CN105936884A - 一株能耐受高砷锑污染并氧化As(Ⅲ)的包西氏菌AS-1菌株及其用途 - Google Patents

一株能耐受高砷锑污染并氧化As(Ⅲ)的包西氏菌AS-1菌株及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株既能耐受高砷锑污染又能氧化As(Ⅲ)的包西氏菌AS‑1菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为：CCTCC NO：M2016190；该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明分离筛选的菌株可以将三价砷氧化为五价砷，极大地降低了环境中砷的危害。本发明的AS‑1菌株具有很强的氧化性和适应性，在净化砷污染方面能够发挥重要作用。

Description

一株能耐受高砷锑污染并氧化As(Ⅲ)的包西氏菌AS-1菌株及其用途
技术领域
本发明涉及一种包西氏菌菌株，该菌株可耐受和净化高砷锑污染，属于微生物技术领域。
背景技术
砷是一种广泛存在于自然界中的元素。长期暴露会导致一系列疾病，例如皮肤病，癌症等。无机态的砷是砷元素毒性最大是形式，一般情况下土壤、水体、食物中都含有微量砷。近期的研究发现，砷的毒性远远大于先前的认知，仅孟加拉国就有7700万人口暴露在含砷水中。尽管砷以各种形式存在于自然界中，但目前发现毒性最大的是水体中的亚砷酸盐(H3AsO3)以及砷酸盐(H3AsO4)。而三价砷的毒性比五价砷大100倍。
锑的毒性和砷相似。三价锑化合物的毒性较五价锑强，吸入后会引起溶血和肝、肾障碍、肺水肿。锑的毒性和砷相似。三价锑化合物的毒性较五价锑强，吸入后会引起溶血和肝、肾障碍、肺水肿。世界卫生组织规定:饮用水中锑含量不得超过5ug/L。我国的锑矿储量位居世界第一，锑产量约占世界总量的79.6％，很多地区由于锑矿开采受到严重污染。
目前，针对砷锑污染已经出现了一些治理方法，主要有以下几种：一是化学方法，比如化学沉淀，此法效果明显，但存在二次污染；二是物理方法，比如物理吸附，此法费用高，不利于大范围应用；三是植物修复方法，将某些能利用砷的植物种植到污染位点，将砷富集到植物体内，再收集植物体并妥善处理，但此法不适应处理大面积污染环境。三是微生物氧化方法，随着很多研究者分离筛选出具有氧化能力的菌种，微生物氧化的使用应运而生，成为当前热点，但大部分菌株耐受浓度和氧化效率较低。
发明内容
本发明解决了背景技术中的问题，提供了一种能耐受高砷锑污染并氧化As(Ⅲ)的包西氏菌AS-1菌株，该菌株可耐受高浓度砷锑污染，并且能高效的将三价砷氧化为五价砷，极大地降低了环境中砷的毒性并增强了砷的可吸附去除性，达到对环境净化的效果。
本发明人筛选到一株新型砷氧化菌，该菌株被命名为AS-1，属一种包西氏菌(Bosea sp. AS-1)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为：CCTCC NO：M2016190；该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
由于三价砷比五价砷的毒性强100倍，而且三价砷不带电荷、具有很强的移动性，不易被去除，对环境的危害更大；所以提供一种能够针对性氧化处理三价砷的微生物是本领域急需解决的问题。而本发明分离筛选的菌株可以将三价砷氧化为五价砷，极大地降低了环境中砷的危害。本发明的AS-1菌株具有很强的氧化性和适应性，在净化砷污染方面能够发挥重要作用。
附图说明
图1为Bosea sp.AS-1菌株在2mM/L砷浓度环境下的生长曲线图及氧化率曲线图；
图2为Bosea sp.AS-1菌株在5mM/L砷浓度环境下的生长曲线图及氧化率曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
菌株的筛选、分离和鉴定
本实施例中从中国湖南省锡矿山砷污染的表层土壤，加一定浓度NaAsO2进行富集培养，再对富集培养的土样进行稀释并涂布含有一定浓度NaAsO2的MMM固体培养基平板，培养长出砷抗性菌，挑取不同形态的菌落划线得单菌落，再接种到MMM液体培养基，用KMnO4法检测出砷氧化菌，用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光(HPLC-HG-AFS)测As(Ⅲ)和As(Ⅴ)浓度，并计算氧化率。再对检测出的砷氧化菌做16S核糖RNA基因(16S rDNA)、形态学等相关鉴定工作，最终得到包西氏菌，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
详细技术步骤如下：
(1)样品采取：2015年7月采取湖南省锡矿山尾矿坝渗滤水附近土壤。
(2)样品富集：精确称量100g于250ml灭菌锥形瓶中，加2.5ml的500mM的NaAsO2置30℃恒温培养箱中培养一周。
(3)砷抗性菌分离：精确称量NaAsO2富集土样10g于装有90ml无菌生理盐水的锥形瓶中，置于30℃摇床中振荡0.5h。再依次取1ml到9ml无菌生理盐水中逐步稀释至10-3、10-4、10-5，分别取0.1ml涂布到含5mM/L的MMM固体培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，置30℃恒温培养箱中培养三天，长出的菌株为砷抗性菌，将平板置4℃冰箱中待用。MMM固体培养基配方如下，1L培养基包括：大量元素：7.568g Na2HPO4·7H2O，1g KH2PO4，1g NH4Cl，0.3gMgSO4·7H2O；酵母提取物1g；微量元素5ml和维生素10ml；5mM As(Ⅲ)，1.5％的琼脂。大量元素和琼脂121℃高压灭 菌，其它过滤灭菌。
1L微量元素包括:50g EDTA，22g ZnSO4·7H2O，5.54g CaCl2，5.06g MnCl2·4H2O，4.99g FeSO4·7H2O，1.1g(NH4)6Mo7O24·4H2O,1.57g CuSO4·5H2O and1.61g CoCl2·7H2O.
1L维生素包括:0.002g biotin，0.002g folic acid，0.01gpyridoxine hydrochloride，0.005g nicotinic acid，0.005g pantothenic acid，0.0001g B12，0.005g p-aminobenzoic acid，and 0.005g thioctic acid。
(4)划线分离：将步骤(3)中得到的砷抗性菌挑取不同菌落划线，确保得到单菌落，划线用MMM培养基平板，待菌长出后放4℃冰箱中待用并用甘油冷冻管保存三份于-80℃冰箱。
(5)砷氧化菌筛选：将步骤(4)中得到的砷抗性菌的菌落转接到MMM液体培养基中，砷浓度为5nM/L，置30℃摇床中振荡培养，待菌长浓后用KMnO4检测其氧化性。方法如下，取1ml上述培养的MMM菌液到1.5ml离心管中，离心，取上清液到新的离心管中，再加入100μl 0.01M KMnO4溶液，若KMnO4由粉红色变为橙色说明没有氧化，若KMnO4仍为粉红色说明发生氧化(KMnO4可以将NaAsO2氧化为Na3AsO4，菌液中如存在NaAsO2，则KMnO4发生变色)。MMM液体培养基配方同MMM固体培养基，只是不含琼脂。
(6)砷氧化菌的分类鉴定：一是利用16S rDNA鉴定，即采用原核生物16S rDNA通用引物27F(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和1492R(5'GGYTACCTTGTTACGACTT3')进行PCR扩增，扩增其16S rDNA并测序，再与国际NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸数据库对比，核苷酸同源性为99％。鉴定为Shinella sp.；二是革兰氏染色分析。Shinella sp.AS-1菌学特征如下：杆状；革兰氏阴性；菌落呈圆形，中间凸起，呈乳白色，端生鞭毛，无芽孢。大小约(0.5～1)μm x(1.5～2)μm。三是扩增砷氧化酶基因－aoxB，采用引物M1-2F(5'-CCACTTCTGCATCGTGGGNTGYGGNTA-3')和M3-2R(5'-TGTCGTTGCCCCAGATGADNCCYTTYTC-3')进行PCR扩增，体系为25ul，其中Ex Taq 12.5ul，M1-2F 1ul，M3-2R 1ul，RNA-free water 8.5ul，DNA 2ul。得到1058-1111bp的条带，再与国际NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸数据库对比，核苷酸同源性为97％，确定为砷氧化酶基因。上述aoxB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示所示。
(7)锑耐受检测：由于该菌分离与高砷及锑污染土壤，进一步检测此株菌能否耐受锑污染环境，通过在MMM培养基中添加酒石酸锑钾(KSbC4H4O7)发现，Bosea sp.AS-1至少可耐受600mg/L的Sb(Ⅲ)。
菌株的保藏：
该菌株可以在MMM固体或液体培养基30℃培养，培养后可在4℃下短期保藏。若长期保藏，可使用甘油冷冻管或冷冻干燥管保藏菌株比较合适。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为：CCTCC NO：M2016190。
菌株的性能研究：
下面给出本发明所提供的包西氏菌AS-1菌株的性能研究结果：
1、菌株的生长曲线和三价砷氧化曲线
挑取菌株接种到10mlMMM液体培养基，置30℃摇床中震荡培养48h作为种子菌液用于接种。此时细胞密度OD600为0.25，保存在4℃冰箱做种子菌液备用。以1％的接种量吸取1ml菌液到新鲜100mlMMM培养基中，As浓度分别为2mM/L、5mM/L，,置30℃摇床中震荡培养，每隔2小时取一次样，直至As(Ⅲ)完全氧化。取1ml菌液用分光光度法测细胞密度(OD600)，以不加菌株的培养基为标准；将2mM/L的菌液稀释2000倍(75μg/l)，5mM/L的菌液稀释5000倍(75μg/l)后取1ml，用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光(HPLC-HG-AFS)测As(Ⅲ)和As(Ⅴ)浓度。依次绘制生长曲线和氧化曲线图，分别如图1和图2所示，图1中：三价砷浓度为2mM/L；X轴——时间，取样间隔2h；左轴Y——溶液在600nm波长处的吸光度；右Y轴——三价砷氧化率(As(Ⅴ)/As(总))；图2中：三价砷浓度为5mM/L；X轴——时间，取样间隔2h；左轴Y——溶液在600nm波长处的吸光度；右Y轴——三价砷氧化率(As(Ⅴ)/As(总))。
2、检测包西氏菌AS-1菌株的最大耐受砷浓度
检测包西氏菌AS-1菌株的最大耐受砷浓度，将细菌分别接种到砷浓度分别为5mM/L、8mM/L、12mM/L、15mM/L、20mM/L、30mM/L、40mM/L和50mM/L的液体培养基中培养，置30℃摇床中震荡培养，观察到多大浓度后培养基不会浑浊。经试验得到AS-1菌株的最大耐受砷浓度为1100mg/L，证明本发明提供的AS-1菌株能够耐受高浓度砷。
3、检测包西氏菌对三价锑的最大耐受浓度
检测包西氏菌AS-1菌株的最大耐受锑浓度，将细菌分别接种到锑浓度分别为到三价砷浓度分别为100μM/L、200μM/L、500μM/L、800μM/L、1mM/L、2mM/L、3mM/L、4mM/L和5mM/L的液体培养基中培养，置30℃摇床中震荡培养，观察到多大浓度后培养基不会浑浊。
经试验得到Bosea sp.AS-1至少可耐受浓度为600mg/L的三价锑。

Claims (3)

1.一株既能耐受高砷锑污染又能氧化As(Ⅲ)的包西氏菌(Bosea sp.)AS-1菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为：CCTCC NO：M2016190，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述包西氏菌AS-1菌株的用途，其特征在于：用于将无机三价砷氧化为无机五价砷。
3.根据权利要求2所述包西氏菌AS-1菌株的用途，其特征在于：用于处理含砷废水。
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