CN115252749A

CN115252749A - 附子理中制剂作为抗抑郁靶向药物的应用

Info

Publication number: CN115252749A
Application number: CN202210308032.2A
Authority: CN
Inventors: 李炳锦; 赵芳一; 李东秀; 刘磊
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2022-03-26
Filing date: 2022-03-26
Publication date: 2022-11-01

Abstract

本发明涉及附子理中制剂作为抗抑郁靶向药物的应用，从附子理中制剂的给药剂量和mTORC1抑制剂雷帕霉素对附子理中制剂抗抑郁作用的两个方面说明其对卵巢摘除小鼠的抑郁样行为的作用及其作用机制，附子理中制剂反复给药7天能显著减少强迫游泳和悬尾实验中由卵巢摘除延长的不动时间，其抗抑郁作用是通过BDNF/TrkB/mTORC1通路的激活及其突触蛋白的表达增加而实现的，首次阐明附子理中制剂抗抑郁作用的机制，为附子理中制剂作为抗抑郁药物提供理论依据，同时为抗抑郁药物的开发具有重要的经济和社会价值。

Description

附子理中制剂作为抗抑郁靶向药物的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及将附子理中制剂作为抗抑郁靶向药物的应用。

背景技术

抑郁症是一种现代医学精神科常见的疾病，是由各种原因引起的以抑郁为主要症状的一组心境障碍或情感性障碍，临床表现为情绪低落、失眠乏力、反应迟钝、思路闭塞、闭门独居、回避社交和记忆力下降，严重则出现自杀倾向。抑郁症发病率逐年上升，其发病机制复杂，涉及机体神经、内分泌和免疫系统等多个方面。

随着生活水平的提高，人们越来越追求自身心理健康，抑郁症就诊率不断提高，抗抑郁药物的需求也逐年攀升。抑郁的发病存在性别差异。女性抑郁的发生频率大约是男性的两倍，且女性的抑郁症往往更为严重，这可能是由于女性的生理特点和社会分工不同造成的。女性的抑郁障碍经常发生在性激素变化时期，围绝经期的女性由于生殖系统功能的减退，更易出现抑郁、疲劳、失眠等症状，更易出现围绝经期抑郁障碍。围绝经期是指妇女绝经前后的一段时期，围绝经期是卵巢功能衰退的征兆，是正常的生理变化时期。出现围绝经期情绪异常，多发生在45～55岁，临床表现为情绪不稳、焦虑不安、心情低落、疲倦乏力、喜怒易哭、多疑心烦、孤独冷漠，严重者甚至出现自伤、自杀等抑郁行为，多同时伴有失眠多梦。围绝经期的女性是抑郁症发生的高发人群。因此，针对女性抑郁症的研究得到了广泛的关注。

目前，常见的抑郁动物模型有很多，包括：慢性不可预测应激导致的抑郁动物模型、获得性无助模型、单一物理应激模型、双侧卵巢摘除模型、双侧嗅球切除模型、利血平给药模型等。双侧卵巢摘除模型是研究围绝经期女性抑郁症发病机制最常用的实验动物模型，小鼠卵巢摘除后，雌激素的水平会在短时间内急剧下降，而雌激素水平的变化与抑郁症有着密不可分的联系。同时卵巢摘除小鼠脑内单胺类神经递质(5-HT和NA)和脑源性神经营养因子BDNF明显减少。

目前，我国上市的抗抑郁药物主要是五羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂以及五羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NA)双重再摄取抑制剂等西药，虽然这些药物上市产品种类多，但都存在服用周期长，易复发，副作用大等缺点，加之逐年增长的抑郁病患者，这促使科学家们研发出多靶点、更高效、更安全的抗抑郁药物。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂氯胺酮(ketamine)近年被发现有快速起效的抗抑郁作用。临床前研究表明，包括氯胺酮在内的速效抗抑郁药激活mTORC1信号通路。该通路受神经元活动、内分泌和代谢信号的调节。相关研究显示，在应激导致大鼠海马组织中mTOR和AKT磷酸化蛋白表达下调，同时mTORC1信号通路受抑制导致抑郁症的发生。Duman等人的研究表明，激活mTORC1通路和BDNF信号传导产生快速的突触和抗抑郁行为反应。由于氯胺酮的副作用包括可诱发幻觉及存在成瘾性，其在临床上的应用受到很大程度上的限制。因此，开发迅速起效，且能够激活mTORC1信号通路的抗抑郁药物备受关注。

与西药相比，中成药具有更安全，副作用小的优势，因此，寻求更高效，安全，具有抗抑郁作用的中药是目前抗抑郁药物开发领域的研究热点。中医学认为抑郁症是由情志所伤造成的脾失健运、肝失疏泄、脏腑气血阴阳失调，属于中医学范畴。中医学之“郁证”是对情志不舒、气机郁滞所致疾病的总称。西医认为的抑郁症包含在了中医的郁证中。目前中医学对于抑郁症主要根据“四诊”获得的症状进行辨证分型，常见抑郁症分型为肝气郁结型、肝肾阴虚型、肝胃不和型、肝郁化火型、肝郁脾虚型、心脾两虚型、心肝火旺型等。国内学者从中医角度认识抑郁症，通过辨证论治挖掘了一批有效的抗抑郁中药复方，如功效为疏肝解郁健脾的逍遥散和益气养心安神的开心散等。附子理中制剂距今已有1800多年的历史，最早见于《阎氏小儿方论》，是由张仲景《伤寒论》中的理中丸加附子而成，真正以附子理中制剂单独列方成名，并在方书中单独以丸命名始于《太平惠民和剂局方》，其全方由附子(制)、党参、炒白术、干姜、炙甘草等5味中药组成，主治脾胃虚寒，脾肾阳虚，脘腹疼痛、呕吐泻泄、手足冰凉、消化不良等症状,是目前临床常用的中成药之一。近年的研究表明，附子理中制剂除了主治脾胃虚寒证之外，在治疗肠应激综合征、胃炎等方面也有良好的疗效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于治疗抑郁的中药复方，该复方为附子理中制剂，所述附子理中制剂高剂量组在对小鼠连续灌胃给药7天可显著缩短小鼠在强迫游泳实验中的不动时间，表现出一定的抗抑郁作用。本发明从附子理中制剂的给药剂量和作用机制两个方面说明其对卵巢摘除诱导的抑郁样行为的作用，

在本发明中将附子理中制剂作为靶向药物用于动物抗抑郁。

在本发明中所述动物为女性。

在本发明中所述动物为雌性小鼠。

在本发明所述抑郁为女性或雌性小鼠卵巢摘除后出现的抑郁样行为。

在本发明所述抑郁为女性围绝经期出现的抑郁样行为。

本发明所述抑郁是mTORC1、BDNF、TrkB、P70S6K、PSD95、GluA1蛋白其中的一种或几种表达下调导致的抑郁样行为。

所述mTORC1和BDNF/TrkB信号通路被抑制导致抑郁样行为在本发明具体实施例中是双侧卵巢摘除小鼠在强迫游泳实验中不动时间增加且挣扎时间下降、双侧卵巢摘除小鼠在悬尾实验不动时间增加。

本发明所述附子理中制剂作为靶向药物的抗抑郁应用为所述的抗抑郁为上调前额叶皮质和海马中mTORC1蛋白的表达、前额叶皮质和海马中BDNF蛋白的表达、前额叶皮质和海马中TrkB蛋白的表达、前额叶皮质和海马中P70S6K蛋白的表达、前额叶皮质中PSD95蛋白的表达和/或前额叶皮质和海马中GluA1蛋白的表达。

本发明所述附子理中制剂作为靶向药物的抗抑郁应用为提高小鼠和卵巢摘除后小鼠的海马CA1区、CA2区、CA3区和DG区树突棘密度。

在本发明中所述附子理中制剂由附子、党参、炒白术、干姜和甘草，以及一种或多种药学上可接受的辅料制成。所述附子、党参、炒白术、干姜和甘草的重量比为1：2：1.5：1：1。

本发明所述附子理中制剂为口服给药，包括但不限于糖浆剂的液体制剂、或者包括但不限于颗粒剂、片剂、胶囊、丸剂、滴丸剂型的固体剂型。

本发明所述中药复方附子理中制剂为丸剂，由制附子100g，党参200g，炒白术150g，干姜100g，甘草100g，以上五味中药粉碎成细粉，过筛，混匀后加炼蜜而制成的棕褐色至黑褐色水蜜丸或大蜜丸，例如已上市的北京同仁堂生产的附子理中制剂，能够显著提高患者的用药安全性，较适合长期用药，且疗效显著，具有重大意义。

与现有技术比，本发明的有益效果如下:

本发明首次发现中药复方附子理中制剂对卵巢摘除抑郁模型小鼠具有治疗作用及其作用机制。实验研究证明，与卵巢摘除抑郁模型组相比，复方附子理中制剂给药组可以显著降低小鼠在强迫游泳实验中和悬尾实验中的不动时间。

本发明提供的复方附子理中制剂可以通过激活mTORC1和BDNF/TrkB信号通路对卵巢摘除抑郁模型小鼠起到治疗作用。与抑郁模型组相比，复方附子理中制剂给药显著增加了前额叶皮质和海马中mTORC1蛋白的表达、前额叶皮质和海马中BDNF蛋白的表达、前额叶皮质和海马中TrkB蛋白的表达、前额叶皮质和海马中P70S6K蛋白的表达、前额叶皮质中PSD95蛋白的表达或前额叶皮质和海马中GluA1蛋白的表达，见图1。试验证明本发明所述复方附子理中制剂具有改善抑郁小鼠的一般状态，且起效时间快，疗效显著。

本发明所述复方附子理中制剂是古代名方，距今有千年多的历史，具有较高的生物安全性，为其在精神疾病领域的广泛应用提供新的理论，具有重要的社会效益及经济价值。

本发明所述附子理中制剂以疏肝补脾的方式达到抗抑郁的疗效。

附图说明

图1是本发明的附子理中制剂产生抗抑郁作用的机制图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例进一步描述本发明，但本发明的应用范围不限于以下实施方式。

对于本领域技术人员而言，本发明不限于以下示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

本发明的附子理中制剂具有疏肝解郁和缓解脾胃虚寒的功效以及抗抑郁作用，以双侧卵巢摘除抑郁小鼠模型，检测附子理中制剂连续灌胃给药7天后抑郁小鼠的抑郁样行为；并采用免疫印迹实验检测抑郁小鼠海马和前额叶皮质中BDNF-mTORC1信号通路相关蛋白的表达情况；采用高尔基染色法对抑郁小鼠海马CA1、CA2、CA3、DG脑区神经元树突棘进行染色，观察树突棘密度的变化，从而为抑郁中药物治疗提供新思路。

实施例1：复方附子理中制剂给药7天对卵巢摘除抑郁模型小鼠的抑郁样行为的影响的机制。

1材料与方法

1.1材料

主要药品与试剂：附子理中制剂(Fuzi-lizhong Pill，FLP)-北京同仁堂、盐酸氟西汀(Fluoxetine Hydrochloride)-sigma公司。实施例中所使用的附子理中制剂购自北京同仁堂的附子理中丸，其纯度为99％。实验动物：雌性SPF级ICR小鼠，体重21-23g，单笼饲养于吉林大学基础医学院动物实验中心屏障环境，保持12h昼夜节律，室内温度控制在22±1℃，给予充足的水和饲料，自由饮水摄食。所有动物实验均遵照吉林大学动物伦理委员会的相关规定进行。主要实验仪器：小鼠旷场行为测试仪(自制，直径48.8cm，直径16cm，底部19等分)，小鼠强迫游泳行为测试仪(自制，高25cm，直径11cm，水深12cm，水温25±1℃)，电子天平(CNSHP上海衡平仪器仪表厂)。

1.2方法

1.2.1分组与给药：将身体情况相似的雌性小鼠随机分为6组(每组10-20只)，分别为假手术组、围绝经期抑郁模型组、附子理中制剂低剂量组(1.5g/kg)、附子理中制剂中剂量组(4.5g/kg)、附子理中制剂高剂量组(13.5g/kg)和阳性对照氟西汀组(0.02g/kg)，分别对雌性小鼠作如下处理(给药剂量按小鼠的体重计算)。(1)假手术对照组(SHAM)：对小鼠进行手术切口，不摘除小鼠卵巢，灌胃注射0.2％Tween80溶液。(2)抑郁模型组(OVX)：对小鼠进行手术切口，将小鼠的卵巢摘除，灌胃注射0.2％Tween80溶液。(3)附子理中制剂低剂量组(OVL)：对小鼠进行手术切口，将小鼠的卵巢摘除，灌胃注射低剂量的附子理中制剂混悬液。(4)附子理中制剂中剂量组(OVM)：对小鼠进行手术切口，将小鼠的卵巢摘除，灌胃注射中剂量的附子理中制剂混悬液。(5)附子理中制剂高剂量组(OVH)：对小鼠进行手术切口，将小鼠的卵巢摘除，灌胃注射高剂量的附子理中制剂混悬液。(6)氟西汀组(OVF)：对小鼠进行手术切口，将小鼠的卵巢摘除，灌胃注射剂量为0.02g/kg的氟西汀溶液。连续给药7天后进行检测。

1.2.2附子理中制剂给药前后小鼠体重变化：用电子天平对小鼠进行称重。

1.2.3旷场实验：将连续给药7天后的小鼠放在旷场实验箱(聚丙烯材料制作，直径48.8cm，高16cm)中央，实验装置的底部分为19个相等的区域，在每只小鼠实验后擦净实验装置并用酒精消毒，以达到除去小鼠残留气味的目的，防止对下一只鼠的运动产生影响。实验时间为6分钟，在实验过程中，用摄像机记录小鼠的水平运动(穿格次数)和竖直运动(小鼠前肢的抬举)次数；结果用平均值±SE表示。

1.2.4强迫游泳实验：准备透明圆柱体有机玻璃容器(高25cm、直径11cm)，装入温水(水深12cm，水温25±1℃)。将单只小鼠单放入玻璃容器中强迫其游泳，每只小鼠的游泳时间为6分钟。实验期间，用摄像机记录全程并从第三分钟开始统计小鼠的不动时间，小鼠不动指的是小鼠停止挣扎或只通过微小的肢体运动来保持头部浮在水面。游泳实验结束后，用干净的毛巾将小鼠身体擦干，并将其放回原来鼠笼。每测试一只小鼠更换一次干净的水，减少因上一只小鼠遗留的排泄物和气味造成的影响。

1.2.5悬尾实验：将小鼠尾巴(距离尾巴尖约1cm)粘贴在支架上，使小鼠倒挂在实验台上，头部离实验平台约15cm，每只小鼠两侧用木板隔开防止小鼠直接相互注视对实验产生干扰，悬挂6分钟，用摄像机记录，统计小鼠在后4min内的不动时间。

2结果

2.1复方附子理中制剂反复给药7天对小鼠体重的影响

如表1所示，复方附子理中制剂反复给药7天对各组小鼠体重变化无影响，且各组之间的小鼠体重变化均无统计学差异。

表1连续7天复方附子理中制剂给药对抑郁模型小鼠体重的影响

注：数据用平均值士标准误(Mean+SEM)表示，n＝10-20。

2.2复方附子理中制剂反复给药7天对卵巢摘除抑郁模型小鼠自发运动量的影响

如表2A和2B所示，连续给予小鼠7天附子理中制剂(1.5，4.5和13.5g/kg)和氟西汀(0.02g/kg)，在旷场实验中，所有小鼠自发活动没有明显变化，表明浓度梯度附子理中制剂给药没有改变小鼠的自发活动量，其抗抑郁作用具有特异性。

表2A复方附子理中制剂对旷场实验水平运动的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20，抑郁模型组与假手术组比较，p>0.05；给药组与抑郁模型组比较，p>0.05。

表2B复方附子理中制剂对旷场实验垂直运动的影响

2.3复方附子理中制剂反复给药7天对卵巢摘除抑郁模型小鼠强迫游泳不动时间的影响

如表3A、3B和3C所示，与假手术组相比，抑郁模型组小鼠不动时间显著增加且抑郁模型组小鼠的挣扎时间具有显著的下降。与抑郁模型组相比，复方附子理中制剂低、中、高剂量(1.5，4.5和13.5g/kg)反复给药7天都可显著缩短小鼠强迫游泳实验中的不动时间且增加小鼠强迫游泳实验中的挣扎时间，高剂量组具有更明显的不动时间改善作用且高剂量组的挣扎时间显著增加。盐酸氟西汀阳性对照组(0.02g/kg)可显著减少抑郁小鼠的不动时间并增加小鼠的挣扎时间。

表3A复方附子理中制剂对卵巢摘除抑郁模型小鼠强迫游泳实验游泳时间的影响

表3B复方附子理中制剂对卵巢摘除抑郁模型小鼠强迫游泳实验不动时间的影响

表3C复方附子理中制剂对卵巢摘除抑郁模型小鼠强迫游泳实验挣扎时间的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。游泳时间：与假手术组比较，##p<0.01，与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。不动时间：与假手术组比较，##p<0.01，与卵巢摘除抑郁模型组比较，**p<0.01，***p<0.001。挣扎时间：与假手术组比较，##p<0.01，与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。

2.4复方附子理中制剂反复给药7天对卵巢摘除抑郁模型小鼠悬尾实验不动时间的影响

如表4所示，与假手术组相比，抑郁模型组小鼠不动时间显著增加。与抑郁模型组相比，复方附子理中制剂低、中、高剂量反复给药7天都可显著缩短小鼠悬尾实验中的不动时间，且附子理中制剂高剂量组具有更明显的不动时间改善作用。盐酸氟西汀阳性对照组(0.02g/kg)可显著减少悬尾实验中的不动时间。

表4复方附子理中制剂对卵巢摘除抑郁模型小鼠悬尾实验不动时间的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。不动时间：与假手术对照组比较，#<0.05，与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05,*p<0.01,***p<0.001。不动时间：与假手术组比较，#p<0.05，与卵巢摘除抑郁模型组比较*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

本实验研究证明，附子理中制剂低、中、高剂量组(1.5g/kg，4.5g/kg，13.5g/kg)在对小鼠连续给药7天可显著缩短小鼠在强迫游泳实验和悬尾实验中的不动时间，表现出一定的抗抑郁作用。

实施例2：复方附子理中制剂给药7天对卵巢摘除抑郁模型小鼠的抑郁样行为影响的机制1材料与方法

1.1材料；主要药品与试剂：附子理中制剂(Fuzi lizhong Pill，FLP)、盐酸氟西汀(Fluoxetine Hydrochloride,抗mTORC1、BDNF、TRKB、AKT、p70S6K、PSD95、GLUA1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，抗β-Actin抗体购自sigma。实验动物：雌性SPF级ICR小鼠，体重21-23g，单笼饲养于吉林大学基础医学院动物实验中心屏障环境，保持12h昼夜节律，室内温度控制在22±1℃，给予充足的水和饲料，自由饮水摄食。所有动物实验均遵照吉林大学动物伦理委员会的相关规定进行。主要实验仪器：小鼠旷场行为测试仪(自制，直径48.8cm，直径16cm，底部19等分)，小鼠强迫游泳行为测试仪(自制，高25cm，直径11cm，水深12cm，水温25±1℃)，电子天平(CNSHP上海衡平仪器仪表厂)。

1.2方法

1.2.1分组与给药：实验分组和给药方法同上

1.2.2免疫印迹实验：首先，进行小鼠脑组织样品收集。在行为测试后立即将小鼠断头，使用手术刀迅速切取前额叶皮质，并用镊子剥取海马，将取出的海马和前额叶皮质放在实验前准备好的离心管内称重，并将离心管放在冰上。将样品迅速放在-80℃冰箱内冷冻备用。然后用配制好的蛋白裂解液裂解组织，用匀浆机研磨使组织裂解充分，离心取上清得到蛋白，进行免疫印迹实验。

1.2.3Western Blot法检测mTORC1、BDNF、TrkB、P70S6K、AKT、PSD95和GluA1蛋白的表达水平；分别制备浓度为10％分离胶及5％浓缩胶来进行聚丙烯酰胺凝胶。电泳结束后进行转膜，进行抗体反应，4℃孵育过夜、洗涤，在室温下孵育二抗1小时，用TBST洗涤。用Tanon-5200凝胶成像系统成像，用Image J软件分析系统测定条带灰度值。

2结果

2.1如表1和表2所示，附子理中制剂反复给药7天上调了卵巢摘除抑郁模型小鼠的前额叶皮质和海马中mTORC1表达水平(表1和2)。

表1复方附子理中制剂给药7天对小鼠前额叶皮中mTORC1表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与假手术组比较，p>0.05，与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05。

表2复方附子理中制剂给药7天对小鼠海马中mTORC1表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与假手术组比较，p>0.05，与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05,**p<0.01。

2.2如表3和表4所示，附子理中制剂反复给药7天上调了卵巢摘除抑郁模型小鼠的前额叶皮质和海马中BDNF表达水平(表3和4)。

表3复方附子理中制剂给药7天对小鼠前额叶皮质中BDNF表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与假手术组比较，p>0.05。与卵巢摘除抑郁模型组比较,**p<0.01,***p<0.001。

表4复方附子理中制剂给药7天对小鼠海马中BDNF表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与假手术组比较，#p<0.05，。与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05,*p<0.01,***p<0.001。

2.3如表5和表6所示，附子理中制剂反复给药7天上调了卵巢摘除抑郁模型小鼠的前额叶皮质和海马中TrkB表达水平(表5和6)。

表5复方附子理中制剂给药7天对小鼠前额叶皮质中TrkB表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与假手术对照组比较，p>0.05，。与卵巢摘除抑郁模型组比较，***p<0.001。

表6复方附子理中制剂给药7天对小鼠海马中TrkB表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与假手术组比较，##p<0.01。

与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05。

2.4如表7、8所示，附子理中制剂反复给药7天并未影响卵巢摘除抑郁模型小鼠的前额叶皮质和海马中AKT的表达水平(表7和8)。

表7复方附子理中制剂给药7天对小鼠前额叶皮质中AKT表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与假手术组比较，p>0.05。与卵巢摘除抑郁模型组比较，p>0.05。

表8复方附子理中制剂给药7天对小鼠海马中AKT表达水平的影响

2.5如表9、10所示，附子理中制剂反复给药7天上调了卵巢摘除抑郁模型小鼠的前额叶皮质和海马中P70S6K表达水平(表9和10)。

表9复方附子理中制剂给药7天对小鼠前额叶皮质中P70S6K表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与假手术对照组比较，##p<0.01。与卵巢摘除抑郁模型组比较，*<0.05。

表10复方附子理中制剂给药7天对小鼠海马中P70S6K表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与假手术对照组比较，p>0.05。

与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05,*p<0.01,***p<0.001。

2.5如表11、12所示，附子理中制剂反复给药7天上调了卵巢摘除抑郁模型小鼠的前额叶皮质中PSD95表达水平，但并未影响卵巢摘除抑郁模型小鼠的海马中PSD95的表达水平(表11和12)。

表11复方附子理中制剂给药7天对小鼠前额叶皮质中PSD95表达水平的影响

与卵巢摘除抑郁模型组比较，**p<0.01。

表12复方附子理中制剂给药7天对小鼠海马中PSD95表达水平的影响

与卵巢摘除抑郁模型组比较，p>0.05。

2.5如表13、14所示，附子理中制剂反复给药7天上调了卵巢摘除抑郁模型小鼠的前额叶皮质和海马中GluA1表达水平(表13和14)。

表13复方附子理中制剂给药7天对小鼠前额叶皮质中GluA1表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与假手术组比较，##p<0.01。与卵巢摘除抑郁模型组比较，**p<0.01。

表14复方附子理中制剂给药7天对小鼠海马中GluA1表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与假手术组比较，p>0.05。卵巢摘除抑郁模型组比较，**p<0.01。

本实验研究证明，附子理中制剂低、中、高剂量组(1.5g/kg，4.5g/kg，13.5g/kg)在对小鼠连续给药7天可显著提高海马和前额叶皮质中抑郁相关通路mTORC1、BDNF、TrkB、P70S6K蛋白和突触后蛋白PSD95、GluA1的表达，表现出一定的抗抑郁作用。

实施例3：mTORC1抑制剂雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠行为学的影响

1材料与方法

1.1材料；主要药品与试剂：附子理中制剂(Fuzi-lizhong Pill，FLP)、雷帕霉素(Rapamycin)、吐温80溶液。实验动物：雌性SPF级ICR小鼠，体重21-23g，单笼饲养于吉林大学基础医学院动物实验中心屏障环境，保持12h昼夜节律，室内温度控制在22±1℃，给予充足的水和饲料，自由饮水摄食。所有动物实验均遵照吉林大学动物伦理委员会的相关规定进行。主要实验仪器：主要实验仪器同上。

1.2方法

1.2.1分组与给药：将身体情况相似的雌性小鼠随机分为5组(每组10-20只)，分别为假手术对照组、围绝经期抑郁模型组、附子理中制剂剂量组(13.5g/kg)、附子理中制剂剂量组和雷帕霉素拮抗剂组和雷帕霉素拮抗剂组，分别对雌性小鼠作如下处理(给药剂量按小鼠的体重计算)。(1)假手术对照组(SHAM)：对小鼠进行手术切口，不摘除小鼠卵巢，灌胃注射0.2％Tween80溶液。(2)抑郁模型组(OVX)：对小鼠进行手术切口，将小鼠的卵巢摘除，灌胃注射0.2％Tween80溶液。(3)附子理中制剂高剂量组(OVH)：对小鼠进行手术切口，将小鼠的卵巢摘除，灌胃注射高剂量的附子理中制剂混悬液。(4)附子理中制剂剂量组和雷帕霉素拮抗剂组(OVH+R):对小鼠进行手术切口，将小鼠的卵巢摘除，灌胃注射高剂量的附子理中制剂混悬液，行为学实验前30min腹腔注射雷帕霉素(0.03g/kg)。(5)雷帕霉素组(OVX+R)：对小鼠进行手术切口，将小鼠的卵巢摘除，，行为学实验前30min腹腔注射雷帕霉素(0.03g/kg)。连续灌胃给药7天后进行检测。

1.2.2给药前后小鼠体重变化。

1.2.3旷场实验：实验方法同上。

1.2.4强迫游泳实验：实验方法同上。

1.2.5悬尾实验：实验方法同上。

2结果

2.1雷帕霉素对附子理中制剂反复给药卵巢摘除小鼠体重的影响

表1雷帕霉素对附子理中制剂反复给药7天小鼠体重的影响

注：数据用平均值士标准误(Mean+SEM)表示，n＝10-20。

2.2雷帕霉素对附子理中制剂反复给药卵巢摘除小鼠自发运动量的影响

如表2A和2B所示，连续给予小鼠7天附子理中制剂(13.5g/kg)和雷帕霉素(0.03g/kg)，在旷场实验中，所有小鼠自发活动没有明显变化，表明浓度梯度附子理中制剂给药没有改变小鼠的自发活动量，其抗抑郁作用具有特异性。

表2A雷帕霉素对附子理中制剂反复给药小鼠旷场实验水平运动的影响

表2B复方附子理中制剂对旷场实验垂直运动的影响

2.3雷帕霉素对附子理中制剂反复给药卵巢摘除小鼠强迫游泳不动时间的影响：如表3A,3B和3C所示，与卵巢摘除抑郁模型组相比，假手术对照组小鼠不动时间显著下降且抑郁模型组小鼠的挣扎时间具有显著的上升。与抑郁模型组相比，复方附子理中制剂高剂量(13.5g/kg)反复给药7天都可显著缩短小鼠强迫游泳实验中的不动时间且增加小鼠强迫游泳实验中的挣扎时间，高剂量组具有更明显的不动时间改善作用且高剂量组的挣扎时间显著增加。附子理中制剂和雷帕霉素拮抗剂组与附子理中制剂组相比，小鼠的不动时间显著上升且小鼠的挣扎时间显著降低。

表3A雷帕霉素对附子理中制剂反复给药卵巢摘除小鼠强迫游泳实验游泳时间的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05,***p<0.001。

表3B雷帕霉素对附子理中制剂反复给药卵巢摘除小鼠强迫游泳实验不动时间的影响

表3C雷帕霉素对附子理中制剂反复给药卵巢摘除小鼠强迫游泳实验挣扎时间的影响

2.4雷帕霉素对附子理中制剂反复给药卵巢摘除小鼠悬尾实验不动时间的影响

如表4所示，与卵巢摘除抑郁模型组相比，假手术对照组小鼠不动时间显著下降且抑郁模型组小鼠的挣扎时间具有显著的上升。与抑郁模型组相比，复方附子理中制剂高剂量(13.5g/kg)反复给药7天都可显著缩短小鼠悬尾实验中的不动时间且增加小鼠强迫游泳实验中的挣扎时间，高剂量组具有更明显的不动时间改善作用且高剂量组的挣扎时间显著增加。附子理中制剂和雷帕霉素拮抗剂组与附子理中制剂组相比，小鼠的不动时间显著上升且小鼠的挣扎时间显著降低。

表4雷帕霉素对附子理中制剂反复给药卵巢摘除小鼠悬尾实验不动时间的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与卵巢摘除抑郁模型组比较，**p<0.01,***p<0.001。

本实验研究证明，附子理中制剂混悬液高剂量(13.5mg/kg)组反复给药7天可显著降低卵巢摘除抑郁模型小鼠的不动时间并显著增加卵巢摘除抑郁模型小鼠的挣扎时间，表现出抗抑郁作用。且这一作用可被mTORC1通路拮抗剂雷帕霉素给药后被阻断，进一步证明mTORC1可能是研究抑郁的主要靶点。

实施例4：雷帕霉素阻断附子理中制剂抗抑郁作用的分子生物学机制研究

1材料与方法

1.1材料；主要药品与试剂：附子理中制剂(Fuzi-lizhong Pill，FLP)、雷帕霉素(Rapamycin),吐温80，抗E Rα、E Rβ、mTORC1、BDNF、TRKB、AKT、p70S6K、PSD95、GLUA1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，抗β-Actin抗体购自sigma。实验动物：雌性SPF级ICR小鼠，体重25-30g，单笼饲养于吉林大学基础医学院动物实验中心屏障环境，保持12h昼夜节律，室内温度控制在22±1℃，给予充足的水和饲料，自由饮水摄食。所有动物实验均遵照吉林大学动物伦理委员会的相关规定进行。主要实验仪器：主要实验仪器同上。

1.2方法

分组与给药：实验分组和给药方法同上

免疫印迹实验：主要实验方法同上；Western Blot法检测E Rα、E Rβ、TORC1、BDNF、TrkB、P70S6K、AKT、PSD95和GluA1蛋白的表达水平。分别制备浓度为10％分离胶及5％浓缩胶来进行聚丙烯酰胺凝胶。电泳结束后进行转膜，进行抗体反应，4℃孵育过夜、洗涤，在室温下孵育二抗1小时，用TBST洗涤。用Tanon-5200凝胶成像系统成像，用Image J软件分析系统测定条带灰度值。

2结果

2.1如表1、2所示，与卵巢摘除抑郁模型组相比，假手术对照组小鼠前额叶皮质和海马中雌激素受体α(ER-α)表达水平显著上升(表1和2)。

表1雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠前额叶皮中Eα表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05。

表2雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠海马中Eα表达水平的影响

2.2如表3和表4所示，与卵巢摘除抑郁模型组相比，假手术对照组小鼠前额叶皮质和海马中雌激素受体β(ER-β)表达水平显著上升(表3和4)。

表3雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠前额叶皮质中Eβ表达水平影响

表4雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠海马中Eβ表达水平的影响

2.3如表5和表6所示，与卵巢摘除抑郁模型组相比，假手术对照组小鼠前额叶皮质和海马中mTORC1表达水平显著上升(表5和6)。与卵巢摘除抑郁模型组相比，附子理中制剂高剂量给药7天组小鼠前额叶皮质和海马中mTORC1表达水平显著上升，然而，雷帕霉素给药后，小鼠前额叶皮质和海马中mTORC1表达水平显著下降。

表5雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠前额叶皮中mTORC1表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05，**p<0.01,***p<0.001。

表6雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠海马中mTORC1表达水平的影响

2.4如表7和表8所示，与卵巢摘除抑郁模型组相比，假手术对照组小鼠前额叶皮质和海马中BDNF表达水平显著上升(表7和8)。与卵巢摘除抑郁模型组相比，附子理中制剂高剂量给药7天组小鼠前额叶皮质和海马中BDNF表达水平显著上升，然而，雷帕霉素给药后，小鼠前额叶皮质和海马中BDNF表达水平显著下降。

表7雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠前额叶皮质中BDNF表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05,**p<0.01。

表8雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠海马中BDNF表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001。

2.5如表9和表10所示，与卵巢摘除抑郁模型组相比，假手术对照组小鼠前额叶皮质和海马中TrkB表达水平显著上升(表9和10)。与卵巢摘除抑郁模型组相比，附子理中制剂高剂量给药7天组小鼠前额叶皮质和海马中TrkB表达水平显著上升，然而，雷帕霉素给药后，小鼠前额叶皮质和海马中TrkB表达水平显著下降。

表9雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠前额叶皮质中TrkB表达水平的影响

表10雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠海马中TrkB表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与卵巢摘除抑郁模型组比较，**p<0.01。

2.6如表11和表12所示，与卵巢摘除抑郁模型组相比，假手术对照组小鼠前额叶皮质和海马中AKT表达水平没发生变化，各组之间无统计学差异(表11和12)。与卵巢摘除抑郁模型组相比，附子理中制剂高剂量反复给药7天并未影响卵巢摘除抑郁模型小鼠的前额叶皮质和海马中AKT的表达水平。

表11雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠前额叶皮质中AKT表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与卵巢摘除抑郁模型组比较，p>0.05。

表12雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠海马中AKT表达水平的影响

2.7如表13和表14所示，与卵巢摘除抑郁模型组相比，假手术对照组小鼠前额叶皮质和海马中P70S6K表达水平显著上升(表13和14)。与卵巢摘除抑郁模型组相比，附子理中制剂高剂量给药7天组小鼠前额叶皮质和海马中P70S6K表达水平显著上升，然而，雷帕霉素给药后，小鼠前额叶皮质和海马中P70S6K表达水平显著下降。

表13雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠前额叶皮质中P70S6K表达水平的影响

注：数据用平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，n＝10-20。与卵巢摘除抑郁模型组比较，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

表14雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠海马中P70S6K表达水平的影响

2.8如表15和表16，与卵巢摘除抑郁模型组相比，假手术对照组小鼠前额叶皮质和海马中PSD95表达水平显著上升(表15和表16)。与卵巢摘除抑郁模型组相比，附子理中制剂高剂量给药7天组小鼠前额叶皮质和海马中PSD95表达水平显著上升，然而，雷帕霉素给药后，小鼠前额叶皮质和海马中PSD95表达水平显著下降。

表15雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠前额叶皮质中PSD95表达水平的影响

表16雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠海马中PSD95表达水平的影响

2.9如表17和表18，与卵巢摘除抑郁模型组相比，假手术对照组小鼠前额叶皮质和海马中GluA1表达水平显著上升(表17和表18)。与卵巢摘除抑郁模型组相比，附子理中制剂高剂量给药7天组小鼠前额叶皮质和海马中GluA1表达水平显著上升，然而，雷帕霉素给药后，小鼠前额叶皮质和海马中GluA1表达水平显著下降。

表17雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠前额叶皮质中GluA1表达水平的影响

表18雷帕霉素对附子理中制剂给药卵巢摘除小鼠海马中GluA1表达水平的影响

本实验研究证明，附子理中制剂混悬液高剂量(13.5g/kg)组反复给药7天可显著降低卵巢摘除抑郁模型小鼠前额叶皮质和海马中抑郁相关通路mTORC1、BDNF、TrkB、P70S6K蛋白和突触后蛋白PSD95、GluA1的表达，表现出一定的抗抑郁作用，且这一作用可以被mTORC1拮抗剂雷帕霉素所阻断。

实施例5：雷帕霉素阻断附子理中制剂抗抑郁作用的突触可塑性机制研究

1材料与方法

1.1材料

主要药品与试剂：附子理中制剂(Fuzi-lizhong Pill，FLP)、雷帕霉素(Rapamycin)，吐温80，乌拉坦，无水乙醇，生理盐水，蔗糖，重铬酸钾，铬酸钾，氯化汞，氨水，定影液，二甲苯，中性树胶，香柏油。

实验动物：实验动物同上。

主要实验仪器：主要实验仪器同上

1.2方法

1.2.1分组与给药：实验分组和给药方法同上

1.2.2高尔基染色(Golgi Staining)

利用神经元的嗜银性，可以很好的显示神经元的形态以及树突棘。虽然树突棘的数量不能直接与突触活动的数量直接相关，但树突棘密度分析可以用来评估突触的连接性以及突触可塑性变化的过程。高尔基染色法检测各组小鼠海马CA1、CA2、CA3、DG区每个独立神经元取3个二级树突分支进行树突棘密度统计。

(1)Golgi-Cox试剂：以下操作于通风橱中使用玻璃仪器避光进行。取重铬酸钾10g于200mL水中充分溶解制圾5％重铬酸钾溶液，称储备液A；取氯化汞l0 g于200mL水中充分搅拌至溶解，制成5％氯化汞溶液，称储备液B；取铬酸钾8g于160mL水中充分溶解制成5％铬酸钾溶液，称储备液C。各储备液可在室温避光条件下储存数月。使用时，按照储备液A:储备液B:储备液C:水的体积比为5:5:4:10量取，将储备液C与水混合后，缓慢搅拌加入AB混合液中，充分混匀制成工作液，室温避光保存，静置沉淀2日后方可使用。

(2)定影液：定影液配制操作应于通风橱中进行。取A溶液125mL，搅拌下向其中加入溶液11.5mL后，用双蒸水定容至500mL，搅拌2min即可，于4℃保存。

实验步骤：1)侵染：行为学实验后，将小鼠心脏灌流取脑。乌拉坦(15％)麻醉小鼠后，置其于冰上，于剑突下剪开皮肤和横膈，充分暴露心脏。眼利剪剪开右心耳，将20mL注射器上替换的1mL针头小心从左心室心尖插入，缓慢注入生理盐水20mL，迅速断头收集脑组织，快速用双蒸水冲洗组织表面去除血液。将脑组织浸于Golgi-Cox试剂中避光浸染2日，再重新更换试剂继续浸染至14日。2)脱水：将脑组织从浸染液中取出，擦除表面液体，4C下依次用10％、20％、30％的蔗糖溶液避光梯度脱水至沉底。3)切片：将30％蔗糖溶液注满样品槽后，对脑组织进行修块。得到海马组织。固定于样品台，启动振动切片机，校准，以振幅1.5V、速度0.05um/s进行切片，片厚200um。将脑片贴于载玻片上，吸去水分，晾干备用。4)染色：在通风橱中按照如下操作进行染色:①蒸馏水冲洗3次，l min/次②氨水碱化60min③蒸馏水冲洗3次，l min/次④定影液固定30min⑤蒸馏水冲洗3次，l min/次⑥乙醇多梯度脱水:50％乙醇，1min；70％乙醇，1min；95％乙醇，1min；100％乙醇2次，5min/次；⑦二甲苯透明3次，4min/次；⑧中性树胶封片，室温避光嚓干。

(3)拍照及数据分析：在光学显微镜100倍油镜下拍摄结构清晰、与其他树突交叉较少的树突。采用ImageJ软件按每组取4只小鼠、每只小鼠取3个独立神经元、每个独立神经元取3个二级树突分支进行树突棘密度统计，结果以树突棘数目/um表示。

所有实验结果均以平均值+标准误(Mean+SEM)表示。所有实验结果均采用IBMSPSS 19.0和Graphpad Prism 7软件进行统计和可视化分析。采用单因素方差分析(ANOVA)分析组间差异，并通过Tukey检验进行多重比较。p<0.05被认为具有统计学意义。

2实验结果

2.1如表1，表2，表3和表4所示，与卵巢摘除抑郁模型组相比，假手术对照组小鼠海马CA1、CA2区、CA3区和DG区神经元树突棘密度显著上升。与卵巢摘除抑郁模型组相比，附子理中制剂高剂量给药7天组小鼠海马CA1区、CA2区、CA3区和DG区神经元树突棘密度显著上升。然而，在mTORC1拮抗剂雷帕霉素给药后，附子理中制剂高剂量给药7天组小鼠海马CA1区，CA2区，CA3区和DG区神经元树突棘密度显著下降。

表1雷帕霉素对附子理中制剂反复给药卵巢摘除小鼠海马CA1区树突棘表达水平的影响

表2雷帕霉素对附子理中制剂反复给药卵巢摘除小鼠海马CA2区树突棘表达水平的影响

表3雷帕霉素对附子理中制剂反复给药卵巢摘除小鼠海马CA3区树突棘表达水平的影响

表4雷帕霉素对附子理中制剂反复给药卵巢摘除小鼠海马DG区树突棘表达水平的影响

本实验研究证明，附子理中制剂混悬液高剂量(13.5g/kg，i.g.)组反复给药7天可显著提高抑郁模型小鼠海马CA1区、CA2区、CA3区和DG区树突棘密度，表现出一定的抗抑郁作用，但这一作用可以被mTORC1拮抗剂雷帕霉素所阻断。

本实验研究证明，附子理中制剂高剂量组在对小鼠连续灌胃给药7天可显著缩短小鼠在强迫游泳实验中的不动时间，表现出一定的抗抑郁作用。本发明从附子理中制剂的给药剂量和作用机制两个方面说明其对卵巢摘除诱导的抑郁样行为的作用，通过以上具体实施实例可知，高剂量的附子理中制剂13.5g/kg(i.g.)能够显著逆转抑郁模型小鼠强迫游泳实验和悬尾实验不动时间，并增加抑郁模型小鼠的挣扎时间，且这一作用是通过激活mTORC1(BDNF-TrkB-mTORC1)通路引起的，所以本发明为附子理中制剂在临床上具有改善胃肠疾病和治疗围绝经期抑郁症靶向药物。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。对于本领域技术人员而言，本发明不限于上述示范性实施例的细节，在不背离本发明基本特征的前提下，可以通过其他形式实现本发明。基于本发明中的实施例，本领域技术人员所获得的无创造性劳动的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims

1.附子理中制剂作为抗抑郁靶向药物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑郁是mTORC1、BDNF、TrkB、P70S6K、PSD95、GluA1蛋白其中的一种或几种表达下调导致的抑郁样行为。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的抗抑郁为上调前额叶皮质和海马中mTORC1蛋白的表达、前额叶皮质和海马中BDNF蛋白的表达、前额叶皮质和海马中TrkB蛋白的表达、前额叶皮质和海马中P70S6K蛋白的表达、前额叶皮质中PSD95蛋白的表达和/或前额叶皮质和海马中GluA1蛋白的表达。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抑郁是动物卵巢摘除后出现的抑郁样行为。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述动物为女性或雌性小鼠。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑郁样行为是在小鼠卵巢摘除后给附子理中制剂7天检测行为学效应来判定：在小鼠强迫游泳实验中不动时间增加且挣扎时间具有下降和/或在小鼠悬尾实验不动时间增加。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述附子理中制剂提高小鼠和卵巢摘除后小鼠的海马CA1区、CA2区、CA3区和DG区树突棘密度。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述附子理中制剂由附子、党参、炒白术、干姜和甘草，以及一种或多种药学上可接受的辅料制成。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述附子、党参、炒白术、干姜和甘草的重量比为1：2：1.5：1：1。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述附子理中制剂为口服制剂，包括但不限于糖浆剂的液体制剂、或者包括但不限于颗粒剂、片剂、胶囊、丸剂、滴丸剂型的固体剂型。