CN115247140A - 一种砷胁迫下降解石油烃的菌株及其应用 - Google Patents

一种砷胁迫下降解石油烃的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种砷胁迫下降解石油烃的菌株及其应用，该菌株于2022年5月20日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2022684，保藏名称为鲍曼不动杆菌Acinetobacter sp.JYZ‑3，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。该菌株不仅可以应用于修复单一石油烃污染环境，也可以应用于修复砷‑石油烃复合污染环境中。

Description

一种砷胁迫下降解石油烃的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种砷胁迫下降解石油烃的菌株及其应用。
背景技术
随着油田开采的不断加剧，石油污染问题越来越引起人们的关注。利用微生物可以使石油中的一部分物质作为营养物质被吸收，转化合成微生物体内的有机成分或者繁殖成新的微生物，剩下的部分被生物氧化分解成简单的有机或无机物，从而达到降低石油烃污染的目的。
然而，土壤中的石油烃污染常常伴随着重金属污染，形成的复合污染会影响生物菌群的生存能力，导致现有的石油烃生物处理技术普遍存在微生物降解能力差、菌群适应性不佳、需要频繁接种等问题，运行困难、成本高，难以实现大规模工业化推广应用。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明的目的之一在于提供一种砷胁迫下降解石油烃的菌株，其信息如下：鲍曼不动杆菌Acinetobacter sp.JYZ-3，于2022年5月20日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2022684，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
形态特征为：菌株纯化后在平板上观察，菌株呈灰白色、圆形、光滑、边缘整齐。在光学显微照片及扫描电镜下形态观察，菌株呈短杆状。
该菌株既能够用于修复单一石油烃污染的环境，也能用于同时修复砷-石油烃复合污染的环境。
本发明的目的之二在于提供一种微生物菌剂，该菌剂中含有上述保藏的菌株。
本发明的目的之三在于提供上述菌株在降解石油烃中的应用。
本发明的目的之四在于提供上述菌株在生物修复石油污染中的应用。
本发明的目的之五在于提供上述菌株在生物修复砷石油污染中的应用。
本发明的目的之六在于提供上述菌株在生物修复砷石油污染土壤中的应用。
本发明的目的之七在于提供上述菌株在生物修复砷石油污染水体中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中柴油波长扫描结果；
图2为本发明实施例1中柴油浓度与吸光度的标准曲线；
图3为MSM培养过程中各因素对菌株生长的影响，其中A为pH对菌株生长的影响结果，B为温度对菌株生长的影响结果，C为接种量对菌株生长的影响结果，D为盐度对菌株生长的影响结果；
图4为不同重金属对03号菌株生长的影响；
图5为菌株在砷-石油烃复合污染土壤和石油烃单一污染土壤中对石油烃的降解效率结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1菌株的筛选
(1)石油烃降解菌株的富集分离
用量筒量取95mL的超纯水倒入三角瓶中，与20颗玻璃珠置于高温灭菌锅中灭菌，制成无菌水，称量5g土壤与灭菌的玛瑙珠浸泡其中，将三角瓶置于30℃恒温摇床，150rpm震荡培养30min，使细胞充分分散到无机盐培养基中，震荡完成后，静置10min，上清液即为菌悬液。
(2)高降解活性菌株的筛选
吸取1mL的0#柴油过0.22μm的滤膜除去杂菌，加到94mL MSM培养基中，在无菌环境下，接种5mL的上述菌液，空白对照不接种菌悬液，放入恒温摇床中以150rpm、30℃的条件下震荡培养，7天后以5％的接种量转接到新的MSM培养基中继续培养，7天后将培养基稀释10、102、103、104、105、106、107倍涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，待长出单菌落后进行分离纯化得到单一菌株。
(3)菌株的鉴定
将分离纯化得到的7株菌株分别编号为01、02、03、04、05、06、07进行鉴定，其中生理生化鉴定结果如下表1所示：
表1生理生化鉴定实验结果
实验\菌株 01 02 03 04 05 06 07
革兰氏染色 G- G- G- G- G- G- G-
接触酶 + + + + + + +
乳化性能 0.47 0.56 0.48 0.46 0.47 0.46 0.46
淀粉酶 + + + + + + +
甲基红 - - + - + - +
采用模板DNA(菌液)2μL、引物27f(10μmol/L)1μL、引物1492r(10μmol/L)1μL、2×EasyTaq PCR SuperMix10μL、水11μL的25μLPCR反应体系进行扩增及鉴定，鉴定结果如下表2所示：
表2各菌株鉴定结果
菌株 菌属/种 同源性
01 Acinetobacter sp. 99.93％
02 Pseudomonas aeruginosa 100％
03 Acinetobacter baumannii 99.86％
04 Acinetobacter junii 99.86％
05 Acinetobacter oleivorans 100％
06 Delftia tsuruhatensis 99.93％
07 Chryseobacterium hungaricum 99.79％
(4)耐砷及柴油降解菌株的筛选
对1000mg/L柴油-石油醚标准溶液用紫外可见分光光度计进行200～400nm波长扫描，找出最佳吸收波长后绘制标准曲线进行验证。
将分离的不同菌株在含1mg/L砷的含油MSM培养基中培养5天，对照不接种菌悬液，8000rpm离心10min，将上清液倒入125mL分液漏斗中，用20mL石油醚萃取柴油，取上层液体稀释10倍后用紫外可见分光光度计在参考波长处测定，降解效率计算方法如下：
降解效率(％)＝(对照残余柴油含量-样品残余柴油含量)/对照残余柴油含量×100
柴油扫描结果发现6次扫描结果均在258nm处吸光度稳定，确定285nm为参考波长，并检测标准曲线，标准曲线R2＝0.9995，证明参考波长结果可信，柴油扫描结果如图1所示，标准曲线如图2所示(横轴为柴油浓度，纵轴为吸光度)，7种菌株在含砷和不含砷的MSM培养基中的生长密度及对柴油的降解效率如表3所示：
表3各菌株对柴油的降解效率及生长密度
菌株编号 5d降解效率(％) 6d细菌密度(无砷) 6d细菌密度(含砷)
01 34.43 0.5071 0.4772
02 25.72 0.1793 0.1467
03 64.92 1.2032 0.815
04 62.90 0.5029 0.446
05 57.56 0.1905 0.2966
06 46.00 0.0992 0.0839
07 45.34 0.0782 0.0774
从上表可以看出，03、04、05号菌株对柴油的降解效率最高，其中03号菌株在砷的胁迫下生长最快。
将03号菌株命名为：鲍曼不动杆菌Acinetobacter sp.JYZ-3，并于2022年5月20日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2022684，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
(5)培养条件的确定
研究MSM培养基中pH、盐度、初始接种量、温度四个单因素对菌株生长产生的影响，具体结果如图3所示，并确定出03菌株最佳最佳生长环境为pH 7、温度25～30℃、盐度0.1％、接种量2％，与驯化过程条件基本保持一致。
实施例2 03号菌株对石油烃降解效率研究
柴油为中质石油，主要由碳原子个数为C11～C25的烷烃组成。将菌株用LB培养基培养至对数生长期后，于50mL离心管8000rpm离心5min，弃去上清液，用灭菌的生理盐水悬浮菌体，重复以上操作3次，调节菌悬液OD600＝1.2，以1％接种量接入质量百分比为1％的柴油MSM培养基中。将培养7d后MSM培养基倒入离心管8000rpm离心10min，用石油醚萃取残余柴油并洗涤三角瓶和离心管，合并萃取液定容至20mL，稀释10倍后进行测定。各正构烷烃降解效率如下表4所示：
表4各正构烷烃降解效率
碳原子个数 空白对照含量(mg/L) 实验组降解效率(％)
C11 11.94±0.80 48.78±0.97
C12 113.70±5.87 74.65±6.05
C13 294.27±18.76 87.51±4.36
C14 644.28±43.60 81.25±6.95
C15 794.74±54.45 83.85±5.10
C16 596.48±40.25 84.33±4.42
C17 355.69±25.30 85.20±3.41
C18 360.10±12.02 84.03±5.09
C19 346.46±22.48 85.87±3.95
C20 235.60±18.70 83.94±7.68
C21 202.03±14.08 89.29±3.85
C22 114.92±9.14 89.18±3.59
C23 47.27±3.43 78.70±8.59
C24 26.43±2.30 93.65±8.98
C25 13.14±0.80 100±0
总(C11～C25) 4157±246 84.05±5.11
7天后对照组MSM培养基中(不接种菌液)总正构烷烃含量为4157mg/L，实验组的降解率为84.05％。
实施例3 03号菌株对重金属的耐受能力研究
比较Cu、As(V)、Pb、Cd、Cr(Ⅵ)5种不同重金属对03号菌株的毒害，在LB培养基中找出不同重金属对菌株产生毒害的临界浓度。
具体步骤如下：在LB培养基中接入降解菌培养至OD600为0.8～1.0之间作为种子液，将03菌株以2％接种量接入含不同浓度不同重金属离子的LB培养基中，置于150rpm摇床30℃恒温培养12h后测定其OD600，具体结果如图4所示，其中Cu2+对菌株开始产生明显毒害的浓度为150mg/L，Cd2+为20mg/L，Pb2+为400mg/L，Cr(Ⅵ)毒性强，存在5mg/L即会对菌株生长产生明显抑制。As(V)毒性较强，但菌株在700mg/L范围内对As(V)具有一定的耐受性，生长没有明显受到抑制，说明菌株耐受As(V)毒性能力较强，而对其余重金属的毒害，其生长存在一定的阈值。
实施例4 03号菌株对石油烃、石油烃和砷复合污染土壤的降解效果
将采集的土壤风干、磨碎过2mm筛，与柴油混合，密封避光老化10d，使石油烃在土壤中分布均匀，制成模拟石油污染土壤。用LB培养基中接入03菌株培养过夜，8000rpm离心5min，用无菌水洗菌3次，调节菌悬液OD600＝0.9左右。加入10mL菌悬液，接种量约为5×107CFU/g土壤。将实验组置于30℃生化培养箱中恒温培养，定时加灭菌纯水保持含水率为10％左右，每隔5～7天测定剩余石油烃含量，对比土壤中菌株是否受砷胁迫导致降解效率降低，具体结果如图5所示。菌株在复合污染土壤中，与石油烃单一污染土壤中降解效率并没有下降，因此，菌株具有较好的砷-石油烃复合污染土壤修复潜能。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种砷胁迫下降解石油烃的菌株，于2022年5月20日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2022684，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1所述的菌株。
3.权利要求1所述的菌株在降解石油烃中的应用。
4.权利要求1所述的菌株在生物修复石油污染中的应用。
5.权利要求1所述的菌株在生物修复砷石油污染中的应用。
6.权利要求1所述的菌株在生物修复砷石油污染土壤中的应用。
7.权利要求1所述的菌株在生物修复砷石油污染水体中的应用。
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