CN115261427A - 黄精发酵寡糖及其制法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了黄精发酵寡糖及其制法和应用。具体地，本发明提供了发酵寡糖产物含有黄精发酵寡糖，所述黄精发酵寡糖是以黄精或其多糖提取物为原料，通过黑曲霉菌发酵所形成的寡糖。与常规的黄精多糖相比，本发明的黄精发酵寡糖产物具有更强的还原力、更强的羟自由基清除活性、更小的分子量等优点，可作为抗氧化剂用于化妆品等领域。本发明还提供相应的生产工艺，具有方法简单、生产周期短，适合工业化生产等优点。

Description

黄精发酵寡糖及其制法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及了黄精发酵寡糖及其制法和应用。

背景技术

黄精是一种来自百合科植物滇黄精等植物的中药材，黄精含有丰富的多糖类物质、皂苷、黄酮、等营养元素，其中多糖是其主要生物活性成粉。黄精已应用在中药、食品、化妆品等行业。

黄精多糖是黄精的一类活性物质，具有抗氧化、延缓衰老、保湿、预防心血管疾病、预防糖尿病等多种功效。

以化妆品应用为例，黄精含有大量多糖，具有抗氧化、抗衰老和保湿的作用，因此黄精多糖具有应用于化妆品的潜力。然而，由于黄精原生多糖应用于化妆品时存在难以透皮吸收、人体利用率不高、保存中极易吸潮结块，不便于长期保存和使用等问题，限制了黄精多糖在化妆品等领域中的应用。

此外，通过直接提取而获得的黄精多糖，其功效有限，例如抗氧化性能较低，进一步限制了黄精多糖在化妆品中应用。

因此，本领域迫切需要进一步开发基于黄精的具有更优良性能(如更高抗氧化性能、具有抗皱、紧致性能)的深加工产物，以便提升黄精附加值，扩大黄精应用场合。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄精发酵寡糖及其制法和应用，所述黄精发酵寡糖具有更优良性能(如更高的抗氧化、抗皱、紧致等性能)的深加工产物及其制法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种黄精发酵寡糖产物，所述的发酵寡糖产物含有黄精发酵寡糖，所述黄精发酵寡糖是以黄精或其多糖提取物为原料，通过黑曲霉菌发酵所形成的寡糖。

在另一优选例中，所述的黄精发酵寡糖的重均平均分子量为700-1000Da；和/或所述的黄精发酵寡糖产物的羟基自由基清除活性的IC50值Z1与未发酵的黄精多糖提取液的IC50值Z0之比满足：Z1/Z0≤0.8。

在另一优选例中，所述的黄精发酵寡糖的重均平均分子量为750-900Da，较佳地为750-850Da。

在另一优选例中，所述黄精发酵寡糖的重均平均分子量M1与未发酵的黄精多糖的分子量M2之比(即M1/M2)≤0.5，较佳地≤0.4；如0.05-0.5，较佳地0.1-0.4。

在另一优选例中，所述的黄精发酵寡糖的数均平均分子量为70-150Da，较佳地为75-120Da，更佳地为80-100Da。

在另一优选例中，所述黄精发酵寡糖的数均平均分子量M1与未发酵的黄精多糖的分子量M2之比(即M1/M2)≤0.4，较佳地≤0.3；如0.05-0.4，较佳地0.1-0.3。

在另一优选例中，所述的黄精发酵寡糖产物具有抗氧化性能。

在另一优选例中，所述的黄精发酵寡糖产物的羟基自由基清除活性的IC50值Z1与未发酵的黄精多糖提取液的IC50值Z0之比，即Z1/Z0≤0.6；如0.2-0.8，较佳地0.3-0.6。

在另一优选例中，所述的黄精发酵寡糖产物的羟基自由基清除活性的IC50值≤3.5mg/mL，较佳地IC50值≤3 mg/mL，更佳地IC50值为1-3mg/mL或1.5-2.8 mg/mL。

在另一优选例中，所述的黄精发酵寡糖产物具有还原能力。

在另一优选例中，所述的黄精发酵寡糖产物的还原力的IC50值为3-8 mg/mL，较佳地为4-6 mg/mL。

在另一优选例中，所述的黄精发酵寡糖产物的平均清除率C1是与同浓度未发酵的黄精多糖提取液的平均清除率C0之比≥2，较佳地≥2.5。

在另一优选例中，所述发酵寡糖产物为液态。

在另一优选例中，所述发酵寡糖产物为固态。

在另一优选例中，所述发酵寡糖产物为黄精发酵物冻干粉。

在另一优选例中，所述黄精发酵物冻干粉中寡糖的含量为450-700 mg/g，较佳地为500-650 mg/g，更佳地为550-600 mg/g。

在另一优选例中，所述发酵寡糖产物为黄精发酵脱色浸膏。

在另一优选例中，所述黄精发酵脱色浸膏中寡糖的含量为200-400mg/mL，较佳地为250-350 mg/mL，更佳地为280-300 mg/mL。

在另一优选例中，所述黄精发酵脱色浸膏的加德纳色度＜6，较佳地≤5，更佳地≤4.5(如约4.0±0.1)。

在另一优选例中，所述的黄精多糖提取物为黄精多糖提取液。

在另一优选例中，所述的黄精多糖提取物为黄精根状茎水提取物。

在另一优选例中，所述黄精为滇黄精。

在另一优选例中，所述发酵寡糖产物是采用本发明第三方面所述的方法制备。

在本发明的第二方面，提供了一种制剂组合物，所述的组合物包括本发明第一方面所述的黄精发酵寡糖产物和辅料。

在另一优选例中，所述的制剂组合物包括富含黄精发酵寡糖产物的化妆品添加剂。

在另一优选例中，所述化妆品添加剂中，所述黄精发酵寡糖产物的含量≥10wt％，较佳地≥30wt％，更佳地≥50wt％，最佳地≥60wt%，如10-90wt%或20-80wt％。

在另一优选例中，所述的辅料选自下组：糊精(如麦芽糊精)。

在另一优选例中，所述的制剂组合物基本上由黄精发酵寡糖产物和麦芽糊精构成。

在另一优选例中，所述的黄精发酵寡糖产物与辅料的质量比为2：8～8：2，如3：7～7：3，如5:5或6:4。

在另一优选例中，所述的制剂组合物包括化妆品组合物。

在另一优选例中，在所述化妆品组合物中，精发酵寡糖产物的含量为0.01-10wt％，较佳地0.1-8wt％，更佳地0.2-5wt％。

本发明第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的黄精发酵寡糖产物的制备方法，包括步骤：

(S1) 提供发酵原料，所述发酵原料包括黄精或黄精多糖提取物；

(S2) 用黑曲霉对所述发酵原料进行发酵处理，将黄精多糖转化为黄精寡糖，从而获得含黄精发酵寡糖的产物；

(S3) 从所述黄精发酵浸膏中分离出所述的黄精发酵寡糖，从而获得黄精发酵寡糖产物。

在另一优选例中，所述含黄精发酵寡糖的产物为黄精发酵浸膏。

在另一优选例中，所述的制备方法还包括：

(1)对发酵菌种的选择；

(2)发酵时间的选择；和

(3)发酵温度的选择。

在另一优选例中，所述的发酵菌种选自黑曲霉菌。

在另一优选例中，所述的发酵时间为20h-36h，较佳地为24h-30h。

在另一优选例中，所述的发酵温度为20℃-40℃。

在另一优选例中，步骤(S3)中所述的分离包括步骤：脱色。

在另一优选例中，所述的脱色包括步骤：

(a)取黄精发酵浸膏，以上样体积V1上样于大孔树脂中进行脱色；和

(b)取V2体积的水洗脱上样流出液，得到黄精发酵脱色浸膏。

在另一优选例中，所述的黄精发酵寡糖产物的制备方法还包括：将黄精发酵脱色浸膏进行冷冻干燥，从而得到黄精发酵物冻干粉。

在另一优选例中，所述上样体积为2～3BV，较佳地为2.5BV。

在另一优选例中，所述水洗体积为1～2BV，较佳地为1.5BV。

在另一优选例中，上样和水洗的流速为1-3BV/h，较佳地为2BV/h。

在另一优选例中，在所述发酵中，将黄精或黄精多糖提取物作为主要或唯一的发酵原料进行发酵。

在另一优选例中，将黄精或黄精多糖提取物作为发酵的主要或唯一的碳源和氮源。

在另一优选例中，所述的“作为主要的发酵原料”指除了黄精或黄精多糖提取物之外的其他发酵原料的用量(菌种除外)≤发酵原料的5%，较佳地≤2%，更佳地≤1%，按发酵原料的总干重计算。

本发明的第四方面，提供了一种黄精发酵寡糖产物的用途，用于制备含黄精发酵寡糖产物的产品。

在另一优选例中，所述的产品具有抗氧化、抗衰老、抗皱紧致的作用。

在另一优选例中，所述的产品为化妆品。

在另一优选例中，所述的产品包括：面霜、面膜、乳液、精华、眼霜、洗发及或护发类产品。

在另一优选例中，所述化妆品还含有额外的可用于化妆品的成分。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了脱色前浸膏10%水溶液。

图2显示了脱色后浸膏10%水溶液。

图3显示了黄精提取物冻干粉。

图4显示了黄精发酵物冻干粉。

图5显示了黄精提取物分子量分布曲线。

图6显示了黄精发酵物分子量分布曲线。

图7显示了黄精提取物冻干粉、黄精发酵物冻干粉羟自由基清除曲线。

图8显示了黄精提取物冻干粉、黄精发酵物冻干粉还原力测定曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地开发了一种具有更强抗氧化性能的黄精发酵寡糖产物，本发明的所述寡糖产物是对黄精多糖或含黄精多糖的提取物，用特定真菌(如黑曲霉)进行发酵，从而使得黄精多糖发生降解和/或转化所形成的寡糖产物。实验表明，本发明的寡糖产物具有更强的还原力、更强的羟自由基清除活性、更小的分子量等特点。在此基础上完成了本发明。

黄精及黄精多糖提取物

黄精，为百合科植物滇黄精(Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.)、黄精(Polygonatum sibiricum Red.)或多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)的干燥根茎。

在本发明中，黄精(包括新鲜的或其干燥的药材)均可作为黄精多糖的原料。如本文所用，术语“黄精提取物”、“黄精多糖浸膏”、“黄精提取物浸膏”、“滇黄精提取物”可互换使用，指对黄精或含黄精多糖的提取物，未经过真菌发酵。

优选地，在本发明中，采用经粉碎处理黄精原料(如粉末、或颗粒)作为进行发酵处理的原料。

此外，在本发明中，另一种适合用于发酵处理的原料是含黄精多糖的提取物，其中包括(但并不限于)用水或水性溶剂或醇溶剂提取的黄精多糖提取物。

在本发明中，术语“水性溶剂”指水与其他可与水互溶的溶剂(如C1-C4醇)形成的混合溶剂。优选的醇包括：甲醇、乙醇、丙醇、或其组合。

代表性的水性溶剂包括(但并不限于)：水与甲醇和/或乙醇等醇以任意比例(如0.1-99.5%的醇+余量的水)混合的混合溶剂。通常，水性溶剂含有5-90%的醇和余量的水。

应理解，在本发明中，也可以使用任何可以提取的黄精多糖的溶剂来制备含黄精多糖的提取物。

黄精发酵寡糖产物及其应用

如本文所用，术语“本发明的黄精发酵寡糖产物”、“本发明的寡糖产物”、“本发明的黄精寡糖产物”、“黄精发酵寡糖脱色浸膏”、“黄精发酵脱色浸膏”、“滇黄精发酵脱色浸膏”可互换使用，指对黄精多糖或含黄精多糖的提取物，用特定真菌(如黑曲霉)进行发酵，从而使得黄精多糖发生降解和/或转化所形成的寡糖产物。

本发明所提供的黄精发酵寡糖产物，与未经处理的黄精多糖相比，出乎意料地具有更强的抗氧化能力，因此可以用于多种不同的需要抗氧化性能的场合，例如用于化妆品、食品、药物等。

在本发明中，本发明的黄精发酵寡糖产物具有更强的羟基自由基清除活性。例如，与未发酵的滇黄精提取液等相比，本发明寡糖产物的羟基自由基清除活性显著提高。

本发明还提供一种含有本发明的高抗氧化性能的黄精发酵寡糖产物的产品，或由本发明的黄精发酵寡糖产物构成的产品。

本发明的黄精发酵寡糖产物具有抗皱、紧致的活性，非常适用于化妆品、护肤品。

优选地，本发明提供了一种冻干粉形式的黄精发酵寡糖产物及其制备方法。该黄精发酵寡糖冻干粉可用黄精或其多糖提取物为主要或唯一发酵原料，用黑曲霉在优化条件下进行发酵，然后发酵产物进行分离、脱色和干燥等后处理，从而制得黄精发酵寡糖冻干粉。

黄精发酵寡糖产物的制法

本发明还提供一种黄精发酵寡糖产物的制备方法，包括步骤：

(a) 提供发酵原料，所述发酵原料包括黄精或黄精多糖提取物；

(b) 用黑曲霉(Aspergillus niger)对所述发酵原料进行发酵处理，将黄精多糖转化为黄精寡糖，从而获得含黄精发酵寡糖的发酵产物；和

(c) 从所述发酵产物中分离出所述的黄精发酵寡糖，从而获得黄精发酵寡糖产物。

本发明的黄精发酵寡糖产物的制备方法还包括：

(d)将所述黄精发酵寡糖分离的最优分离条件的筛选；和

(e)将分离的黄精发酵寡糖产物制成冻干粉。

本发明中所述的分离条件包括：大孔吸附树脂型号、上样体积、水洗体积和流速。

优选地，所述上样体积为2～3BV，较佳地为2.5BV。

优选地，所述水洗体积为1～2BV，较佳地为1.5BV。

优选地，所述流速为1-3BV/h，较佳地为2BV/h。

优选地，所述方法还包括：

本发明利用单一菌种发酵、大孔树脂脱色和冷冻干燥技术制备黄精发酵寡糖产物，生产工艺简单，生产周期短，便于保存，适合工业化生产。

应用

如本文所用，术语“药物或化妆品组合物”包括(a)本发明所述的黄精发酵寡糖产物；和(b)药学上或化妆品学上可接受的载体或赋形剂。此外，所述药物组合物还包括保健品组合物，所述化妆品组合物包括护肤品。

有可能将本发明的黄精发酵寡糖产物制备成药物组合物，诸如片剂、胶囊、粉剂、微粒剂、溶液剂、锭剂、胶冻、乳膏制剂、醑剂、悬液、酊、泥敷剂、搽剂、洗剂、和气雾剂之类的剂型。药物能够由通常已知的制备技术来制备，并且合适的药物添加剂能够被添加到该药物中。

药物添加剂的例子包括赋形剂、粘结剂、分解剂、润滑剂、流动助剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、保温(润湿)剂、防腐剂、溶剂、增溶剂、防腐剂、调味剂、增甜剂、染料、香料、推进剂等，这些药物添加剂可以进行选择并以在不影响本发明的效果的范围内的合适量添加。

有可能将本发明的黄精发酵寡糖产物制备成化妆品组合物，如乳剂、液体、膏剂、霜剂、糊剂、饼、粉剂之类的剂型。

在不防碍本发明的效果的范围内，本发明的化妆品中可以添加通常的化妆品中使用的其它成分，例如成膜剂、油溶性凝胶化剂、有机改性粘土矿物、树脂、保湿剂、防腐剂、抗菌剂、香精、盐类、抗氧化剂、pH调节剂、螯合剂、清凉剂、抗炎剂、皮肤美化用成分(美白剂、细胞活性剂、皮肤粗糙改善剂、血液循环促进剂、皮肤收敛剂、抗脂漏剂等)、维生素类、氨基酸类、核酸、激素、包合化合物等。

油溶性凝胶化剂是选自硬脂酸铝、硬脂酸镁、肉豆蔻酸锌等金属皂；N-月桂酰基-L-谷氨酸、α，γ-二-正丁基胺等氨基酸衍生物；环糊精棕榈酸酯、环糊精硬脂酸酯、环糊精2-乙基己酸棕榈酸酯等环糊精脂肪酸酯；蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯等蔗糖脂肪酸酯；一亚苄基山梨醇、二亚苄基山梨醇等山梨醇的亚苄基衍生物；二甲基苄基十二烷基铵蒙脱石粘土、二甲基二十八烷基铵蒙脱石粘土等有机改性粘土矿物等的凝胶化剂，可以根据需要使用一种，或者使用二种或以上。

保湿剂有：甘油、山梨醇、丙二醇、双丙甘醇、1，3-丁二醇、葡萄糖、木糖醇、麦芽糖醇、聚乙二醇、透明质酸、硫酸软骨素、吡咯烷酮羧酸盐、聚氧乙烯甲基葡糖苷、聚氧丙烯甲基葡糖苷等。

抗菌防腐剂有：对羟基苯甲酸烷基酯、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、苯氧基乙醇等，抗菌剂有：苯甲酸、水杨酸、石炭酸、山梨酸、对羟基苯甲酸烷基酯、对氯间甲酚、六氯酚、苯扎氯铵、氯化洗必泰、三氯-N-碳酰苯胺、三氯生、感光素、苯氧基乙醇等。

抗氧化剂有：生育酚、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、植酸等，pH调节剂有：乳酸、柠檬酸、乙醇酸、琥珀酸、酒石酸、dl-苹果酸、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢铵等，螯合剂有丙氨酸、乙二胺四乙酸钠盐、多磷酸钠、偏磷酸钠、磷酸等，清凉剂有：L-薄荷醇、樟脑等，抗炎剂有：尿囊素、甘草亭酸、甘草酸、凝血酸、甘葡环烃(Azulene)等。

皮肤美化用成分有：胎盘提取液、熊果苷、谷胱甘肽、虎耳草提取物等美白剂；蜂王浆、感光素、胆甾醇衍生物、小牛血液提取液等细胞活性剂；皮肤粗糙改善剂；壬酸缬草酰胺、烟酸苄酯、烟酸β-丁氧基乙酯、辣椒素、姜油酮、斑蝥酊、鱼石脂、咖啡因、鞣酸、α-冰片、烟酸生育酚、六烟酸肌醇脂、环扁桃酯、桂利嗪、妥拉唑啉、乙酰胆碱、维拉帕米、千金藤素、γ-谷维醇等血液循环促进剂；氧化锌、鞣酸等皮肤收敛剂；硫、等抗脂漏剂等，维生素类有：维生素A油、松香油、乙酸松香油、棕榈酸松香油等维生素A类；核黄素、丁酸核黄素、黄素腺嘌呤核苷酸等维生素B2类；吡多辛盐酸盐、吡多辛二辛酸酯、吡多辛三棕榈酸酯等维生素B6类，维生素B12及其衍生物，维生素B15及其衍生物等维生素B类；L-抗坏血酸、L-抗坏血酸二棕榈酸酯、L-抗坏血酸-2-硫酸钠、L-抗坏血酸磷酸二酯二钾等维生素C类；麦角钙化醇、胆钙化醇等维生素D类；α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、乙酸dl-α-生育酚、烟酸dl-α-生育酚、琥珀酸dl-α-生育酚等维生素E类；维生素H；维生素P；烟酸、烟酸苄酯、烟酰胺等烟酸类；泛酸钙、D-泛醇、泛酰基乙基醚、乙酰基泛酰基乙基醚等泛酸类；生物素等。

氨基酸类有：甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸等，核酸有脱氧核糖核酸等，激素有雌二醇、乙烯基雌二醇等。

本发明的化妆品的优选例子包括：皮肤护理化妆品、彩妆化妆品、防紫外线化妆品。例如有乳液、霜、露、防晒剂、面膜材料、洗面奶、精华液等基础化妆品；粉底、白粉、腮红等彩妆化妆品等。

对于产品的形态没有特别限定，可以是液状、乳液状、霜状、固体状、糊状、凝胶状、粉末状、多层状、摩丝状(mousse)、喷雾状等。

本发明还提供了一种皮肤护理方法，所述方法包括步骤：对需要的个体施用本发明的所述的黄精发酵寡糖产物或本发明所述的组合物。

在另一优选例中，所述黄精发酵寡糖产物的有效浓度范围为100 μg/ml–500 mg/ml。

在另一优选例中，所述方法为抗氧化、保湿、抗炎、晒后修复、美白、淡斑、抗糖化等方法。

在本发明中，所述的晒后修复，既包括预防性的应用，也包括事后改善性的应用。例如，对于晒后修复，包括在晒之前、之中、和/或之后施用本发明的黄精发酵寡糖产物或组合物，以进行晒后修复。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明将黄精提取物经发酵和脱色技术处理后，其平均分子量下降2.86倍，黄精中大分子多糖得到了有效的降解，得到的滇黄精冻干粉具有更小的分子量，更利于皮肤的吸收利用；

(b)本发明将黄精提取物经发酵和脱色技术处理后，制备得到的滇黄精发酵冻干粉更强的羟基自由基清除能力；

(c)本发明将黄精提取物经发酵和脱色技术处理后，制备得到的滇黄精发酵冻干粉具有更强的还原力，抗氧化活性显著提高；

(d)本发明制备的滇黄精发酵冻干粉颜色较浅、稳定性好，便于保存，制备工艺简单，操作简便，生产周期短，适合工业化生产；

(e)本发明将黄精提取物经发酵和脱色技术处理后，制备得到的滇黄精发酵浸膏具有抗皱、紧致的功效。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用方法

寡糖含量测定

1.试剂与样品准备

1.1实验试剂：无水乙醇、蒽酮、浓硫酸、无水葡萄糖对照品[CAS:50-99-7](购于上海源叶生物技术有限公司)。

对照品溶液配制：称取无水葡萄糖对照品[CAS:50-99-7]适量，精密称定，加水定容至刻度，制成每1 mL含有0.1mg的葡萄糖溶液，即得。

蒽酮-硫酸溶液配制：精密称取蒽酮试剂0.2 g，移入烧杯，缓慢加入100 mL浓硫酸，用玻璃棒小心搅拌，避光保存1 h后使用。每次现配现用。

待测液制备：准确移取2 mL试样于20 mL离心管中，准确加入8 mL无水乙醇，摇匀后静置8 h后4000 rpm离心10 min，取上清液按实验设计稀释即得。

测定法

2.1标准曲线绘制：分别取对照品溶液：0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，于试管中，加水补足至1.0 mL。分别缓慢加入4.0 mL蒽酮-硫酸试剂，于沸水中水浴加热10 min，取出冷却至室温。以试剂空白为参比，于波长620 nm处检测各管的吸光度值。

样品含量测定：分别取待测液1.0 mL于试管中，缓慢加入4.0 mL蒽酮-硫酸试剂，于沸水中水浴加热10 min，取出冷却至室温。以试剂空白为参比，于波长620 nm处检测各管的吸光度值。并根据标准曲线计算供试品寡糖含量。

计算：

寡糖含量(mg/mL)=(C₀*A*10^-3)

式中：

C₀=样品稀释后紫外检测到的浓度(μg/mL)

A=样品稀释倍数

还原糖含量测定

1. 试剂与样品准备

1.1 实验试剂：10%亚铁氰化钾、20%乙酸锌、DNS(NY/T法)试剂(购于上海源叶生物技术有限公司)

1.2 对照品溶液配制：称取无水葡萄糖对照品[CAS:50-99-7]适量，精密称定，加水定容至刻度，制成每1 mL含有0.2 mg的葡萄糖溶液，即得。

待测液的制备：移取1.0 mL样品于离心管中，加入0.3 mL亚铁氰化钾溶液摇匀，加入0.3 mL乙酸锌溶液摇匀，加入8.4 mL纯水摇匀。将样品置于离心机中，4000 rpm离心10min。取离心后的上清液按实验需求稀释。取1.0 mL该稀释液置入试管中，加入2.5 mL纯水，再加入2.5 mL DNS(NY/T法)试剂摇匀，于沸水浴中水浴8 min，至于冰水浴中冷却20 min，放置至室温，即得。

标准曲线的绘制：精密吸取葡萄糖标准溶液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0mL分别置试管中，补水至3.5 mL，分别加入DNS(NY/T法)试剂2.5 mL，沸水浴8 min迅速置入冰水浴中冷却20 min，放置至室温，以试剂空白为参比，在波长540 nm处测定吸光度值。

测定法：取上述已经显色的待测溶液，以试剂空白为参比，在540 nm处测定吸光值，根据标准曲线计算供试品含量(mg/g)。

计算：C=C₀×A×10^-3

式中：

C：原样品还原糖含量，单位(mg/mL)

C₀：样品稀释后紫外检测到的浓度，单位(μg/mL)

A：样品稀释倍数

多糖分子量测定(GPC)

1.试剂及样品制备

1.1实验试剂：Dextran T-300(MW300600)、Dextran T-150(MW135030)、DextranT-10(MW9750)、Dextran T-5(MW2700)、葡萄糖180，均购置于中检所。

1.2样品制备：分别称取发酵前后浸膏50mg于10 mL容量瓶中，用流动相溶解，定容即得。

2.仪器设备：Waters 2695 高效液相色谱仪(配2410示差折光检测器和Empower工作站)

3.色谱条件：

色谱柱：UItrahydroge™Linear 300 mm× 7.8mmid

流动相：0.1N硝酸钠

流速：0.5 mL/min

柱温：40℃

DPPH自由基清除率测定

1.试剂与样品准备

1.1 DPPH甲醇溶液：取7.88 mg DPPH用甲醇定容到100 mL，暗处存放。

1.2 Vc溶液(0.1 mg/mL)：精确称取10 mg抗坏血酸，定容到100 mL.

1.3 样品处理：按实验需求用纯水稀释即得。

2. 检测流程

2.1 实验组：分别取0.050 mL、0.100 mL、0.250 mL、0.500 mL样品于深孔板中，用蒸馏水补足到0.500 mL，加入2.0mL DPPH甲醇溶液，混匀，暗处放置30 min，不断震荡，测定520 nm处的吸光值。

空白组：深孔板中分别取同实验组等体积的样品溶液，用蒸馏水补足到0.500 mL，加入2.0 mL的甲醇溶液。混匀后暗处放置30 min，不断震荡，测定520 nm处吸光值。

对照组：0.500 mL蒸馏水加入2.0 mL DPPH甲醇溶液。混匀后暗处放置30 min，不断震荡，测定520 nm处的吸光值。

阳性对照组：分别取0.050 mL、0.100 mL、0.250 mL、0.500 mL Vc溶液(2.2)于试管中，用蒸馏水补足到0.500 mL，加入2.0 mL DPPH甲醇溶液。混匀后暗处放置30 min，不断震荡，测定520 nm处的吸光值。

3.计算：

DPPH清除率(%)=A_0-A₁+A₂/A₀*100%

其中A₀为对照组吸光度值；A₁为实验组吸光度值；A₂为空白组吸光度值；

使用 Origin 2018 64bit软件进行IC₅₀值的计算。

羟自由基清除率测定

1.试剂与样品准备

1.1水杨酸-乙醇溶液(2.5 mM)：称取0.017 g水杨酸，使用无水乙醇定容到50 mL。

1.2 硫酸亚铁溶液(2.5 mM，现配现用) ：称取0.035 g FeSO4•7H2O，蒸馏水定容到50 mL。

1.3双氧水(0.01%)：取0.1 mL 30%的双氧水，加入30 mL蒸馏水混匀后取5mL用蒸馏水定容到50mL

1.4 测试样品配制：分别取发酵前冻干粉、发酵后冻干粉2 g用纯化水定容至25mL即得。

2.检测流程

2.1实验组：在深孔板中加入25 μL、50 μL、75μL、100μL、150 μL、200 μL、250μL待测样品，用蒸馏水补足到250 μL；加入500 μL蒸馏水，250 μL 7.5 mM FeSO4溶液(2.2)，充分混匀后再加入250 μL双氧水(2.4)启动fenton反应，37℃孵育10min，保温结束加入250 μL水杨酸-乙醇溶液(2.1)； 37℃保温30 min后，在520 nm处测定其吸光值。

2.2空白组：在深孔板中加入25 μL、50 μL、75μL、100μL、150 μL、200 μL、250μL待测样品，用蒸馏水补足到250 μL；加入500 μL蒸馏水，250 μL 7.5 mM FeSO4溶液(2.2)，充分混匀后再加入250 μL蒸馏水代替实验组的双氧水，37℃孵育10min，保温结束加入250 μL水杨酸-乙醇溶液(2.1)； 37℃保温30 min后，在520 nm处测定其吸光值。

2.3对照组：在深孔板中加入蒸馏水750 μL， 250 μL 7.5 mM FeSO4溶液(2.2)，充分混匀后再加入250 μL双氧水(2.4)启动fenton反应，37℃孵育10min，保温结束加入250 μL水杨酸-乙醇溶液(2.1)； 37℃保温30 min后，在520 nm处测定其吸光值。

3.计算：

其中A1为实验组的吸光度值；A2为空白组的吸光度值；A3为对照组的吸光度值。

使用 Origin 2018 64bit软件进行IC₅₀值的计算。

抗氧化活性—还原力测定

1.实验试剂及配置方法

1.1磷酸盐缓冲液(0.2 M，pH 6.6)：试剂A：称取7.16 g Na₂H_PO₄•12H₂O用蒸馏水定容到100 mL；试剂B：称取3.12 g NaH₂PO₄•2H₂O用蒸馏水定容到100 mL；或者取KH₂PO₄，称取2.72 g， 定容到100 mL；取试剂A 37.5 mL，试剂B 62.5 mL，混合均匀后用pH计测定其pH值，用试剂A或B调pH至6.6。

1.2铁氰化钾溶液(1%)：称取0.5 g铁氰化钾，用水定容到50 mL。注：有腐蚀性，需带手套操作。

1.3三氯乙酸溶液(10%)：称取2.5 g三氯乙酸用水定容到25 mL。注：有腐蚀性，需带手套操作；配制试剂需当天使用。

1.4三氯化铁(0.1%)：称取0.166 g FeCl₃，水定容到100 mL。注：有腐蚀性，需带手套操作；配制试剂需当天使用。

1.5 VC溶液(560 μg/mL)：称取28 mg VC固体，用磷酸盐缓冲液定容至50 mL。溶液避光保存于4℃，并尽快用完。

1.6 测试样品配制：分别取发酵前冻干粉、发酵后冻干粉2 g用纯化水定容至25mL即得。

2.检测流程

2.1实验组：分别取25 μL、50 μL、75μL、100μL、150 μL、200 μL、250μL样品于深孔板中，用磷酸盐缓冲液将体积补足到250 μL；在各组样品中加入250 μL磷酸盐缓冲液和250μL铁氰化钾溶液，混匀，50℃水浴20 min，取出，加入250 μL三氯乙酸溶液，混匀。加入1000μL蒸馏水和200 μL的三氯化铁溶液，迅速混匀。测定溶液在700 nm处的吸光值。

2.2空白组：分别取25 μL、50 μL、75μL、100μL、150 μL、200 μL、250μL样品于深孔板中，用磷酸盐缓冲液将体积补足到250 μL；在各组样品中加入250 μL磷酸盐缓冲液和250μL铁氰化钾溶液，混匀，50℃水浴20 min，取出，加入250 μL三氯乙酸溶液，混匀。加入1200μL蒸馏水，迅速混匀。测定溶液在700 nm处的吸光值。

2.3阳性对照组：分别取阳性对照样品——560 μg/mL VC溶液25 μL、50 μL、75μL、100μL、150 μL、200 μL、250μL，用磷酸盐缓冲液补足到250 μL，余下操作同实验组。

2.4阳性对照空白组：分别取阳性对照样品——560 μg/mL VC溶液25 μL、50 μL、125 μL、250 μL，用磷酸盐缓冲液补足到250 μL，余下操作同空白组。

3.计算：

将VC溶液(560 μg/mL)添加量为250 μL的点定义为还原力100%的点，以计算不同样品添加量下的还原力。为保证数据有效，VC溶液(560 μg/mL)添加量为125 μL的点还原力应≥95%。具体计算如下：

其中：

A1为样品组或阳性对照组所测吸光值，

A1o为样品空白组或阳性对照--空白组所测吸光值；

n为样品稀释倍数；

A2为Vc加量为250μL所测样品吸光值；

A2o为Vc加量为250μL空白组所测样品吸光值。

使用 Origin 2018 64bit软件进行IC₅₀值的计算。

实施例1 黄精发酵寡糖的制备-发酵菌种筛选

在本实施例中，采用不同的菌种和发酵条件，对滇黄精进行发酵处理，从而制得黄精发酵寡糖。

方法

1.取蒸制黄精，按照蒸制黄精：水=1：15(W/W)的料液比混合，沸水煮15min，补足重量，置入匀浆机打成匀浆，加热灭菌，温度为121℃，时间为30min。

2.待步骤1中底物冷却至20℃～50℃，分成5份，每份质量为200g。

3.按照2%(V/V)的接种量，按表1加入事先活化的液态菌种(液态菌种的浓度为 8*10⁷～1*10⁸CFU/ml)或未加入菌种(作为对照)，并进行发酵。

4.步骤3中各组液体加热灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30 min，冷却至20℃～40℃过滤，将发酵滤液分为两份，一份用于步骤5、6，醇沉测定寡糖含量，一份用于步骤6，DPPH自由基清除活性的测定。

5.待步骤4完成，取2 mL发酵滤液使用通用方法中所述的寡糖含量的测定方法，测定发酵滤液中的寡糖含量。

6.待步骤4完成后，取其中一份发酵滤液使用通用方法中所述的DPPH自由基清除率测定方法，进行DPPH自由基清除率的测定；

7.根据步骤5、步骤6实验结果，选定一种最优发酵菌种。

表1：滇黄精发酵条件

1.2 结果

结果如表2所示，

表2：滇黄精发酵菌种筛选

*DPPH自由基最高清除率：表示样品在该实验所设计的最高添加量下显示出的最高DPPH自由基清除率。

上述结果表明，出乎意料地，当黑曲霉作为发酵菌种时，一方面可以将更多的黄精多糖转化为寡糖；另外，发酵所形成的黄精发酵寡糖具有最强的抗氧化性能，在该实验条件下具有最高的DPPH自由基清除能力。

此外，虽然植物乳杆菌也对黄精多糖有较好的降解能力，然而植物乳杆菌发酵形成的寡糖的DPPH自由基清除能力比黑曲霉发酵样品差。

综合上述结果，在后续实施例中，选用黑曲霉菌作为发酵菌种。

实施例2 发酵时间的优化

考虑到发酵体积对生产成本的影响，在本实施例中，采用黄精多糖浸膏，用黑曲霉菌进行发酵，制备黄精发酵寡糖，发酵时间为0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120小时，以还原糖含量为指标表征其多糖的降解程度，从而确定最佳发酵时间。

方法

取蒸制黄精，按照黄精：水=1：8(W/W)的料液比混合，回流提取1.5 h，过滤，收集浸提液，再加入黄精投料量7倍纯化水(W/W)，回流提取1.5 h，过滤，收集浸提液，混合两次提取所得浸提液，敞口沸腾浓缩至黄精投料量的2倍(W/W)，得到黄精多糖浸膏，浸膏加热灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。

将多糖提取物冷却至20℃～50℃，接种黑曲霉菌(接种量约为2%(W/W))，发酵时间为12～120 h，获得发酵产物。

将发酵产物置入湿热灭菌锅灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min；待经灭菌的液体冷却至室温后，分别取各组液体过滤，滤液即为黄精发酵浸膏。

取黄精发酵浸膏、黄精多糖浸膏分别稀释10倍，采用通用方法所述的DPPH自由基清除率测定方法，测定其DPPH自由基清除能力，并计算IC₅₀值(μL/mL)。

取黄精发酵浸膏、黄精多糖浸膏，采用通用方法所述的还原糖含量测定方法，测定其还原糖含量(mg/mL)。

2.2 结果

表3：黄精发酵时间筛选

*NC：表示在该实验条件下，最高添加量组DPPH清除率＜50%，无法计算IC₅₀值。

由表3知，随着发酵时间的延长，样品中还原糖含量不断增加，DPPH清除能力不断增强，但发酵时间超过24 h以后，还原糖含量的增加速度和DPPH清除能力的增强速度明显减慢，考虑到实际生产中的成本问题，确定发酵时间为24 h。

实施例3 黄精发酵寡糖的制备

在本实施例中，采用黄精提取物浸膏，用黑曲霉菌进行发酵，制备黄精发酵寡糖。

方法

取蒸制黄精，按照黄精：水=1：8(W/W)的料液比混合，回流提取1.5 h，过滤，收集浸提液，再加入黄精投料量7倍纯化水(W/W)，回流提取1.5 h，过滤，收集浸提液，混合两次提取所得浸提液，敞口沸腾浓缩至黄精投料量的2倍(W/W)，得到黄精多糖浸膏，浸膏加热灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。

将多糖提取浸膏冷却至20℃～50℃，接种黑曲霉菌(接种量：多糖提取液质量的2%(W/W))，发酵时间为24 h，获得发酵产物。

将发酵产物置入湿热灭菌锅灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，趁热用滤布抽滤，滤液即为黄精发酵浸膏。

待黄精发酵浸膏冷却至室温，分别取黄精多糖浸膏、黄精发酵浸膏，采用通用方法所述的寡糖含量测定方法，测定其寡糖含量(mg/mL)。

待黄精发酵浸膏冷却至室温，分别取黄精多糖浸膏、黄精发酵浸膏，采用通用方法中所述的DPPH自由基清除能力测定方法，测定其DPPH清除能力，并计算IC₅₀值；

3.2 结果

表4

*NC：表示在该实验条件下，最高添加量组DPPH清除率＜50%，无法计算IC₅₀值。

如表4所示，经过黑曲霉发酵后的滇黄精多糖，寡糖含量显著提高，DPPH自由基清除能力显著提高。

实施例4 最优脱色工艺的优化-树脂型号

在本实施例中，采用实施例3中的方法制备的黄精多糖浸膏，用黑曲霉菌进行发酵，制备黄精发酵寡糖浸膏，发酵时间为24小时，使用不同型号的大孔树脂对滇黄精发酵寡糖进行脱色处理，以确定最优型号脱色树脂。

方法

待确定最佳发酵时间后，将最佳发酵时间发酵的发酵滤液，冷却至20～50℃，取发酵液进行大孔树脂静态脱色实验，实验条件见表5。

表5：大孔树脂脱色试验

待静态脱色完成，取各组液体过滤，取滤液分别测定各组液体加德纳色度、还原糖含量，计算还原糖损失率，以确定最优脱色树脂型号。

结果

黄精发酵液脱色的最佳大孔吸附树脂型号，结果见表6。

表6：脱色树脂筛选

由表6知，除LS-308大孔吸附树脂外，其余型号大孔吸附树脂对还原糖含量影响较小，从加德纳色度结果可知，D101大孔树脂脱色效果最佳，故确定D101大孔树脂为最优大孔树脂型号。

实施例5 最优脱色工艺的优化-上样体积

5.1 方法

待确定最优型号脱色树脂后，取最优型号树脂，即D101大孔树脂，用体积百分比95%的乙醇浸泡36 h，湿法装柱，再用纯化水冲洗至无醇味。

取以最优发酵工艺制备的发酵浸膏，上样于最优型号大孔吸附树脂，筛选上样体积，条件见表7。

表7：上样体积筛选

按照表7条件进行上样，收集各组流出液，测定加德纳色度及还原糖含量，以确定最佳上样体积。

结果

确定出黄精发酵液大孔树脂脱色最佳上样体积，结果见表8。

表8：上样体积条件筛选

由表8知，当上样体积超过2.5 BV后，还原糖回收率上升缓慢，且加德纳色度结果显示，样品颜色快速变深，所以确定最佳上样体积为2.5 BV。

实施例6 最优脱色工艺的优化-水洗体积

6.1 方法

以最佳上样体积上样，即2.5 BV，收集上样流出液，加入纯化水洗脱，条件见表9。

表9：水洗体积和流速

按照表9的条件加入纯水洗脱，收集各组上样流出液及水洗液，混合均匀，还原糖含量，以确定最佳水洗体积。

结果

黄精发酵液大孔树脂脱色最佳水洗体积，结果见表10，

表10：水洗体积条件筛选

由表10知，当水洗体积达到1.5 BV时，还原糖回收率基本保持不变，所以确定1.5BV为最佳水洗体积。

实施例7 最优脱色工艺的优化-流速

7.1 方法

以最优上样体积(2.5 BV)及最优水洗体积(1.5 BV)处理调节流速至2～4BV/h，收集上样流出液及水洗液，测定还原糖含量及加德纳色度以确定最优流速。

结果

黄精发酵液大孔树脂脱色最佳流速，结果见表11。

表11：脱色流速条件筛选

如表11所示，通过加德纳色度及还原糖回收率可知，当流速上升时，还原糖回收率下降，加德纳色度升高，即样品颜色随流速上升而变深，故选择2 BV/h作为树脂脱色的最优流速。

实施例8 黄精发酵物冻干粉

以确定的最优脱色工艺对黄精发酵寡糖产物进行脱色，收集上样流出液和水洗液，敞口煮沸浓缩成浓缩液(黄精发酵脱色浸膏)，用一定量的水将麦芽糊精(麦芽糊精添加量0～110%，按脱色浸膏中可溶性固形物计，W/W)溶解，加入黄精发酵脱色浸膏混匀后冷冻干燥，粉碎，过80目筛，即得黄精发酵物冻干粉。

实施例9 制备黄精发酵脱色浸膏

在本实施例中，采用与实施例3的条件，以滇黄精提取物为原料，用黑曲霉菌进行发酵，制备含黄精发酵寡糖的滤液，并进行后处理，获得含黄精发酵寡糖的发酵浸膏。随后，对发酵浸膏进行脱色处理，制备得到黄精发酵脱色浸膏。

9.1方法

1.水提：取蒸制黄精水提两次，第一次提取1.5 h，第二次提取1.5 h，合并两次提取液，300目筛网过滤，收集滤液，敞口浓缩至药材投料量的2倍(W/W)得到提取浸膏。

2.灭菌：取步骤1浸膏，121℃灭菌30 min。

3.接种：待步骤2中底物冷却至30℃接种发酵，发酵菌种为黑曲霉，接种量为2%。

4.发酵：通气条件下发酵24 h，温度为30～32℃。

5.灭菌：待步骤3完成，121℃灭菌30min。

6.过滤：待步骤5完成，先用300目筛网过滤，获得粗滤滤液，对上述粗滤液再用1μm滤膜过滤，得到深褐色粘稠液体状黄精发酵浸膏。

7.脱色：取D101大孔树脂用95%乙醇浸泡36 h，湿法装柱，用纯化水冲洗至无醇味，调整流速至2 BV/h，按照2.5 BV将上述发酵浸膏上样，收集上样流出液，按照1.5 BV水洗量洗脱，收集水洗液，混合上样流出液、水洗液，浓缩至蒸制黄精投料量的2倍(W/W)，得到脱色后的深黄色粘稠液体状黄精发酵脱色浸膏(黄精发酵脱色浸膏)。

8.取黄精发酵脱色浸膏稀释10倍，按通用方法测定其寡糖含量、DPPH清除能力，并计算IC₅₀值。

表12 黄精发酵脱色浸膏抗氧化能力测试

9.2结果-脱色效果

取脱色前黄精发酵浸膏(步骤6)和脱色后黄精发酵浸膏(步骤7) 各5g，加入45g水，制得浓度10%的水溶液，并通过拍照和肉眼观察。

结果如图1和图2所示。脱色前黄精发酵浸膏10%水溶液为深棕色，脱色后黄精发酵浸膏10%水溶液为浅黄色。

实施例10 滇黄精发酵冻干粉的制备及其寡糖含量测定

取实施例9制备的脱色后的黄精发酵浸膏，通过真空冷冻干燥制备滇黄精发酵冻干粉，方法如下：取一定量纯化水，按黄精脱色浸膏固形物含量的40%(W/W)加入麦芽糊精，并加热溶解，混合麦芽糊精溶液与脱色浸膏，混合均匀后冷冻干燥48 h，取冻干物粉碎，过80目筛网，得到黄精发酵物粉末，即滇黄精发酵冻干粉，并按照实施例1的方法测定滇黄精发酵冻干粉中的寡糖含量(mg/g)。

取0.9970 g黄精发酵冻干粉，用10 mL纯水溶解，采用通用方法中所述的寡糖含量的测定方法，测定其寡糖含量。

滇黄精发酵冻干粉中寡糖的含量为：565.810 mg/g。

如图3所示，结果表明冻干粉具有较浅的颜色，粉质疏松，质地均匀。

如图4所示，结果表明，其10%(W/W)水溶液颜色较浅、澄清透明，具有很好的水溶性，方便在化妆品成品配方中使用。

实施例11 黄精提取物冻干粉制备

取蒸制黄精，按照黄精：水=1：8(W/W)的料液比混合，回流提取1.5 h，过滤，收集浸提液，再加入黄精投料量7倍纯化水(W/W)，回流提取1.5 h，过滤，收集浸提液，混合两次提取所得浸提液，敞口沸腾浓缩至黄精投料量的2倍(W/W)，得到黄精多糖提取液，先用300目筛网过滤，获得粗滤滤液，对上述粗滤液再用1μm滤膜过滤，得到黄精多糖浸膏。

取一定量纯化水，加入黄精提取物浸膏固形物含量的40%(W/W)麦芽糊精，并加热溶解，混合麦芽糊精溶液与黄精多糖浸膏，混合均匀后冷冻干燥48 h，取冻干物粉碎，过80目筛网，即得黄精提取物冻干粉。

实施例12 黄精发酵脱色浸膏多糖分子量测定(GPC)

取实施例9制备的经脱色的滇黄精发酵浸膏，采用通用方法中所述的多糖分子量测定(GPC)方法，测定糖类物质(多糖、寡糖)的分子量。(冻干粉添加了糊精，会影响测定结果，所以用发酵浸膏进行测定。)

检测结果：表13：平均分子量测试结果

如表13所示，由测试结果可知，黄精提取物经发酵和脱色技术处理后其平均分子量明显下降，黄精中大分子多糖得到了有效的降解。

实施例13 黄精发酵物冻干粉、黄精多糖提取物冻干粉抗氧化活性—羟自由基清 除活性测试

取实施例10、11制备的黄精发酵冻干粉、黄精多糖提取物冻干粉，采用通用方法中所述的羟自由基清除率测定方法，测定其羟基自由基清除活性。

实验结果：

羟自由基清除活性结果如表14和图7所示。

表14：黄精提取物抗氧化活性—羟自由基清除活性测试

注：计算得IC₅₀=4.75(mg/mL)

表15：黄精发酵物抗氧化活性—羟自由基清除活性测试

注：计算得IC₅₀=2.51(mg/mL)

由表14和表15所示的结果可知，经发酵、脱色处理后，黄精发酵寡糖的羟自由基清除能力得到了提升。

实施例14 黄精发酵冻干粉、黄精多糖提取物冻干粉—还原力测定

取实施例10、11制备的黄精发酵冻干粉、黄精多糖提取物冻干粉采用通用方法中所述的抗氧化活性—还原力测定方法，测定其抗氧化活性—还原力。

实验结果

表16：黄精提取物抗氧化活性—还原力测定

注：该实验条件下最高清除率未达到50%，故无法计算IC₅₀。

表17：黄精发酵物抗氧化活性—还原力测定

注：计算得IC₅₀=4.52(mg/mL)

表18：阳性对照组抗氧化活性—还原力测定

由表16、表17和表18的结果可知，经发酵、脱色处理后，黄精发酵寡糖的还原力得到了大幅度的提升。

实施例15 黄精发酵脱色浸膏抗皱紧致功效测试

本实施例中，取实施例9制备的黄精发酵脱色浸膏，在UVA照射成纤维细胞的基础上，分别进行Ⅰ型胶原蛋白(Collagen I)、基质金属蛋白酶Ⅰ(MMP-1)和弹力蛋白(Elastin)的含量测定。

基于UVA照射成纤维细胞的Ⅰ型胶原蛋白(Collagen I)、基质金属蛋白酶Ⅰ(MMP-1)分泌量的检测。

15.1.1 材料

测试系统：本次测试所用的细胞为成纤维细胞，批号：19052002，由广东博溪生物科技有限公司提供。

样品：取实施例9制备的滇黄精发酵脱色浸膏测定。

主要试剂：低糖DMEM 培养基(博溪生物)、PBS(博士德)、新生牛血清(NBS，兰州荣晔)、TGF-β1(Peprotech)、Collagen I ELISA 试剂盒(Abcam)、MMP-1 ELISA 试剂盒(Abcam)、RNAiso Plus(Takara)、反转录试剂盒(Takara)。

主要设备：CO₂ 培养箱(Thermo，150i)、超净工作台(苏州安泰，SW-CJ-1F)、酶标仪(BioTek，Epoch)、荧光定量PCR 仪(BioRad)。

15.1.2 测试方法：

细胞接种：按2.2×10⁵ 个/孔的接种密度接种成纤维细胞至6 孔板，培养箱(37℃、5% CO₂)中孵育过夜。

配液：根据测试方案(表19)分别配制受试物工作液。

测试方案：如表19所示

表19 测试方案

给药：根据表1 测试方案，待6 孔板中细胞铺板率达到40%～60%时，进行分组给药，每孔加样2mL，每组设3 个复孔。给药完成后将6 孔板放置在培养箱(37℃、5% CO₂)中培养24h。

UVA 辐照：根据试验分组，对有 UVA 照射的组别进行 30J/cm² 的UVA 辐照，辐照结束后，放入培养箱(37℃、5%CO₂)中继续培养24h。

ELISA 收样：培养24 h 后，收集细胞培养上清液于EP 管中，置于-80℃冰箱冷冻保存。

ELISA 检测：根据Collagen I ELISA 试剂盒、MMP-1 ELISA 试剂盒的操作说明书进行检测。

15.1.3 数据分析

应用GraphPad Prism 作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。

15.1.4 测试结果

1)Ⅰ型胶原蛋白表达量检测结果

表20 Ⅰ型胶原蛋白表达量检测

注：用t-test 方法进行统计分析时，与BC 组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05 表示为#，P-value＜0.01表示为##；与NC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**。

如表20结果所示，基于成纤维细胞，与对照组相比，样品黄精发酵脱色浸膏在0.1%、0.02%浓度下，均能显著升高Collagen I 的表达量，其中0.1%浓度下提升率为52.14%，在0.02%浓度下提升率为37.65%。

2)MMP-1表达量测试结果

表21 MMP-1表达量测试

注：备注：用t-test 方法进行统计分析时，与BC 组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05 表示为#，P-value＜0.01表示为##；与NC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01 表示为**。

如表21所示，基于成纤维细胞，与对照组相比，样品黄精发酵脱色浸膏在0.1%浓度下，能显著抑制MMP-1 表达量，抑制率为26.03%。

15.2 基于UVA 照射成纤维细胞的弹力蛋白(Elastin)含量检测

14.2.1 材料

测试系统：本次测试所用的细胞为成纤维细胞，批号：19052002，由广东博溪生物科技有限公司提供。

样品：取实施例9制备的黄精发酵脱色浸膏测定。

主要试剂：低糖DMEM 培养基(博溪生物)、PBS(博士德)、新生牛血清(NBS，兰州荣晔)、Elastin ELISA试剂盒(Abcam)。

主要设备：CO₂ 培养箱(Thermo，150i)、超净工作台(苏州安泰，SW-CJ-1F)、酶标仪(BioTek，Epoch)。

测试方法：

1)细胞接种：按2.2×10⁵ 个/孔的接种密度接种成纤维细胞至6 孔板，培养箱(37℃、5% CO₂)

2)配液：根据测试方案(表22)分别配制受试物工作液。

表22 测试方案

3)给药：根据表22测试方案，待6 孔板中细胞铺板率达到40%～60%时，进行分组给药，每孔加样2mL，每组设3 个复孔。给药完成后将6 孔板放置在培养箱(37℃、5% CO₂)中培养24h。

4)UVA 辐照：根据试验分组，对有UVA 照射的组别进行30J/cm2 的UVA 辐照，辐照结束后，放入培养箱(37℃、5% CO₂)中继续培养24h。

5)收样：培养24 h 后，收集细胞培养上清液于EP 管中，置于-80℃冰箱冷冻保存。

6)检测：根据Elastin ELISA 试剂盒的操作说明书进行检测。

15.2.3 数据分析

应用GraphPad Prism 作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test 统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05 认为具有显著差异，P<0.01 认为具有极显著差异。

15.2.4 测试结果

表23 弹力蛋白含量检测结果

注：用t-test 方法进行统计分析时，与BC 组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05 表示为#，P-value＜0.01表示为##；与NC 组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05 表示为*，P-value＜0.01 表示为**。

如表23所示，基于成纤维细胞，与对照组相比，样品黄精发酵脱色浸膏在0.1%和0.02%浓度下，弹力蛋白含量均显著升高，提升率分别为51.72%和42.12%。

抗皱紧致活性结论：

1)基于成纤维细胞，与对照组相比，样品黄精发酵脱色浸膏在0.1%浓度下，Collagen I 的分泌量显著升高，提升率为52.16%；MMP-1 分泌量显著降低，抑制率为26.03%，认为样品黄精发酵脱色浸膏在0.1%浓度下，通过提升Collagen I 的含量，抑制MMP-1 含量达到抗皱、紧致功效；

2)基于成纤维细胞，与对照组相比，样品黄精发酵脱色浸膏在0.02%浓度下，Collagen I 的分泌量显著升高，提升率为37.67%；认为样品黄精发酵浸膏在0.02%浓度下，通过提升Collagen I 的含量达到抗皱、紧致功效。

3)基于成纤维细胞，与对照组相比，样品黄精发酵脱色浸膏在0.1%和0.02%浓度下，弹力蛋白分泌量均显著升高，提升率分别为51.72%和42.12%，认为样品黄精发酵脱色浸膏在0.1%和0.02%浓度下，通过提升弹力蛋白的含量达到抗皱、紧致功效。

实施例16 黄精发酵抗皱眼霜

在本实施例中，以实施例10制备的冻干粉为原料，制备黄精发酵抗皱眼霜，其配方如表24所示。

表24 滇黄精发酵抗皱眼霜

工艺：

1、 B组分室温搅拌溶解均匀后升温至75-80℃保温搅拌；

2、 预配A组分，升温至75-80℃，搅拌溶解均匀，加入B组分中，保温搅拌；

3、 待上述混合组分搅拌均匀后，冷却至室温，加入预配制的C相；

4、 预配C组分，升温至75-80℃，搅拌溶解均匀，加入上述混合组分中；

依次加入D、E组分，搅拌溶解均匀。

讨论

在本发明之前，未见以黄精或滇黄精为发酵原料，通过特定发酵工艺和后处理来制备具有优异抗氧化性能的黄精发酵寡糖产物的报道。且发酵后颜色较深，为该发酵物的实际应用带来了许多限制。

本发明采用黄精根状茎水提取物作为发酵基质，该方法大幅度减小了木质素、纤维素对发酵的影响，大大缩短了发酵时间，且不添加外源碳源及氮源。通过发酵处理有效降低黄精原生多糖分子量，同时提高其抗氧化活性，发酵后的黄精多糖具有更高的耐贮性和功能性。

黄精经提取技术、发酵技术、大孔树脂脱色技术和干燥技术处理，制备得到的黄精发酵物粉末具有更小的分子量，更强的羟自由基清除活性、更强的还原力的特点，生产工艺简单，生产周期短，便于保存，适合工业化生产。

将经过发酵处理的黄精提取物脱色后制成粉末，其平均分子量较未发酵样品有明显下降，抗氧化活性有大幅度提升，稳定性比未经过发酵的黄精提取物粉末更强，可以长期保存和使用，且样品颜色较浅。人体皮肤细胞氧化损伤是衰老最主要因素，黄精多糖是一种纯天然来源且具有抗氧化活性的物质。因此，开发一种可用于化妆品的高活性、人体利用率高、容易保存且天然安全的黄精发酵物是有益的。

所述黄精发酵产物可应用于面霜、面膜、乳液、精华、眼霜、洗发及护发类产品中，其具有较好的水溶性，可在常温下直接添加在水相下，建议优先考虑在抗氧化、抗衰老、抗皱紧致类产品中使用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种黄精发酵寡糖产物，其特征在于，所述的发酵寡糖产物含有黄精发酵寡糖，所述黄精发酵寡糖是以黄精或其多糖提取物为原料，通过黑曲霉菌发酵所形成的寡糖；其中，所述的黄精发酵寡糖的重均平均分子量为700-1000Da；所述的黄精发酵寡糖产物的羟基自由基清除活性的IC50值Z1与未发酵的黄精多糖提取液的IC50值Z0之比满足：Z1/Z0≤0.8。

2.如权利要求1所述的黄精发酵寡糖产物，其特征在于，所述的黄精发酵寡糖的重均平均分子量为750-900Da。

3.如权利要求1所述的黄精发酵寡糖产物，其特征在于，所述的黄精发酵寡糖产物的羟基自由基清除活性的IC50值Z1与未发酵的黄精多糖提取液的IC50值Z0之比，即Z1/Z0≤0.6。

4.如权利要求1所述的黄精发酵寡糖产物，其特征在于，所述发酵寡糖产物为黄精发酵脱色浸膏。

5.如权利要求4所述的黄精发酵寡糖产物，其特征在于，所述黄精发酵脱色浸膏中寡糖的含量为200-400mg/mL。

6.一种制剂组合物，其特征在于，所述的组合物包括权利要求1所述的黄精发酵寡糖产物和辅料。

7.一种如权利要求1所述的黄精发酵寡糖产物的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(S1) 提供发酵原料，所述发酵原料包括黄精或黄精多糖提取物；

(S2) 用黑曲霉对所述发酵原料进行发酵处理，将黄精多糖转化为黄精寡糖，从而获得含黄精发酵寡糖的发酵产物；

(S3) 从所述发酵产物中分离出所述的黄精发酵寡糖，从而获得黄精发酵寡糖产物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述发酵中，将黄精或黄精多糖提取物作为主要或唯一的发酵原料进行发酵。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的“作为主要的发酵原料”指除了黄精或黄精多糖提取物之外的其他发酵原料的用量≤发酵原料的5%，按发酵原料的总干重计算。

10.一种权利要求1的黄精发酵寡糖产物的用途，其特征在于，用于制备含黄精发酵寡糖产物的产品。

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