CN115245516A - 一种抗卵巢癌肿瘤药物联用方法、体外和体内验证方法 - Google Patents

一种抗卵巢癌肿瘤药物联用方法、体外和体内验证方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗卵巢癌肿瘤药物联用方法、体外和体内验证方法。具体涉及奥拉帕尼联合CD47中和抗体在抗卵巢癌肿瘤中的应用，主要解决目前奥拉帕尼在非BRCA突变卵巢癌肿瘤中联合用药较少的技术问题。本发明通过奥拉帕尼联合CD47中和抗体的抗卵巢癌肿瘤活性试验，显示较好的抗卵巢癌肿瘤活性，提出新的肿瘤联合治疗方法。

Description

一种抗卵巢癌肿瘤药物联用方法、体外和体内验证方法
技术领域
本发明涉及抗肿瘤治疗领域，尤其涉及一种抗卵巢癌肿瘤药物联用方法、体外和体内验证方法。
背景技术
肿瘤的治疗一直被全世界所密切关注。由于肿瘤早期具有转移的能力，肿瘤细胞生长快、易变异，从而对常规化疗药物，尤其是单药化疗产生耐药，导致化疗失败，因此仍需要研究开发新型抗肿瘤药物以满足临床治疗的需求。
肿瘤巨噬细胞是乳腺肿瘤中肿瘤浸润性白细胞的主要群体之一，巨噬细胞是一种异质性的细胞群，常分为M2样(促肿瘤表型)和M1样(抗肿瘤表型)巨噬细胞。巨噬细胞具有很强的吞噬能力。M1巨噬细胞常产生促炎细胞因子，吞噬微生物，并启动免疫反应。
“自我标记”膜蛋白CD47通常在肿瘤细胞上高表达，并与巨噬细胞上的“信号调节蛋白”SIRP-a结合抑制巨噬细胞的吞噬功能，进而协助肿瘤细胞免疫逃逸。靶向CD47是癌症免疫治疗的一种新策略，抗CD47 IgG倾向于激活巨噬细胞的吞噬作用。
PARP抑制剂选择性地诱导具有同源重组缺陷(HRD)的癌症细胞进入凋亡，最显著的是BRCA1和BRCA2基因突变的癌症细胞。
然而，最近的临床证据表明，无论BRCA1/2或HRD状态如何，PARP抑制剂作为癌症治疗药物都是有效的，这表明更广泛的患者群体可能受益于PARP抑制剂治疗。
目前，四种PARP抑制剂已获美国食品和药物管理局(FDA)批准，用于治疗BRCA突变的晚期卵巢癌和乳腺癌。
尽管已经证明PARP抑制剂可以提高无进展生存期，但癌细胞不可避免地会产生耐药性。为了克服对PARP抑制剂的耐药性，优先考虑PARP抑制剂与激活免疫反应的药物进行联用。
PAPR抑制剂与新型癌症疗法的组合使用仍是一个创新领域。联合治疗已成为癌症治疗的一个重要发展方向，亟待新的联合治疗方案来更有效的对抗各种癌症。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种抗卵巢癌肿瘤药物联用方法、体外和体内验证方法，解决现有技术中奥拉帕尼在非BRCA突变卵巢癌肿瘤中联合用药较少的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是提供一种新型抗卵巢癌肿瘤联合用药体外验证方法，用奥拉帕尼处理已经敲低CD47表达的卵巢癌细胞ID8，验证与之共培养的巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力，包括：
(1)取小鼠骨髓单核细胞，用包含有浓度为20ng/ml的C-MSF、10％胎牛血清、100units/ml青霉素以及100units/ml链霉素的DMEM培养基中培养5天，换成包含有浓度为20ng/ml的C-MSF、10％胎牛血清、100units/ml青霉素以及100units/ml链霉素的卵巢癌细胞ID8上清进行培养48小时，诱导为肿瘤相关巨噬细胞TAM；
(2)将带绿色荧光蛋白的sh Scramble ID8细胞、sh CD47 ID8细胞与TAM共孵育，分为四组，shSramble ID8+TAM+saline组、shCD47ID8+TAM+saline组、shSramble ID8+TAM+Olaparib组、shCD47 ID8+TAM+Olaparib组；
(3)向以上四组同时加入奥拉帕尼2.5uM或者saline,37°共孵育1小时，再用F4/80标记巨噬细胞，流式检测F4/80+GFP+来表示巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的效率；
(4)流式检测发现shCD47 ID8+TAM+Olaparib组F4/80+GFP+的细胞数量最多。
优选的，敲低CD47表达的卵巢癌细胞ID8的方法包括：
第一步，用完全培养基对小鼠卵巢癌细胞ID8制备第一密度的细胞悬液，然后从中定量取出，分别移入到孔板中的多个容纳孔中，继续培养第一时长；
第二步，取出低温环境保存的小鼠CD47 shRNA病毒，冰上进行缓慢融化；用完全培养基将所述小鼠CD47 shRNA病毒稀释至少三种不同的滴度，且每种滴度的容量均为第一容量；
第三步，向所述容纳孔中加入经过稀释后的小鼠CD47 shRNA病毒液，感染后8-12h，再向每个容纳孔中加入100ul完全培养基，保持细胞正常生长；
第四步，继续培养2-3天，期间补充营养基，保持细胞活性；
第五步，感染效果确认，感染后72小时，荧光表达丰度较高时，用显微镜观察，当感染效率在80％，且细胞生长良好的组继续扩大培养，扩大培养后进行流式细胞分选，分选出GDP阳性的细胞，即转染成功的细胞。
本发明还提供一种抗卵巢癌肿瘤药物联用体内验证方法，奥拉帕尼联合中和抗体Anti-CD47 IgG对小鼠体内肿瘤生长抑制进行验证，包括：
(1)分别给小鼠接种LUC+GFP ID8细胞，分为四组，Isotype处理组、Anti-CD47 IgG处理组、奥拉帕尼联合Isotype处理组、奥拉帕尼联合Anti-CD47 IgG处理组；
(2)从接种肿瘤细胞第7天给予奥拉帕尼，50mg/kg/day，腹腔注射，接种第10天和第20天，给予Isotype或者Anti-CD47 IgG，50ug/只，瘤内注射；
(3)开始给药后每隔7天进行小动物活体成像，隔天测量肿瘤体积及小鼠体重；
(4)对小鼠肿瘤体积进行隔天测量，奥拉帕尼联合Anti-CD47IgG处理组肿瘤体积明显小于单独使用奥拉帕尼处理组，肿瘤体积更小。
本发明还提供一种抗卵巢癌肿瘤药物联用方法，将奥拉帕尼联合CD47中和抗体用于抗卵巢癌肿瘤治疗。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种抗卵巢癌肿瘤药物联用方法、体外和体内验证方法。具体涉及奥拉帕尼联合CD47中和抗体在抗肿瘤中的应用，主要解决目前奥拉帕尼在非BRCA突变肿瘤中联合用药较少的技术问题。本发明通过奥拉帕尼联合CD47中和抗体的抗肿瘤活性试验，显示较好的抗肿瘤活性，提出新的肿瘤联合治疗方法和药物。
附图说明
图1是小鼠CD47shRNA病毒稀释示意图；
图2是RT-PCR验证敲低ID8细胞上CD47表达的效果图；
图3是RT-PCR验证敲低E0771细胞上CD47表达的效果图；
图4是抗卵巢癌肿瘤药物联用体外验证方法一实施例流程图；
图5是敲低CD47表达的ID8细胞及巨噬细胞共培养，经奥拉帕尼处理后吞噬能力流式检测图；
图6是敲低CD47表达的ID8细胞及巨噬细胞共培养，经奥拉帕尼处理后吞噬能力流式检测结果统计图；
图7是敲低CD47表达的E0771细胞及巨噬细胞共培养，经奥拉帕尼处理后吞噬能力流式检测图；
图8是敲低CD47表达的E0771细胞及巨噬细胞共培养，经奥拉帕尼处理后吞噬能力流式检测结果统计图；
图9是基于小鼠皮下卵巢癌模型的小鼠荷瘤及治疗活体成像荧光示意图；
图10是基于小鼠皮下卵巢癌模型的小鼠荷瘤第7天开始每隔一周进行喂药时间安排图；
图11是基于小鼠皮下卵巢癌模型的对活体成像荧光值统计图；
图12是基于小鼠皮下卵巢癌模型的小鼠肿瘤体积统计图；
图13是基于小鼠原位乳腺癌模型的小鼠荷瘤及治疗活体成像荧光示意图；
图14是基于小鼠原位乳腺癌模型的小鼠荷瘤第7天开始每隔一周进行喂药时间安排图；
图15是基于小鼠原位乳腺癌模型的活体成像荧光值统计图；
图16是基于小鼠原位乳腺癌模型的小鼠肿瘤体积统计图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
需要说明的是，除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例一
首先，本发明提供一种敲低小鼠癌细胞中CD47表达的方法实施例，具体包括步骤：
第一步，用完全培养基对小鼠癌细胞制备第一密度的细胞悬液，然后从中定量取出，分别移入到孔板中的多个容纳孔中，继续培养第一时长；
第二步，取出低温环境保存的小鼠CD47 shRNA病毒，冰上进行缓慢融化；用完全培养基将所述小鼠CD47 shRNA病毒稀释至少三种不同的滴度，且每种滴度的容量均为第一容量；
第三步，向所述容纳孔中加入经过稀释后的小鼠CD47 shRNA病毒液，感染后8-12h，再向每个容纳孔中加入100ul完全培养基，保持细胞正常生长。期间不再更换病毒液，以免损失细胞数量。
第四步，继续培养2-3天，期间可以补充营养基，保持细胞活性；
第五步，感染效果确认，感染后72小时，荧光表达丰度较高时，用显微镜观察，优选的，感染效率80％左右，且细胞生长良好的组可继续扩大培养。扩大培养后进行流式细胞分选，分选出GDP阳性的细胞，即转染成功的细胞。
优选的，在第一步中，其中的小鼠癌细胞包括小鼠卵巢癌细胞ID8或乳腺癌细胞E0771。
优选的，在第一步中，第一密度的细胞悬液是密度为5*104个/ml的细胞悬液。所述定量为100ul，也即是在每个容纳孔中加入定量为100ul的上述密度的细胞悬液，例如取100ul/孔分组加入96孔板中，共12个孔，其中3孔作为Control组，37°培养16-24小时，至细胞汇合度为20-30％。
优选的，在第二步中，所述小鼠CD47 shRNA慢病毒液包括：LV-CD47-RNAi(96931-1)、LV-CD47-RNAi(96932-1)、LV-CD47-RNAi(96930-1)(购自吉凯基因)，分别用于转染卵巢癌细胞ID8和乳腺癌细胞E0771。
优选的，在第二步中，将所述小鼠CD47 shRNA病毒稀释至少三种不同的滴度包括1x108TU/ml，5x107TU/ml，1x107TU/ml，优选的所述第一容量是50微升，稀释过程参考图1。
优选的，对于第三步，为了确认合适的感染条件，按照不同培养条件分为四组：
M组：完全培养基组:观察常规培养条件下病毒对细胞的感染效果；A组：完全培养基+HiTransG A组，观察HiTransG A是否可以提高感染效果；P组：完全培养基+HiTransG P组，观察HiTransG P是否可以提高感染效果；Control组：监控实验过程中细胞生长是否正常。
优选的，吸掉各孔中上清液，按照表1更换培养基，加入病毒和相应感染增强液(HiTransG A或HiTransG P),混匀，继续培养。感染后12h用完全培养基进行换液，过程中观察细胞形态，保持细胞正常生长。
表1不同病毒和感染增强液分组表
Figure BDA0003451864720000071
优选的，为了验证上述敲低小鼠癌细胞中CD47的方法的效果，具体采用了RT-PCR方法验证卵巢癌细胞ID8和乳腺癌细胞E0771中CD47的敲低验证效果，验证方法包括：或
1.用RNA提取试剂(Trizol)收取，分别用慢病毒液LV-CD47-RNAi(96931-1)、LV-CD47-RNAi(96932-1)、LV-CD47-RNAi(96930-1)病毒液感染的乳腺癌细胞E0771和卵巢癌细胞ID8，提取RNA，进行反转录；
2.实时荧光定量PCR，引物序列：
CD47-Forword：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
CD47-Reverse:GGCGCAAAGCACCGAAGAAATGTT
GAPDH-Forword:AGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GAPDH-Reverse:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
3.按照表2的试剂进行配置，冰上操作，混匀；
Figure BDA0003451864720000072
4.将混匀的液体加入荧光定量PCR板。用封口膜密封荧光定量PCR板，避光，离心机顺离。
进一步使用软件StepOne进行检测每个孔的Ct值，以GAPDH作为内参，以ΔCt＝CtGene-CtGapdh,Folds＝2-ΔΔCt。
以上过程我们利用小鼠CD47 shRNA慢病毒液转染卵巢癌细胞ID8或乳腺癌细胞E0771，同时用带有GFP荧光的空载体病毒液转染卵巢癌细胞ID8或乳腺癌细胞E0771。RT-PCR方法分别验证卵巢癌细胞ID8或乳腺癌细胞E0771中CD47的敲低验证效果，分别如图2和图3所示，可以看出，3#小鼠CD47 shRNA慢病毒液(对应LV-CD47-RNAi(96930-1))转染效率最高，接下来用此病毒液LV-CD47-RNAi(96930-1)转染的细胞株进行体外实验。
实施例二
基于实施例一，在体外，利用奥拉帕尼处理已敲低CD47表达的肿瘤细胞(即实施例一中已敲低CD47表达的卵巢癌细胞ID8或乳腺癌细胞E0771)及共培养的巨噬细胞，观察对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞效率的影响，实现的方法包括：
(1)取小鼠骨髓单核细胞，用包含有浓度为20ng/ml的C-MSF、10％胎牛血清、100units/ml青霉素以及100units/ml链霉素的DMEM培养基中培养5天，换成包含有浓度为20ng/ml的C-MSF、10％胎牛血清、100units/ml青霉素以及100units/ml链霉素的乳腺癌肿瘤细胞E0771上清进行培养48小时，诱导为肿瘤相关巨噬细胞TAM；
注意，该步骤中的乳腺癌细胞E0771上清对应的乳腺癌细胞E0771是没有敲低CD47表达的乳腺癌细胞E0771，其目的是为了培养肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。
(2)将带绿色荧光蛋白的sh Scramble E0771细胞、sh CD47 E0771细胞(表示已敲低CD47表达的E0771细胞)与TAM共孵育，分为四组，sh Sramble E0771+TAM+saline组、shCD47 E0771+TAM+saline组、shSramble E0771+TAM+Olaparib组、shCD47 E0771+TAM+Olaparib组；
(3)向以上四组同时加入奥拉帕尼2.5uM或者saline,37°共孵育1小时，再用F4/80标记巨噬细胞，流式检测F4/80+GFP+来表示巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的效率；
(4)流式检测发现shCD47 E0771+TAM+Olaparib组F4/80+GFP+的细胞数量最多。
同样，用奥拉帕尼处理已经敲低CD47表达的卵巢癌细胞ID8，验证与之共培养的巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力，如图4所示，包括相类似的步骤，即：
步骤S1:(1)取小鼠骨髓单核细胞，用包含有浓度为20ng/ml的C-MSF、10％胎牛血清、100units/ml青霉素以及100units/ml链霉素的DMEM培养基中培养5天，换成包含有浓度为20ng/ml的C-MSF、10％胎牛血清、100units/ml青霉素以及100units/ml链霉素的卵巢癌细胞ID8上清进行培养48小时，诱导为肿瘤相关巨噬细胞TAM；
注意，该步骤中的卵巢癌细胞ID8上清对应的卵巢癌细胞ID8是没有敲低CD47表达的卵巢癌细胞ID8。其目的是为了培养肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。
步骤S2:(2)将带绿色荧光蛋白的sh Scramble ID8细胞、sh CD47 ID8(表示已敲低CD47表达的ID8细胞)与TAM共孵育，分为四组，shSramble ID8+TAM+saline组、shCD47ID8+TAM+saline组、shSramble ID8+TAM+Olaparib组、shCD47 ID8+TAM+Olaparib组；
步骤S3:(3)向以上四组同时加入奥拉帕尼2.5uM或者saline,37°共孵育1小时，再用F4/80标记巨噬细胞，流式检测F4/80+GFP+来表示巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的效率；
步骤S4:(4)流式检测发现shCD47 ID8+TAM+Olaparib组F4/80+GFP+的细胞数量最多。
该方法的实验结果表明：在体外，奥拉帕尼处理敲低CD47表达的肿瘤细胞，使得与之共培养的巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力更强。
为了进一步验证奥拉帕尼与肿瘤细胞上低表达CD47对于巨噬细胞吞噬功能的影响，我们利用构建好的低表达CD47的ID8细胞及带有对照空载体的ID8细胞与体外诱导的TAM，同时加入奥拉帕尼2.5uM或者生理盐水(Saline),37°共孵育1小时，流式检测发现shCD47 ID8+TAM+Olaparib组F4/80+GFP+的细胞数量最多，shCD47 ID8+TAM+saline组、shSramble ID8+TAM+Olaparib组与ID8+TAM+saline组相比，F4/80+GFP+的数量也是增多，但是明显少于shCD47 ID8+TAM+Olaparib组，说明shCD47 ID8+TAM+Olaparib组巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的数量最多，巨噬细胞吞噬ID8细胞的能力最强。
可以进一步参见图5和图6，其中图5表明流式显示奥拉帕尼处理已敲低CD47表达的DI8细胞及共培养的巨噬细胞后，吞噬GFP阳性ID8细胞数量即F4/80+GFP+细胞增多；图6为流式结果的统计，奥拉帕尼联合敲低CD47组F4/80+GFP+细胞数量较单独使用奥拉帕尼明显增多，具有统计学意义。
该方法的实验结果还表明：在体外，奥拉帕尼处理已敲低CD47表达的E0771细胞及共培养的巨噬细胞后，使巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力更强。
我们利用构建好的低表达CD47的E0771细胞及带有对照空载体的E0771细胞与体外诱导的TAMs，同时加入奥拉帕尼2.5uM或者saline,37°共孵育1小时，流式检测发现：
shCD47 E0771+TAM+Olaparib组F4/80+GFP+的细胞数量最多，shCD47 E0771+TAM+saline组、shSrambleE0771+TAM+Olaparib组与E0771+TAM+saline组相比，F4/80+GFP+的数量也是增多，但是明显少于shCD47 E0771+TAM+Olaparib组，说明shCD47 E0771+TAM+Olaparib组巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的数量最多，巨噬细胞吞噬E0771细胞的能力最强。
可以进一步参见图7和图8，其中图7表明流式显示奥拉帕尼处理已敲低CD47表达的E0771细胞及共培养的巨噬细胞后，巨噬细胞吞噬GFP阳性E0771细胞数量即F4/80+GFP+细胞增多；图8为流式结果的统计，奥拉帕尼联合敲低CD47组F4/80+FITC+细胞数量较单独使用奥拉帕尼明显增多，具有统计学意义。
上述实验结果表明奥拉帕尼联合CD47中和抗体可能通过增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力，使奥拉帕尼具有更强的抗肿瘤活性，这一组合属于新型抗肿瘤药物联合方式，因此具有很好的应用前景。
实施例三
利用奥拉帕尼联合CD47中和抗体对小鼠体内肿瘤抑制进行验证，获得奥拉帕尼联合CD47中和抗体(Anti-CD47 IgG)对小鼠肿瘤生长的影响。该方法具体包括：
1.分别给小鼠接种LUC+GFP ID8细胞或LUC+GFP E0771细胞，分为四组，vehicle+Isotype处理组、vehicle+Anti-CD47 IgG处理组、奥拉帕尼联合Isotype处理组、奥拉帕尼联合Anti-CD47 IgG处理组。
2.从接种肿瘤细胞第7天，对于奥拉帕尼联合Isotype处理组、奥拉帕尼联合Anti-CD47 IgG处理组，给予奥拉帕尼，50mg/kg/day，腹腔注射，接种第10天和第20天，给予这四组分别注射Isotype或者Anti-CD47 IgG，50ug/只，瘤内注射。
3.开始给药后每隔7天进行小动物活体成像，隔天测量肿瘤体积及小鼠体重。
结果表明，在小鼠卵巢癌和乳腺癌模型中，奥拉帕尼联合CD47中和抗体显示出更强的抗肿瘤效果。
优选的，为了进一步探究奥拉帕尼联合CD47中和抗体在卵巢癌小鼠体内的抗肿瘤作用，我们建立了小鼠皮下卵巢癌模型，从接种肿瘤细胞第7天给予奥拉帕尼，50mg/kg/day，腹腔注射，接种第10天和第20天，给予Isotype或者Anti-CD47 IgG，50ug/只，瘤内注射；分为四组，vehicle+Isotype处理组、vehicle+Anti-CD47 IgG处理组、奥拉帕尼+Isotype处理组、奥拉帕尼+Anti-CD47 IgG处理组；接种后第28天给予D-荧光素钠盐(150ug/ml,200ul/只)进行活体成像拍照。如图10所示，为小鼠荷瘤及治疗示意图。
发现相较于奥拉帕尼联合Isotype处理组，奥拉帕尼联合Anti-CD47 IgG处理组小鼠肿瘤荧光值更弱，图9是小鼠荷瘤第28天治疗结束时的活体成像荧光图，图11对活体成像荧光值进行统计，奥拉帕尼联合CD47中和抗体组肿瘤荧光值明显小于单独使用奥拉帕尼处理组，图12对小鼠肿瘤体积进行隔天测量，奥拉帕尼联合CD47中和抗体组肿瘤体积明显小于单独使用奥拉帕尼处理组，肿瘤体积更小，具有统计学意义。
进一步的，Isotype处理组与单独Anti-CD47 IgG处理组两组的小鼠肿瘤生长差异没有奥拉帕尼联合Isotype处理组与奥拉帕尼联合Anti-CD47 IgG处理组两组之间的差异明显，因此，在小鼠卵巢癌肿瘤模型中，奥拉帕尼联合CD47中和抗体在抗肿瘤过程中起协同作用。
优选的，为了进一步探究奥拉帕尼联合CD47中和抗体在他肿瘤模型中的抗肿瘤作用，我们建立了小鼠原位乳腺癌模型，分为四组，vehicle+Isotype处理组、vehicle+Anti-CD47 IgG处理组、奥拉帕尼+Isotype处理组、奥拉帕尼+Anti-CD47 IgG处理组。奥拉帕尼与CD47中和抗体的使用方法与上述一致；接种后第28天给予D-荧光素钠盐(150ug/ml,200ul/只)进行活体成像拍照(图13)。结果显示相较于奥拉帕尼联合Isotype处理组，奥拉帕尼联合Anti-CD47 IgG处理组小鼠肿瘤荧光值更弱(图15)，肿瘤体积更小(图16)。乳腺癌模型中得到的结果与小鼠卵巢癌肿瘤模型基本一致，奥拉帕尼联合CD47中和抗体在抗肿瘤过程中起协同用。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.一种抗卵巢癌肿瘤药物联用体外验证方法，其特征在于，用奥拉帕尼处理已经敲低CD47表达的卵巢癌细胞ID8，验证与之共培养的巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力，包括：
(1)取小鼠骨髓单核细胞，用包含有浓度为20ng/ml的C-MSF、10％胎牛血清、100units/ml青霉素以及100units/ml链霉素的DMEM培养基中培养5天，换成包含有浓度为20ng/ml的C-MSF、10％胎牛血清、100units/ml青霉素以及100units/ml链霉素的卵巢癌细胞ID8上清进行培养48小时，诱导为肿瘤相关巨噬细胞TAM；
(2)将带绿色荧光蛋白的sh Scramble ID8细胞、sh CD47 ID8细胞与TAM共孵育，分为四组，shSramble ID8+TAM+saline组、shCD47ID8+TAM+saline组、shSramble ID8+TAM+Olaparib组、shCD47ID8+TAM+Olaparib组；
(3)向以上四组同时加入奥拉帕尼2.5uM或者saline,37°共孵育1小时，再用F4/80标记巨噬细胞，流式检测F4/80+GFP+来表示巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的效率；
(4)流式检测发现shCD47 ID8+TAM+Olaparib组F4/80+GFP+的细胞数量最多。
2.根据权利要求1所述的抗卵巢癌肿瘤药物联用体外验证方法，其特征在于，敲低CD47表达的卵巢癌细胞ID8的方法包括：
第一步，用完全培养基对小鼠卵巢癌细胞ID8制备第一密度的细胞悬液，然后从中定量取出，分别移入到孔板中的多个容纳孔中，继续培养第一时长；
第二步，取出低温环境保存的小鼠CD47 shRNA病毒，冰上进行缓慢融化；用完全培养基将所述小鼠CD47 shRNA病毒稀释至少三种不同的滴度，且每种滴度的容量均为第一容量；
第三步，向所述容纳孔中加入经过稀释后的小鼠CD47 shRNA病毒液，感染后8-12h，再向每个容纳孔中加入100ul完全培养基，保持细胞正常生长；
第四步，继续培养2-3天，期间补充营养基，保持细胞活性；
第五步，感染效果确认，感染后72小时，荧光表达丰度较高时，用显微镜观察，当感染效率在80％，且细胞生长良好的组继续扩大培养，扩大培养后进行流式细胞分选，分选出GDP阳性的细胞，即转染成功的细胞。
3.一种抗卵巢癌肿瘤药物联用体内验证方法，其特征在于，奥拉帕尼联合中和抗体Anti-CD47 IgG对小鼠体内肿瘤生长抑制进行验证，包括：
(1)分别给小鼠接种LUC+GFP ID8细胞，分为四组，Isotype处理组、Anti-CD47 IgG处理组、奥拉帕尼联合Isotype处理组、奥拉帕尼联合Anti-CD47 IgG处理组；
(2)从接种肿瘤细胞第7天给予奥拉帕尼，50mg/kg/day，腹腔注射，接种第10天和第20天，给予Isotype或者Anti-CD47 IgG，50ug/只，瘤内注射；
(3)开始给药后每隔7天进行小动物活体成像，隔天测量肿瘤体积及小鼠体重；
(4)对小鼠肿瘤体积进行隔天测量，奥拉帕尼联合Anti-CD47IgG处理组肿瘤体积明显小于单独使用奥拉帕尼处理组，肿瘤体积更小。
4.一种抗卵巢癌肿瘤药物联用方法，其特征在于，将奥拉帕尼联合CD47中和抗体用于抗卵巢癌肿瘤治疗。
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US20190062428A1 (en) * 2017-06-19 2019-02-28 Surface Oncology, Inc. Combination of anti-cd47 antibodies and cell death-inducing agents, and uses thereof
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