛉传播的白蛉病毒遗传相似性的新型蜱传白蛉病毒，尽管二者基因序列同源，且经系统进化分析关系更为密切，但由于其生物学特性不同被归类为新型蜱传白蛉病毒，具体表现为Mukawa病毒在蚊源C6/36细胞和白蛉LL-5细胞中低水平复制，而在蜱源ISE6细胞和人源Huh7细胞中高水平复制。目前，Mukawa病毒的致病机制尚不清晰，有研究报道，将Mukawa病毒接种于8周龄小鼠体内观察直至14天，观察期间感染小鼠未出现任何临床症状(如体重严重下降)，但在感染后3、7、14天小鼠组织器官(肝脏、脾脏、肾脏)中可检出Mukawa病毒的RNA，全血中未曾检出，考虑病毒毒力可能因宿主动物种类不同存在差异。
值得注意的是，Mukawa病毒在哺乳动物和节肢动物中的感染提示着其存在潜在人畜共患的潜力，尚不能排除不会类似新布尼亚病毒，造成人际传播。本发明研究设计针对Mukawa病毒的特异性引物对，开发基于Mukawa病毒核酸序列测定的特异性检测方法，为应对Mukawa病毒提供技术储备，可广泛应用于Mukawa病毒的检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速检测Mukawa病毒。
本发明首先提供一种检测或辅助检测Mukawa病毒的特异引物对，所述引物对是由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对。
本发明的第二个目的是提供用于检测或辅助检测Mukawa病毒的PCR试剂。
本发明提供的用于检测或辅助检测Mukawa病毒的PCR试剂包括上述引物对。
所述PCR试剂还包括进行PCR扩增所需的非引物试剂。
所述非引物试剂可为PCR反应缓冲液，和/或，DNA聚合酶或含有DNA聚合酶的溶液。
本发明的第三个目的是提供用于检测或辅助检测Mukawa病毒的试剂盒。
所述试剂盒能用于检测或辅助检测Mukawa病毒。
本发明提供的用于检测或辅助检测Mukawa病毒的试剂盒包括上述引物对或上述PCR试剂。
本发明的第四个目的是提供上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒的新用途。
本发明提供了上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在在制备检测或辅助检测Mukawa病毒产品中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测Mukawa病毒的方法。
本发明提供的检测或辅助检测Mukawa病毒的方法，包括如下步骤：用上述引物对对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，根据所述PCR扩增产物确定待测样本是否为Mukawa病毒阳性：PCR扩增产物是大小为895bp片段的待测样本或者PCR扩增产物序列如序列表序列3所示的待测样本为Mukawa病毒阳性。
本发明提供的高特异性的引物对和基于该引物对的Mukawa病毒检测方法，可实现Mukawa病毒的准确检测，操作简单，通量高，可同时进行批量样本检测，灵敏度高，特异性强的优点避免了误检漏检情况的发生，同时借助PCR和测序技术，也避免了传统病毒分离方法检测周期长，操作步骤繁琐，技术水平要求高和血清学方法检测灵敏度低，窗口期较长等状况。本发明旨在为Mukawa病毒的检测提供技术储备以应对未来感染人类甚至暴发或流行的可能。
附图说明
图1为检测Mukawa病毒的PCR方法灵敏度实验电泳结果图，其中M表示DL2000DNAMarker(宝生物工程(大连)有限公司产品)；N为阴性对照；泳道1-7质粒浓度依次分别为1×107copies/uL、1×106copies/uL、1×105copies/uL、1×104copies/uL、1×103copies/uL、1×102copies/uL、1×101copies/uL扩增结果。
图2为检测Mukawa病毒的PCR方法特异性实验电泳结果图，其中M表示DL2000DNAMarker(宝生物工程(大连)有限公司产品)；N为阴性对照；泳道1-4分别为甲型流感病毒、肠道病毒EV71、汉坦病毒、腹地病毒扩增结果；泳道6-7分别为Mukawa病毒扩增结果。
图3为Mukawa病毒的特异性引物对及检测方法在Mukawa病毒阳性核酸样本中的应用实验电泳结果图，其中M表示DL2000 DNA Marker(宝生物工程(大连)有限公司产品)；N为阴性对照；泳道1-20均为Mukawa病毒扩增结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、Mukawa病毒检测方法
根据Mukawa病毒的L片段基因序列，采用PrimerPremier 5.0软件设计特异性引物，并将拟定的特异性引物对在GenBank数据库中进行Blast比对，确定引物的特异性。最后选定的引物如序列表中序列1和序列2所示，引物对应的目的片段的DNA序列为序列表中序列3：
正向引物：5′-CCATCAATCTGTACACCAGG-3′(序列表中序列1)；
反向引物：5′-ACACAAAGTCCGCCCATTAC-3′(序列表中序列2)。
待检样品为Mukawa病毒阳性核酸样本，来自军事医学科学院微生物流行病研究所。
提取待检样品的RNA，即模板RNA，可以利用现有技术中已知的方法或试剂盒提取。
进行PCR扩增，反应体系如下：12.5μL PCR反应缓冲液，1μL酶混合液，7.5μL纯水，1μL上游引物(序列如序列表中序列1所示)，1μL下游引物(序列如序列表中序列2所示)，2μLRNA模板；
扩增程序为：50℃30分钟；94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分钟，每个循环降低0.5℃，共13个循环；然后按照下列参数进行37次循环：94℃变性30秒，51℃复性30秒，72℃延伸1分钟；循环反应结束后在72℃保持5分钟。回收扩增产物判断是否为Mukawa病毒阳性，判断标准为：能扩增出大小895bp左右的条带或扩增产物的序列如序列表的序列3所示的待测样本为Mukawa病毒阳性，否则为阴性。
实施例2、方法敏感性测试
1、材料
采用实施例1的Mukawa病毒检测方法检出的Mukawa病毒的阳性RNA样本，将阳性扩增产物插入pUC57载体(武汉淼灵生物科技有限公司)的多克隆位点，得到pUC57-Mukaw质粒。
2、方法
使用分光光度计测定pUC57-Mukaw质粒浓度后对其进行倍比稀释，设置7个梯度(1×107copies/uL～1×101copies/uL)，并以本发明提供的特异性引物对(以序列表中序列1所示的核苷酸片段和序列表中序列2所示的核苷酸片段组成)进行PCR扩增。检测PCR扩增最低检测浓度，以验证方法的灵敏度。
3、结果
结果如图1所示，显示PCR扩增最低检测浓度为1×103copies/uL，说明该方法具有高灵敏性。
实施例3、方法特异性测试
1、材料
采用实施例1提供的Mukawa病毒检测方法检测常见病毒RNA样本包括甲型流感病毒、肠道病毒EV71、汉坦病毒、腹地病毒和Mukawa病毒的RNA。样本均来自军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所。
2、方法
采用本发明实施例1的Mukawa病毒检测方法对常见病毒的核酸阳性RNA样本进行检测，以验证方法的特异性。
3、结果
结果见图2，显示甲型流感病毒、肠道病毒EV71、汉坦病毒、腹地病毒四种常见病毒RNA样本检测结果均为阴性，说明该方法对上述病毒无交叉反应，检测体系具有良好的特异性。
实施例4、Mukawa病毒的特异性引物对及检测方法在Mukawa病毒阳性核酸样本中的应用
1、材料
采用实施例1提供的Mukawa病毒特异性引物对及检测方法分别对20份经实验室确认为Mukawa病毒阳性的核酸样本进行检测，样本来自军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所。
2、方法
采用本发明所述的Mukawa病毒特异性引物对及检测方法对20份经实验室确认为Mukawa病毒阳性的核酸样本进行PCR扩增，并利用基因测序技术对扩增样本进行序列分析比对，以实现Mukawa病毒的检测。
4、结果
结果见图3，20份Mukawa病毒阳性的核酸样本中，本发明所述的Mukawa病毒特异性引物对及检测方法可检出阳性样本20份，检出率达到100％。
综上所述，本发明提供的高特异性的引物对和基于该引物对的Mukawa病毒检测方法，可实现Mukawa病毒的准确检测，操作简单，通量高，可同时进行批量样本检测，灵敏度高，特异性强的优点避免了误检漏检情况的发生，同时借助PCR和测序技术，也避免了传统病毒分离方法检测周期长，操作步骤繁琐，技术水平要求高和血清学方法检测灵敏度低，窗口期较长等状况。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 检测Mukawa病毒的特异引物对及其应用
<130> GNCSY210841
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccatcaatct gtacaccagg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acacaaagtc cgcccattac 20
<210> 3
<211> 895
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccatcaatct gtacaccagg tctagattca ctcacgcaga tctgcacatc ctatcttaca 60
ctgcctctga ccaggatatt agctctgcta gcattgcagc tctgagaaag tgcgaggacc 120
agttagagct agacctgctc aaaagagagc caacctgcag ctggttcaac tgcaagcccc 180
ttgacatagg gatggtggag gctcttgcac aggtcctgga tgggagaaga tcactcccga 240
ggcatcttga caaggaaagg ctctccagca ttttcaagat gagctgcgag tcctcactga 300
gagcccggat cggtggcctg ccaatactag ctgaagtcaa ggttgaggac aactccaact 360
ttagcctcca ggatatgata ggtgaggtca tcctcagctt gaaatctgat gaactgttcg 420
aacaagctgt ggaagggatg gagcttccca acatcatcag tgatcttgac ttcgagggag 480
agtttgacct gagcggaata gaggcatttg gacccagcta ctacaaggag ctatccaatc 540
tcagcctgat gtcccacccc ttgatggatg gttttgtgga gcacgtgcta gacactatag 600
ggcagagaga gattaggcgt gtcctcagcc aagcaagatg caagccatct cactatgata 660
tttgctgtgt cctcttcagg gtgcttggga gagaccctgc aaggattaag aaggatgtct 720
tcgacagact gcctgtgagt gaggtggagg atgacatgct cggctagagc gtgctatgaa 780
gcaactaggt gagacattgc ctaatgtttg atggttaacc cttgtctttg ttgaacaagg 840
gtggacaggg tgcgtctact gataacatct cattggtaat gggcggactt tgtgt 895

Claims (6)

1.一种检测或辅助检测Mukawa病毒的特异引物对，其特征在于：所述引物对是由SEQID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对。
2.检测或辅助检测Mukawa病毒的PCR试剂，其特征在于：包括权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂，其特征在于：所述PCR试剂还包括进行PCR扩增所需的非引物试剂。
4.试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的PCR试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒能用于检测或辅助检测Mukawa病毒。
6.权利要求1所述的引物对，或权利要求2或3所述的PCR试剂，或权利要求4或5所述的试剂盒在制备检测或辅助检测Mukawa病毒产品中的应用。
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