CN115243700A - 治疗性细胞组合物及其制造方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了通过表达具有增强的吞噬活性的嵌合抗原受体来制备和使用工程改造的杀伤吞噬细胞以用于癌症或感染中的免疫疗法的组合物和方法，所述嵌合受体由重组核酸编码。

Description

治疗性细胞组合物及其制造方法和用途
交叉引用
本申请要求2020年3月23日提交的美国申请号16/826,708；2019年12月11日提交的美国临时申请号62/946,896；2020年4月1日提交的美国临时申请号63/003,617；以及2020年4月22日提交的美国临时申请号63/014,068的权益；这些申请各自通过引用整体并入本文。
背景技术
循环单核细胞代表一个多功能和动态的细胞群，由多个亚群构成，这些亚群在表型、大小、形态和转录谱方面不同，并由它们在血液中的位置定义。这些离散的单核细胞亚群可以通过人类中CD14和CD16以及小鼠中Ly6C、CCR2和CX3CR1的表达来区分。在人类中，CD14+CD16-(经典)单核细胞占循环单核细胞池的约85％，而剩余约15％由CD14+CD16+(中间)和CD14lo CD16+(非经典)单核细胞组成。同样，在小鼠中，已经描述了两个单核细胞群：Ly6Chi CCR2+CX3CR1int和Ly6Clo CCR2-CX3CR1hi，分别代表经典和非经典单核细胞。单核细胞从骨髓中排出需要趋化因子受体CCR2的表达，该受体仅限于CD14+CD16-经典单核细胞。
髓样细胞被有效地募集到感染或发病部位。经典单核细胞被迅速募集到癌症、感染、自身免疫和损伤部位，在那里它们表现出相当大的功能可塑性，分化成许多下游细胞，诸如树突状细胞和巨噬细胞。经典单核细胞在稳态条件下补充驻留的外周单核细胞衍生细胞。然而，一些内源性和组织环境因素影响并控制巨噬细胞在消灭病原体和产生具有免疫记忆的强烈免疫应答方面的有效性。
发明内容
使用髓样细胞(包括巨噬细胞和树突状细胞)开发细胞疗法很有吸引力，因为这些细胞充当先天免疫与获得性免疫之间的桥梁。一方面，利用这些细胞的炎症能力，包括吞噬作用、细胞因子产生、趋化因子产生、抗原呈递/交叉呈递和T细胞活化，有可能彻底改变癌症治疗。利用这些细胞的免疫调节能力也有可能治疗多种自身免疫性病症以及神经退行性疾病，诸如阿尔茨海默氏症和其他蛋白质积聚病症。
本文提供了使用髓样细胞，特别是髓样细胞亚类作为疫苗或作为抗感染治疗剂的组合物和方法。在一些实施方案中，进一步离体操纵髓样细胞，特别是本申请中描述的髓样细胞亚类。在一些实施方案中，髓样细胞，特别是髓样细胞亚类，被进一步工程改造以表达重组蛋白。在一些实施方案中，髓样细胞是从人类供体获得的。在一些实施方案中，髓样细胞用于自体细胞疗法。
过去在治疗环境中使用髓样细胞通常涉及树突状细胞。树突状细胞已被用作免疫疗法的疫苗。用于这种用途的树突状细胞通常离体衍生自单核细胞或巨噬细胞。
从历史上看，巨噬细胞和树突状细胞的产生依赖于从血液中正选择CD14+单核细胞，然后在MCSF(巨噬细胞)或GMCSF+IL4(或其他因子)中培养大于5天。此过程导致单核细胞分别成熟为巨噬细胞或树突状细胞。此过程导致这些细胞发生变化，从而减少了能够迁移到疾病部位所需的许多关键功能。这种细胞已被用于肿瘤疫苗和其他用途。虽然这些细胞在体外似乎具有很强的功能能力，但在注入宿主后它们存在许多问题，包括：重新注入人体后寿命短；能够运输到炎症/肿瘤部位所需的关键趋化因子受体的下调-导致运输不良；需要培养超过5天(通常至少7天)以准备体内应用。
这些问题可能导致临床研究中使用巨噬细胞和DC的结果不理想。这并不是因为原始细胞无法产生影响，而是因为用于生成这些细胞的过程减弱了它们的能力。本文描述的方法侧重于利用CD14+单核细胞的功效而不改变其内在能力。本文描述的方法侧重于利用CD14+/CD16-单核细胞的功效而不改变其内在能力。
考虑到上述情况，本文提供了从来自人对象的生物样品例如血液生成髓样细胞群(无需任何形式的干细胞动员)的方法和组合物，该髓样细胞群显示出分化成下游前体细胞的能力；追踪癌症、感染、炎症、神经退行性变和自身免疫部位的能力；以及分化成许多下游效应细胞的能力。这些细胞可以用嵌合抗原受体进行工程改造，并且/或者工程改造为表达可溶性因子，并且/或者工程改造为将分子和抗原呈递给免疫系统的其他分支，同时细胞保留其前体功能和体内分化能力。
本文还提供了生成髓样细胞池的方法和组合物，这些髓样细胞可以被工程改造或修饰以用于治疗目的(例如，负载抗原、用CAR工程改造等)。
此外，本文提供了生成髓样细胞池的方法，这些髓样细胞可被冷冻和解冻以备将来使用(例如上文所述)。
本文提供了一种包含离体CD14+/CD16-细胞群的组合物，其中CD14+/CD16-细胞群是工程改造的细胞群并且/或者包含外源性剂。
在一些实施方案中，CD14+/CD16-细胞群是人细胞群。
在一些实施方案中，离体细胞群是缺乏CD16表达的CD11b+细胞和CD14+细胞。
在一些实施方案中，细胞群是未极化或未分化的髓样细胞群。
在一些实施方案中，外源性剂是重组核酸，其包含编码在CD14+/CD16-细胞群的细胞中表达的蛋白质或肽的序列。在一些实施方案中，外源性剂不诱导或干扰细胞或相邻细胞中的多能性或干细胞特性(stemness)或其诱导。
在一些实施方案中，外源性剂是重组核酸，其包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列。在一些实施方案中，CFP包含：(i)胞外抗原结合结构域；和(ii)跨膜结构域，其中胞外抗原结合结构域与跨膜结构域可操作地连接。在一些实施方案中，CFP包含：(a)包含抗原结合结构域的胞外结构域；和(b)与胞外结构域可操作地连接的跨膜结构域。在一些实施方案中，CFP还包含一个或多个胞内信号传导结构域，其可操作地连接到跨膜结构域。在一些实施方案中，在膜表面上表达的蛋白质或肽包含与抗原或致病剂结合的胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原是癌抗原。在一些实施方案中，抗原是微生物致病抗原。在一些实施方案中，CFP包含衍生自吞噬受体或清道夫受体的胞内结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包括激酶募集结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是CD5结合结构域或HER2结合结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域或CD68跨膜结构域。
在一些实施方案中，重组核酸编码增强细胞免疫应答的蛋白质或肽。在一些实施方案中，重组核酸编码双特异性或三特异性接合体(engager)。在一些实施方案中，蛋白质或肽包含一种或多种抗原或其片段。在一些实施方案中，一种或多种抗原中的抗原与内体靶向序列融合。在一些实施方案中，一种或多种抗原中的抗原包含分泌序列。在一些实施方案中，重组核酸编码与内体靶向序列融合的第一抗原和包含分泌序列的第二抗原。
在一些实施方案中，重组核酸编码由CD14+/CD16-细胞群中的细胞分泌的蛋白质或肽。
在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原由相同基因编码。
在一些实施方案中，蛋白质或肽是内体加工的蛋白质。
在一些实施方案中，蛋白质或肽是展示在细胞表面上的抗原的表位。
在一些实施方案中，抗原是病毒、细菌、原生动物或真菌抗原。
在一些实施方案中，外源性剂是包含编码蛋白质或肽的序列的重组核酸，所述蛋白质或肽是胞质蛋白或肽。
在一些实施方案中，外源性剂是包含编码免疫原性蛋白质或肽的序列的重组核酸。
在一些实施方案中，所述剂是抗原。
在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD14+和CD16-。在一些实施方案中，细胞群中少于10％的细胞是树突状细胞。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD14+和CD16-，且细胞群中少于10％的细胞是树突状细胞。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD11b+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD14+/CD11b+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD11b+/CD16-。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD14+/CD11b+/CD16-。在一些实施方案中，细胞群中少于50％的细胞是CD56+。在一些实施方案中，细胞群中少于50％、少于20％、少于10％或少于5％的细胞是CD56+。在一些实施方案中，细胞群中少于50％的细胞是CD42b+。在一些实施方案中，细胞群中少于50％、少于20％、少于10％或少于5％的细胞是CD42b+。在一些实施方案中，细胞群中少于50％、少于20％、少于10％或少于5％的细胞是CD3+。
在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CCR2+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CCR5+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CCR2+和CCR5+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD63+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD56-、CD3-和/或CD19-。在一些实施方案中，细胞群中少于40％的细胞是巨噬细胞。
在一些实施方案中，离体人细胞群包含至少1x107个细胞。
本文提供了一种药物组合物，其包含(a)包含重组核酸的人细胞群，其中重组核酸包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列，其中(i)人细胞群中至少50％的细胞是CD14+和CD16-，并且(ii)人细胞群中少于10％的细胞是树突状细胞；和(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD11b+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD14+/CD11b+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD11b+/CD16-。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD14+/CD11b+/CD16-。在一些实施方案中，细胞群中少于50％的细胞是CD56+。在一些实施方案中，细胞群中少于50％、少于20％、少于10％或少于5％的细胞是CD56+。在一些实施方案中，细胞群中少于50％的细胞是CD42b+。在一些实施方案中，细胞群中少于50％、少于20％、少于10％或少于5％的细胞是CD42b+。在一些实施方案中，细胞群中少于50％、少于20％、少于10％或少于5％的细胞是CD3+。
本文提供了上述实施方案中任一项的药物组合物，其中CFP包含：(a)胞外结构域，其包含：(i)特异性结合CD5或HER2的scFv，和(ii)衍生自CD8或CD28的铰链结构域、或CD68的胞外结构域或其一部分；(b)CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域或CD68跨膜结构域；以及(c)包含至少两个胞内信号传导结构域的胞内结构域，其中所述至少两个胞内信号传导结构域包含(i)衍生自FcγR或FcεR的第一胞内信号传导结构域，和(ii)第二胞内信号传导结构域，其：(A)包含PI3-激酶(PI3K)募集结构域，或(B)衍生自CD40。
在一些实施方案中，人细胞群是离体工程改造的细胞。
本文提供了药物组合物，其包含：(a)包含重组核酸的人细胞群，其中重组核酸包含编码抗原肽的序列，其中：(i)人细胞群中至少50％的细胞是CD14+和CD16-，并且(ii)人细胞群中少于10％的细胞是树突状细胞；和(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD11b+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD14+/CD11b+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD11b+/CD16-。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD14+/CD11b+/CD16-。在一些实施方案中，细胞群中少于50％的细胞是CD56+。在一些实施方案中，细胞群中少于50％、少于20％、少于10％或少于5％的细胞是CD56+。在一些实施方案中，细胞群中少于50％的细胞是CD42b+。在一些实施方案中，细胞群中少于50％、少于20％、少于10％或少于5％的细胞是CD42b+。在一些实施方案中，细胞群中少于50％、少于20％、少于10％或少于5％的细胞是CD3+。
在一些实施方案中，人细胞群中的CD14+和CD16-细胞在细胞表面上展示与MHC I类或MHC II类分子缔合的微生物抗原或其片段。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码选自以下的抗原肽的序列：CMVpp65肽、突变体R132H、异柠檬酸脱氢酶1(IDH)肽、TRP2肽和SARS-CoV-2抗原肽。
在一些实施方案中，重组核酸编码与内体靶向序列融合的第一抗原和包含分泌序列的第二抗原。
在一些实施方案中，抗原由CD14+和CD16-细胞进行内体加工。
在一些实施方案中，人细胞群的细胞是从来自对象的生物样品分离的。
在一些实施方案中，细胞是从外周血分离的。
在一些实施方案中，细胞是离体工程改造的。
在一些实施方案中，药物组合物包含细胞群，其中(a)细胞群中至少50％的细胞是CCR2+和/或CCR5+；(b)细胞群中至少50％的细胞是CD63+；(c)细胞群中至少50％的细胞是CD56-、CD3-和/或CD19-；并且(d)细胞群中少于40％的细胞是巨噬细胞。
在一些实施方案中，细胞群是未极化或未分化的髓样细胞群。
在一些实施方案中，药物组合物包含约10^7个细胞至约10^10个细胞。
在一些实施方案中，药物组合物的细胞已经暴露于两个或更少的冷冻/解冻循环。
在一些实施方案中，药物组合物的细胞在从生物样品分离或富集后离体培养少于48小时。
在一些实施方案中，施用前，药物组合物的细胞活力大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。
本文提供了一种治疗有需要的对象的微生物感染的方法，所述方法包括向对象施用本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括在施用之前制备表达微生物抗原的CD14+和CD16-细胞，所述方法包括：(i)从生物样品分离或富集CD14+和CD16-细胞，(ii)向细胞中引入包含编码至少一种抗原的序列的重组核酸，用于在细胞表面上表达和呈递抗原。
本文提供了一种治疗有需要的对象的癌症的方法，所述方法包括向对象施用本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括在施用之前制备表达CFP的CD14+和CD16-细胞，所述方法包括：(i)从生物样品分离或富集CD14+和CD16-细胞，(ii)将包含编码CFP的序列的重组核酸引入细胞中。
在一些实施方案中，引入细胞中包括用重组核酸对细胞进行电穿孔。
在一些实施方案中，重组核酸是RNA。
在一些实施方案中，重组核酸是mRNA。
在一些实施方案中，在掺入细胞中之前，重组核酸与水性混合物中的一种或多种脂质缔合。
在一些实施方案中，药物组合物的细胞在施用前已经暴露于两个或更少的冷冻/解冻循环。
在一些实施方案中，药物组合物的细胞在施用前已经离体培养少于48小时。
在一些实施方案中，当在体外培养时在掺入重组核酸细胞的48小时内将药物组合物施用于人对象，或将药物组合物冷冻以备将来施用。
在一些实施方案中，在施用前，离体人细胞群已经离体培养少于36小时、24小时、少于18小时、少于12小时或少于6小时。
在一些实施方案中，药物组合物包含细胞群中至少10^7个细胞。
在一些实施方案中，药物组合物包含细胞群中至少10^8个细胞。
在一些实施方案中，药物组合物包含细胞群中至少10^9个细胞。
在一些实施方案中，药物组合物施用一次。
在一些实施方案中，药物组合物施用超过一次。
在一些实施方案中，药物组合物的施用每两周一次、每4周一次、每6周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次、每16周一次、每20周一次、每24周一次或每年一次。
在一些实施方案中，细胞是对象自体的。
在一些实施方案中，药物组合物的细胞可以：(a)施用后在对象中分化成效应细胞；(b)在施用后渗入对象的病变部位或在施用后迁移到对象的病变部位；和/或(c)在施用后在对象中具有至少5天的寿命。
本文提供了本文所述的组合物用于制备供治疗疾病或病况用的基于细胞的治疗剂的用途，其中所述疾病或病况是癌症、感染或自身免疫性疾病。本文提供了本文所述的组合物用于治疗癌症或感染性疾病或自身免疫性疾病的用途。
本文提供了一种负选择细胞以用于制备本文所述的药物组合物的方法，所述方法包括：(a)使来自人对象的生物样品与抗CD16抗体和选自抗CD56抗体、抗CD3抗体和抗CD19抗体的一种或多种抗体接触，以及(b)收集生物样品中未被抗CD16抗体结合且未被抗CD56抗体、抗CD3抗体和/或抗CD19抗体结合的细胞，(c)将包含编码CFP的序列的重组核酸引入从(b)收集的细胞中，从而形成细胞群，其中：(i)细胞群中至少50％的细胞是CD14+和CD16-，并且(ii)细胞群中少于10％的细胞是树突状细胞。在一些实施方案中，所述方法包括流式细胞术或荧光激活细胞分选(FACS)。
本文提供了一种疫苗组合物，其包含含有重组核酸的CD14+/CD16-细胞群，其中所述细胞已离体培养少于48小时。
在一些实施方案中，重组核酸包含内体靶向序列，所述内体靶向序列是LAMP1序列。
在一些实施方案中，重组核酸包含分泌序列，所述分泌序列是以下各项的分泌信号肽序列：人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)信号传导序列、人免疫球蛋白重链信号传导序列、人免疫球蛋白轻链信号传导序列、人血清白蛋白信号传导序列、人天青霉素信号传导序列或人胱抑素序列或信号传导序列。
本文提供了一种治疗有需要的人对象的疾病或病况的方法，其包括：向人对象施用本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，CD14+/CD16-细胞群是经过基因修饰以稳定表达外源基因的工程改造的细胞群。在一些实施方案中，可以进行修饰以将基因或其片段稳定地整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，可以使用转座子系统将基因或其片段稳定地整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，转座子是逆转录转座子。
本文提供了一种包含细胞群的组合物，其中所述细胞群是工程改造的人髓样细胞群并且/或者包含外源性剂，其中细胞群中大于50％的细胞是CD14+和/或CD16-，并且其中(a)细胞群中大于50％的细胞表达CCR2和/或CCR5；(b)细胞群中大于50％的细胞是CD63+；(c)细胞群中大于50％的细胞是CD56-、CD3-和/或CD19-；(d)细胞群中少于40％的细胞是巨噬细胞和/或细胞群中少于10％的细胞是树突状细胞(DC)；并且/或者(e)外源性剂包含重组核酸，所述重组核酸包含编码嵌合抗原受体(CAR)或抗原肽的序列；并且/或者(f)细胞群缺乏通过CAR的紧张性(tonic)信号传导。
本文提供了一种包含细胞群的组合物，其中所述细胞群是工程改造的CD14+和/或CD16-细胞群，并且其中(a)细胞群是未极化的髓样细胞；(b)细胞群在施用后在对象中分化成效应细胞；(c)细胞群在施用后渗入对象的病变部位或在施用后迁移到对象的病变部位；和/或(d)细胞群在施用后在对象中具有至少5天的寿命。
本文还提供了一种药物组合物，其包含本文所述的组合物和药学上可接受的赋形剂。
本文还提供了一种治疗有需要的对象的疾病或病况的方法，其包括：向有需要的对象施用本文所述的药物组合物。
本文提供了一种治疗有需要的对象的疾病或病况的方法，其包括：向对象施用包含细胞群的药物组合物，其中细胞群是工程改造的细胞群并且/或者包含外源性剂，其中细胞群是CD14+、CD11b+和/或CD16-，并且其中(a)在(i)外源性剂已被引入细胞群或(ii)细胞群已被工程改造后的72小时内向对象施用药物组合物；(b)髓样细胞群在施用前已离体培养少于48天；(c)通过不包括干细胞动员的方法获得细胞群；和/或(d)通过负选择获得细胞群。
本文提供了一种治疗有需要的对象的疾病或病况的方法，其包括：向对象施用包含髓样细胞的药物组合物，其中髓样细胞(a)的特征在于以下中的一项或多项：(i)强CD14表达；(ii)低或检测不到的CD16表达；(iii)CCR2和/或CCR5表达；(iv)具有在接受一种或多种合适的刺激后分化成多个骨髓谱系亚型的能力；以及(b)包含外源性剂，其中当被外源性剂离体修饰时，外源性剂不改变髓样细胞的分化或极化状态。
在一些实施方案中，髓样细胞是CD16-(CD16阴性)或CD16low(CD16低)。
在一些实施方案中，髓样细胞是CD16-。
在一些实施方案中，髓样细胞是CD14+(CD14阳性)。
在一些实施方案中，髓样细胞是CD11b+(CD11b阳性)。
在一些实施方案中，髓样细胞是CCR2+(CCR2阳性)和/或CCR5+(CCR5阳性)。
在一些实施方案中，在施用药物组合物后，髓样细胞能够在对象中分化成效应细胞。在一些实施方案中，在施用药物组合物后，髓样细胞能够迁移到对象的病变部位。在一些实施方案中，在施用药物组合物后，髓样细胞能够渗入对象的病变部位。
在一些实施方案中，髓样细胞是CD14+/CCR2+(CD14和CCR2双阳性)。
在一些实施方案中，髓样细胞是CD14+/CCR5+(CD14和CCR5双阳性)。
在一些实施方案中，髓样细胞是CD14+/CCR2+/CCR5+(CD14、CCR2和CCR5三阳性)。
在一些实施方案中，髓样细胞是CD63+(CD63阳性)。
在一些实施方案中，髓样细胞是包含外源性剂或已被离体修饰的效应髓样细胞；例如，被修饰以表达外源性基因，例如，已经历基因组修饰以稳定表达外源性核酸，或瞬时表达外源性核酸，或已另外被剂离体修饰以执行功能，其中任何此类修饰均不涉及诱导、抑制或改变干细胞特性或细胞自我更新能力、老化途径或改变分化途径。
在一些实施方案中，外源性剂是重组核酸、肽、碳水化合物、脂质或小分子。在一些实施方案中，外源性剂包含重组核酸，所述重组核酸包含编码肽的序列，其中所述肽是嵌合抗原受体(CAR)，例如本文所述的CFP。
在一些实施方案中，在施用药物组合物时，髓样细胞已在体外培养少于2天。
在一些实施方案中，在施用药物组合物时，髓样细胞保持细胞可塑性。
在一些实施方案中，在施用时，髓样细胞表达CAR。
在一些实施方案中，在施用药物组合物时，髓样细胞不表现出通过CAR或CFP或抗原肽的紧张性信号传导。
在一些实施方案中，髓样细胞群是通过包括对分离的多种髓样细胞进行体外操纵的方法获得的。
在一些实施方案中，髓样细胞群是通过不包括干细胞动员的方法获得的。
在一些实施方案中，通过使用生物样品中的一种或多种髓样细胞的抗体介导的结合进行负选择，来从生物样品分离多种髓样细胞。在一些实施方案中，使用流式细胞术进行负选择。在一些实施方案中，多种分离的髓样细胞是(i)CD3-(阴性)，(ii)CD16-(阴性)或CD16low，(iii)CD19-(阴性)；(iv)CD56-(阴性)；以及(v)CD14+(阳性)。在一些实施方案中，多种分离的髓样细胞是CD11b+、CD14+、CD16-、CD3-、CD19-、CD56-和CD42b-。
在一些实施方案中，髓样细胞群是CD16-/CD56-/CD3-/CD19-细胞，它们是通过从生物样品中对多种髓样细胞进行负选择而获得的。
在一些实施方案中，生物样品是外周血样品。在一些实施方案中，生物样品是单采血液成分术(apheresis)样品。在一些实施方案中，生物样品对于包含髓样细胞的药物组合物所施用至的对象是异源的或自体的。
在一些实施方案中，髓样细胞群中至少50％的髓样细胞是未分化的。在一些实施方案中，髓样细胞群中至少50％的髓样细胞是未极化的。在一些实施方案中，髓样细胞群包含M0单核细胞。在一些实施方案中，髓样细胞群包含M1单核细胞。在一些实施方案中，髓样细胞群包含M2单核细胞。
在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，疾病或病况选自癌症、感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、代谢疾病、神经退行性疾病和单基因、多基因或多因素的疾病或病症。在一些实施方案中，疾病或病况是癌症。在一些实施方案中，疾病或病况是细菌、病毒、真菌或寄生虫感染。在一些实施方案中，疾病或病况是神经退行性变。
本文提供了一种用于分离或富集治疗有效的髓样细胞的方法，其包括：(a)从包含髓样细胞的生物样品中负选择治疗有效的髓样细胞，所述负选择是通过：(i)使生物样品与一种或多种抗体接触，所述一种或多种抗体包括抗CD16抗体、抗CD56抗体、抗CD3抗体和/或抗CD19抗体，以及(ii)收集或收获生物样品中不被所述一种或多种抗体结合的细胞，从而分离或富集在过程中相对不受干扰的治疗有效的髓样细胞。
在一些实施方案中，通过正选择从生物样品分离治疗有效的髓样细胞。例如，治疗有效的髓样细胞可以通过细胞与抗CD14抗体的结合而从生物样品分离。
在一些实施方案中，分离的治疗有效的髓样细胞是CD14+。
在一些实施方案中，分离的治疗有效的髓样细胞是CD14hi。
在一些实施方案中，分离的治疗有效的髓样细胞是CD11b+。
在一些实施方案中，分离的治疗有效的髓样细胞是CD16-或CD16low。
在一些实施方案中，分离的治疗有效的髓样细胞保留响应于合适的刺激而分化成骨髓谱系亚群的能力。
在一些实施方案中，分离的治疗有效的髓样细胞能够进一步分化成极化的单核细胞、巨噬细胞、DC1、DC2、DC3、DC4、DC5、DC6树突状细胞、或其任何组合。在一些实施方案中，分离的治疗有效的髓样细胞保留响应于合适的刺激而向M1和M2表型极化的能力。
本文提供了一种用于生成髓样细胞群以治疗有需要的对象的方法，所述方法包括：(i)从生物样品分离或富集多种髓样细胞，其中所述多种髓样细胞表现出细胞可塑性；(ii)使用外源性剂对从生物样品分离的多种髓样细胞进行体外操纵，并获得髓样细胞群；其中所述体外操纵不改变所述多种髓样细胞的细胞可塑性；以及(iii)制备包含髓样细胞群和可接受的赋形剂的治疗组合物。
在一些实施方案中，对象是人。
在一些实施方案中，生物样品是外周血样品、单采血液成分术样品、白细胞单采术样品或脐带血样品。在一些实施方案中，生物样品来源于对象。在一些实施方案中，生物样品来源于合适的人供体。
在一些实施方案中，从生物样品分离或富集多种髓样细胞包括通过负选择来分离或富集CD14+细胞。
在一些实施方案中，负选择是通过使人样品中的细胞与选自抗CD16抗体、抗CD56抗体、抗CD3抗体和抗CD19抗体的一种或多种抗体接触并固定或消除人样品中被所述一种或多种抗体结合的细胞来实现的。
在一些实施方案中，通过流式细胞术或FACS进行负选择。
在一些实施方案中，从生物样品分离的多种髓样细胞是CD14+并且不表达CD3、CD19、CD56、CD42b和/或CD16。
在一些实施方案中，髓样细胞是未分化的或未极化的。
在一些实施方案中，外源性剂是重组核酸、肽、碳水化合物、脂质或小分子。
在一些实施方案中，操纵包括对多种髓样细胞进行基因工程改造。在一些实施方案中，操纵包括将包含编码肽的序列的重组核酸引入多种髓样细胞。
在一些实施方案中，重组核酸是RNA。
在一些实施方案中，重组核酸是mRNA。
在一些实施方案中，在引入包含编码肽的序列的核酸后，髓样细胞群表达所述肽。
在一些实施方案中，肽是嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，肽包含：(i)跨膜结构域；(ii)胞外区，其包含与第二细胞的表面组分结合的至少一个靶结合结构域；以及(iii)胞内区，其包含一个或多个信号传导结构域。
在一些实施方案中，第二细胞是病变细胞或癌细胞。在一些实施方案中，病变细胞是受感染的细胞。
在一些实施方案中，肽包含至少一个胞内吞噬信号传导结构域。
在一些实施方案中，胞内吞噬信号传导结构域与胞外靶结合结构域可操作地连接并且被配置为在胞外靶结合结构域与第二细胞的表面组分结合时被激活。
在一些实施方案中，引入重组核酸包括通过电穿孔或核穿孔引入。在一些实施方案中，引入重组核酸包括通过化学递送引入。在一些实施方案中，重组核酸稳定掺入细胞基因组中。在一些实施方案中，掺入是通过激活转座酶、整合酶、核酸内切酶、重组酶和逆转录酶中的一种或多种进行的。
在一些实施方案中，组合物的制备包括将细胞悬浮在药学上可接受的赋形剂中。
在一些实施方案中，髓样细胞群保留细胞可塑性和在合适的刺激后分化成多个骨髓谱系的能力。
在一些实施方案中，髓样细胞群不表现出通过CAR的紧张性信号传导。上述髓样细胞群可以表达功能性CAR，并能够表现出CAR介导的抗原特异性应答。在一些实施方案中，可接受的赋形剂是缓冲液、包含营养物的细胞培养基、DMSO、甘油或其组合。
在一些实施方案中，将组合物冷冻直至进一步使用。在一些实施方案中，离体方法被定制为在少于12小时、少于10小时、少于8小时、少于6小时、少于4小时或少于2小时内进行。在一些实施方案中，在将外源性重组核酸掺入分离的细胞中的1或2或3或4小时内将组合物冷冻。
在一些实施方案中，所述方法在2小时或更短的时间内完成。
在一些实施方案中，对多种髓样细胞进行基因修饰和/或编辑，从而获得髓样细胞群。在一些实施方案中，使多种髓样细胞与一种或多种抗原肽接触，从而获得负载抗原的髓样细胞群。在一些实施方案中，髓样细胞群可以在约6小时或更短的时间内制造。在一些实施方案中，所制造的髓样细胞群是未分化或未极化的，表现出细胞可塑性和/或缺乏紧张性信号传导。
在一些实施方案中，用于细胞疗法的髓样细胞群包括以下中的任一项或多项：(a)群中大于约50％的CD14+CD16-活细胞；(b)群中大于约50％的CCR2+和/或CCR5+活细胞；(c)群中少于50％的表达CD64、CD68、CD80、CD86、CD163、CD206、CD200R、CD31、CD71、CLEC9A、CD1C和AXL/SIGLEC6中的一种或多种的活细胞；(d)M0单核细胞，(e)M1单核细胞，(f)M2单核细胞，(g)树突状细胞，以及(h)前树突状细胞或树突状前体细胞。
本文提供了一种用于细胞疗法的髓样细胞群，其包含未分化或未极化的细胞，这些细胞已从生物样品分离，并且进一步使用选自重组核酸、肽、碳水化合物、化合物和小分子的外部剂进行体外操纵，其中，髓样细胞群中的髓样细胞为CD14+CD16-；或者为CD14hi和CD16lo；并且展示以下中的一项或多项：(i)细胞可塑性，(ii)分化成多个骨髓谱系的能力，(iii)在体内迁移到病变组织的能力，(iv)渗入病变组织的能力，以及(v)隔离和/或破坏致病细胞、组织或生物体的能力。
在一些实施方案中，通过负选择分离髓样细胞群。在一些实施方案中，外源性剂是重组核酸、肽、碳水化合物、脂质或小分子。
在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞包含具有编码肽的序列的重组核酸。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞包含具有编码CAR的序列的重组核酸。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞表达CAR，其表现出CAR介导的激活。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞表达CAR并且不表现出通过CAR的紧张性信号传导。
在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞是CD14+。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞是CD16-。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞是CD14highCD16low。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞是CD56-。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞是CD3-。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞是CD19-。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞表达一种或多种趋化因子受体。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞表达CCR2。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞表达CCR5。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞表达CCR2和CCR5。在一些实施方案中，髓样细胞群中的细胞是CD14+和CD16-CD56-CD3-CD19-。
本文提供了一种包含髓样细胞群的药物组合物。
本文提供了一种用于癌症疗法中的髓样细胞群。
在一些实施方案中，本文提供了用于针对神经退行性变的疗法中的髓样细胞群。在一些实施方案中，与未经体外操纵的细胞相比，群中的细胞在作为细胞疗法施用后表现出提高的免疫原性。在一些实施方案中，与未经体外操纵的细胞相比，群中的细胞在作为细胞疗法施用后表现出增强的向病变组织的细胞迁移。在一些实施方案中，与未经体外操纵的细胞相比，群中的细胞在作为细胞疗法施用后表现出增强的吞噬能力。在一些实施方案中，与未经体外操纵的细胞相比，群中的细胞在作为细胞疗法施用后表现出提高的细胞毒性。
在一些实施方案中，髓样细胞群用作单一疗法。在一些实施方案中，髓样细胞群用作组合疗法。
本文提供了一种制备用于治疗有需要的人对象的人髓样细胞的方法，其包括：(i)通过使用至少包括抗CD16抗体、抗CD3抗体、抗CD56抗体和抗CD19抗体的多种抗体的负选择，从同种异体或自体生物样品获得包含未分化或未极化髓样细胞的多种髓样细胞；(ii)工程改造、培养、稳定、激活、富集和/或扩增来自步骤(i)的细胞；以及(iii)向对象施用来自步骤(ii)的细胞；其中从(i)中的获得至(iii)中施用的时间间隔小于约3天。
在一些实施方案中，生物样品是外周血样品。
在一些实施方案中，生物样品是单采血液成分术样品。
在一些实施方案中，来自步骤(ii)的细胞是CD14+CD16-或CD14hi和CD16lo。
一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含(a)包含重组核酸的细胞群，其中重组核酸包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列或编码抗原肽的序列，其中：(i)细胞群中至少60％的细胞是CD14+和CD16-，并且(ii)细胞群中少于10％的细胞是树突状细胞；和(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CCR2+和/或CCR5+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD63+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD56-、CD3-和/或CD19-，并且其中，细胞群中少于40％的细胞是巨噬细胞。
一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含(a)包含重组核酸的细胞群，其中重组核酸包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列或编码抗原肽的序列，其中：(i)细胞群中至少70％的细胞是CD14+和CD16-，并且(ii)细胞群中少于10％的细胞是树突状细胞；和(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CCR2+和/或CCR5+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD63+。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD56-、CD3-和/或CD19-，并且其中，细胞群中少于40％的细胞是巨噬细胞。
在一些实施方案中，本文所述的髓样细胞被离体修饰以生成疫苗。在一些实施方案中，髓样细胞被修饰以生成预防性疫苗。在一些实施方案中，髓样细胞被修饰以生成治疗性疫苗。在一些实施方案中，将重组多核苷酸掺入上述髓样细胞中，其中髓样细胞是CD14+细胞，例如CD14+/CD16-细胞。在一些实施方案中，髓样细胞表达由重组核酸编码的肽或蛋白质。在一些实施方案中，重组核酸编码病原体的一种或多种抗原，例如微生物病原体，诸如致病病毒或病毒颗粒、细菌、真菌病原体、疟原虫病原体等。
在一些实施方案中，重组多核苷酸包含编码一种或多种病毒表位的核酸序列。将多核苷酸掺入如本申请所述的髓样细胞中，其中髓样细胞是CD14+细胞，例如CD14+/CD16-细胞。然后髓样细胞在其表面上表达病毒抗原。病毒抗原被呈递给淋巴细胞，以随后激活免疫反应。可以进一步修饰表达病毒抗原的此类髓样细胞以增强一种或多种髓样细胞功能，例如迁移、细胞因子产生和/或炎症反应。本文所述的髓样细胞可以有效地迁移到淋巴结，在那里所表达的抗原被呈递给大量的T细胞，从而产生强大的免疫力。在一些实施方案中，本文所述的髓样细胞可以表达高水平的趋化因子受体，诸如CCR2受体，以有效迁移至淋巴结。淋巴结不仅含有淋巴细胞，而且还是幼稚T细胞的储库，这有助于产生新的对髓样细胞呈递的抗原具有特异性的T细胞。
在一些实施方案中，多核酸包含编码全长病毒蛋白的序列，例如病毒抗原蛋白。多核酸被掺入髓样细胞中以表达病毒抗原或抗原表位。在一些实施方案中，多核酸包含编码重组蛋白的序列。在一些实施方案中，重组蛋白包含多个抗原表位，其中一种或多种抗原或抗原表位串联编码。在一些实施方案中，重组核酸包含两个表位编码序列之间的插入序列，其中插入序列可以是接头，例如，具有对翻译后肽酶作用敏感的序列的接头。在一些实施方案中，核酸翻译产物促进溶酶体运输和降解为表位，并被呈现在髓样细胞的表面上。在一些实施方案中，核酸包含促进溶酶体递送的标签或肽。
在一些实施方案中，多核酸包含编码多个表位序列的序列。
在一些实施方案中，病毒是流感病毒。在一些实施方案中，病毒是丙型肝炎病毒(HCV)。在一些实施方案中，病毒是HIV、HPV、登革热病毒、疱疹病毒、CMV或任何合适的病毒。在一些实施方案中，病毒是冠状病毒。
在一些实施方案中，病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，病毒抗原是冠状病毒抗原，例如刺突蛋白抗原(S)、核蛋白(NP或N)抗原、非结构蛋白(NSP)抗原。
在一些实施方案中，产生髓样细胞群以用于开发如本文所述的疫苗，其中通过在细胞中掺入包含编码外源性或重组蛋白质或肽的序列的多核酸来进一步修饰髓样细胞群中的髓样细胞，并且所述髓样细胞表达重组蛋白。在一些实施方案中，重组核酸包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列，其中CFP包含胞外结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，髓样细胞群缺乏通过CFP的紧张性信号传导。在一些实施方案中，胞外结构域包含可以结合病原体或致病抗原的区域。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码CFP的序列，其中CFP包含：(a)包含抗原结合结构域的胞外结构域，和(b)与胞外结构域可操作地连接的跨膜结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是CD5结合结构域或HER2结合结构域。在一些实施方案中，CFP进一步包含衍生自吞噬受体或清道夫受体的胞内结构域。在一些实施方案中，CFP包含：(a)胞外结构域，其包含：(i)特异性结合CD5或HER2的scFv，和(ii)衍生自CD8或CD28的铰链结构域、或CD68的胞外结构域或其一部分；(b)CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域或CD68跨膜结构域；以及(c)包含至少两个胞内信号传导结构域的胞内结构域，其中所述至少两个胞内信号传导结构域包含(i)衍生自FcγR或FcεR的第一胞内信号传导结构域，(ii)第二胞内信号传导结构域，其：(A)包含PI3-激酶(PI3K)募集结构域，或(B)衍生自CD40。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码抗原肽的序列，其中抗原肽是CMVpp65肽。
在一些实施方案中，抗原结合结构域是与致病抗原结合的抗体或其功能片段。在一些实施方案中，表达嵌合融合蛋白的髓样细胞被递送到生物体，诸如人，诸如患者或对象中以用于疗法，其中髓样细胞可以结合至生物体例如人或对象中的病原体，吞噬病原体并溶解病原体；从而减少病原体负荷或消除组织中的病原体负荷。在一些实施方案中，髓样细胞被进一步修饰以增强其吞噬功能。在一些实施方案中，髓样细胞表达一种或多种活化因子、免疫原、细胞因子或趋化因子，以便以自分泌方式激活髓样细胞或以旁分泌方式激活附近的免疫细胞。在一些实施方案中，表达嵌合融合蛋白的髓样细胞可与病原体结合，吞噬病原体并溶解病原体并将抗原呈递给驻留的T细胞，从而激活有效的免疫应答和免疫记忆。
一方面，本文提供了一种治疗有需要的对象的疾病或病况的方法，其包括：向对象施用包含上述髓样细胞的药物组合物。施用可以局部或全身进行。施用可以皮下、静脉内或通过其他合适的方式进行。
在一些实施方案中，细胞群的细胞：(a)在施用后在对象中分化成效应细胞；(b)在施用后渗入对象的病变部位或在施用后迁移到对象的病变部位；或者(c)在施用后在对象中具有至少5天的寿命。在一些实施方案中，细胞群来自对象。在一些实施方案中，在将重组核酸引入细胞群后72小时内将药物组合物施用于对象。在一些实施方案中，细胞群在施用前已离体培养少于48小时。
在一些实施方案中，如说明书和实施例中所述地分离本文所述的髓样细胞，例如CD14+细胞，例如本文所述的CD14+/CD16-细胞，并负载病毒抗原，例如冠状病毒抗原，并用于向有需要的对象施用。这种髓样细胞在体内将抗原有效呈递给T细胞，因此可以直接用于给对象接种疫苗。在一些实施方案中，本文所述的髓样细胞，诸如本文所述的CD14+/CD16-细胞，负载有病毒抗原或抗原肽，例如冠状病毒抗原或抗原肽，并且可用于离体刺激T细胞，诸如在体外条件下刺激T细胞，继而将刺激的T细胞用于疗法。
在一些实施方案中，本文描述了一种用于细胞疗法中的髓样细胞群，其被工程改造以表达外源性基因，例如CFP，或由重组核酸编码的抗原或抗原结合蛋白。在一些实施方案中，本文描述了一种用于免疫疗法中例如作为癌症疫苗的髓样细胞群，其被工程改造以表达外源性基因，例如CFP。在一些实施方案中，本文描述了一种用于制备药物组合物的髓样细胞群，其被工程改造以表达外源性基因，例如CFP。髓样细胞群可包含编码外源性蛋白质例如CFP或抗原的重组核酸，并且其中髓样细胞群表达外源性蛋白质，并且群中至少50％的细胞是CD14+和CD16-，且群中少于10％的细胞是树突状细胞。
在一些实施方案中，本文所述的编码一种或多种抗原肽的多核苷酸构建体可直接用于对对象进行疫苗接种，诸如通过以合适的剂量和时间间隔静脉内施用多核酸。在一些实施方案中，本文所述的编码一种或多种抗原肽的多核苷酸构建体可用于产生抗原，例如通过体外翻译，并且可用作抗原以用于有需要的对象的疫苗接种，诸如通过以合适的剂量和时间间隔静脉内施用抗原肽。
一方面，本文提供了一种药物疫苗组合物，其包含含有重组核酸的离体人细胞群，其中所述重组核酸包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列，其中：(i)离体人细胞群中至少50％的细胞是CD14+和CD16-，并且(ii)离体人细胞群中少于10％的细胞是树突状细胞；和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，离体人细胞群中至少50％的细胞是CCR2+和/或CCR5+。在一些实施方案中，离体人细胞群中至少50％的细胞是CD63+。在一些实施方案中，离体人细胞群中至少50％的细胞是CD56-、CD3-和/或CD19-。
在一些实施方案中，离体人细胞群中少于40％的细胞是巨噬细胞。
在一些实施方案中，药物疫苗组合物包含离体人细胞群，其中离体人细胞群中至少50％的细胞是CCR2+和/或CCR5+；离体人细胞群中至少50％的细胞是CD63+；离体人细胞群中至少50％的细胞是CD56-、CD3-和/或CD19-；并且/或者离体人细胞群中少于40％的细胞是巨噬细胞。
在一些实施方案中，重组核酸包括mRNA。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码CFP的序列，并且离体人细胞群缺乏通过CFP的紧张性信号传导。在一些实施方案中，CFP包含：(a)包含抗原结合结构域的胞外结构域，和(b)与胞外结构域可操作地连接的跨膜结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域是CD5结合结构域或HER2结合结构域。在一些实施方案中，CFP进一步包含衍生自吞噬受体或清道夫受体的胞内结构域。在一些实施方案中，CFP包含：(a)胞外结构域，其包含：特异性结合CD5或HER2的scFv、和衍生自CD8或CD28的铰链结构域、或CD68的胞外结构域或其一部分；(b)CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域或CD68跨膜结构域；以及(c)包含至少两个胞内信号传导结构域的胞内结构域，其中所述至少两个胞内信号传导结构域包含衍生自FcγR或FcεR的第一胞内信号传导结构域，和第二胞内信号传导结构域，所述第二胞内信号传导结构域包含PI3激酶(PI3K)募集结构域或衍生自CD40。
本文还提供了一种用于治疗有需要的人对象的疾病或病况的方法，所述方法包括：将本文所述的药物组合物施用于人对象。
在一些实施方案中，离体人细胞群的细胞：(a)施用后在对象中分化成效应细胞；(b)施用后渗入对象的病变部位或在施用后迁移到对象的病变部位；或(c)施用后在对象中具有至少5天的寿命。
在一些实施方案中，离体人细胞群来自人对象。
在一些实施方案中，在重组核酸被引入离体人细胞群后72小时内将药物组合物施用于人对象，或将药物组合物冷冻以备将来使用。在一些实施方案中，在重组核酸被引入离体人细胞群后48小时内将药物组合物施用于人对象，或将药物组合物冷冻以备将来使用。在一些实施方案中，细胞的离体暴露限于总共少于72小时、少于48小时、少于36小时或少于24小时。在一些实施方案中，离体人细胞群在施用前已离体培养少于48小时。
在一些方面，本文提供了一种负选择细胞以用于制备药物组合物的方法，所述方法包括：(a)使来自人对象的生物样品与抗CD16抗体和选自抗CD56抗体、抗CD3抗体和抗CD19抗体的一种或多种抗体接触，以及(b)收集生物样品中未被抗CD16抗体结合且未被所述一种或多种抗体结合的细胞，(c)将包含编码CFP的序列的重组核酸引入从(b)收集的细胞中，从而形成细胞群，其中：(i)细胞群中至少50％的细胞是CD14+和CD16-，并且(ii)细胞群中少于10％的细胞是树突状细胞。在一些实施方案中，所述方法包括流式细胞术。
在一些实施方案中，抗原结合结构域是癌抗原结合结构域。
在一些实施方案中，药物组合物的离体人细胞群包含至少1x107个细胞。在一些实施方案中，抗原结合结构域是癌抗原结合结构域。
根据以下具体实施方式，本公开的另外的方面和优点对于本领域技术人员将容易地变得清楚，在以下具体实施方式中仅示出和描述了本公开的说明性实施方案。如将会理解的，本公开能够具有其他的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些都不背离本公开。因此，附图和说明书将在本质上被视为是说明性的而非限制性的。
通过引用并入
本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同指示每个单独出版物、专利或专利申请明确且单独地通过引用并入一般。就通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开文本相矛盾而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何这种矛盾的材料。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别地阐述。将通过参考阐述了利用本发明原理的说明性实施方案的以下具体实施方式和附图(在本文中也称为“图”)，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述附图中：
图1描绘了分离的髓样细胞的临床过程的示意图概述。
图2描绘了示出本文描述的骨髓效应细胞的示例性应用的示意图。
图3是表达高水平CD14的细胞(CD14hi细胞)的分化潜能的图解表示。
图4示出的表格指示通过抗体介导的选择和从单采血液成分术产物的CD14+细胞分离或富集所使用和回收的总细胞数，以及所示细胞亚型的百分比。上图，选择前；下图，选择后。
图5A示出了CD14+细胞分离或富集前的流式细胞术分析数据。分析了细胞的CD14、CD16、CD19和CD56标志物。
图5B示出了CD14+细胞分离或富集后的流式细胞术分析数据。分析了细胞的CD14、CD16、CD19和CD56标志物。
图6示出了CD14+分离或富集后的流式细胞术分析数据。分析了细胞的CD14和CD56标志物。
图7示出了证明在极化刺激存在下CD14+细胞分化成M0、M1和M2细胞的数据。
图8A示出了在极化刺激存在下培养24小时的M0、M1和M2极化CD14+细胞的显微照片。
图8B示出了在极化刺激存在下培养48小时的M0、M1和M2极化CD14+细胞的显微照片。
图9A示出了在极化刺激存在下CD14+细胞中CD206表达的流式细胞术数据。
图9B示出了在极化刺激存在下CD14+细胞中CD14和CD16表达的流式细胞术数据。
图9C示出了在极化刺激存在下CD14+细胞中CCR2表达的流式细胞术数据。
图10是效应髓样细胞制造的图解表示。
图11示出了流式细胞术数据，显示在引入重组核酸后的指定时间下在CD14+细胞中的CAR表达。
图12为用极化刺激处理CD14+细胞以测试细胞的极化电位的示意图。
图13A示出了流式细胞术数据，显示在极化刺激存在下表达或不表达CAR的细胞的CD14(左)和CD16(右)表达水平的变化。
图13B示出了流式细胞术数据，显示在极化刺激存在下表达或不表达CAR的细胞的CD206(左)和CD163(右)表达水平的变化。
图13C示出了流式细胞术数据，显示在极化刺激存在下表达或不表达CAR的细胞的PDL1(左)和CCR2(右)表达水平的变化。
图13D示出了流式细胞术数据，显示在极化刺激存在下表达或不表达CAR的细胞的MHCI(上部)和MHCII(下部)表达水平的变化。
图14A描绘了示例性功能测定的示意性流程图：将表达HER-2特异性CAR的THP-1细胞用极化刺激刺激，与HER2包被的珠粒接触，并使用Luminex多重测定试剂盒分析THP-1细胞的细胞因子和趋化因子释放。
图14B示出了针对所示趋化因子，在类似于图14A中描述的示例性实验中来自THP-1细胞的Luminex测定的数据。
图14C描绘了示例性功能测定的示意性流程图：将所分离的表达HER-2特异性CAR的人髓样细胞用极化刺激刺激，与HER2包被的珠粒接触，并使用Luminex多重测定试剂盒分析髓样细胞的细胞因子和趋化因子释放。
图14D示出了针对所示趋化因子，在类似于图14C中描述的示例性实验中来自所分离的人髓样细胞的Luminex测定的数据。
图15A描绘了示例性功能测定的示意性流程图：将表达HER-2特异性CAR的效应髓样细胞用极化刺激刺激，与表达HER2的肿瘤或不表达HER-2的肿瘤细胞(例如H9细胞)接触，并使用Luminex多重测定试剂盒分析HER-2-CAR-髓样细胞的细胞因子和趋化因子释放。作为替代方案，对表达C5-CAR的效应髓样细胞进行相同的处理并与H9 T细胞淋巴瘤或非淋巴瘤细胞(例如表达HER-1的肿瘤细胞)接触并如上所述进行分析。
图15Bi示出了来自图15A中描述的实验的Luminex测定针对CCL3、IL6和IL10分泌的数据。
图15Bii示出的数据显示CD80或CD206水平没有随着图15A所示的处理而改变。
图16A示出了来自吞噬测定的数据结果。将THP-1细胞用包含胞外FLAG亚基(用绿色荧光标记的抗FLAG抗体检测)的HER-2特异性CAR转导，并与表达HER-2的SKOV3(卵巢癌细胞系)细胞接触，该细胞表达红色荧光蛋白。CAR的设计以图形方式显示在左侧的图像中。用PMA或对照刺激THP-1细胞。在将FLAG与荧光抗体缀合后进行成像。
图16B示出了使用慢病毒转导的表达HER-2特异性CAR的原代效应髓样细胞的吞噬测定的结果，并进行了流式细胞术以量化肿瘤吞没的髓样细胞。
图16C示出了吞噬测定的显微镜成像结果，其中髓样细胞(巨噬细胞，红色荧光)被喂以吞噬作用的阴性靶标——Jurkat细胞，或阳性靶标——表达HER-2的SKOV3靶细胞(肿瘤细胞，绿色)。
图17A描绘了在小鼠中建立体内肿瘤模型及随后输注五次表达肿瘤特异性CAR的效应髓样细胞的示意性流程图，并进行了生存研究、细胞计数分析和成像研究。在一项代表性实验中，小鼠按所示分组。
图17B示出了生物成像结果，显示在如图17A所示的方案中输注一剂或三剂髓样细胞后在代表性实验中小鼠的肿瘤消退。
图17C和17D是在图17A和17B中所示实验设置中对肿瘤消退的定量评估。
图18A-18B示出了使用方案1在生成CD5阳性CAR细胞期间获得的所示细胞级分的流式细胞术数据。
图19A-19B示出了使用方案2在生成CD5阳性CAR细胞期间获得的所示细胞级分的流式细胞术数据。
图20示出了示例性数据，显示用包含编码CFP的核酸序列的病毒载体转导的CD14+/CD16-细胞中CD14和CD16表达在所示时间过程中的变化。
图21A示出了示例性数据，显示在M-CSF(每组左侧的条形图)或GM-CSF(每组右侧的条形图)存在下CD14+/CD16-细胞的电穿孔后(EP)过夜培养物的活细胞和活力数据。将细胞在电穿孔前(Pre-EP)、模拟电穿孔或用编码以下四种CD5结合物CFP构建体之一的重组核酸电穿孔后进行收集：CD5-FcR-PI3K构建体、CD5-FcR-CD40构建体、CD5-FcR-MDA5构建体、CD5-FcR-MyD88构建体，并且数据集在图中分别标记为FcR-PI3K、FcR-CD40、FcR-MDA5和FcR-MyD88。
图21B示出了示例性流式细胞术数据，显示当细胞在存在M-CSF(上图)或GM-CSF(下图)的情况下培养过夜时每种CD5结合物CFP(CD5-CFP)构建体的表达水平。下部的插图显示图中以条形图示出的点图的定量数据；对于每个集，左条形图，M-CSF培养；右条形图，GM-CSF培养。
图21C示出了示例性数据，显示图21A或21B中描述的每个集的吞噬指数(％)。对于每个集，左条形图，M-CSF培养；右条形图，GM-CSF培养。
图21D示出了如所示的每组的细胞因子分泌的示例性数据。对于每个集，左条形图，M-CSF培养；右条形图，GM-CSF培养。
图22示出了示例性流式细胞术数据，显示表达CD5结合物CFP(C5-CFP)(左)或HER2结合物CFP(HER2 CFP)(右)的细胞，以及CD14和CD16的表达。
图23示出了来自根据本公开的方法的示例性细胞制造轮次的流式细胞术数据，显示在电穿孔后24小时表达CD5结合物CFP的细胞。显示在袋子或不同烧瓶(烧瓶1和烧瓶2)中培养细胞的效果。
图24示出了根据本公开的方法的示例性细胞制造轮次的流式细胞术数据，显示淘析后来自人供体的细胞，说明了与供体全血相比的CD14、CD16、CD11b和CD3细胞百分比。
图25A-25D示出了根据本公开的方法的示例性细胞制造轮次的结果，显示来自一个供体的细胞在电穿孔后被冷冻并在解冻后0小时测试。图25A上部，CD14+细胞的流式细胞术，图25A下部，CD16+细胞的流式细胞术；图25B上部，CD11b+细胞的流式细胞术，图25B下部，CD3+细胞的流式细胞术。图25C，在解冻后0小时的时间点(右)在细胞中CD5结合物CFP的表达。左侧，对照，模拟转导。图25D示出了用细胞凋亡标志物7AAD对细胞的染色，通过流式细胞术来检测。UNT–未转染；CD5，CD5-结合物转导组；模拟，模拟转染。UNT和模拟是图中使用的对照。
图26示出了根据本公开的方法的示例性细胞制造轮次的结果，显示转染后的细胞质量，最左侧，单核细胞的门控；第二列，单细胞百分比；第三列，活细胞百分比；最右侧，CD5-结合物CFP表达。
图27A示出了在其中被递送编码CFP的mRNA的细胞中的低细胞因子产生。
图27B示出了在其中被递送编码CFP的mRNA的细胞中的CFP长期表达。
图28描绘了在无细胞或表达抗CD5 CFP的原代人单核细胞与所示浓度的CCL2培育后随时间变化的相对荧光单位(RFU)的示例图。与对照相比的倍数增加描绘了与仅用测定缓冲液处理的细胞相比，CCL2诱导的趋化性的比率。图上的每个条形代表两个重复孔的平均值±SD。
图29描绘了显示肿瘤样品的生物成像的荧光显微图像，该肿瘤样品是在CFSE标记的CD14+细胞向携带MSTO肿瘤的NSG小鼠施用之后24小时被取出，该CD14+细胞是从健康供体Leukopak分离并用编码含有以下项的CFP的慢病毒载体转导：胞外HER2结合结构域(scFv)、胞外Flag标签、衍生自CD8的胞外铰链结构域、CD8跨膜结构域、以及延生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和含有PI3K募集结构域的第二胞内信号传导结构域。观察到转导的细胞迁移到肿瘤中并在肿瘤细胞周围积聚。
图30描绘了显示受体连接触发升高和持续的促炎表型的图。
图31描绘了使用条件培养基的T细胞募集测定的示例性结果的图。
具体实施方式
所有术语都旨在被理解为它们将被本领域技术人员理解的方式。除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与由本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
尽管本公开的各种特征可以在单一实施方案的上下文中描述，但所述特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。反过来，尽管为了清楚起见，本文可以在单独的实施方案的上下文中描述本公开，但本公开也可以在单一实施方案中实施。
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料也可以用于对本公开的实践或测试，但是现在描述优选的方法和材料。一个或多个特定实施方案的细节在下文的描述中进行阐述。
在整个说明书中，术语“约”或“大约”意指由本领域普通技术人员测定的具体值处于可接受的误差范围内，这将部分取决于所述值的测量或测定方式，即测量系统的限制性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个或多于1个标准偏差内。或者，“约”可意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可意指在值的一个数量级以内、优选在值的5倍以内及更优选在值的2倍以内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指所述特定值在可接受的误差范围内。如本说明书和权利要求书中所用，词语“包含”(和包含的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和包括的任何形式，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和含有的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容性的或是开放性的，且不排除额外、未列举的元素或方法步骤。预期本说明书中讨论的任何实施方案可以关于本公开的任何方法或组合物来实施，并且反之亦然。此外，本公开的组合物可以用于实现本公开的方法。
“剂”是任何小分子化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
“更改”或“改变”是增加或减少。改变可以少至1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％或40％、50％、60％，或甚至多达70％、75％、80％、90％或100％。
“抗原”是能够刺激免疫应答的分子。被T细胞(无论是辅助T淋巴细胞(T辅助(TH)细胞)或细胞毒性T淋巴细胞(CTL))识别的抗原不是作为完整蛋白质被识别，而是作为与细胞表面上的I类或II类MHC蛋白缔合的小肽被识别。在自然发生的免疫应答过程中，与抗原呈递细胞(APC)上的II类MHC分子缔合而被识别的抗原是从细胞外获得，经过内化并加工成与II类MHC分子缔合的小肽。
“抗原呈递细胞”或“APC”包括专职性抗原呈递细胞(例如，B淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞)，以及其他抗原呈递细胞(例如，角质形成细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞(脑)、胰腺β细胞和血管内皮细胞)。这些细胞是吞噬细胞。APC进一步表达主要组织相容性复合物(MHC)分子，并可以在其表面展示与MHC复合的外来抗原，以便被T细胞接触和识别，从而触发T细胞活化和免疫应答。专职性抗原呈递细胞，特别是树突状细胞，在刺激幼稚T细胞中起关键作用——但非专职性抗原呈递细胞，诸如成纤维细胞，也可能有助于此过程。APC也可以通过加工外源抗原并在I类MHC分子上呈递加工的抗原来交叉呈递肽抗原。产生与I类MHC分子缔合而被识别的蛋白质的抗原通常是在细胞内产生的蛋白质，并且这些抗原被加工并且与I类MHC分子缔合。
“生物样品”是来源于生物体的任何组织、细胞、流体或其他物质。如本文所用，术语“样品”包括生物样品，诸如来源于生物体的任何组织、细胞、流体或其他物质。
如本文所用，“细胞”是生物体的生物单位，例如真核细胞。在一些实施方案中，它可以代表如在使用的上下文中所理解的原核细胞(例如细菌或藻类细胞)，例如在大肠杆菌细胞中生长质粒的情况下。在其他实施方案中，如本文所用的细胞是真核细胞，诸如哺乳动物细胞，诸如来自组织或器官的细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是源自患者的细胞。在一些实施方案中，细胞是马、猪、猫、犬、羊细胞或源自生物体的任何细胞。在一些实施方案中，细胞是髓样细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞前体，例如CD14+细胞。在一些实施方案中，CD14+细胞不表达CD16(CD14+/CD16-)。不表达CD14的细胞是CD14-细胞。本领域技术人员可以将CD14+细胞解释为骨髓来源的细胞。同样，CD3细胞或可互换地表示为CD3+细胞是淋巴细胞或淋巴样细胞。在一些实施方案中，髓样细胞或单核细胞可以是抗原呈递细胞、吞噬细胞或溶解它吞噬的细胞的溶解细胞。
未分化的髓样细胞可以是骨髓前体细胞或前体样细胞；或未分化为晚期单核细胞(例如中间或非经典单核细胞表型)或巨噬细胞表型或DC表型的细胞。未极化的髓样细胞可以是尚未极化成M1或M2表型的髓样细胞。M1和M2表征在本领域中是众所周知的。
“嵌合受体”是包含一个或多个原本不存在于天然受体中的区域、结构域或区段的受体。例如，嵌合受体可以具有胞外结构域或跨膜结构域或这两者或其片段，由与构成受体其余部分的天然受体蛋白质不同的蛋白质替代。嵌合受体通常是重组蛋白。在一些实施方案中，嵌合受体是融合蛋白。如本文所用，“嵌合融合蛋白”是一种融合蛋白，其中天然蛋白质的一个或多个片段或区段或结构域或其部分被一种或超过一种不同的非天然蛋白质的一个或多个片段或区段或结构域或其部分替代。可以通过融合不同蛋白质的不同部分、区段、片段或结构域来生成嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，嵌合融合蛋白是受体。在一些实施方案中，嵌合受体可互换地用作嵌合融合蛋白，其中嵌合融合蛋白(CFP)具有胞外结构域(ECD)、跨膜结构域(TM、或TMD或TD)和/或胞内结构域(ICD)。在一些实施方案中，CFP可以互换地称为CAR，即嵌合抗原受体。在一些实施方案中，CFP或CAR可以是嵌合受体，其包含吞噬受体的一个或多个结构域、片段、区段或部分。在一些实施方案中，CFP可互换地称为吞噬或束缚受体(PR)融合蛋白(PFP)。通常，CFP是通过重组DNA技术生成的。CFP是重组蛋白。同样，CAR或PFP是通过重组DNA技术生成的，并且是重组蛋白。在一些实施方案中，嵌合受体的靶标可以是癌细胞上的癌抗原。在一些实施方案中，靶标可以是CD5。在一些实施方案中，靶标可以是HER2。因此，在一些实施方案中，与特定靶标结合的嵌合受体或嵌合融合蛋白可称为靶标的“结合物”，例如，结合CD5的CFP可称为CD5-结合物，或可互换地称为抗CD5 CFP或抗CD5结合物分子。如在此上下文中使用的结合物可以是具有特定结合靶标的CFP。
术语“免疫应答”包括受T细胞共刺激的调节影响的T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答，例如细胞因子产生和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括间接受T细胞活化影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子反应细胞(例如巨噬细胞)的活化。
术语“电穿孔”意指伴随电脉冲将例如外源性核酸分子掺入细胞中的过程，诸如在细胞膜上产生电压梯度以允许核酸暂时穿过细胞膜。在一些实施方案中，可以进行电穿孔以将编码CFP的核酸分子掺入哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，可以进行电穿孔以将编码CFP的核酸分子掺入髓样细胞诸如人髓样细胞中。电穿孔可以是核穿孔或核转染。如本领域技术人员所知，电穿孔可以根据电穿孔器制造商(例如，Amaxa NucleofectorTechnology,Lonza)的建议，基于细胞类型以及待掺入的核酸的类型和性质来进行。在一些实施方案中，待掺入的核酸可以是DNA和RNA(例如mRNA或circRNA)，并且可以是质粒DNA或裸DNA。在一些实施方案中，电穿孔可以被认为是一种转染形式。将细胞数量、培养基、电穿孔程序以及从电穿孔中恢复的细胞针对每种细胞类型和所用的构建体进行了优化。
术语“表位”包括能够特异性结合至本文定义的抗体、抗体肽和/或抗体样分子(包括但不限于T细胞受体)的任何蛋白质决定簇。
如本文所用，“接合体(engager)”是具有用于结合至特定靶标(例如，细胞表面蛋白、抗原、受体等)的结合结构域以使得接合体在结合至其靶标时与细胞接合的多肽、蛋白质或缀合蛋白。在一些实施方案中，接合体可以包含两个或更多个特异性结合结构域，使得它可以接合两个或更多个靶标，并且当结合靶标出现在两个或更多个不同的细胞中时，接合体将两个或更多个靶细胞接合至两个或更多个单独的细胞。在一些实施方案中，接合体可以包含两个接合体，其具有对两个不同靶标有特异性的两个结合结构域(双特异性接合体)。在一些实施方案中，接合体可以包含三个接合体，其具有对三个不同结合靶标有特异性的两个结合结构域(双特异性接合体)。双特异性或三特异性接合体与两种或更多种细胞类型上的靶标结合。例如，一个结合结构域(或结合物)可以结合至单核细胞或巨噬细胞表面蛋白，而另一个结合结构域可以结合至癌细胞、感染细胞或坏死细胞，从而接合体将两种细胞并列，使得吞噬细胞可能随后吞噬靶细胞。在一些实施方案中，接合体接合细胞上的细胞表面分子，这可以激活或去激活细胞。结合结构域可以包含与别处所述的结合物的结合结构域相同的组分，或其片段，例如抗体的可变结构域、CDR或CDR与框架区的组合，或scFv或其片段，其可以特异性结合至靶分子，诸如抗原、细胞表面蛋白、受体等。
工程改造的细胞可以是已经被操纵以增强功能的细胞，例如通过基因工程方法，以表达一种或多种外源性蛋白，诸如融合蛋白，例如CAR。在一些实施方案中，如本文所用的工程改造的细胞是指表达转基因或已被基因编辑的髓样细胞。在一些实施方案中，工程改造的细胞或工程改造的髓样细胞是表达重组融合蛋白诸如吞噬受体融合蛋白的髓样细胞。在一些实施方案中，如本文所用的吞噬受体融合蛋白(CAR)包含与吞噬受体融合的对靶细胞抗原有特异性的胞外抗原结合结构域。靶细胞是例如癌细胞。在一些实施方案中，工程改造的吞噬细胞，在吞没癌细胞后，可在其细胞表面上呈递癌抗原，从而激活T细胞。
效应髓样细胞可以是髓样细胞或骨髓祖细胞，其在功能上能够进一步配制成药物组合物，以用于通过将药物组合物施用于有需要的对象而进行的细胞疗法。在一些实施方案中，效应髓样细胞从生物样品例如外周血单核细胞分离(和/或富集)，并且可以被进一步操纵以例如表达转基因，或包含外源编辑的基因组，并且表现出的特征可包括但不限于：特异性吞噬和消除靶细胞或病原体的能力；响应于分化触发信号而进一步分化的能力；响应于活化信号而被进一步激活的能力；与终末分化的髓样细胞相比，相对持久、具有更长的寿命；体内施用时可迁移至淋巴结。
“配体”是能够与受体形成复合物的分子。根据本公开，配体应理解为意指例如蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、脂蛋白或与受体结合的任何组分。在一些实施方案中，受体具有特异性配体。在一些实施方案中，受体可以与其配体混杂结合，在这种情况下，它可以结合至在结构构型、电荷分布或任何其他物理化学特征上至少具有相似性的几个配体。配体可以是生物分子。配体可以是非生物材料，例如，TiO2是清道夫受体SRA1的配体。
如本文所用的“吞噬作用”可以与“吞没”互换使用。吞噬过程与免疫应答密切相关，并且最重要的是，它是免疫应答的第一步，即抗原呈递。外源性抗原的加工是在它们通过某种类型的内吞事件被摄取到专职性抗原呈递细胞中之后进行的。吞噬作用也促进抗原呈递：来自被吞噬细胞或病原体的抗原(包括癌抗原)被加工并呈递在APC的细胞表面上。
本公开的“吞噬细胞”表达与癌细胞上的抗原或表位结合的编码重组核酸，所述吞噬细胞吞没癌细胞以将其从体内除去。
如本文所用的术语“抗体”包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgM和IgY，并且意在包括全抗体，包括单链全抗体及其抗原结合(Fab)片段。抗原结合抗体片段包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd(由VH和CH1组成)、单链可变片段(scFv)、单链抗体、二硫键连接的可变片段(dsFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗体可以来自任何动物来源。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可以包括单独的或与以下中的全部或部分组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。还包括可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。抗体可以是例如特异性结合HLA相关多肽或HLA-肽复合物的单克隆、多克隆、嵌合、人源化和人单克隆和多克隆抗体。本领域技术人员将认识到，多种免疫亲和性技术适合于富集可溶性蛋白质，诸如可溶性HLA-肽复合物或膜结合HLA相关多肽(例如，已经从膜上蛋白水解裂解的)。这些包括这样的技术，其中(1)将能够与可溶性蛋白特异性结合的一种或多种抗体固定至固定的或可移动的基材(例如，塑料孔或树脂、胶乳或顺磁珠)，以及(2)使含有来自生物样品的可溶性蛋白的溶液经抗体包被的基材穿过，从而允许可溶性蛋白与抗体结合。将具有抗体和结合的可溶性蛋白的基材与溶液分离，并且任选地将抗体和可溶性蛋白例如通过改变浸浴抗体的溶液的pH和/或离子强度和/或离子组成来解离。可替代地，可以使用其中将抗体和可溶性蛋白组合并且形成大分子聚集体的免疫沉淀技术。可以通过尺寸排除技术或通过离心将大分子聚集体与溶液分离。
“肽”或“多肽”可以互换使用，并且如本文所用可以是“蛋白质”，包括但不限于糖蛋白、脂蛋白、细胞蛋白或膜蛋白。多肽可以包括蛋白质的一种或多种亚基。多肽可以由重组核酸编码。在一些实施方案中，多肽可以在单一氨基酸链中包含超过一种肽，所述超过一种肽可以通过间隔子、接头或肽裂解序列分开。多肽可以是融合多肽。多肽或蛋白质可以包含一个或多个结构域。结构域是蛋白质的具有限定功能的结构部分，多肽或蛋白质可以包含一个或多个模块。模块是结构域或结构域的一部分或具有特定功能的蛋白质部分。模块可以是蛋白质的结构模块，其根据其结构实施方案来命名。部分是多肽、蛋白质或核酸的具有特定结构或进行特定功能的一部分。例如，信号传导部分是在多肽或蛋白质或重组核酸的较大结构内的特定单元，所述特定单元(或在核酸的情况下由其编码的蛋白质部分)参与信号转导过程，例如磷酸化。除非在文本中另外定义了特定结构或功能性取向，否则模块、结构域和部分可以互换使用。基序是生物分子中的结构实体。例如，蛋白质或多肽中的信号传导基序是指蛋白质或多肽上的氨基酸链段，所述氨基酸链段含有可以磷酸化、去磷酸化或可以充当另一种信号传导分子的结合位点的氨基酸。类似地，在核酸的情况下，例如，TNFmRNA在3'UTR中具有保守基序UUAUUUAUU，mRNA去稳定化酶诸如锌指结合蛋白36家族成员与所述保守基序结合。
“受体”应理解为表示能够结合配体的生物分子或分子组。受体可以是通过胞外结构域，例如，通过与胞外结构域能够结合的剂(例如，胞外靶结合结构域)接触接收信息的细胞膜结合分子。受体可用于在细胞、细胞形成或生物体中传递信息。在一些实施方案中，受体可以包含胞外结构域，或超过一个胞外结构域，其可操作地连接到跨膜结构域，该跨膜结构域是跨细胞膜结构域。在一些实施方案中，受体可包含胞内结构域，或超过一个胞内结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内结构域可以可操作地连接到跨膜结构域的胞质末端，该胞质末端继而连接到受体的胞外结构域。在一些实施方案中，靶标(例如，配体)与胞外结合结构域的结合，则受体被“激活”，使得受体的一个或多个结构域可以经历构象变化或化学变化，继而可以诱导细胞内的一些生化变化，例如激活细胞、激活细胞因子释放或诱导吞噬作用，或者例如使细胞失活、诱导细胞凋亡。构象变化可以发生在跨膜区或另一个胞外区或其片段处，使得受体寡聚化。在一些实施方案中，在配体与靶标缔合或结合后，胞内结构域可被磷酸化、去磷酸化、泛素化或经历任何其他生化或构象变化或其组合，并可诱导胞内信号转导。在一些实施方案中，这样的结构域可以称为胞内信号传导结构域。受体包含至少一个受体单元并且可以含有两个或更多个受体单元，其中每个受体单元可以由蛋白质分子例如糖蛋白分子组成。受体具有与配体结构互补的结构，并且可以复合配体作为结合伴侣。信号传导信息可以通过受体与细胞表面上的配体结合后的构象变化来传递。根据本公开，受体可以是指能够与配体形成受体/配体复合物的MHC I类和II类蛋白，例如，具有合适长度的肽或肽片段。
“特异性结合”是指化合物(例如，肽)识别并结合某分子(例如，多肽)，但是实质上不识别并结合样品(例如，生物样品)中的其他分子。
术语“重组核酸”是指通过重组克隆技术制得的核酸。可以在实验室中合成重组核酸。可以通过使用DNA的酶促修饰，诸如酶限制消化、连接和DNA克隆而通过使用重组DNA技术来制备重组核酸。如本文所用的重组核酸可以是DNA或RNA。可以在体外转录重组DNA以产生信使RNA(mRNA)，可以分离、纯化重组mRNA并且将其用于转染细胞。重组核酸可以编码蛋白质或多肽。可以将重组核酸在合适的条件下掺入到活细胞中，并且可以在活细胞内表达。如本文所用，核酸的“表达”通常是指核酸的转录和/或翻译。核酸表达的产物通常是蛋白质，但也可以是mRNA。在已经掺入重组核酸的细胞中检测到由重组核酸编码的mRNA被认为是核酸在细胞中“表达”的阳性证据。
将核酸插入或掺入至细胞中的过程可以经由转化、转染或转导进行。转化是细菌细胞摄取外来核酸的过程。此方法适于质粒DNA的增殖、蛋白质产生和其他应用。转化将重组质粒DNA引入从环境中摄取胞外DNA的感受态细菌细胞中。一些细菌物种在某些环境条件下天然是感受态的，但在实验室环境中人工诱导感染态。转染是迫使小分子诸如DNA、RNA或抗体引入到真核细胞中。只是为了避免混淆，‘转染’还指将噬菌体引入到细菌细胞中。‘转导’主要用于描述将重组病毒载体颗粒引入到靶细胞中，而‘感染’是指用野生型病毒对人或动物的自然感染。
术语“载体”是指能够转运或介导异源核酸表达的核酸分子。质粒是由术语“载体”涵盖的属的种类。载体典型地是指含有复制起点和在宿主细胞中复制和/或维持所需的其他实体的核酸序列。能够指导其可操作地连接至的基因和/或核酸序列的表达的载体在本文中称为“表达载体”。一般来讲，具有效用的表达载体常常呈“质粒”的形式，其是指圆形双链DNA分子，所述分子在其载体形式中不与染色体结合，并且典型地包含用于稳定或瞬时表达的实体或编码的DNA。可用于本文公开的方法中的其他表达载体包括但不限于质粒、附加体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体或病毒载体，并且此类载体可以整合至宿主的基因组中或在细胞中自主复制。载体可以是DNA或RNA载体。也可以使用本领域技术人员已知的起等同功能的其他形式的表达载体，例如，自我复制型染色体外载体或能够整合至宿主基因组中的载体。示例性载体是能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些载体。
如关于融合蛋白所用的术语“间隔子”或“接头”是指连接构成融合蛋白的蛋白质的肽。一般来说，除了连接或保持蛋白质或RNA序列之间的一定最小距离或其他空间关系之外，间隔子没有特定的生物活性。然而，在一些实施方案中，可以选择间隔子的组成氨基酸以影响分子的一些特性，诸如分子的折叠、净电荷或疏水性。适用于本公开的实施方案的合适接头是本领域技术人员熟知的并且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。使用接头来将两种抗原肽分开足以确保在一些实施方案中每种抗原肽适当折叠的距离。示例性肽接头序列采用柔性延伸构象，并且未表现出发展有序二级结构的倾向。柔性蛋白质区域中的典型氨基酸包括Gly、Asn和Ser。预期含有Gly、Asn和Ser的氨基酸序列的几乎任何排列都满足接头序列的以上标准。其他近中性氨基酸(诸如Thr和Ala)也可用于接头序列中。
如本文所用，术语“测定”、“评估”、“分析”、“测量”、“检测”及其语法等价物可以指定量和/或定性测定。当预期定量测定时，可以使用短语“测定”分析物的“量”等。当预期定性和/或定量测定时，可以使用短语“测定”分析物的“水平”或“检测”分析物。
术语“分离的”、“纯化的”、“生物学纯的”及其语法等同词是指在不同程度上不含如在其天然状态下发现的通常与其相伴的组分的物质。“分离”表示与初始来源或周围环境的分开程度。“纯化”表示高于分离或富集的分开程度。“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质实质上不含其他物质，使得任何杂质不会实际上影响蛋白质的生物特性或引起其他不利后果。即，如果当本公开的核酸或肽通过重组DNA技术产生时实质上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者当其用化学方法合成时实质上不含化学前体或其他化学品时，则所述核酸或肽是纯化的。纯度和均质性典型地使用分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来测定。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可以经受修饰(例如，磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离蛋白质，所述分离蛋白质可以单独纯化。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，并且指的是任何长度的核苷酸的聚合形式(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物，无论是单链、双链抑或多链形式。多核苷酸对于细胞可以是外源的或内源的。多核苷酸可以存在于无细胞的环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸可以包含一种或多种类似物(例如改变的骨架、糖或核碱基)。如果存在，则可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉代类、锁核酸、乙二醇核酸、苏阿糖核酸、双脱氧核苷酸、蛹虫草菌素、7-脱氮杂-GTP、荧光团(例如与糖连接的罗丹明或荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷和怀俄苷。多核苷酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析所定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、eDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、无细胞的多核苷酸(包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA))、核酸探针和引物。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。
如本文所用，术语“靶多核苷酸”和“靶核酸”可以指的是被本公开的核酸编辑部分靶向的核酸或多核苷酸。例如，“靶核酸”可以被包含如本文所述的核酸切割部分的核酸整合部分靶向。靶核酸可以是DNA。靶核酸可以是RNA。靶核酸可以指的是染色体序列或染色体外序列(例如，游离序列、小环序列、线粒体序列、叶绿体序列等)。靶核酸可以是与核酸样品中的任何其他序列不通过单个核苷酸取代而相关的核酸序列。靶核酸可以是与核酸样品中的任何其他序列不通过2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸取代而相关的核酸序列。在一些实施方案中，取代可以不在靶核酸5'端的5、10、15、20、25、30或35个核苷酸内发生。在一些实施方案中，取代可以不在靶核酸3'端的5、10、15、20、25、30、35个核苷酸内发生。通常，术语“靶序列”是指靶核酸单链上的核酸序列。靶序列可以是基因的一部分、调控序列、基因组DNA、包括cfDNA和/或cfRNA的无细胞核酸、cDNA、融合基因以及包括mRNA、miRNA、rRNA等的RNA。
如本文所用，术语“基因”可以指的是核酸(例如，DNA，诸如基因组DNA和cDNA)及其对应的核苷酸序列，这些核苷酸序列参与编码RNA转录物。如本文所用的关于基因组DNA的术语包括介入的非编码区以及调控区并且可以包括5'和3'端。在一些用途中，该术语涵盖转录序列，包括5'和3'非翻译区(5'-UTR和3'-UTR)、外显子和内含子。在一些基因中，转录区将含有编码多肽的“可读框”。在该术语的一些用途中，“基因”仅包含编码多肽所必需的编码序列(例如，“可读框”或“编码区”)。在一些情况下，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转移RNA(tRNA)基因。在一些情况下，术语“基因”不仅包括转录序列，而且还包括非转录区，包括上游和下游调控区、增强子和启动子。基因可以是指“内源性基因”或在生物体基因组中其天然位置处的天然基因。基因可以是指“外源性基因”或非天然基因。非天然基因可以是指通常不见于宿主生物体中但通过基因转移引入宿主生物体中的基因。非天然基因也可以是指不在生物体基因组中其天然位置处的基因。非天然基因也可以是指包含突变、插入和/或缺失的天然存在的核酸或多肽序列(例如，非天然序列)。
术语“基因组编辑”可以指的是改变细胞基因组内的一个或多个核苷酸。细胞可以在体内。细胞可以是离体或在体外的。基因组编辑方法的非限制性实例包括CRISPR介导的基因修饰多肽，诸如Cas9、Cas12a(Cpf1)或其他CRISPR核酸内切酶、Argonaute核酸内切酶、转录激活因子样(TAL)效应子和核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、表达载体、转座子系统(例如PiggyBac转座酶)或其任何组合。设计锌指、转录激活因子样效应子(TALE)或归巢大范围核酸酶可用于产生靶向基因组扰动。
靶向基因组编辑可能通过使用Cas或Cas样核酸内切酶进行的CRISPR介导的基因修饰，。CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复)，也称为SPIDR(SPacer散布直接重复)，构成通常对特定细菌物种有特异性的DNA基因座家族。CRISPR基因座包含在大肠杆菌中被识别的一类独特的散布短序列重复(SSR)和相关基因。
术语“转基因”可以指的是被引入细胞中的任何核酸分子。接受转基因后得到的细胞被称为转基因细胞。转基因可包括与转基因生物体或细胞部分或完全异源(即外来)的基因，或可代表与生物体或细胞的内源性基因同源的基因。在一些情况下，转基因包括任何多核苷酸，诸如编码多肽或蛋白质的基因、转录成抑制性多核苷酸的多核苷酸或不转录的多核苷酸(例如，缺乏表达控制元件，诸如驱动转录的启动子)。在一些实施方案中，可以通过位点特异性重组过程将转基因或外来多核苷酸引入细胞以稳定掺入基因组中。如本文可互换使用的术语“重组”或“DNA重组”通常可以是指交换来自两个不同多核苷酸序列的核酸片段的过程。重组可能涉及两条DNA链之间DNA区段的断裂和交换。重组可以由重组部分调节，例如小分子或诸如酶的多肽。在一个实例中，重组可以由至少1、2、3、4、5或更多种酶调节。重组可以由至多5、4、3、2或1种酶调节。一种或多种执行或促进DNA重组的酶可以是一种或多种酶，它们执行以下步骤：产生断裂(切除)、使交换链靠近断裂位点并去除预先存在的链、以及密封断端或连接。一种或多种酶可以包括例如一种或多种用于产生断裂的核酸内切酶；和一种或多种用于连接的连接酶。DNA重组可以通过重组酶进行。如本文可互换使用的术语“序列特异性重组”和“位点特异性重组”是指由重组部分(例如酶)执行的功能，例如，识别和结合至短核酸位点的重组酶或“序列特异性重组酶靶位点”，即重组酶识别位点，并催化核酸与这些位点相关的重组。这些酶可以包括重组酶、转座酶和整合酶。术语“序列特异性重组酶靶位点”、“位点特异性重组酶靶位点”、“序列特异性靶位点”和“位点特异性靶位点”可以指的是短核酸位点或序列，即重组酶识别位点，它们被序列或位点特异性重组酶识别，并在位点特异性重组事件中成为交叉区域。序列特异性重组酶靶位点的实例包括但不限于lox位点、att位点、dif位点和frt位点。Cre/lox系统经常用于DNA的序列特异性重组。Cre重组酶是Cre/lox系统的调节剂，其通过两个远距离的Cre识别序列(即loxP位点)之间的交叉来催化位点特异性重组。loxP位点是指噬菌体P1的cre基因产物(即Cre重组酶)可以催化位点特异性重组事件处的核苷酸序列。loxP位点包括两个由8bp间隔序列隔开的13bp反向重复序列。由于Cre介导的重组，在两个34bp loxP序列之间引入的任何DNA序列(称为“floxed”DNA)都会被切除。Cre重组酶的存在对于第一和第二多核苷酸序列的交换是必需的。
转座子或转座元件(TE)是具有通过使用称为转座酶的酶将遗传物质转置到基因组中的能力的遗传元件。哺乳动物基因组包含大量转座元件(TE)衍生序列，且我们的基因组中高达70％代表TE衍生序列(de Koning等人2011；Richardson等人2015)。可以利用这些元件将遗传物质引入细胞的基因组中。TE元件能够动员，通常被称为基因组内的“跳跃(jumping)”遗传物质。TE通常以可逆无活性、表观遗传沉默的形式存在于真核基因组中。
术语“转染”或“转染的”是指通过基于非病毒或基于病毒的方法将核酸引入细胞中。核酸分子可以是编码完整蛋白质或其功能部分的基因序列。参见，例如Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,18.1-18.88。
术语“表达”可以指的是多核苷酸从DNA模板转录(诸如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或RNA诸如mRNA翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。就表达而言，“上调”是指多核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)和/或多肽序列的表达水平相对于其在野生型状态下的表达水平有所增加，而“下调”是指多核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)和/或多肽序列的表达水平相对于其在野生型状态下的表达有所减少。转染基因的表达可以在细胞中瞬时或稳定地发生。在“瞬时表达”期间，转染的基因在细胞分裂期间不转移到子细胞。由于其表达仅限于转染细胞，因此基因的表达随着时间的推移而丧失。相比之下，当基因与另一种赋予转染细胞以选择优势的基因共转染时，可以发生转染基因的稳定表达。这种选择优势可以是对呈递至细胞的某种毒素的抗性。在需要表达转染基因的情况下，本申请设想使用密码子优化序列。密码子优化序列的一个实例可以是为在真核生物例如人中的表达而优化的序列(即，为在人中的表达而优化)，或为另一种真核生物、动物或哺乳动物而优化的序列。除人以外的宿主物种的密码子优化或特定器官的密码子优化是已知的。在一些实施方案中，编码蛋白质的编码序列可以为在特定细胞诸如真核细胞中的表达而进行密码子优化。真核细胞可以是属于或来源于特定生物体的那些细胞，诸如植物或哺乳动物，包括但不限于本文讨论的人或非人真核生物或动物或哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、狗、牲畜或非人哺乳动物或灵长类动物。密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子(例如，约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子)来修饰核酸序列以增加在目标宿主细胞中的表达同时保持天然氨基酸序列的过程。不同的物种对于具有特定氨基酸的某些密码子表现出特殊偏倚。密码子偏倚(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率又被认为尤其取决于被翻译的密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选tRNA在细胞中的优势通常反映肽合成中最常使用的密码子。因此，可基于密码子优化来定制基因以便于在给定生物体中的最佳基因表达。密码子使用表是易于获得的，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的“密码子使用数据库(CodonUsage Database)”，并且这些表可以按多种方式进行改编。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可得的，诸如Gene Forge(Aptagen；Jacobus,PA)。
术语“表达盒”、“表达构建体”或“表达载体”是指包括核苷酸序列诸如编码序列和模板序列以及编码序列表达所必需的序列的核酸。表达盒可以是病毒的或非病毒的。例如，表达盒包括核酸构建体，当其被引入宿主细胞时，分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。该定义明确包括不翻译或不能翻译的反义构建体或有义构建体。本领域技术人员将认识到插入的多核苷酸序列不必相同，而可以仅与它所来源的基因序列实质上相似。
如本文所用，“质粒”可以指的是非病毒表达载体，例如编码基因和/或基因表达所必需的调控元件的核酸分子。如本文所用，“病毒载体”是指能够将另一种核酸转运到细胞中的病毒来源的核酸。当病毒载体存在于适当的环境中时，所述病毒载体能够指导由载体携带的一个或多个基因编码的一种或多种蛋白质的表达。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体。
如本文所用，术语“启动子”可以指的是能够驱动编码序列在细胞中的转录的多核苷酸序列。因此，在本公开的多核苷酸构建体中使用的启动子包括顺式作用的转录控制元件和参与调控或调节基因转录的时机和/或速率的调控序列。例如，启动子可以是顺式作用的转录控制元件，包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5'和3'非翻译区或内含子序列，它们参与转录调控。这些顺式作用序列通常与蛋白质或其他生物分子相互作用以进行(打开/关闭、调控、调节等)基因转录。“组成型启动子”可以是能够在几乎所有组织类型中启动转录的启动子。“组织特异性启动子”可以在一种或几种特定组织类型中启动转录。“诱导型启动子”可以是仅在特定环境条件、发育条件或药物或化学条件下启动转录的启动子。示例性的诱导型启动子可以是强力霉素或四环素诱导型启动子。四环素调控的启动子可以是四环素诱导型或四环素抑制型，称为tet-on和tet-off系统。tet调控系统依赖于两个组分，即四环素控制的调控子(也称为反式激活因子)(tTA或rtTA)和以四环素依赖性方式控制下游cDNA表达的tTA/rtTA依赖性启动子。tTA是融合蛋白，其含有大肠杆菌的Tn10四环素抗性操纵子的阻遏物和单纯疱疹病毒(VP16)的蛋白16的羧基末端部分。tTA依赖性启动子由最小的RNA聚合酶II启动子组成，该启动子与tet操纵子(tetO)序列(一组七个同源操纵子序列)融合。这种融合将tet阻遏物转化为真核细胞中的强转录激活因子。在没有四环素或其衍生物(诸如强力霉素)的情况下，tTA与tetO序列结合，允许tTA依赖性启动子的转录激活。然而，在存在强力霉素的情况下，tTA不能与其靶标相互作用并且不会发生转录。使用tTA的tet系统被称为tet-OFF，因为四环素或强力霉素允许转录下调。相比之下，在tet-ON系统中，已使用随机诱变分离了tTA的突变形式，称为rtTA。与tTA相比，rtTA在不存在强力霉素的情况下不起作用，但需要存在配体才能进行反式激活。
术语“药学上可接受的”可以指的是由联邦或州政府监管机构批准或可批准或者在美国药典或其他通常认可的药典上列出以用于动物(包括人)的。“药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂”可以指的是可与剂一起施用于对象并且在以足以递送治疗量的剂的剂量施用时不破坏其药理学活性且无毒的赋形剂、载剂或稀释剂。“药学上可接受的盐”可以是通常在本领域中被认为适合与人类或动物的组织接触使用而没有过度毒性、刺激、变应性应答或其他问题或并发症的酸盐或碱盐。此类盐包括碱性残基(诸如胺)的矿物盐和有机酸盐以及酸性残基(诸如羧酸)的碱金属盐或有机盐。具体的药用盐包括但不限于诸如以下的酸的盐：盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、富马酸、硫酸、氨基磺酸、磺胺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙烷二磺酸、2-羟乙基磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、扑酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙酸、羟基马来酸、氢碘酸、苯乙酸、链烷酸诸如乙酸、HOOC-(CH2)n-COOH(其中n是0-4)等。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。本领域的普通技术人员应从本公开和本领域知识认识到本文提供的汇集的疾病特异性抗原的另外的药学上可接受的盐包括由Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,PA,p.1418(1985)列出的那些。
在一些情况下，用外源性剂操纵细胞可以指的是将异源基因或核酸掺入细胞中。在一些情况下，操纵可以是指添加一种剂，诸如肽或小分子来激活细胞。
如本文所用，“实质上”可以指的是“相当”或“完全”，并且可以设置在仅相对于已知、可比较或预期结果的可量化情形中。例如，相对于包含80％或更多T细胞的比较样品，实质上较少T细胞的样品可以指的是该样品包含少于20％。在类似的上下文中，“实质上没有”可以是少于10％或少于5％或约0％的T细胞。
术语“治疗”及类似词意指减少、预防或改善病症(例如，瘤形成或肿瘤或感染原或自身免疫性疾病)和/或与其相关的症状。“治疗”可以是指在疾病(例如，癌症或感染原感染或自身免疫性疾病)发作或疑似发作之后向对象施用疗法。“治疗”包括“减轻”的概念，其是指减少与疾病相关的任何症状或其他不良作用和/或与疗法相关的副作用的发生或复发频率或严重程度。术语“治疗”还涵盖“管理”的概念，其是指降低患者中疾病或病症的严重程度，例如延长患有疾病的患者的寿命或延长所述患者的生存能力；或延迟其复发，例如延长已经罹患疾病的患者的缓解期。应理解，治疗病症或病况并不需要完全消除病症、病况或与其相关的症状，但也不排除该情况。
如本文所用，术语“预防”及其语法等同词可以意指在施用剂或化合物开始时尚未发展出与疾病或病况相关的症状的对象中避免或延迟此类症状的发作。
术语“治疗效果”可以是指在一定程度上减轻病症(例如，瘤形成、肿瘤或感染原感染或自身免疫性疾病)或其相关病变的一种或多种症状。如本文所用的“治疗有效量”可以是指剂的量，其在单剂量或多剂量施用于细胞或对象时，有效地延长患有这种病症的患者的生存能力、减少病症的一种或多种体征或症状、进行预防或延迟等，从而超过在不存在这种治疗下预期的情况。“治疗有效量”旨在限定实现治疗效果所需的量。具有本领域中普通技术的医师或兽医能够容易地确定并开具所需药物组合物的“治疗有效量(例如，ED50)”。
虽然癌症是在本公开中专门详细描述的一个示例性实施方案，但是预期本文所述的方法和技术可用于靶向体内的感染细胞或以其他方式病变的细胞。类似地，本文描述了使用工程改造的细胞的治疗性和疫苗组合物。
用于免疫疗法的髓样细胞
一方面，本申请涉及可用于有效免疫疗法例如有效疫苗接种的髓样细胞亚群。本文提供了一种通过功能测定来分离或富集、选择、富集和验证可用于有效免疫疗法的髓样细胞亚群的方法。一方面，本文提供了一种用于鉴定和分离或富集髓样细胞亚群的方法，所述亚群可以进一步被适当地修饰以生成效应髓样细胞。
目前广泛用于免疫疗法中的髓样细胞是抗原呈递树突状细胞或活化的成熟巨噬细胞。抗原呈递DC或活化的巨噬细胞通常不能对体内转移产生治疗效果，因为细胞是终末的，已达到其增殖极限并且不能进一步分裂，寿命短，是耗竭的，在体内循环中的兴奋性差。在一些情况下，此类细胞在组织环境内运转时表达的任何转基因都很差，或者它们可能完全失去转基因表达。在一些情况下，DC或活化的巨噬细胞可能表现出较差的迁移，并且无法进入淋巴结，因此在激活可通过激活淋巴结中的幼稚T细胞触发的适应性免疫后遗症方面效果较差。
另一方面，有效的免疫疗法要求细胞，优选应用对象的髓样细胞，应该是柔韧的，可以被工程改造，例如，在细胞中表达转基因，而不损害可塑性，可能不会表现出紧张性信号传导，并且只能在组织微环境中被激活，在体内可能表现出有效的迁移，并且可以进入淋巴结并激活淋巴细胞以产生主动的适应性免疫应答。
对于上述情况，重要的是鉴定正确的细胞群以进一步操纵和产生可用于有效免疫疗法的髓样细胞。
在一些实施方案中，髓样细胞是祖细胞。在一些实施方案中，髓样细胞在施用于有需要的对象之前不被转化或活化。在一些实施方案中，骨髓在施用于对象时不表现出紧张性信号传导。在一些实施方案中，细胞可以分化成效应细胞；并且在施用后渗入对象的病变部位或在施用后迁移到对象的病变部位；或在施用后在对象中具有至少5天的寿命。
在一些实施方案中，髓样细胞在施用于对象之前，或在通过外部刺激(诸如，用细胞因子或生长因子)离体激活之前或在存在吞噬作用的靶标的情况下表现出低吞噬作用。在一些实施方案中，髓样细胞在施用于对象之前，或在通过外部刺激(诸如，用细胞因子或生长因子)离体激活之前或在存在吞噬作用的靶标的情况下表现出中度吞噬作用。在一些实施方案中，髓样细胞表现出对以下中的任一项或多项的反应性：GMCSF、GCSF、IL-4、IL-1b、IL-6、TNF、CCL2、CCL5、CXCL1或其组合。
在一些实施方案中，髓样细胞在通过外部刺激(诸如，用细胞因子或生长因子)离体激活时或在存在吞噬作用的靶标的情况下表现出增强的吞噬作用。在一些实施方案中，与活化的终末分化的髓样细胞(诸如成熟的活化后巨噬细胞)相比，髓样细胞在通过外部刺激(诸如，用细胞因子或生长因子)离体激活时或在存在吞噬作用的靶标的情况下表现出约1.1倍、1.2倍、1.5倍、1.7倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、14倍、17倍、20倍或更多倍增强的吞噬作用。在一些实施方案中，髓样细胞表现出对由以下中的任一项或多项所例示的细胞因子或趋化因子的反应性：GMCSF、GCSF、IL-4、IL-1b、IL-6、TNF、CCL2、CCL5、CXCL1或其组合。
在一些实施方案中，可以离体操纵髓样细胞。离体操纵可以包括但不限于：髓样细胞的基因工程改造；在髓样细胞中表达转基因；使髓样细胞与核酸接触；使髓样细胞与化学物质或小分子接触；用细胞因子、生长因子、趋化因子、触觉刺激、热刺激或其组合来激活髓样细胞。
在一些实施方案中，与预活化和预分化的髓样细胞(例如在类似情况下的成熟巨噬细胞)相比，髓样细胞在离体操纵后表现出更长的寿命，该寿命可以是例如至少长于24小时、长于48小时、长于50小时、长于55小时、长于60小时、长于70小时、长于80小时、长于90小时、长于100小时、长于110小时、长于120小时、长于130小时、长于140小时、长于150小时、长于160小时、长于170小时、长于180小时、长于190小时、长于200小时、长于210小时、长于220小时、长于230小时、长于240小时、长于250小时、长于300小时、长于350小时、长于400小时、长于500小时、长于1000小时。
在一些实施方案中，髓样细胞在施用于有需要的对象之前表现出细胞学可塑性。在一些实施方案中，髓样细胞不会自发地转化为活化和/或成熟的细胞，或者在形态学或生理学上没有改变，或者在施用于有需要的对象之前不表现出晚期衰老。在一些实施方案中，髓样细胞可能能够进行细胞分裂。
在一些实施方案中，髓样细胞是原代细胞。在一些实施方案中，髓样细胞是转化的细胞，其是离体转化的。在一些实施方案中，髓样细胞不是干细胞。在一些实施方案中，可以离体工程改造髓样细胞。
在一些实施方案中，与活化的巨噬细胞相比，髓样细胞响应于趋化性刺激(例如趋化剂、趋化因子)表现出更高的趋化性，如通过趋化性测定所确定。在一些实施方案中，与活化的终末分化的髓样细胞(诸如活化的巨噬细胞)相比，髓样细胞响应于趋化性刺激(例如趋化剂、趋化因子)表现出至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍更高趋化性，如通过趋化性测定所确定。
在一些实施方案中，髓样细胞分离自人对象，诸如供体。在一些实施方案中，髓样细胞被富集以提高髓样细胞在细胞群中的比例。
在一些实施方案中，髓样细胞是自体的。在一些实施方案中，髓样细胞是同种异体的。
一方面，本文提供了一种从人外周血分离的细胞群，其进一步富集适合于产生治疗有效的髓样细胞的髓样细胞，其中所述细胞群包含少于5％的CD3+细胞。在一些实施方案中，富集的髓样细胞群包含少于4％的CD3+细胞。在一些实施方案中，富集的髓样细胞群包含少于3％的CD3+细胞。在一些实施方案中，富集的髓样细胞群包含少于5％的CD19+细胞。在一些实施方案中，富集的髓样细胞群包含少于4％的CD19+细胞。在一些实施方案中，富集的髓样细胞群包含少于3％的CD19+细胞。在一些实施方案中，富集的髓样细胞群包含少于5％的CD56+细胞。在一些实施方案中，富集的髓样细胞群包含少于4％的CD56+细胞。在一些实施方案中，富集的髓样细胞群包含少于3％的CD56+细胞。在一些实施方案中，富集的髓样细胞群包含少于10％的CD42b+细胞。在一些实施方案中，富集的髓样细胞群包含少于5％的CD42b+细胞。在一些实施方案中，富集的髓样细胞群包含少于3％的CD42b+细胞。
在一些实施方案中，髓样细胞被富集并离体修饰以产生治疗有效的髓样细胞。如本文所用，离体修饰髓样细胞可意味着离体操纵细胞。如本文所用的离体操纵可以包括但不限于：髓样细胞的基因工程改造；在髓样细胞中表达转基因；使髓样细胞与核酸接触；使髓样细胞与化学物质或小分子接触；用细胞因子、生长因子、趋化因子、触觉刺激、热刺激或其组合来激活髓样细胞。
在一些实施方案中，对髓样细胞进行操纵以产生针对癌症的治疗剂。在一些实施方案中，对髓样细胞进行操纵以产生癌症疫苗。在一些实施方案中，对髓样细胞进行操纵以产生针对感染性疾病诸如病毒性、细菌性、真菌性、疟原虫或寄生虫感染的治疗剂。在一些实施方案中，对髓样细胞进行操纵以产生针对结核病的治疗剂。在一些实施方案中，对髓样细胞进行操纵以产生针对炎性疾病的治疗剂。在一些实施方案中，对髓样细胞进行操纵以产生针对自身免疫性疾病的治疗剂。
CD14+/CD16-单核细胞关键“祖”细胞
早期单核细胞或单核细胞祖细胞在细胞疗法中的潜力尚未得到充分研究。单核细胞在循环血群中占很大比例，并且是迄今为止组织(包括肿瘤)中免疫活性部位中最丰富的细胞。这些细胞迁移到几乎所有的病理组织中，并且可以分化成任意数量的下游骨髓效应细胞。通过利用这些细胞并将它们与工程改造相结合，这些髓样细胞可被设计为有效的细胞疗法工具，并广泛应用为癌症、神经退行性变、心脏病和感染性疾病等中的治疗剂。
治疗有效的髓样细胞的候选物可以是与成熟髓样细胞(例如巨噬细胞)相比具有更长寿命潜力的祖细胞；它们有可能成熟或分化成骨髓谱系，诸如巨噬细胞或树突状细胞谱系，有可能受到多种刺激的刺激，有可能很容易迁移到免疫活性组织位置并且可以激活适应性组织系统。本申请中描述的骨髓祖细胞可能不指骨髓祖干细胞。本公开中描述的方法不对应于干细胞动员过程。
本申请至少部分基于以下发现：如本文所述的具有治疗意义的髓样细胞的表型可以是单核细胞祖细胞谱系，尤其是具有分化为单核细胞、树突状细胞或极化为M0、M1或M2巨噬细胞亚型的可塑性。一方面，此类细胞可以是CD14+。一方面，此类细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，治疗有效的髓样细胞谱系可以表达高水平的CD14(CD14hi或CD14高)，并且表达低水平的CD16，或不表达可检测的CD16。在一个实施方案中，如本文所述的具有治疗意义的髓样细胞可以表达高水平的CCR2和/或CCR5，和/或用于迁移到对象的病变部位的趋化因子。在一个实施方案中，细胞表达低水平的CD206、CD163、CD80、CD86和/或CD63。
在一个实施方案中，髓样细胞可以在表型上与成熟巨噬细胞区分开来，因为细胞比成熟巨噬细胞更具球形，没有伪足，并且可以表达或可以被诱导以表达高水平的趋化因子和细胞因子，并且可以主动迁移到免疫活性组织位置。在一个实施方案中，本公开的髓样细胞可以是抗原幼稚的。
如本文所述的具有高治疗潜力的髓样细胞通常可以在健康人中以总外周血单核细胞(PMBC)的大于20％的水平存在于外周血中。
关于分离或富集并将此特定细胞用于临床目的，我们知之甚少。在一些情况下，关于树突状细胞(DC)疗法，DC可通过以下过程从分离的单核细胞中体外产生，该过程包括培养单核细胞并离体刺激细胞至少一周以产生准备好向对象输注的有效细胞。从细胞分离或富集(或从冷冻状态解冻)到施用的时间点，这样的过程需要不少于约10天。一方面，本文提供了一种通过以下步骤制备髓样细胞的方法：从对象的生物样品分离或富集细胞，用外源性剂操纵细胞并且能够施用于有需要的对象，其中所述方法可以在3天内完成(图1)。在一些实施方案中，可以通过用抗原或肽激活细胞以产生抗原呈递细胞来对细胞进行操纵。在一些实施方案中，操纵可以包括用一种或多种治疗剂激活细胞。在一些实施方案中，操纵可以是指基因操纵或异源核酸的掺入。
一方面，本文提供了一种包含CD14+/CD16-细胞群的组合物，其中CD14+/CD16-细胞群是工程改造的细胞群并且/或者包含外源性剂。
在一些实施方案中，细胞群是未极化或未分化的髓样细胞群。在一些实施方案中，外源性剂是编码在CD14+/CD16-细胞群的细胞中表达的蛋白质或肽的重组核酸。在一些实施方案中，外源性剂是编码在CD14+/CD16-细胞群中的细胞膜表面上表达的蛋白质或肽的重组核酸。在一些实施方案中，在膜表面上表达的蛋白质或肽是融合蛋白。在一些实施方案中，在膜表面上表达的肽可以结合至抗原或致病剂。
在一些实施方案中，抗原是癌抗原。在一些实施方案中，抗原是微生物致病抗原。在一些实施方案中，在膜表面上表达的蛋白质或肽是内体加工的蛋白质。在一些实施方案中，在膜表面上表达的蛋白质或肽是抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒、细菌、原生动物或真菌抗原。
在一些实施方案中，外源性剂是重组核酸，其包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列。在一些实施方案中，重组核酸包含编码CFP的序列，其中CFP包含：(a)包含抗原结合结构域的胞外结构域；和(b)与胞外结构域可操作地连接的跨膜结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域是CD5结合结构域或HER2结合结构域。
在一些实施方案中，外源性剂是编码抗原肽的重组核酸。在一些实施方案中，外源性剂是编码从CD14+/CD16-细胞群中的细胞分泌的蛋白质或肽的重组核酸。在一些实施方案中，外源性剂是重组核酸，其编码经内体加工的蛋白质。
在一些实施方案中，重组核酸编码的蛋白质是胞质蛋白。在一些实施方案中，重组核酸编码具有免疫原性的蛋白质或肽。在一些实施方案中，重组核酸编码增强细胞免疫应答的蛋白质或肽。
在一些实施方案中，外源性剂是抗原。
在一些实施方案中，所述方法可以在72小时或更短、70小时或更短、65小时或更短、60小时或更短、55小时或更短、50小时或更短、45小时或更短、40小时或更短、或35小时或更短的时间内完成。
在一些实施方案中，通过在体外掺入异源核酸来操纵髓样细胞。在一些实施方案中，在操纵后短暂培养细胞。在一些实施方案中，操纵使得所述操纵不改变细胞的可塑性。被操纵的细胞保持高水平的CD14表达，被操纵的细胞不以更高的水平表达CD16。被操纵的细胞在存在刺激的情况下表达CCR2和/或CCR5。在一些实施方案中，被操纵的细胞可以培养少于48小时(h)、或少于36小时、或少于24小时或少于20、18、16、14、12、10、8、6或少于4h。在一些实施方案中，可以在操纵之前或之后或这两者，在一种或多种情况下以冷冻和解冻的形式获得细胞。在一些实施方案中，小心地进行冷冻和解冻以使得该过程不会改变细胞的可塑性。
一方面，如本文所述的具有治疗意义的髓样细胞具有高可塑性，可有效地用作神经退行性疾病的细胞疗法中的治疗性细胞。分离的CD14+/CD16-髓样细胞可用于表达嵌合抗原受体(例如具有scFv)，作为阿尔茨海默氏病的治疗策略，所述受体可以结合并从神经退行性斑块中去除淀粉样蛋白β细胞，并促进淀粉样蛋白清除。另一方面，此类细胞可以被操纵以表达抗VEGF抗体；或用于产生针对病原体感染的更好的疫苗和岗哨细胞(图2)。
一方面，具有治疗意义的髓样细胞的特征在于高水平的可塑性，并且当细胞在体内遇到合适的刺激时，可以分化或被刺激以分化成许多细胞亚型，这些细胞亚型在免疫应答中非常有效。例如，如图3所示，如本文所述的表达CD14的髓样细胞可以在组织炎症或免疫应答部位处适当地分化成多种树突状细胞亚型。在一个实施方案中，具有治疗意义的髓样细胞可以被激活、分化和/或极化以在体内产生效应细胞，例如，当全身施用时可以迁移到感染或炎症部位，可以渗入免疫活性部位或例如肿瘤，并且可以在免疫活性部位，例如在肿瘤微环境部位处有效地发挥免疫功能。
一方面，本文提供的方法是可扩展的，并且可用于制造在临床规模上治疗有效的髓样细胞。在一些实施方案中，CD14+/CD16-髓样细胞可以通过负选择和使用商购的柱进行分离和纯化，并在临床规模下加工；根据需要，操纵分离的细胞，并制备治疗有效的组合物。
用于癌症免疫疗法中的髓样细胞
一方面，本文作为示例性或作为原理验证提供了在癌症免疫疗法中利用如本文所述的具有治疗意义的髓样细胞的组合物和方法。可以使用不改变这些细胞可塑性的方法从所分离的具有治疗意义的髓样细胞生成骨髓效应细胞。单核细胞谱系细胞是吞噬细胞，并且是有效的抗原呈递细胞。吞噬细胞是免疫系统的天然哨兵，并且在体内形成第一道防线。它们吞没病原体、病原体感染的细胞、外来体或癌细胞并且将其从体内除去。大多数潜在病原体在它们可能引起例如显著感染之前被该系统迅速中和。这可能涉及通过网格蛋白包被小窝系统进行的受体介导的摄取、作为膜边缘波动的结果的胞饮作用(特别是巨胞饮作用)和吞噬作用。因此，吞噬细胞可以由多种非自身(和自身)元件来激活，并且在识别其“靶标”方面表现出可塑性水平。大多数吞噬细胞在其表面上表达作为模式识别分子的清道夫受体，并且可以与广泛范围的外来颗粒以及体内的死细胞、碎屑和不需要的颗粒结合。一方面，编码嵌合抗原受体(CAR)的重组核酸可以在细胞中表达。CAR可被设计成不同的方式来攻击特定的肿瘤细胞，并且表达CAR的骨髓效应细胞可以被激活以吞噬和杀死肿瘤细胞。CAR可被设计来产生吞噬受体，这些受体被特异性激活以响应靶标的参与，并且巨噬细胞的吞噬潜能通过受体的特殊工程改造的胞内结构域而得到增强。此外，表达CAR的骨髓效应细胞可以迁移到淋巴结并将抗原交叉呈递给淋巴结中的幼稚T细胞，从而激活适应性应答。
在一些实施方案中，本文公开了用于产生髓样细胞的组合物和方法，所述髓样细胞从生物样品分离并离体工程改造以表达重组蛋白，并且被配制成药物组合物，使得组合物的髓样细胞是“效应”髓样细胞，在体内有效诱导免疫激活。在一些实施方案中，组合物的髓样细胞被称为‘ATAK’髓样细胞，其中细胞在攻击和破坏靶细胞方面是骨髓有效的。
本文提供了包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的重组核酸的组合物，所述嵌合融合蛋白是诸如吞噬受体(PR)融合蛋白(PFP)、清道夫受体(SR)融合蛋白(SFP)、整合素受体(IR)融合蛋白(IFP)或半胱天冬酶募集受体(半胱天冬酶-CAR)融合蛋白。由重组核酸编码的CFP可包含胞外结构域(ECD)，所述胞外结构域(ECD)包含结合至靶细胞抗原的抗原结合结构域。胞外结构域可以融合至衍生自受体的铰链结构域或胞外结构域，所述受体是诸如CD2、CD8、CD28、CD68、吞噬受体、清道夫受体或整合素受体。由重组核酸编码的CFP可进一步包含跨膜结构域，诸如衍生自CD2、CD8、CD28、CD68、吞噬受体、清道夫受体或整合素受体的跨膜结构域。在一些实施方案中，由重组核酸编码的CFP进一步包含胞内结构域，所述胞内结构域包括胞内信号传导结构域，诸如衍生自吞噬受体、清道夫受体或整合素受体的胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可以包含一个或多个衍生自吞噬受体、清道夫受体或整合素受体的胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可以包括一个或多个胞内信号传导结构域，其促进吞噬活性、炎症反应、一氧化氮产生、整合素激活、增强的效应细胞迁移(例如，经由趋化因子受体表达)、抗原呈递和/或增强的交叉呈递。在一些实施方案中，CFP是吞噬受体融合蛋白(PFP)。在一些实施方案中，CFP是吞噬清道夫受体融合蛋白(PFP)。在一些实施方案中，CFP是整合素受体融合蛋白(IFP)。在一些实施方案中，CFP是炎症受体融合蛋白。在一些实施方案中，由重组核酸编码的CFP进一步包含胞内结构域，所述胞内结构域包含募集结构域。例如，胞内结构域可以包含一个或多个PI3K募集结构域、半胱天冬酶募集结构域或半胱天冬酶激活和募集结构域(CARD)。
本文提供了一种组合物，其包含编码包含吞噬或束缚受体(PR)亚基(例如吞噬受体融合蛋白(PFP))的CFP的重组核酸，所述PR亚基包含：(i)跨膜结构域，和(ii)包含吞噬受体胞内信号传导结构域的胞内结构域；以及对抗原(例如，靶细胞的或靶细胞上呈递的抗原)有特异性的胞外抗原结合结构域；其中跨膜结构域与胞外抗原结合结构域可操作地连接，使得抗原通过在吞噬受体的胞内信号传导结构域中激活的融合受体的胞外抗原结合结构域与靶标结合。
本文提供了一种组合物，其包含编码包含吞噬或束缚受体(PR)亚基(例如吞噬受体融合蛋白(PFP))的CFP的重组核酸序列，所述PR亚基包含：跨膜结构域和包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；以及胞外结构域，其包含对靶细胞的抗原有特异性的抗原结合结构域；其中跨膜结构域与胞外结构域可操作地连接；并且其中在CFP与靶细胞的抗原结合后，表达CFP的髓样细胞诸如嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓树突状细胞(mDC)、肥大细胞或巨噬细胞的杀伤或吞噬活性与不表达CFP的细胞相比增加了至少大于5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或1000％。
一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含：(a)包含重组核酸的髓样细胞，诸如单核细胞、前体单核细胞或巨噬细胞，其中所述重组核酸包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列，所述CFP包含：(i)包含抗CD5结合结构域的胞外结构域，和(ii)与胞外结构域可操作地连接的跨膜结构域；以及(b)药学上可接受的载剂；其中所述髓样细胞表达CFP并且与不表达CFP的髓样细胞相比，表现出对表达CD5的靶细胞的吞噬作用至少1.1倍的增加。在一些实施方案中，CD5结合结构域是CD5结合蛋白，其包含抗体的抗原结合片段、Fab片段、scFv结构域或sdAb结构域。示例性CFP可以包含一个或多个下表(表1)中列出的氨基酸序列
表1.示例性嵌合融合蛋白和受体结构域
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在一些实施方案中，本公开提供了用于增强接合体介导的髓样细胞活化从而得到癌症免疫疗法的组合物和方法。本文提供的方法有助于设计工具，所述工具可以诱导驻留人单核细胞或巨噬细胞变为靶向癌细胞并通过高效的吞噬作用消除它们的高效杀伤细胞。在一些实施方案中，单核细胞或巨噬细胞提供针对癌细胞的持续免疫应答。本文描述了各种实施方案。
本文提供了特异性构建体，并且公开了用于此类嵌合蛋白(称为嵌合“接合体”)的设计。接合体可作为核酸治疗剂或蛋白质治疗剂直接施用于有需要的对象，其可在体内激活髓样细胞并帮助体内髓样细胞与靶细胞(例如癌细胞或受感染细胞)接合。
在一些实施方案中，嵌合接合体包含两种或更多种融合抗体，每种融合抗体具有在靶细胞(诸如癌细胞)上或者单核细胞或巨噬细胞上的特异性结合区域。在某些实施方案中，两种或更多种融合抗体或免疫融合体包含靶标结合结构域，所述靶标结合结构域由免疫球蛋白恒定区的铰链-CH2-CH3结构域或铰链-CH3结构域可操作地连接至特异性结合单核细胞或巨噬细胞的细胞表面组分的效应结合结构域。
一方面，嵌合蛋白是双特异性单核细胞或巨噬细胞接合体。在一些实施方案中，双特异性接合体包含第一治疗剂，其中第一治疗剂包含：(i)与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一抗原结合结构域；和(ii)与单核细胞或巨噬细胞的受体的细胞外区域特异性相互作用的第二抗原结合结构域。在一个实施方案中，治疗剂是双特异性接合体。在一个实施方案中，双特异性单核细胞或巨噬细胞接合体仅包含具有柔性接头的两个抗体单链可变区(scFv)(不包括Fc氨基酸区段)，一个scFv结合靶细胞的细胞表面组分并且另一个结合单核细胞或巨噬细胞表面上的受体。在IgG的完全未修饰形式中，可变轻链结构域(VL)和可变重链结构域(VH)是单独的多肽链，即分别位于轻链和重链中。形成了抗体轻链和抗体重链的相互作用，特别是抗体的表位结合位点之一VL和VH结构域的相互作用。相比之下，在scFv构建体中，而是抗体的VL和VH结构域包括在单一多肽链中。两个结构域由柔性接头分开，所述柔性接头足够长以允许VL和VH结构域自组装为功能性表位结合位点。
在一些实施方案中，双特异性单核细胞或巨噬细胞接合体包含：(a)与靶细胞的细胞表面组分(例如，癌抗原)结合的单链可变片段(scFv)，(b)与效应细胞(例如单核细胞或巨噬细胞)的细胞表面组分结合的单链可变片段(scFv)，(c)可操作地连接(a)和(b)的短接头。在一些实施方案中，scFv在其C末端处融合。每个scFv包含由肽接头可操作地连接的轻链可变结构域和重链可变结构域。在某些实施方案中，scFv是人源化的。人源化scFv包含存在于与互补决定区域(CDR)所来源于的亲本免疫球蛋白相比不同的物种的免疫球蛋白的框架上的“CDR”。例如，可以将鼠类CDR移植至人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。在一些实施方案中，双特异性接合体是双抗体。将双特异性双抗体构建为在单一多肽链上具有对不同(非相同)表位具有结合特异性的VL和VH结构域。另外，连接VL和VH的接头的长度短于12个氨基酸，所述长度不足以重新组装为功能性表位。一般来讲，一种多肽链构建体包含对第二抗原具有结合特异性的VL和对第二抗原具有结合特异性的VH，并且另一种多肽链构建体包含对第二抗原具有结合特异性的VL和对第一抗原具有结合特异性的VH；允许两条多肽链自组装为双特异性双抗体。在一些实施方案中，可以将半胱氨酸残基引入构建体的C端处，从而可以允许两条链之间的二硫键形成，而不干扰接合体分子的结合特性。在一些实施方案中，双特异性接合体是串联-双-scFv。在一些实施方案中，可以制备编码双特异性scFv接合体的重组核酸构建体。用于表达双特异性scFv接合体的重组核酸构建体包含一种或多种多肽，所述一种或多种多肽编码(a)编码靶细胞结合scFv轻链的可变结构域、接头、靶细胞结合scFv重链的可变结构域的核酸序列；(b)编码接头的核苷酸序列；(c)编码效应细胞(单核细胞或巨噬细胞)结合scFv轻链的可变结构域、接头、效应细胞(单核细胞或巨噬细胞)结合scFv重链的可变结构域的核酸序列。在一些实施方案中，用于表达双特异性scFv接合体的核酸构建体包含N末端信号肽序列以用于分泌双特异性scFv接合体。
在一些实施方案中，可操作地连接(a)和(b)的短接头可以进一步具有另外的功能。在一些实施方案中，肽可以与特定细胞表面受体(例如像TLR受体)结合，并且可以激活单核细胞或巨噬细胞中受体介导的细胞信号传导途径。在一些实施方案中，接头被设计为能够结合单核细胞或巨噬细胞并激活其中的至少一条炎症途径，或者加强单核细胞或巨噬细胞介导的对靶细胞的吞噬和杀伤。在一些实施方案中，接头肽可以具有阻断或抑制靶细胞介导的单核细胞或巨噬细胞功能下调的功能。
在一些实施方案中，可以产生用于双特异性VHH接合体的核酸构建体，其包含：(a)核酸序列，所述核酸序列编码(a)与靶细胞的细胞表面组分(例如，癌抗原)结合的VHH结构域，(b)与效应细胞(例如单核细胞或巨噬细胞)的细胞表面组分结合的VHH结构域，(c)可操作地连接(a)和(b)的短接头。在一些实施方案中，用于表达双特异性scFv接合体的核酸构建体包含N末端信号肽序列以用于分泌双特异性scFv接合体。
如本领域技术人员已知的，可以将编码包含VHH或scFv结合结构域的多肽的核酸序列插入在合适的表达载体中处于编码多肽的序列的5'端处的一个或多个启动子(例如CMV)和3'端处的聚腺苷酸化信号之下。
在一些实施方案中，嵌合蛋白是双特异性接合体。
三特异性接合体包含第一治疗剂，其中第一治疗剂包含：与靶细胞的抗原特异性相互作用的第一抗原结合结构域；与单核细胞或巨噬细胞的第一受体的胞外区域特异性相互作用的第二抗原结合结构域；以及与单核细胞或巨噬细胞的第二受体的胞外区域特异性地相互作用的第三抗原结合结构域。
在一些实施方案中，三特异性接合体是三个scFv的融合构建体，所述三个scFv包含对靶癌细胞上的细胞表面组分有特异性的第一scFv、对单核细胞或巨噬细胞上的细胞表面组分(例如，嵌合吞噬受体)有特异性的第二scFv以及对单核细胞或巨噬细胞上的另一个细胞表面组分有特异性的第三scFv。在一些实施方案中，三特异性接合体被设计为使得第三scFv可以结合的单核细胞或巨噬细胞上的细胞表面组分提供单核细胞或巨噬细胞的另外的激活信号，以触发对靶细胞的吞噬作用和杀伤。在一些实施方案中，第三scFv与单核细胞或巨噬细胞上的另一种吞噬受体结合。在一些实施方案中，第三scFv与危险相关的单核细胞或巨噬细胞信号传导途径(DAMP)结合。在一些实施方案中，第三scFv与TLR受体结合。在一些实施方案中，第三scFv与细胞因子受体结合，从而激活受体并且触发单核细胞或巨噬细胞细胞内信号传导。在一些实施方案中，第三scFv与已知产生吞噬作用抑制信号的单核细胞或巨噬细胞受体结合，并且第三scFv与受体的该结合阻断受体，使得能够增强吞噬作用。在一些实施方案中，第三scFv与跟一个或多个跨膜结构域接合并增强吞噬信号传导的受体结合。
在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合体与癌细胞上的抗原结合，所述抗原选自：胸苷激酶(TK1)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、粘蛋白-1、粘蛋白-16(MUC16)、MUC1、表皮生长因子受体vIII(EGFRvIII)、间皮素、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素、EBNA-1、LEMD1、磷脂酰丝氨酸、癌胚抗原(CEA)、B细胞成熟抗原(BCMA)、磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)、卵泡刺激激素受体、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、产生促红细胞生成素的肝细胞癌A2(EphA2)、EphB2、自然杀伤组2D(NKG2D)配体、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD45、CD56CD79b、CD97、CD117、CD123、CD133、CD138、CD171、CD179a、CD213A2、CD248、CD276、PSCA、CS-1、CLECL1、GD3、PSMA、FLT3、TAG72、EPCAM、IL-1、整合素受体、PRSS21、VEGFR2、PDGFR-β、SSEA-4、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、GM3、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、IGLL1及其组合。在一些实施方案中，例如，靶癌细胞的癌抗原可以是以下突变/癌抗原中的一种或多种：MUC16、CCAT2、CTAG1A、CTAG1B、MAGE A1、MAGEA2、MAGEA3、MAGE A4、MAGEA6、PRAME、PCA3、MAGE C1、MAGEC2、MAGED2、AFP、MAGEA8、MAGE9、MAGEA11、MAGEA12、IL13RA2、PLAC1、SDCCAG8、LSP1、CT45A1、CT45A2、CT45A3、CT45A5、CT45A6、CT45A8、CT45A10、CT47A1、CT47A2、CT47A3、CT47A4、CT47A5、CT47A6、CT47A8、CT47A9、CT47A10、CT47A11、CT47A12、CT47B1、SAGE1和CT55。在一些实施方案中，癌细胞上的抗原选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CCR4、CD8、CD30、CD45、CD56。
在一些实施方案中，抗原是卵巢癌抗原或T淋巴瘤抗原。
在一些实施方案中，例如，靶癌细胞的癌抗原可以是突变/癌抗原中的一种或多种：IDH1、ATRX、PRL3或ETBR，其中癌症是胶质母细胞瘤。
在一些实施方案中，例如，靶癌细胞的癌抗原可以是突变/癌抗原中的一种或多种：CA125、β-hCG、尿促性腺激素片段、AFP、CEA、SCC、抑制素或外二醇，其中癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，靶癌细胞的癌抗原可以是CD5。在一些实施方案中，靶癌细胞的癌抗原可以是HER2。在一些实施方案中，靶癌细胞的癌抗原可以是EGFR变体III。在一些实施方案中，靶癌细胞的癌抗原可以是CD19。在一些实施方案中，抗原是整合素受体。在一些实施方案中，抗原是选自以下的整合素受体：α1、α2、αIIb、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αD、αE、αL、αM、αV、αX、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7和β8。在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合体与来自整合素β2亚家族αMβ2(CD11b/CD18、Mac-1、CR3、Mo-1)、αLβ2(CD11a/CD18、LFA-1)、αXβ2(CD11c/CD18)和αDβ2(CD11d/CD18)的成员的单核细胞或巨噬细胞受体的胞外结构域结合。在一些实施方案中，接合体包含可以与粘附分子诸如整合素或选择素(例如，P-选择素、L-选择素或E-选择素)的胞外结构域结合的结合结构域。
激活吞噬作用的巨噬细胞受体包含胞内吞噬作用信号传导结构域，其包括具有一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)基序的结构域。在一些实施方案中，双特异性和三特异性接合体包含与单核细胞或巨噬细胞清道夫受体结合的结合结构域。在一些实施方案中，接合体与单核细胞或巨噬细胞上的一个或多个这些受体的结合被设计为激活单核细胞或巨噬细胞的吞噬作用。目前有八类清道夫受体(A-H类)。在一些情况下，已经将多个名称分配给相同受体(例如，MSR1、SR-AI、CD204和SCARA1)。此外，存在已经基于其他标准命名并且尚未包括在一般清道夫受体名称中的表现出清道夫受体活性的蛋白质。一些实例包括RAGE(SR-E1)、LRP1、LRP2、ASGP、CD163、SR-PSOX和CXCL16。在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合体包含与清道夫受体结合的结合结构域，所述清道夫受体选自凝集素、dectin 1、甘露糖受体(CD206)、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)和CD169受体。在一些实施方案中，双特异性或三特异性接合体包含结合结构域，其与可以例如经由激活以下中的任一种产生吞噬作用激活信号或促炎信号的蛋白质结合：MRC1、ItgB5、MERTK、ELMO、BAIL Tyro3、Axl、Traf6、Syk、MyD88、Zap70、PI3K、FcγR1、FcyR2A、FcyR2B2、FcyR2C、FcyR3A、FcER1、FcαRl、BAFF-R、DAP12、NFAM1和CD79b。
在一些实施方案中，接合体可被设计成包含促进髓样细胞的炎症活性的结构域，使得结合结构域可以与TLR接合。在一些实施方案中，接合体被设计为具有促进髓样细胞的细胞粘附和炎症活性的结构域。在一些实施方案中，接合体被设计为具有抑制髓样细胞的抗吞噬和抗炎活性的结合结构域。例如，双特异性或三特异性接合体可以包含抑制CD47介导的单核细胞或巨噬细胞吞噬作用下调的另外的功能结构域。肿瘤细胞典型地表达“不要吃我”的信号CD47，其与单核细胞或巨噬细胞受体SIRP-α结合，并且抑制吞噬作用。双特异性或三特异性接合体的一个臂可以包含CD47阻断剂。与接合体相关的CD47阻断剂可以是SIRP-α的胞外CD47结合结构域，充当诱骗受体或中和受体。
示例性的双特异性或三特异性接合体可以包含用于结合物或结合结构域或其部分的氨基酸序列，其包含如SEQ ID NO 8-14中所公开的任一种结合结构域或其片段。
结合结构域以10-5至10-12M或更小、或10-7至10-12M或更小、或10-8至10-12M的解离常数(KD)(即以105至1012M或更大、或107至1012M或更大、或108至1012M的缔合常数(KA))与其对应配体结合。
示例性抗CD5结合物可以包含含有以下序列的重链：MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTV(SEQ ID NO:36)
或
MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ IDNO:37)，或与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37具有至少90％同一性的序列。
另一示例性抗CD5结合物可以包含含有以下序列的重链：EIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTV(SEQ ID NO:38)或与SEQ ID NO:38具有至少90％同一性的序列，或EIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:39)或与SEQ ID NO:39具有至少90％同一性的序列。
示例性抗CD5结合物可以包含含有氨基酸序列的轻链：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:40)或与SEQ ID NO:40具有至少90％同一性的序列。
示例性双特异性或三特异性接合体，诸如含有抗CD5 scFv的双特异性或三特异性接合体可以包含连接示例性重链和示例性轻链的短肽接头，其具有以下序列：SSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)或SGGGGS(SEQ ID NO:42)或GGGGS(SEQ ID NO:43)或GGGG(SEQ ID NO:44)。
示例性抗CD5 scFv可以包含以下氨基酸序列：MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:45)或与SEQ ID NO:45具有至少90％同一性的序列。
示例性抗CD16 scFv可以包含含有氨基酸序列的重链可变序列：QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:46)或与SEQ ID NO:46具有至少90％同一性的序列。
示例性抗CD16 scFv可以包含含有氨基酸序列的轻链可变序列：SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:47)或与SEQ ID NO:47具有至少90％同一性的序列。
一方面，组合物的髓样细胞可以包含外源性核酸，所述外源性核酸包含编码抗原或免疫原性蛋白质的序列。这些细胞可用于治疗免疫疾病，例如像癌症或微生物感染。在一些实施方案中，通过向对象施用有效量的疫苗组合物在对象中诱导抗原特异性免疫应答，所述疫苗组合物包含含有外源性核酸的髓样细胞，所述外源性核酸包含编码抗原或免疫原性蛋白质的序列。抗原多肽是能够被适应性免疫系统特异性识别的多肽。抗原多肽包括任何具有免疫原性的多肽。抗原多肽包括但不限于病原体相关、过敏原相关、肿瘤相关、癌症相关或其他疾病相关的抗原。病原体可以是病毒性、寄生虫、真菌性和细菌性病原体以及蛋白质病原体，诸如朊病毒。抗原多肽可以是全长蛋白质或其部分。众所周知，免疫系统对许多蛋白质的识别是基于相对少量的氨基酸，通常称为表位。表位可能只有8-10个氨基酸。因此，本文所述的抗原多肽可以是全长蛋白质、8个氨基酸长的表位或10、12、15、18、20、25、30、35、40、50个氨基酸长或介于这些极端之间的任何部分。在一些实施方案中，抗原多肽可以包括超过一个表位。本文提供了药物组合物，包括基于细胞的抗肿瘤疫苗组合物(即，负载抗原的单核细胞和药学上可接受的载剂)。本文所述的免疫原性疫苗组合物或治疗性组合物可包含组合物，所述组合物包含分离自生物来源并使用本文公开的方法工程改造以表达外源性核酸的本公开的髓样细胞，所述外源性核酸表达一种或多种肿瘤抗原，并且所述组合物当施用于有需要的对象时，可有效产生抗肿瘤T细胞免疫。疫苗组合物可以包含至少50％的CD14+和CD16-细胞，其中这种CD14+/CD16-细胞表达一种或多种抗原肽。在一些实施方案中，组合物中少于10％的细胞是树突状细胞。在一些实施方案中，细胞组合物中巨噬细胞的总数不大于细胞总数的40％。巨噬细胞可以表征为表达多种细胞表面标志物，例如CD14、CD16、CD64、CD68、CCR5、CD206、F4/80等。在一些实施方案中，细胞组合物中巨噬细胞的总数可以小于30％、20％或10％。
在一些实施方案中，髓样细胞包含编码作为突变肽的免疫原性或抗原肽的重组核酸。在一些实施方案中，抗原肽是肿瘤相关肽。在一些实施方案中，抗原肽是仅存在于癌组织中(例如肿瘤中)的突变肽。在一些实施方案中，一种或超过一种抗原肽和一种或多种肽或蛋白质佐剂可以由用于工程改造髓样细胞的重组核酸编码。在一些实施方案中，抗原是卵巢癌抗原或T淋巴瘤抗原。在一些实施方案中，例如，由重组核酸编码的癌抗原多肽包含抗原或其片段或其表位，其可以选自一种或多种突变/癌抗原：MUC16、CCAT2、CTAG1A、CTAG1B、MAGE A1、MAGEA2、MAGEA3、MAGE A4、MAGEA6、PRAME、PCA3、MAGE C1、MAGEC2、MAGED2、AFP、MAGEA8、MAGE9、MAGEA11、MAGEA12、IL13RA2、PLAC1、SDCCAG8、LSP1、CT45A1、CT45A2、CT45A3、CT45A5、CT45A6、CT45A8、CT45A10、CT47A1、CT47A2、CT47A3、CT47A4、CT47A5、CT47A6、CT47A8、CT47A9、CT47A10、CT47A11、CT47A12、CT47B1、SAGE1和CT55。
在一些实施方案中，治疗有效的髓样细胞包含或呈递或表达一种或多种外源性或重组肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原是组织特异性抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原是内源性过表达的抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原是突变的蛋白质抗原。在一些实施方案中，治疗有效的髓样细胞包含或呈递或表达黑色素瘤抗原，诸如酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)抗原，诸如TRP2表位，诸如TRP2(SVYDFFVWL)的氨基酸180-188。在一些实施方案中，治疗有效的髓样细胞包含或呈递或表达突变抗原，例如胶质母细胞瘤抗原，例如异柠檬酸脱氢酶1(mIDHI)抗原，诸如突变IDH1抗原(R132H)，诸如GWVKPIIIGHHAYGDQYRATDFVVP。在一些实施方案中，方法可以包括施用包含或呈递或表达一种或多种外源性或重组抗原的髓样细胞以治疗癌症，诸如脑癌、神经胶质瘤或胶质母细胞瘤。
在一些实施方案中，例如，髓样细胞包含编码免疫原性或抗原肽的重组核酸，其中免疫原性或抗原肽可以是一种或多种突变/癌抗原：IDH1、ATRX、PRL3或ETBR，其中癌症是胶质母细胞瘤(GBM)。在一些实施方案中，GBM的抗原肽是突变的IDH。在一些实施方案中，突变的IDH包含R13H突变，并且可以包含氨基酸序列，GWVKPIIIGHHAYGDQYRATDFVVP(SEQ ID NO:48)。
在一些实施方案中，免疫原性肽是TRP2(180-188)肽，包含具有氨基酸序列SVYDFFVWL(SEQ ID NO:49)的表位。
在一些实施方案中，抗原肽是CMVpp65肽。
在一些实施方案中，重组核酸包含内体靶向序列，所述内体靶向序列是LAMP1序列。
在一些实施方案中，重组核酸包含分泌序列，所述分泌序列是以下各项的分泌信号肽序列：人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)信号传导序列、人免疫球蛋白重链信号传导序列、人免疫球蛋白轻链信号传导序列、人血清白蛋白信号传导序列、或人天青霉素信号传导序列、人胱抑素。
在一个实施方案中，用于操纵髓样细胞的重组核酸是mRNA。在一些实施方案中，mRNA是逆转录和纯化的。在一些实施方案中，mRNA通过电穿孔掺入细胞中。在一些实施方案中，mRNA被设计成具有长半衰期。在一些实施方案中，mRNA包含长的聚腺苷酸(poly A)尾。在一些实施方案中，mRNA 3'UTR包含来自β珠蛋白mRNA3'-UTR的区域。
在一些实施方案中，重组核酸是circRNA。
在一些实施方案中，编码重组核酸的mRNA包含逆转录转座子序列。在一些实施方案中，将编码重组CAR的核酸序列置于逆转录转座子元件内。在一些实施方案中，逆转录转座子包含Alu元件。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括将转基因稳定整合到细胞的基因组中，所述方法包括：将mRNA引入细胞中，所述mRNA包含：(a)编码转基因的序列；(b)5'UTR核酸序列和3'UTR核酸序列，其位于编码转基因的序列的两侧；其中5'UTR核酸序列或3'UTR核酸序列包含以下一种或多种：(i)核酸内切酶结合位点，(ii)逆转录酶结合位点，(iii)核糖体结合位点，(iv)逆转录转座酶结合位点，和(v)聚腺苷酸序列；其中编码转基因的序列是有义或反义方向性的，并且其中转基因稳定地掺入到细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述方法还包括将编码核酸内切酶和/或逆转录酶的序列引入细胞中。在一些实施方案中，mRNA包含编码核酸内切酶和/或逆转录酶的序列。
在一些实施方案中，核酸内切酶和/或逆转录酶是ORF2p。
在一些实施方案中，逆转录转座酶是L1 ORF蛋白。在一些实施方案中，逆转录转座酶是L1 ORF2p蛋白。在一些实施方案中，逆转录转座酶是L1 ORF1p蛋白。在一些实施方案中，聚腺苷酸序列是基因组DNA引发序列。在一些实施方案中，聚腺苷酸序列是逆转录的靶位点引物。
在一些实施方案中，基因组DNA引发序列包含与聚腺苷酸序列相邻的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个核苷酸。在一些实施方案中，与聚腺苷酸序列相邻的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个核苷酸形成用于逆转录的靶位点引物。在一些实施方案中，基因组DNA引发序列包含特定的基因组可靶向序列。在一些实施方案中，5'UTR或3'UTR包含SINE序列。在一些实施方案中，5'UTR包含Alu序列。在一些实施方案中，3'UTR包含Alu序列。在一些实施方案中，5'UTR包含L1序列。在一些实施方案中，3'UTR包含L1序列。在一些实施方案中，转基因被逆转录转座到基因组DNA中。转基因可包含编码如说明书中任何地方所述的CFP、接合体或抗原多肽的序列。在一些实施方案中，转基因以反式逆转录转座。在一些实施方案中，转基因以顺式逆转录转座。在一些实施方案中，转基因在特定基因组基因座处逆转录转座。在一些实施方案中，所述方法还包括与转基因3'端相邻的一个或多个终止密码子。在一些实施方案中，与转基因3'端相邻的一个或多个终止密码子可操作地连接至转基因。在一些实施方案中，与转基因3'端相邻的一个或多个终止密码子串联排列。在一些实施方案中，与转基因3'端相邻的一个或多个终止密码子排列在单独的阅读框中。在一些实施方案中，所述方法还包括将编码L1-ORF2的核酸引入髓样细胞中。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括将编码嵌合抗原受体蛋白的核酸和编码一种或多种另外的蛋白质或肽的一种或多种另外的核酸引入髓样细胞中。例如，所述方法包括将编码CAR的核酸和编码第二蛋白质或肽的第二核酸引入髓样细胞中。例如，所述方法包括将编码CAR的核酸和编码第二蛋白质或第二肽的第二核酸；以及编码第三蛋白质或第三肽的第三核酸引入髓样细胞中。在一些实施方案中，可以将编码一种或多种另外的蛋白质或肽的一种或多种另外的核酸进一步引入髓样细胞以促进CAR表达的增加。在一些实施方案中，一种或多种另外的核酸可以编码髓样细胞的生长因子，或增强吞噬功能，或任何其他相关功能。在一些实施方案中，一种或多种另外的核酸可以编码正向调节趋化性的蛋白质。在一些实施方案中，一种或多种另外的核酸可以编码增强掺入髓样细胞中的转基因表达的蛋白质。
在一个实施方案中，一种或多种另外的核酸包括编码间隙连接蛋白的核酸。在一个实施方案中，间隙连接蛋白的共表达增强掺入髓样细胞中的CAR转基因的表达。间隙连接是动态结构，由成百上千个通道组成，由连接蛋白构成，排列成准晶体阵列。这些胞间结构允许相邻细胞通过允许离子和小代谢物以及核酸通过而进行直接通信。在一些实施方案中，一种或多种另外的核酸编码粘附分子。细胞粘附分子具有使细胞相互粘附和粘附到胞外基质的能力，还允许细胞相互之间及与其环境相互作用和通信，并在此过程中调节一系列细胞功能，包括增殖、基因表达、分化、凋亡和迁移。示例性粘附分子包括但不限于整合素家族的成员、选择蛋白、钙粘蛋白、属于免疫球蛋白超家族的成员和CD44家族的成员。在一些实施方案中，将编码例如ICAM-1的第二核酸序列引入髓样细胞中，与CAR在同一细胞中共表达。在一些实施方案中，编码VCAM-1的第二核酸序列与CAR一起在髓样细胞中共表达。在一些实施方案中，第二核酸编码选择素。在一些实施方案中，第二核酸编码选择素。在一些实施方案中，第二核酸编码CD49a/CD29、或CD49b/CD29、或CD49c/CD29、或CD49d/CD29、或CD49e/CD29、或CD49f/CD29。在一些实施方案中，第二核酸和/或编码第二蛋白质或肽或另外的蛋白质肽的任何另外的核酸包含在载体中，例如表达载体中，其中表达载体具有调控元件，其可以被设计用于受控表达，例如，由转录“打开-关闭”开关控制的表达。具有转录打开-关闭开关的示例性载体可以包括本领域技术人员已知的四环素调控系统(Tet-on,Tet-off系统)或本领域技术人员容易想到的。
在一些实施方案中，一种或多种另外的核酸，例如第二核酸包含编码连接蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，一种或多种另外的核酸包括编码连接蛋白43的核酸。在一些实施方案中，编码连接蛋白43的核酸被包装在表达载体中，所述载体包含启动子、任选的增强子、5'-UTR和3'-UTR、3'UTR中的稳定部分诸如BGH3'区以及聚腺苷酸多核苷酸，它们可操作地连接到编码连接蛋白的核酸区。在一些实施方案中，连接蛋白43在细胞中过表达。在一些实施方案中，编码连接蛋白的核酸与编码嵌合抗原受体CAR的核酸是分开的。在一些实施方案中，编码CAR的核酸在与CAR不同的载体中。在一些实施方案中，CAR作为裸核酸被递送到髓样细胞中，而包含编码CAR的一种核酸的一种或多种核酸在表达载体中表达。在一些实施方案中，表达载体包含CMV启动子。在一些实施方案中，实施方案连接蛋白43是过表达的。在一些实施方案中，第二核酸和/或编码第二蛋白质或肽或另外的蛋白质肽的任何另外的核酸包含在载体中，例如表达载体中，其中表达载体具有调控元件，其可以被设计用于受控表达，例如，由转录“打开-关闭”开关控制的表达。具有转录打开-关闭开关的示例性载体可以包括本领域技术人员已知的四环素调控系统(Tet-on,Tet-off系统)或本领域技术人员容易想到的。
在一些实施方案中，核酸，例如编码嵌合蛋白的重组核酸，通过化学转染或电穿孔被引入髓样细胞中。在一些实施方案中，核酸通过电穿孔被引入髓样细胞中。
在一些实施方案中，核酸是mRNA。
在一些实施方案中，mRNA被直接注射到对象中用于疗法。在一些实施方案中，mRNA被包裹在脂质中。在一些实施方案中，RNA被修饰以在体内引入时促进髓样细胞优先摄取。RNA修饰可以包括糖基化。在一些实施方案中，mRNA在被吞噬细胞摄取之前通过糖基化被特异性修饰以延长循环中的稳定性。
在一些实施方案中，核酸被静脉内注射到对象体内。
在一些实施方案中，可以进一步操纵表达CAR的细胞以减少一种或多种内源基因的表达。在一些实施方案中，所述操纵可以包括在引入编码CAR的核酸之前或之后在髓样细胞的基因组水平编辑内源基因。例如，可以在髓样细胞中编辑基因或其调控片段以增强髓样细胞的一种或多种功能。在一些实施方案中，
在一些实施方案中，与不表达CAR的细胞相比，表达CAR的细胞表现出细胞因子和趋化因子产生的增加。在一些实施方案中，其中细胞因子选自IL-1、IL3、IL-6、IL-12、IL-13、IL-23、TNF、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL17、IP-10、RANTES、干扰素及其组合。
在一些实施方案中，与不表达CAR的细胞相比，表达CAR的细胞表现出效应子活性的增加。
在一些实施方案中，与不表达CAR的细胞相比，表达CAR的细胞表现出对CD47介导的吞噬作用抑制的抗性增加。
在一些实施方案中，与不表达CAR的细胞相比，表达CAR的细胞表现出对LILRB1介导的吞噬作用抑制的抗性增加。
在一些实施方案中，胞外结构域包含Ig结合结构域。
用于感染性疾病疗法的髓样细胞
一方面，本文所述的髓样细胞用于开发治疗有效的细胞以治疗感染性疾病。髓样细胞可以成为治疗感染诸如细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、某些原生动物感染的有力工具。在一个实施方案中，如本发明所述分离的髓样细胞被进一步操纵或修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)具有可与致病细菌上的抗原结合的胞外抗原结合结构域，以及触发和/或增强吞噬作用和/或激活髓样细胞内的炎性体组分的胞内结构域。
在一些实施方案中，CAR可被设计为具有对细菌表面抗原诸如脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)有特异性的胞外结合结构域，其可用于吞噬结核分枝杆菌。有效吞噬病原体(如结核分枝杆菌)的髓样细胞也可以将抗原呈递给淋巴细胞并产生长期免疫应答和免疫记忆。CAR可被设计为具有对来自例如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌或脑膜炎奈瑟菌的抗原有特异性的胞外结合结构域，所述胞外结合结构域可操作地连接到胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域在激活后可增强髓样细胞的吞噬作用。
在一些实施方案中，CAR可以包含针对病毒、靶向病毒抗原的结合结构域。在一些实施方案中，病毒抗原是流感抗原，诸如HA(血凝素)抗原(例如H1、H2、H3、H5)、神经氨酸酶抗原(例如N1、N2、N3等)或基质蛋白抗原(M1)、离子通道蛋白(M2)。表达针对如本文所述的示例性抗原的CAR的髓样细胞可用作基于髓样细胞的抗流感疫苗。
在一些实施方案中，CAR可包含针对HBV蛋白的结合结构域，并且表达CAR的髓样细胞可用于开发基于髓样细胞的HBV疫苗。示例性HBV抗原包括但不限于M-HbsAg、S-HBsAg和L-HBsAg。在一些实施方案中，CAR可以包含针对HPV16或HPV 18的衣壳蛋白的结合结构域。
在一个实施方案中，可以针对导致COVID大流行的冠状病毒(包括但不限于新型冠状病毒-19或2019-nCOV-2)产生强烈的T细胞应答。本文设想了一种髓样细胞，其表达冠状病毒抗原，诸如S蛋白抗原、NSP蛋白抗原、E蛋白抗原、M蛋白抗原、N蛋白抗原或NSP抗原，其中冠状病毒抗原由重组核酸编码。本文还设想了一种髓样细胞，其表达针对nCOV-2抗原诸如S蛋白抗原、NSP蛋白抗原、E蛋白抗原、M蛋白抗原、N蛋白抗原或NSP抗原的CAR。
在一些实施方案中，表达针对病原体的CAR的髓样细胞疗法可以帮助协调宿主中强烈的B细胞应答，同时通过吞噬作用和消除减少初始病原体负荷。
在一些实施方案中，表达针对病原体的CAR的髓样细胞疗法可以帮助协调宿主中强烈的T细胞应答，同时通过吞噬作用和消除减少初始病原体负荷。
在一些实施方案中，本文设想了在其表面上呈递用于体内或离体T细胞活化的抗原的髓样细胞。在一些实施方案中，髓样细胞包含或呈递或表达外源性或重组致病抗原。在一些实施方案中，髓样细胞包含或呈递或表达外源性或重组病毒抗原。在一些实施方案中，髓样细胞包含或呈递或表达外源性或重组细菌抗原。在一些实施方案中，髓样细胞包含或呈递或表达外源性或重组肿瘤抗原。
在一些实施方案中，髓样细胞对疫苗接种具有治疗效果。在一些实施方案中，髓样细胞负载有一种或多种特异性抗原。在一些实施方案中，髓样细胞是如本公开所述的前体细胞。在一些实施方案中，髓样细胞是CD14+。在一些实施方案中，髓样细胞是CD16-。在一些实施方案中，髓样细胞是CD14+/CD16-。在一些实施方案中，髓样细胞是CCR2+。
在一些实施方案中，髓样细胞包含或呈递或表达一种或多种外源性或重组病毒抗原。
在一些实施方案中，髓样细胞包含或呈递或表达外源性或重组流感抗原，诸如HA抗原、NA抗原、M1抗原、M2抗原、NP抗原、PB1抗原、PB2抗原、PA抗原或其组合。在一些实施方案中，表达流感抗原的髓样细胞是如本公开中所述的前体细胞。在一些实施方案中，髓样细胞是CD14+。在一些实施方案中，髓样细胞是CD16-。在一些实施方案中，髓样细胞是CD14+/CD16-。在一些实施方案中，髓样细胞是CCR2+。
在一些实施方案中，髓样细胞包含或呈递或表达外源性或重组2019-nCOV2抗原。在一些实施方案中，治疗有效的髓样细胞负载有一种或多种对2019-COV2有特异性的抗原。在一些实施方案中，包含或呈递或表达2019-nCOV2抗原的治疗有效的髓样细胞是如本公开中所述的前体髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效的髓样细胞是CD14+。在一些实施方案中，髓样细胞是CD16-。在一些实施方案中，髓样细胞是CD14+/CD16-。在一些实施方案中，髓样细胞是CCR2+。在一些实施方案中，用于冠状病毒疫苗接种的治疗有效的髓样细胞包含或呈递或表达外源性或重组复制酶蛋白抗原、S蛋白抗原、NSP蛋白抗原、E蛋白抗原、M蛋白抗原、N蛋白抗原或其组合。
在一个实施方案中，可以针对导致COVID大流行的冠状病毒(包括但不限于新型冠状病毒-19或2019-nCOV-2)产生强烈的T细胞应答。本文设想了一种表达针对nCOV-2(可互换地，SARS-CoV-2)抗原的CAR的髓样细胞，所述抗原是诸如S蛋白抗原、NSP蛋白抗原、E蛋白抗原、M蛋白抗原、N蛋白抗原或NSP抗原。
在一些实施方案中，将编码一种或多种抗原的融合蛋白的重组核酸引入本文所述的髓样细胞中，例如，CD14+/CD16-是髓样细胞。在一些实施方案中，一种或多种重组抗原由髓样细胞进行内体加工，例如表达CD14+且为CD16-的髓样细胞。
在一些实施方案中，本文提供了一种可开发成疫苗的组合物，其中示例性疫苗组合物可包含含有重组核酸的细胞。
在一些实施方案中，编码融合蛋白的mRNA包含用7-甲基-GTP帽加帽的5'端。在一些实施方案中，约70％的修饰RNA具有7-甲基-GTP帽。在一些实施方案中，约80％的修饰RNA具有7-甲基-GTP帽。在一些实施方案中，约90％的修饰RNA具有7-甲基-GTP帽。在一些实施方案中，大于90％的修饰RNA具有7-甲基-GTP帽。在一些实施方案中，编码融合蛋白的mRNA包含3'-聚腺苷酸尾。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾的长度为20-200个核苷酸。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾的长度为50-100个核苷酸。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾的长度小于、大于或为约50个核苷酸。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾的长度小于、大于或为约100个核苷酸。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾的长度小于、大于或为约200个核苷酸。
在一些实施方案中，编码融合蛋白的mRNA包含修饰的核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，编码融合蛋白的mRNA包含2'-O甲基化核苷酸。在一些实施方案中，2'-O甲基化核苷酸是第一核苷酸。在一些实施方案中，编码融合蛋白的mRNA包含5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，编码融合蛋白的mRNA包含用一个或多个5-甲氧基尿苷取代一个或多个尿苷核苷酸。
在一些实施方案中，公开了一种改进的免疫原性剂，其可用于激活髓样细胞，使得髓样细胞又可以激活各种淋巴细胞类型，包括CD8+T细胞、CD4+T细胞和B细胞。
在一些实施方案中，抗原在髓样细胞中表达，其中髓样细胞是CD14+/CD16-髓样细胞。抗原可以是重组抗原。可以设计抗原以使其靶向MHC加工途径。可以设计抗原以使其靶向分泌途径。可以设计抗原以使其靶向MHC加工途径和分泌途径两者。适用于编码这种抗原设计的示例性重组核酸可以是编码融合蛋白的构建体；其中抗原肽与促进共翻译运输到内体隔室以加工和呈递抗原的肽融合。在一些实施方案中，内体靶向序列可以是衍生自LAMP蛋白诸如LAMP1或LAMP2的靶向序列。
示例性LAMP1序列是LIPIAVGGALAGLVLIVLIAYLVGRKRSHAGYQTI(SEQ ID NO:54)。肽序列可以融合到抗原序列的C末端。
在一些实施方案中，构建体可包含编码抗原的序列，所述抗原包含靶向分泌的信号序列或前导序列。此类序列是分泌信号序列。分泌蛋白通常在N末端处包含前导序列或信号序列，其长度为约8-20个氨基酸。示例性分泌蛋白是细胞因子、生长因子、趋化因子、白蛋白等。此类序列可用于替换天然抗原信号序列。在其他实施方案中，可以将信号序列添加到抗原序列的N末端。示例性分泌信号肽序列是人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)信号传导序列：MWLQSLLLLGTVACSIS(SEQ ID NO:7)。另一个示例性分泌信号序列是人免疫球蛋白重链信号传导序列：MDWTWRVFCLLAVTPGAHP(SEQ ID NO:57)，或人免疫球蛋白轻链信号传导序列：MAWSPLFLTLITHCAGSWA(SEQ ID NO:58)。另一个示例性分泌信号序列是人血清白蛋白信号传导序列：MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO:59)。另一个示例性分泌信号序列是人天青霉素信号传导序列：MTRLTVLALLAGLLASSRA(SEQ ID NO:60)。可用于促进分泌的示例性分泌信号肽是：人胱抑素：MARPLCTLLLLMATLAGALA(SEQ ID NO:61)。任何抗原都可被修饰以从细胞中释放，从而激活CD4+T细胞和B细胞。
在一些实施方案中，重组核酸编码超过一种抗原，由诸如T2A序列的自切割序列分开。示例性重组构建体是融合构建体，其包含与内体靶向蛋白序列诸如LAMP1蛋白序列融合的抗原拷贝和具有分泌信号的另一个拷贝，其中这两个拷贝由可切割序列诸如T2A序列分隔开。
在一些实施方案中，重组核酸可以编码一种或多种抗原，其可以与内体靶向序列融合。在一些实施方案中，重组核酸可以编码一种或多种抗原，包含至少一个分泌序列。
在一些实施方案中，重组核酸编码与内体靶向序列融合的第一抗原和包含分泌序列的第二抗原。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原由相同基因编码。
在一些实施方案中，编码一种或多种抗原的mRNA的长度为100-10,000个核苷酸。在一些实施方案中，编码一种或多种抗原的mRNA的长度为1000-5000个核苷酸。在一些实施方案中，编码一种或多种抗原的mRNA的长度为500-2000个核苷酸。在一些实施方案中，编码一种或多种抗原的mRNA的长度为500-8000个核苷酸。在一些实施方案中，编码一种或多种抗原的mRNA的长度小于、大于或为约3000个核苷酸。在一些实施方案中，编码一种或多种抗原的mRNA的长度小于、大于或为约4000个核苷酸。在一些实施方案中，编码一种或多种抗原的mRNA的长度小于、大于或为约5000个核苷酸。在一些实施方案中，编码一种或多种抗原的mRNA的长度小于、大于或为约6000个核苷酸。在一些实施方案中，编码一种或多种抗原的mRNA的长度小于、大于或为约7000个核苷酸。在一些实施方案中，编码一种或多种抗原的mRNA的长度小于、大于或为约8000个核苷酸。在一些实施方案中，编码一种或多种抗原的mRNA的长度小于、大于或为约9000个核苷酸。
在一些实施方案中，重组核酸是编码融合蛋白的mRNA，其包含SARS-CoV-2刺突(S)的一个或多个T细胞表位和/或SARS-CoV-2核衣壳蛋白(NP)的一个或多个T细胞表位。在一些实施方案中，编码融合蛋白的mRNA包含SARS-CoV-2刺突(S)的一个或多个T细胞表位和/或SARS-CoV-2核衣壳蛋白(NP)的一个或多个T细胞表位，融合到可能是溶酶体靶向部分的标签上。
由重组核酸编码的SARS-CoV-2的示例性T细胞表位可以是具有以下序列的肽：MRALWVLGLCCVLLTFGSVRA(SEQ ID NO:50)。
在一些实施方案中，核酸，诸如mRNA或质粒，编码SEQ ID NO:51中所示的SARS-CoV-2的一个或多个T细胞表位：VASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQ(SEQ ID NO:51)。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2的一个或多个T细胞表位的核酸(诸如mRNA或质粒)编码具有SEQ ID NO:52所示序列的肽：ISAMVRS(SEQ ID NO:52)。
在一些实施方案中，核酸，诸如mRNA或质粒，编码SEQ ID NO:53中所示的SARS-CoV-2的一个或多个T细胞表位：AGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTAAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA(SEQ ID NO:53)。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2的一个或多个T细胞表位的核酸(诸如mRNA或质粒)编码具有SEQ ID NO:54所示序列的肽：LIPIAVGGALAGLVLIVLIAYLVGRKRSHAGYQTI(SEQID NO:54)。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2的一种或多种抗原的核酸(诸如mRNA或质粒)包含SEQ ID NO:55的序列：ATGAGGGCCCTGTGGGTGCTGGGCCTCTGCTGCGTCCTGCTGACCTTCGGGagcGTacgtGCT(SEQ ID NO:55)。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2的一种或多种抗原的核酸(诸如mRNA或质粒)可以包含SEQ ID NO:56的序列：GTAGCTAGCCAGAGCATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCAGAGAACAGCGTGGCCTATTCCAACAACTCTATCGCCATTCCCACCAACTTTACAATTAGCGTCACAACAGAGATCCTGCCCGTGAGCATGACCAAGACCAGCGTGGACTGTACAATGTACATCTGTGGCGACAGCACTGAATGCAGCAACCTGCTGCTGCAATACGGCTCCTTTTGCACCCAACTGAACCGGGCGCTGACCGGAATCGCCGTGGAACAGGACAAAAATACCCAGGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCACCTATCAAGGACTTCGGCGGCTTTAACTTTAGCCAGATTCTCCCTGATCCTTCTAAGCCTAGCAAGCGGAGCTTTATCGAGGATCTGCTGTTCAACAAGGTCACCCTGGCCGATGCCGGCTTTATCAAACAGTATGGCGATTGCCTGGGCGACATAGCCGCCAGAGATCTGATCTGCGCCCAGAAATTCAACGGCCTGACAGTTCTCCCACCTCTGCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTACACCTCTGCCCTGCTGGCTGGCACCATCACATCTGGGTGGACATTTGGCGCCGGCGCCGCCCTGCAGATCCCCTTTGCCATGCAGATGGCCTATAGATTCAACGGAATCGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTATGAAAACCAGAAGCTGATCGCTAACCAGTTCAATTCTGCCATCGGCAAGATCCAGGACTCCCTCTCCTCTACCGCCAGCGCCCTGGGCAAACTGCAGGACGTGGTGAATCAGAACGCCCAAGCCCTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTCAGCAGCAATTTTGGCGCCATCAGCTCTGTGCTGAACGATATCCTGTCTAGACTGGACCCTCCAGAAGCCGAAGTCCAGATCGATAGACTGATCACAGGCAGACTGCAGTCCCTGCAAACCTACGTGACCCAACAGCTGATCAGGGCCGCTGAAATAAGAGCCAGCGCCAATCTCGCCGCTACCAAGATGTCCGAGTGTGTGCTGGGACAGTCTAAACGCGTTGACTTCTGCGGCAAAGGCTATCACCTGATGAGCTTCCCCCAGAGCGCGCCGCACGGCGTGGTGTTCCTGCATGTGACATACGTGCCTGCCCAAGAGAAGAATTTCACAACCGCCCCTGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCAAGAGAGGGCGTTTTCGTTTCCAATGGCACACACTGGTTCGTGACACAAAGAAACTTCTACGAACCCCAGATTATCACCACCGACAACACCTTCGTGAGTGGCAATTGTGACGTGGTCATCGGAATCGTGAACAACACAGTGTACGACCCTCTGCAACCTGAGCTGGACTCTTTTAAGGAAGAGCTGGACAAGTACTTTAAAAACCACACCAGCCCCGATGTGGACCTGGGCGACATCAGTGGCATTAACGCCAGCGTGGTGAACATCCAAAAGGAAATCGACAGACTGAACGAGGTGGCCAAGAACCTGAACGAGTCCCTGATCGACCTGCAGGAGCTCGGCAAATACGAGCAG(SEQID NO:56)。
制备治疗有效的髓样细胞的方法
髓样细胞的分离和/或富集
髓样细胞可以从人外周血分离。在一些实施方案中，髓样细胞可以通过直接抽取外周血从对象分离。在一些实施方案中，髓样细胞可以从容器中可用的白细胞单采术样品分离。在一些实施方案中，来自健康供体的外周血用作髓样细胞的来源。在一些实施方案中，PBMC从健康供体的血液样品分离。
在一些实施方案中，PBMC在无菌、封闭系统分离。
在一些实施方案中，PBMC可以与结合至单核细胞或单核细胞祖细胞上的细胞表面分子的抗体接触，并且该抗体用于分离目标细胞。在一些实施方案中，PBMC细胞与抗体包被的珠粒接触，这些珠粒与PBMC内的特定细胞结合，这些细胞表达抗体所结合的特定细胞表面标志物。在一些实施方案中，抗原可以被固定，例如粘附到容器或柱的表面，或者可以附着在珠粒上，当这些珠粒通过PBMC细胞悬液时，捕获表达抗体所结合的细胞表面分子的细胞。这种方法被称为正选择法。在一些实施方案中，PBMC与抗CD14抗体或抗CD14抗体包被的珠粒接触。在一些实施方案中，一种或多种以下抗体用于正选择，其可以结合至在如本文所述的目标髓样细胞上表达的一种或多种表面标志物，但此类标志物不限于由以下组成的列表：CD64、CD192(CCR2)、CD195(CCR5)、CD120a(TNFR1)和CD120b(TNFR2)。在一些实施方案中，如本文所用的任何抗体可以是完整抗体或其功能片段、Fab'、重组抗体、工程改造的抗体、scFv、双抗体、三抗体或其他工程改造的捕获分子。在一些实施方案中，可以工程改造的抗体在结合时不激活一种或多种细胞表面分子和/或不导致髓样细胞中的紧张性信号传导。
与抗体包被的珠粒结合的细胞可以借助于以下手段分离：密度梯度离心；通过磁性分离(其中珠粒是磁珠)；或通过任何其他合适的方式，例如使用预先固定在表面上的珠粒并使PBMC作为流动相通过固定珠粒床。在将未结合的细胞与珠粒结合的细胞分离并用合适的缓冲液洗涤后，通过合适的方法将细胞从珠粒上洗脱下来，例如，通过使用合适的缓冲液或使用肽酶或任何解偶联细胞与抗体包被的珠粒之间的键的其他合适的酶或化合物对配体-抗体结合进行解偶联。回收细胞用于进一步分析。
在一些实施方案中，PBMC可以与结合细胞表面分子的抗体接触，该细胞表面分子在不是单核细胞或单核细胞祖细胞的细胞上表达，并且所述抗体用于从PBMC中去除不需要的细胞并分离剩余的目标细胞。这被称为负选择法。在一些实施方案中，这种方法可以是优选的，例如，考虑到单核细胞在与细胞表面结合分子(诸如抗体)接触时可能变得活化的事实。通过负选择可以避免过早活化。在一些实施方案中，在本发明上下文中的负选择可以通过去除淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞、成熟巨噬细胞和/或耗尽的吞噬细胞中的一种或多种来实现。在一些实施方案中，所述方法包括从任何生物样品中选择性消耗淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞、成熟巨噬细胞和/或耗尽的吞噬细胞中的一种或多种，使得最终收获的剩余细胞是如本文所述的单核细胞或祖单核细胞。在一些实施方案中，一种或多种抗体适合用于去除上面列出的所述细胞，可以包括但不限于CD3抗体、CD16抗体、CD19抗体、CD56抗体。在一些实施方案中，例如，通过使PBMC与抗CD3抗体珠粒接触来进行负选择以获得目标细胞。在一些实施方案中，例如，通过使PBMC与抗CD16抗体珠粒接触来进行负选择以获得目标细胞。在一些实施方案中，使用抗CD19抗体，例如，使用抗CD19抗体包被的珠粒。在一些实施方案中，抗CD56抗体可用于负选择。在一些实施方案中，抗TNFR2抗体可用于负选择。在一些实施方案中，抗体的任意一种或任意数量的组合可以选自包括CD3结合抗体、CD8结合抗体、CD16结合抗体、CD19结合抗体、CD56结合抗体、CX3CR1(fractalkine)结合抗体和TNFR2结合抗体。
一个关键问题是需要密度梯度来获得PBMC，因为密度梯度不容易用于GMP目的和/或不能在封闭系统中轻松执行。虽然依赖塑料粘附的方法相对便宜，但其他方法像通过抗huCD14微珠的正选择或负选择可能不具有成本效益。此外，在正选择下，对异种抗体的使用存在额外的担忧。在一些实施方案中，单核细胞在未触及下被分离以避免过早激活细胞。此过程可以是负选择并且可以通过淘析来进行。
可以用Elutrak进行单核细胞的淘析，这允许在封闭系统中快速且廉价地分离或富集大量未触及的单核细胞。外周血单核细胞可使用细胞分离器(Elutrak,Gambro BCT,Lakewood,Colorado,USA)和单次使用的、功能密封的一次性套件(包含40-ml淘析室)直接从未动员的白细胞单采术产物中富集。细胞分离发生在沉降速度的基础上，这取决于细胞大小和/或密度。可以使用细胞入口泵将白细胞单采术产物装入淘析室并以2400rpm的速度进行离心。此后，离心机速度可以保持恒定，并且包含在两个3-l汇集袋(T3006,Cell-MaxGmbH,Munich,Germany)中的淘析介质(PBS；Bio Whittaker,Walkersville,USA，补充有1％人血清白蛋白；Aventis-Behring,Marburg,Germany)的流动可以逐步增加，以允许将特定的细胞级分淘析到预先连接的收集袋中。
在一些实施方案中，需要至少10^8至约10^12个PBMC，从分离(富集)目标细胞。在一些实施方案中，目标细胞是CD14+细胞。在一些实施方案中，目标细胞是CD14+/CD16-细胞。在一些实施方案中，目标细胞是CD14+/CD16-细胞，其可以表达高水平的细胞表面蛋白，而不是CD14或CD16。在一些实施方案中，目标细胞可以表达高水平的CCR2。在一些实施方案中，在分离或富集目标细胞之前的总细胞可以是约10^8、5x10^8、10^9、5x10^9、10^10、5x10^10、10^11、5x10^11、10^12、5x10^12个细胞或更多。在一些实施方案中，在分离或富集目标细胞之前PBMC的总数可以是至少10^9至约10^12个细胞。在一些实施方案中，在分离或富集目标细胞之前的总细胞可以是约2x10^9、3x10^9、4x10^9、5x10^9、6x10^9、7x10^9、8x10^9、9X10^9或10^10个细胞；约2x10^10、3x10^10、4x10^10、5x10^10、6x10^10、7x10^10、8x10^10、9X10^10个细胞或10^11个细胞；约2X10^11、3x10^11、4x10^11、5x10^11、6x10^11、7x10^11、8x10^11、9X10^11或10^12个细胞；约5x10^12或更多。
在一些实施方案中，在例如使用如上所述的抗体包被的珠粒分离或富集程序之后回收的目标细胞可以是在分离或富集之前的某个时间计数的总PBMC的一部分。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是至少10^7个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是至少10^8个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是至少10^9个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是至少10^10个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约2x10^7个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约3x10^7个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约4x10^7个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约5x10^7个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约6x10^7个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约7x10^7个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约8x10^7个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约9x10^7个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约10^8个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约2x10^8个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约3x10^8个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约4x10^8个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约5x10^8个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约6x10^8个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约7x10^8个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约8x10^8个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约9x10^8个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约10^9个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约2x10^9个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约5x10^9个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约8x10^9个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约9x10^9个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约10^10个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约5x10^10个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约10^11个细胞。在一些实施方案中，分离或富集后的目标细胞可以是约5x10^11个细胞或更多。
在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于2倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于3倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于4倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于5倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于6倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于7倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于8倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于9倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于10倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于12倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于14倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于15倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于20倍。在一些实施方案中，分离或富集过程可以使目标细胞富集大于25倍。
分离细胞的表征
在分离或富集目标细胞后，对细胞进行表征。在大多数情况下，从回收的目标细胞中取出等分试样，通过进一步的测定进行性质和功能特征的采样。使用合适的细胞活力测定检查细胞的细胞活力。示例性测定包括台盼蓝排除测定、LDH释放测定和NC200测定。在一些实施方案中，使用自动化活细胞计数器，诸如NucleoCounter NC 200(Chemometec)，其中仅计数活细胞并且总细胞计数等于总活细胞计数。
在一些实施方案中，大于至少50％的分离细胞可以是CD14+，如通过合适的测定法所确定，诸如使用回收细胞的等分试样进行的流式细胞术测定法。在一些实施方案中，大于至少60％的分离细胞可以是CD14+。在一些实施方案中，大于至少70％的分离细胞可以是CD14+。在一些实施方案中，大于至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％的分离细胞可以是CD14+。在一些实施方案中，大于81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％的分离细胞可以是CD14+。在一些实施方案中，大于91％的分离细胞可以是CD14+。在一些实施方案中，大于92％的分离细胞可以是CD14+。在一些实施方案中，大于93％的分离细胞可以是CD14+。在一些实施方案中，大于94％的分离细胞可以是CD14+。在一些实施方案中，大于95％的分离细胞可以是CD14+。在一些实施方案中，大于96％的分离细胞可以是CD14+。在一些实施方案中，大于97％的分离细胞可以是CD14+。在一些实施方案中，大于98％的分离细胞可以是CD14+。在一些实施方案中，大于99％的分离细胞可以是CD14+。
分离的细胞可以是CD16-，如使用回收细胞的等分试样，通过流式细胞术测定法所确定。在一些实施方案中，至少50％的分离细胞可以是CD16-，如使用回收细胞的等分试样，通过流式细胞术测定法所确定。在一些实施方案中，至少60％的分离细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，至少70％的分离细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，大于至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％的分离细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，大于81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％的分离细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，大于91％的分离细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，大于92％的分离细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，大于93％的分离细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，大于94％的分离细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，大于95％的分离细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，大于96％的分离细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，大于97％的分离细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，大于98％的分离细胞可以是CD16-。在一些实施方案中，大于99％的分离细胞可以是CD16-。
在一些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％或70％的分离或富集的细胞可以是CD14+/CD16-。在一些实施方案中，至少75％的分离或富集的细胞可以是CD14+/CD16-。在一些实施方案中，至少80％的分离或富集的细胞可以是CD14+/CD16-。在一些实施方案中，至少85％的分离或富集的细胞可以是CD14+/CD16-。在一些实施方案中，至少90％的分离或富集的细胞可以是CD14+/CD16-。在一些实施方案中，至少95％的分离或富集的细胞可以是CD14+/CD16-。
分离或富集的细胞可以包含至少少于5％的CD3+细胞，如使用回收细胞的等分试样，通过流式细胞术测定法所确定。分离的细胞可以包含至少少于4％的CD3+细胞。分离的细胞可以包含至少少于3％的CD3+细胞。分离的细胞可以包含至少少于2％的CD3+细胞。分离的细胞可以包含至少少于5％的CD19+细胞，如使用回收细胞的等分试样，通过流式细胞术测定法所确定。分离的细胞可以包含至少少于4％的CD19+细胞。分离的细胞可以包含至少少于4％的CD3+细胞。分离的细胞可以包含至少少于3％的CD19+细胞。分离的细胞可以包含至少少于2％的CD19+细胞。至少5％的分离细胞可以是CD56-细胞，如使用回收细胞的等分试样，通过流式细胞术测定法所确定。至少4％的分离细胞可以是CD56-细胞。至少3％的分离细胞可以是CD56-细胞。至少2％的分离细胞可以是CD56-细胞。
在一些实施方案中，细胞群中少于10％的细胞是树突状细胞。例如，细胞群可包含少于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的树突状细胞。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CCR2+。例如，细胞群可包含至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CCR2+细胞。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CCR5+。例如，细胞群可包含至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CCR5+细胞。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD11b+。例如，细胞群可包含至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD11b+细胞。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD63+。例如，细胞群可包含至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD63+细胞。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD16-。例如，细胞群可包含至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD16-细胞。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD56-。例如，细胞群可包含至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD56-细胞。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD3-。例如，细胞群可包含至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD3-细胞。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD19-。例如，细胞群可包含至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD19-细胞。在一些实施方案中，细胞群中至少50％的细胞是CD42b-。例如，细胞群可包含至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD42b-细胞。在一些实施方案中，细胞群中少于40％的细胞是巨噬细胞。例如，细胞群可包含少于35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％或更少的巨噬细胞。
在一些实施方案中，细胞群中至少25％的细胞是CD14+/CD16-/CD3-。例如，细胞群可包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD14+/CD16-/CD3-细胞。
在一些实施方案中，细胞群中至少25％的细胞是CD14+/CD16-。例如，细胞群可包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD14+/CD16-细胞。
在一些实施方案中，细胞群中至少25％的细胞是CD3-/CD19-/CD42b-/CD56-。例如，细胞群可包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD3-/CD19-/CD42b-/CD56-细胞。
在一些实施方案中，细胞群中至少25％的细胞是CD14+/CD16-/CD11b+。例如，细胞群可包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD14+/CD16-/CD11b+细胞。
在一些实施方案中，细胞群中至少25％的细胞是CD14+/CD16-/CD11b+/CD3-/CD19-/CD42b-。例如，细胞群可包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD14+/CD16-/CD11b+/CD3-/CD19-/CD42b-细胞。
在一些实施方案中，细胞群中至少25％的细胞是CD14+/CD16-/CD11b+/CD3-/CD19-/CD56-。例如，细胞群可包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD14+/CD16-/CD11b+/CD3-/CD19-/CD56-细胞。
在一些实施方案中，细胞群中至少25％的细胞是CD14+/CD16-/CD11b+/CD3-/CD42b-/CD56-。例如，细胞群可包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD14+/CD16-/CD11b+/CD3-/CD42b-/CD56-细胞。
在一些实施方案中，细胞群中至少25％的细胞是CD14+/CD16-/CD11b+/CD19-/CD42b-/CD56-。例如，细胞群可包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD14+/CD16-/CD11b+/CD19-/CD42b-/CD56-细胞。
在一些实施方案中，细胞群中至少25％的细胞是CD14+/CD16-/CD3-/CD19-/CD42b-/CD56-。例如，细胞群可包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD14+/CD16-/CD3-/CD19-/CD42b-/CD56-细胞。
在一些实施方案中，细胞群中至少25％的细胞是CD14+/CD11b+/CD3-/CD19-/CD42b-/CD56-。例如，细胞群可包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD14+/CD11b+/CD3-/CD19-/CD42b-/CD56-细胞。
在一些实施方案中，细胞群中至少25％的细胞是CD16-/CD11b+/CD3-/CD19-/CD42b-/CD56-。例如，细胞群可包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD16-/CD11b+/CD3-/CD19-/CD42b-/CD56-细胞。
在一些实施方案中，细胞群中至少25％的细胞是CD14+/CD16-/CD11b+/CD3-/CD19-/CD42b-/CD56-。例如，细胞群可包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD14+/CD16-/CD11b+/CD3-/CD19-/CD42b-/CD56-细胞。
在分离或富集之后，可以通过功能测定诸如吞噬作用测定或趋化性测定进一步表征细胞。在一些实施方案中，具有上述特征的细胞被进一步用于开发成治疗有效的髓样细胞。细胞可在分离或富集后冷冻或进入下一步以供制备药物组合物。在一些实施方案中，髓样细胞在施用于有需要的对象之前不被转化或活化。
在一些实施方案中，CD14+/CD16-细胞群可以从生物样品，例如外周血分离，例如通过负选择从白细胞单采术样品分离，然后在体外(即离体)操纵(例如工程改造)以掺入编码一种或多种重组蛋白(诸如CFP蛋白)的核酸。在一些实施方案中，工程改造髓样细胞包括通过外源性核酸例如重组核酸的转染或电穿孔或核转染掺入外源性核酸。在一些实施方案中，核酸的掺入通过电穿孔进行。核酸的掺入产生表达重组蛋白的工程改造的细胞，例如CFP。在一些实施方案中，将表达重组蛋白的CD14+/CD16-细胞群培养2-20小时以在体外稳定细胞并从外来核酸掺入细胞中恢复。在一些实施方案中，通过本文所述的方法分离细胞群以从外周血例如PBMC中获得CD14+/CD16-细胞，并在1-10小时内电穿孔。在一些实施方案中，测试从分离群中等分出的样品的细胞表面分子的活力和表达，诸如CD14表达、CD16表达、CD11b表达、CD3表达、CD19表达、CD56表达、CD42b表达、CD63表达、CCR2表达、CCR5和/或CXCR1表达。在一些实施方案中，细胞群在分离或富集后1小时内被电穿孔。在一些实施方案中，细胞群在从分离或富集之时起2小时内、1-3小时内、2-4小时内、1-5小时内、3-6小时、小于6小时、小于8小时或小于10小时被电穿孔。在一些实施方案中，电穿孔的细胞群可在体外培养至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时，然后(i)施用于对象，或(ii)冷冻以备将来使用。在一些实施方案中，电穿孔的细胞群可在体外培养少于12小时，然后(i)施用于对象，或(ii)冷冻以备将来使用。在一些实施方案中，电穿孔的细胞群可在体外培养少于18小时，然后(i)施用于对象，或(ii)冷冻以备将来使用。在一些实施方案中，电穿孔的细胞群可在体外培养少于24小时，然后(i)施用于对象，或(ii)冷冻以备将来使用。在一些实施方案中，电穿孔的细胞群可在体外培养0-2小时，然后(i)施用于对象，或(ii)冷冻以备将来使用。在一些实施方案中，已根据本发明方法离体工程改造和培养的细胞群的至少50％包含CD14+和CD16-细胞，它们也表达CFP。在一些实施方案中，已根据本发明方法离体工程改造和培养的细胞群包含大于50％的CD14+和CD16-细胞，它们也表达CFP，并且所述细胞群包含少于10％的树突状细胞。在一些实施方案中，已根据本发明方法离体工程改造和培养的细胞包含大于70-90％未分化成DC样或巨噬细胞样表型的细胞或具有CD16+或CD14-细胞表型的细胞。在一些实施方案中，细胞保留进一步的分化潜能。在一些实施方案中，细胞未极化成M1或M2表型并在体内施用时保留分化能力。
在一些实施方案中，骨髓在施用于对象时不表现出紧张性信号传导。
在一些实施方案中，髓样细胞在施用于对象之前，或在通过外部刺激(诸如，用细胞因子或生长因子)离体激活之前或在存在吞噬作用的靶标的情况下表现出低吞噬作用。在一些实施方案中，髓样细胞在施用于对象之前，或在通过外部刺激(诸如，用细胞因子或生长因子)离体激活之前或在存在吞噬作用的靶标的情况下表现出中度吞噬作用。在一些实施方案中，髓样细胞表现出对以下中的任一项或多项的反应性：GMCSF、GCSF、IL-4、IL-1b、IL-6、TNF、CCL2、CCL5、CXCL1或其组合。
在一些实施方案中，髓样细胞在通过外部刺激(诸如用细胞因子或生长因子)离体激活时或在存在吞噬作用的靶标的情况下表现出增强的吞噬作用。在一些实施方案中，与活化的终末分化的髓样细胞(诸如成熟的活化后巨噬细胞)相比，髓样细胞在通过外部刺激(诸如用细胞因子或生长因子)离体激活时或在存在吞噬作用的靶标的情况下表现出约1.1倍、1.2倍、1.5倍、1.7倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、14倍、17倍、20倍或更多倍增强的吞噬作用。在一些实施方案中，髓样细胞表现出对由以下中的任一项或多项所例示的细胞因子或趋化因子的反应性：GMCSF、GCSF、IL-4、IL-1b、IL-6、TNF、CCL2、CCL5、CXCL1或其组合。
在一些实施方案中，从生物样品分离的髓样细胞可以进一步分化成M1或M2谱系。理想的是，分离或富集后的髓样细胞在体内施用后保留进一步分化成M1细胞的潜能。
髓样细胞的修饰：
在一些实施方案中，可以进一步修饰或操纵髓样细胞以产生治疗有效的髓样细胞。可以通过在细胞中表达基因或其片段来操纵分离的细胞，而不改变其功能以及发育可塑性、分化潜能和细胞活力。
在一些实施方案中，可以通过将非内源性多核苷酸表达到细胞中来进一步修饰或操纵髓样细胞以产生治疗有效的髓样细胞。非内源性多核苷酸可以编码蛋白质或肽。或者，非内源性多肽可以是非编码序列，诸如抑制性RNA或吗啉代。
在一些实施方案中，可以通过稳定地改变细胞的基因组序列来进一步修饰或操纵髓样细胞以产生治疗有效的髓样细胞。在一些实施方案中，通过使用CRISPR-CAS系统编辑髓样细胞基因组来操纵髓样细胞。在一些实施方案中，可以编辑一种或多种基因以使基因表达沉默。在一些实施方案中，对髓样细胞进行操纵以删除基因。在一些实施方案中，可以编辑一种或多种基因以增加基因表达。在一些实施方案中，遗传物质以信使RNA的形式被引入髓样细胞中，其中信使RNA编码蛋白质或肽，从而使髓样细胞具有治疗效果。在一些实施方案中，裸DNA或信使RNA(mRNA)可用于将核酸引入髓样细胞内。在一些实施方案中，编码嵌合抗原受体的DNA或mRNA通过脂质纳米颗粒(LNP)包裹被引入吞噬细胞中。mRNA是单链的并且可以进行密码子优化。在一些实施方案中，mRNA可以包含一种或多种修饰的或非天然碱基，诸如5'-甲基胞嘧啶、或假尿苷或甲基假尿苷。在一些实施方案中，mRNA中大于或等于约50％的尿苷(‘U’)残基可转化为甲基-假尿苷。在一些实施方案中，mRNA的长度可为50-10,000个碱基。一方面，转基因作为mRNA递送。mRNA可包含大于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000个碱基。在一些实施方案中，mRNA的长度可以大于10,000个碱基。在一些实施方案中，mRNA的长度可为约11,000个碱基。在一些实施方案中，mRNA的长度可为约12,000个碱基。在一些实施方案中，mRNA包含编码融合蛋白的转基因序列。LNP包裹的DNA或RNA可用于转染巨噬细胞或可施用于对象。在一些实施方案中，通过瞬时转染将mRNA掺入效应髓样细胞群中。在一些实施方案中，瞬时转染方法包括mRNA的电穿孔。在一些实施方案中，瞬时转染包括化学转染。在一些实施方案中，1-5,000微克/ml的mRNA可用于使用上述方法的合适方案进行转染。在一些实施方案中，1-2,000微克/ml的mRNA可用于转染。在一些实施方案中，1-1,000微克/ml的mRNA可用于转染。在一些实施方案中，1-1,000微克/ml的mRNA可用于转染。在一些实施方案中，1-500微克/ml的mRNA可用于转染。在一些实施方案中，1-250微克/ml的mRNA可用于转染。在一些实施方案中，约500微克/ml或更少的mRNA可用于转染。在一些实施方案中，约250微克/ml或更少的mRNA可用于转染。在一些实施方案中，使用约10微克/ml的mRNA。在一些实施方案中，使用约20微克/ml的mRNA。在一些实施方案中，使用约30微克/ml的mRNA。在一些实施方案中，使用约40微克/ml的mRNA。在一些实施方案中，使用约50微克/ml的mRNA。在一些实施方案中，使用约60微克/ml的mRNA。在一些实施方案中，使用约80微克/ml的mRNA。在一些实施方案中，使用约100微克/ml的mRNA。在一些实施方案中，使用约150微克/ml的mRNA。在一些实施方案中，使用约200微克/ml的mRNA。在一些实施方案中，使用20、50、100、150、200、250、300、400、500或约1000微克/ml的mRNA。基于方法和仪器和/或试剂制造商的说明，或如本领域技术人员所熟知的，为转染选择合适的细胞密度。
在一些实施方案中，重组核酸是mRNA。mRNA构建体可在冰上解冻并轻轻移液至单核细胞并预混合。在一些实施方案中，将mRNA电穿孔到细胞中。淘析后的细胞可以汇集，离心，并且可以使用为所述目的优化的MaxCyte ATX系统用mRNA进行电穿孔。在一些实施方案中，优化的电穿孔缓冲液、细胞密度和/或mRNA浓度用于每个构建体的每个方案。
在一些实施方案中，可以将多核苷酸以环状RNA(circRNA)的形式引入髓样细胞中。在环状RNA(circRNA)中，3'和5'端是共价连接的。circRNA可以使用LNP在细胞内递送。
在一些实施方案中，转基因稳定整合到巨噬细胞和其他吞噬细胞中可以通过使用转座酶和转座元件，特别是mRNA编码的转座酶来实现。在一个实施方案中，可以考虑长散布元件-1(L1)RNA用于转基因的逆转录转座和稳定整合到巨噬细胞或吞噬细胞中。逆转录转座子可用于稳定整合编码吞噬或束缚受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸。
在一些实施方案中，可以通过将转基因掺入瞬时表达载体中表达转基因来修饰髓样细胞。在一些实施方案中，转基因的表达可以由来自细胞外的调控剂临时调控。实例包括Tet-on Tet-off系统，其中转基因的表达通过四环素的存在或不存在来调控。
在一些实施方案中，可以通过使细胞与化合物接触来修饰髓样细胞以产生治疗有效的细胞，所述化合物可以是髓样细胞内的蛋白质或酶的抑制剂或活化剂。
在一些实施方案中，可以将编码嵌合抗原受体的多核苷酸引入通过前面部分中描述的方法获得的分离的髓样细胞中，其中嵌合抗原受体在髓样细胞中表达后增强了髓样细胞的先天免疫应答功能。在一些实施方案中，嵌合抗原受体表达可以将髓样细胞引导至体内或体外的特定靶标。在一些实施方案中，嵌合抗原受体可以增强髓样细胞的吞噬潜能。在一些实施方案中，嵌合抗原受体提高髓样细胞的免疫原性。在一些实施方案中，嵌合抗原受体可以增强胞内信号传导。在一些实施方案中，嵌合抗原受体可以与细胞内的一种或多种蛋白质协同发挥作用。在一些实施方案中，嵌合抗原受体可以与髓样细胞内的第二受体或跨膜蛋白二聚化或多聚化，其中第二受体或跨膜蛋白是内源性蛋白。在一些实施方案中，细胞在解冻后或在核酸掺入后短暂离体培养。在一些实施方案中，离体培养在合适的培养基存在下进行，该培养基可包含调节血清组分，例如人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方案中，离体培养和操纵可以在含低血清的培养基中进行。在一些实施方案中，针对补体失活对血清进行特别处理。在一些实施方案中，髓样细胞可以如上所述在M-CSF存在下离体培养。在一些实施方案中，髓样细胞可以如上所述在GM-CSF存在下离体培养。在一些实施方案中，髓样细胞可以在一种或多种细胞因子存在下培养。在一些实施方案中，髓样细胞可以在不存在生长因子或细胞因子的情况下离体培养或操纵一段时间。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在少于72小时、70小时、65小时、60小时、55小时、50小时、45小时、40小时、或35小时、或30小时、或28小时、或26小时或24小时内分离或富集及操纵髓样细胞。在一些实施方案中，髓样细胞可以培养少于24小时、或少于20小时或少于16小时、或少于14小时、或少于12小时、或少于10小时、或少于8小时、或少于6小时或少于约4小时。分离或富集及操纵后的髓样细胞可以短暂培养并冷冻直至进一步使用。在一些实施方案中，将髓样细胞解冻一次或至多两次。
在一些实施方案中，治疗感受态细胞是已经用编码多肽的重组核酸电穿孔、冷冻和解冻、培养稳定少于24小时的细胞，并且其中细胞群中的细胞在施用时表现出(i)大于至少70％的活力，(ii)大于至少50％的CD14+和CD16-细胞；和/或大于50％的CD11b+/CD14+/CD16-细胞；(iii)少于5％的CD3+细胞、少于5％的CD19+细胞、少于约10％的CD56+细胞、少于约10％的CD42b+细胞；(iv)大于50％的细胞表达由电穿孔的核酸编码的多肽。在一些实施方案中，治疗感受态细胞是已经用编码多肽的重组核酸电穿孔、培养稳定少于24小时、冷冻和解冻的细胞，并且其中细胞群中的细胞在施用时表现出(i)大于至少70％的活力，(ii)大于至少50％的CD14+和CD16-细胞；和/或大于50％的CD11b+/CD14+/CD16-细胞；(iii)少于5％的CD3+细胞、少于5％的CD19+细胞、少于约10％的CD56+细胞、少于约10％的CD42b+细胞；(iv)大于50％的细胞表达由电穿孔的核酸编码的多肽。在一些实施方案中，治疗感受态细胞是已经培养稳定少于24小时、已用编码多肽的重组核酸电穿孔、冷冻和解冻的细胞，并且其中细胞群中的细胞在施用时表现出(i)大于至少70％的活力，(ii)大于至少50％的CD14+和CD16-细胞；和/或大于50％的CD11b+/CD14+/CD16-细胞；(iii)少于5％的CD3+细胞、少于5％的CD19+细胞、少于约10％的CD56+细胞、少于约10％的CD42b+细胞；(iv)大于50％的细胞表达由电穿孔的核酸编码的多肽。细胞必须不含病原体。在上述实施方案中，治疗感受态细胞可以被冷冻和解冻不超过两次，优选一次，并且可以在解冻后24小时内、解冻后18小时内、解冻后8小时内或解冻后2小时内施用。在施用之前对细胞进行质量保证测试以符合本文所述的公开内容中的标准。
药物组合物
本文提供了一种药物组合物，其包含含有重组核酸的细胞群，其中所述重组核酸包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列或编码抗原肽的序列。细胞群包含效应髓样细胞。在一些实施方案中，效应髓样细胞从分离自生物样品的PBMC群分离和富集，并且药物组合物包含(i)细胞群中至少50％的细胞是CD14+和CD16-，和(ii)细胞群中少于10％的细胞是树突状细胞；以及药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码CFP的序列，其中CFP包含：(a)包含抗原结合结构域的胞外结构域，和(b)与胞外结构域可操作地连接的跨膜结构域。在一些实施方案中，包含编码CFP的序列的重组核酸，其中CFP包含：(a)包含抗原结合结构域的胞外结构域，和(b)跨膜结构域以及(c)一个或多个胞内信号传导结构域，所有这些都相互可操作地连接，使得当胞外结构域与靶抗原结合时，胞内结构域被激活，激活胞内信号传导并激活髓样细胞。活化的髓样细胞表现出以下中的一项或多项：更高的吞噬活性、更高的趋化性、增强的炎症功能以及吞噬细胞或生物体的更高杀伤力。
在一些实施方案中，药物组合物是针对感染性疾病的治疗性组合物，其中所述药物组合物包含细胞群，所述细胞群包含CFP，所述CFP具有结合致病抗原或展示在受感染细胞上的抗原(例如，细菌上的抗原、病毒抗原、真菌抗原、原生动物抗原等)的胞外抗原结合结构域。
在一些实施方案中，使用本文所述的技术细节的其他示例性药物组合物是癌症治疗性组合物，其中所述药物组合物包含细胞群，所述细胞群包含CFP，所述CFP具有结合癌抗原的胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中，癌抗原是淋巴瘤抗原。在一些实施方案中，药物组合物包含表达重组CFP的效应髓样细胞，其中抗原结合结构域是CD5结合结构域或HER2结合结构域。在一些实施方案中，药物组合物包含表达具有CD5或HER2抗原结合结构域的重组CFP的效应髓样细胞，并且还包含源自吞噬受体或清道夫受体的胞内结构域。在一些实施方案中，如上所述的药物组合物表达CFP，其中CFP包含：(a)胞外结构域，其包含：(i)特异性结合CD5或HER2的scFv，和(ii)衍生自CD8或CD28的铰链结构域、或CD68的胞外结构域或其一部分；(b)CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域或CD68跨膜结构域；以及(c)包含至少两个胞内信号传导结构域的胞内结构域，其中所述至少两个胞内信号传导结构域包含：(i)衍生自FcγR或FcεR的第一胞内信号传导结构域，和(ii)第二胞内信号传导结构域，其：(A)包含PI3-激酶(PI3K)募集结构域，或(B)衍生自CD40。在一些实施方案中，重组核酸包含编码抗原肽的序列，其中抗原肽是CMVpp65肽。
在一些实施方案中，将治疗有效的髓样细胞直接配制成药物组合物以施用于有需要的对象。或者，将储存的髓样细胞(冷冻)解冻一次并测试活力，在营养丰富的培养基中稳定至少1-4小时，然后配制成药物组合物。药物组合物包含髓样细胞和至少一种赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂包含中性pH的无菌缓冲液(例如HEPES或PBS)。在一些实施方案中，药物组合物的pH为7.5。在一些实施方案中，pH可以在可接受的范围内变化。在一些实施方案中，工程改造的细胞可以包含在无菌富集的细胞悬液培养基中，该培养基包含补体失活或合成血清。在一些实施方案中，药物组合物还包含用于细胞保存和功能的细胞因子、趋化因子或生长因子。在一些实施方案中，单次治疗剂量可以悬浮在1ml-100ml的总体积中。在一些实施方案中，单次治疗剂量可以悬浮在1-25ml、或1-20ml、或1-15ml、或1-10ml、或1-5ml的总体积中。在一些实施方案中，悬液体积为约1ml。在一些实施方案中，悬液体积为约5ml。在一些实施方案中，悬液体积为约10ml。在一些实施方案中，药物组合物包含约10^6个效应髓样细胞至约10^12个效应髓样细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含每毫升约10^6个效应髓样细胞至每毫升约10^8个效应髓样细胞。
在一些实施方案中，药物组合物可以包含另外的治疗剂，与表达CFP的工程改造的效应髓样细胞共同施用。
治疗方法
本文提供了用于治疗免疫疾病，例如感染性疾病或癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法可用于治疗细菌性疾病。在一些实施方案中，所述方法可用于治疗病毒用于治疗病毒性疾病。在一些实施方案中，所述方法可用于治疗免疫疾病。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含细胞群，所述细胞群包含治疗有效剂量的髓样细胞。在一些实施方案中，细胞群：在施用后在对象中分化成效应细胞；施用后渗入对象的病变部位或施用后迁移到对象的病变部位；和/或在施用后在对象中具有至少5天的寿命。
本文提供了使用药物组合物治疗对象的癌症的方法，所述药物组合物包含工程改造的吞噬细胞，特别是巨噬细胞，其表达编码吞噬受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸，所述融合蛋白被专门设计用于靶向、攻击和杀死癌细胞。PFP也被称为吞噬作用的嵌合抗原受体(CAR-P)，这两个术语在本文中可以互换使用。在本文的描述中，工程改造的吞噬细胞也被称为CAR-P细胞。
癌症包括但不限于T细胞淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、B细胞癌(例如多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症)、重链疾病(诸如像α链疾病、γ链疾病μ链疾病)、良性单克隆丙种球蛋白病和免疫细胞淀粉样变性、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌(例如转移性、激素难治性前列腺癌)、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、周围神经系统癌症、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠癌或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌等。适用于由本公开所涵盖的方法的癌症类型的其他非限制性实例包括人肉瘤和癌，例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉糖瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、骨癌、脑肿瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如，急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞性白血病(成髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；以及真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链疾病。在一些实施方案中，癌症是上皮癌，诸如但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈部癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在其他实施方案中，上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如，浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以在其他方面有不同的特点，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞或未分化性。在一些实施方案中，本公开用于淋巴瘤或其亚型的治疗、诊断和/或预后，包括但不限于套细胞淋巴瘤。淋巴增生性疾病也被认为是增生性疾病。
一般而言，细胞免疫疗法包括为患者提供包含活细胞的药剂。在一些方面，用自体细胞治疗患有癌症的患者或对象，所述方法包括分离或富集PBMC衍生的巨噬细胞，离体修饰巨噬细胞以产生能够溶解肿瘤的高度吞噬性巨噬细胞，所述方法是通过向巨噬细胞中引入编码用于吞噬作用的嵌合抗原受体(其是吞噬受体融合蛋白(PFP))的重组核酸，并且将修饰的巨噬细胞施用于患者或对象来实现。
一方面，向对象施用一剂或多剂包含治疗性吞噬细胞的药物组合物，其中所述细胞是同种异体的。可以匹配HLA以与对象相容，从而使细胞不会导致移植物抗宿主病(GVHD)。在确定治疗或治疗性方案之前，对到达诊所的对象进行HLA分型以确定对象表达的HLA抗原。
在一些实施方案中，一次输注的治疗有效剂量范围在10^7个细胞至10^12个髓样细胞之间。细胞数量可以根据年龄、体重和其他与对象相关的参数而变化，并且可以由开业医师确定。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约10^7个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约2x10^7个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约3x10^7个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约4x10^7个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约5x10^7个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约6x10^7个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约7x10^7个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约8x10^7个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约9x10^7个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约10^8个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约2x10^8个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约3x10^8个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约4x10^8个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约5x10^8个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约6x10^8个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约7x10^8个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约8x10^8个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约9x10^8个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约10^9个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约2x10^9个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约3x10^9个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约4x10^9个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约5x10^9个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约6x10^9个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约7x10^9个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约8x10^9个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约9x10^9个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约10^10个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约5x10^10个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约10^11个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约5x10^11个髓样细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量是约10^12个髓样细胞。
实施方案
1.一种包含CD14+/CD16-细胞群的组合物，其中所述CD14+/CD16-细胞群是工程改造的细胞群并且/或者包含外源性剂。
2.一种包含细胞群的组合物，其中所述细胞群是工程改造的细胞群并且/或者包含外源性剂，其中所述细胞群是CD14+和/或CD16-，并且其中(a)所述细胞群表达CCR2和/或CCR5和/或CD11b；并且/或者(b)所述细胞群是CD63+；并且/或者(c)所述细胞群是CD56-、CD3-和/或CD19-；并且/或者(d)髓样细胞群包含少于40％的巨噬细胞、和/或少于10％的树突状细胞(DC)、和/或少于10％的NK细胞、和/或少于10％的粒细胞；(e)所述外源性剂包含重组核酸，所述重组核酸包含编码嵌合融合蛋白(CFP)(例如，嵌合抗原受体(CAR))的序列；并且/或者所述细胞群缺乏通过所述CAR的紧张性信号传导。
3.一种包含细胞群的组合物，其中所述细胞群是工程改造的细胞群并且/或者包含外源性剂，其中所述细胞群是CD14+和/或CD16-，并且其中(a)所述细胞群是未极化的髓样细胞；(b)所述细胞群在施用后在对象中分化成效应细胞；(c)所述细胞群在施用后渗入对象的病变部位或在施用后迁移到对象的病变部位；或(d)所述细胞群在施用后在对象中具有至少5天的寿命。
4.一种药物组合物，其包含上述实施方案中任一项的组合物和药学上可接受的赋形剂。
5.一种治疗有需要的对象的疾病或病况的方法，其包括：向所述对象施用段落4中的实施方案的药物组合物。
6.一种治疗有需要的对象的疾病或病况的方法，其包括：向所述对象施用包含细胞群的药物组合物，其中所述细胞群是工程改造的细胞群并且/或者包含外源性剂，其中所述细胞群是CD14+和/或CD16-，并且其中(a)在(i)所述外源性剂已被引入细胞群或(ii)所述细胞群已被工程改造后的72小时内向所述对象施用所述药物组合物；(b)所述髓样细胞群在施用前已离体培养少于48天；(c)所述细胞群通过不包括干细胞动员的方法获得；并且/或者(d)所述细胞群通过负选择获得。
7.一种治疗有需要的对象的疾病或病况的方法，其包括：向所述对象施用包含髓样细胞的组合物，其中所述髓样细胞(a)的特征在于以下中的一项或多项：(i)具有强CD14表达；(ii)具有低或检测不到的CD16表达；(iii)表达CCR2和/或CCR5；(iv)具有在接受一种或多种合适的刺激后分化成多个骨髓谱系亚型的能力；并且(b)包含外源性剂，其中当被所述外源性剂离体修饰时，所述外源性剂不改变所述髓样细胞的分化或极化状态。
8.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞是CD16-(CD16阴性)或CD16low(CD16低)。
9.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞是CD14+(CD14阳性)。
10.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞是CCR2+(CCR2阳性)和/或CCR5+(CCR5阳性)。
11.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中在施用所述药物组合物后，所述髓样细胞能够在所述对象中分化成效应细胞。
12.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中在施用所述药物组合物后，所述髓样细胞能够迁移到所述对象的病变部位。
13.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中在施用所述药物组合物后，所述髓样细胞能够渗入所述对象的病变部位。
14.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞是CD14+/CCR2+。
15.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞是CD14+/CCR5+。上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞是CD14+/CCR2+/CCR5+。
16.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞是CD14+/CD11b+/CCR2+/CCR5+。
17.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞是CD63+。
18.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述外源性剂是重组核酸、肽、碳水化合物、脂质或小分子。
19.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述外源性剂包含重组核酸，所述重组核酸包含编码肽的序列，其中所述肽是嵌合抗原受体(CAR)。
20.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中在施用所述药物组合物时，所述髓样细胞已在体外培养少于2天。
21.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中在施用所述药物组合物时，所述髓样细胞保持细胞可塑性。
22.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中在施用之时，所述髓样细胞表达CAR。
23.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中在施用所述药物组合物之时，所述髓样细胞不表现通过所述CAR的紧张性信号传导。
24.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞群是通过包括对分离的多种髓样细胞进行体外操纵的方法获得的。
25.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞群通过不包括干细胞动员的方法获得。
26.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中通过使用生物样品中的一种或多种髓样细胞的抗体介导的结合进行负选择来从所述生物样品分离多种髓样细胞。
27.段落26中的实施方案的方法，其中使用流式细胞术进行所述负选择。
28.段落26中的实施方案的方法，其中所述多种分离的髓样细胞是(i)CD3-(阴性)，(ii)CD16-(阴性)或CD16low，(iii)CD19-(阴性)；(iv)CD56-(阴性)；以及(v)CD14+(阳性)。
29.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞群不表达CD16、CD56、CD3或CD19(CD16-/CD56-/CD3-/CD19-细胞)，这是通过对从所述生物样品分离的多种髓样细胞进行负选择而获得的。
30.段落29中的实施方案的方法，其中所述生物样品是外周血样品。
31.段落29中的实施方案的方法，其中所述生物样品是单采血液成分术样品。在一些实施方案中，单采血液成分术样品中仅1、2或3种合适的级分被用于本文公开的治疗性细胞制剂。
32.段落24中的实施方案的方法，其中所述生物样品对所述对象是异源的或自体的。
33.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞群中至少50％的髓样细胞是未分化的。
34.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞群包含M0单核细胞。
35.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞群包含M1单核细胞。
36.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞群包含M2单核细胞。
37.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述髓样细胞群中至少50％的髓样细胞是未极化的。
38.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述对象是人。
39.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述疾病或病况选自癌症、感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、代谢疾病、神经退行性疾病和单基因、多基因或多因素疾病或病症。
40.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述疾病或病况是癌症。
41.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述疾病或病况是细菌、病毒、真菌或寄生虫感染。
42.上述实施方案中任一项的组合物或方法，其中所述疾病或病况是神经退行性变。
43.一种用于分离或富集治疗有效的髓样细胞的方法，其包括：(a)通过以下操作从包含髓样细胞的生物样品中负选择治疗有效的髓样细胞：(i)使所述生物样品与选自抗CD16抗体、抗CD56抗体、抗CD3抗体和抗CD19抗体的一种或多种抗体接触，以及(ii)消除所述生物样品中被所述一种或多种抗体结合的细胞，从而分离或富集在过程中相对不受干扰的治疗有效的髓样细胞。在一些实施方案中，所述富集是基于大小和/或粒度，例如通过流式细胞术进行的。
44.段落43中的实施方案的方法，其中所分离的治疗有效的髓样细胞是CD14+。
45.段落43中的实施方案的方法，其中所分离的治疗有效的髓样细胞是CD14hi。
46.段落43中的实施方案的方法，其中所分离的治疗有效的髓样细胞是CD16-或CD16low。
47.段落43中的实施方案的方法，其中所分离的治疗有效的髓样细胞保留响应于合适的刺激而分化成骨髓谱系亚群的能力。
48.段落43中的实施方案的方法，其中所分离的治疗有效的髓样细胞能够进一步分化成极化的单核细胞、巨噬细胞、DC1、DC2、DC3、DC4、DC5、DC6树突状细胞、或其任何组合。
49.段落43中的实施方案的方法，其中所分离的治疗有效的髓样细胞保留响应于合适的刺激而向M1和M2表型极化的能力。
50.一种用于生成髓样细胞群以治疗有需要的对象的方法，所述方法包括：(i)从生物样品分离或富集多种髓样细胞，其中所述多种髓样细胞表现出细胞可塑性；(ii)使用外源性剂对从所述生物样品分离的所述多种髓样细胞进行体外操纵，并获得所述髓样细胞群；其中所述体外操纵不改变所述多种髓样细胞的细胞可塑性；以及(iii)制备包含髓样细胞群和可接受的赋形剂的治疗组合物。
51.段落50中的实施方案的方法，其中所述对象是人。
52.段落50中的实施方案的方法，其中所述生物样品是外周血样品、单采血液成分术样品、白细胞单采术样品或脐带血样品。
53.段落50中的实施方案的方法，其中所述生物样品来源于所述对象。
54.段落50中的实施方案的方法，其中所述生物样品来源于合适的人供体。
55.段落50中的实施方案的方法，其中从生物样品分离或富集多种髓样细胞包括通过负选择来分离或富集CD14+细胞。
56.段落55中的实施方案的方法，其中所述负选择是通过使人样品中的细胞与选自抗CD16抗体、抗CD56抗体、抗CD3抗体和抗CD19抗体的一种或多种抗体接触并固定或消除所述人样品中被所述一种或多种抗体结合的细胞来实现的。
57.段落55中的实施方案的方法，其中所述负选择是通过流式细胞术进行的。
58.段落50中的实施方案的方法，其中从所述生物样品分离的所述多种髓样细胞是CD14+，并且不表达CD3、CD19、CD56和/或CD16。
59.实施方案43-58中任一项的方法，其中所述髓样细胞是未分化的或未极化的。
60.段落50中的实施方案的方法，其中所述外源性剂是重组核酸、肽、碳水化合物、脂质或小分子。
61.段落50中的实施方案的方法，其中所述操纵包括对多种髓样细胞进行基因工程改造。
62.段落50或61中的实施方案的方法，其中所述操纵包括将包含编码肽的序列的重组核酸引入所述多种髓样细胞。
63.段落60中的实施方案的方法，其中所述重组核酸是RNA。
64.段落63中的实施方案的方法，其中所述重组核酸是mRNA。
65.段落63中的实施方案的方法，其中在引入所述包含编码肽的序列的核酸后，所述髓样细胞群表达所述肽。
66.段落63中的实施方案的方法，其中所述肽是嵌合抗原受体(CAR)。
67.段落66中的实施方案的方法，其中所述肽包含：(i)跨膜结构域；(ii)胞外区，其包含与第二细胞的表面组分结合的至少一个靶结合结构域；以及(iii)胞内区，其包含一个或多个信号传导结构域。
68.段落67中的实施方案的方法，其中所述第二细胞是病变细胞或癌细胞。
69.段落67中的实施方案的方法，其中所述肽包含至少一个胞内吞噬作用信号传导结构域。
70.实施方案61-69中任一项的方法，其中所述胞内吞噬信号传导结构域与胞外靶结合结构域可操作地连接并且被配置为在所述胞外靶结合结构域与所述第二细胞的表面组分结合时被激活。
71.实施方案61-70中任一项的方法，其中所述引入重组核酸包括通过电穿孔或核穿孔引入。
72.实施方案61-70中任一项的方法，其中所述引入重组核酸包括通过化学递送引入。
73.实施方案61-72中任一项的方法，其中所述重组核酸稳定掺入所述细胞的基因组中。
74.段落73中的实施方案的方法，其中所述掺入是通过激活转座酶、整合酶、核酸内切酶、重组酶和逆转录酶中的一种或多种进行的。
75.段落50中的实施方案的方法，其中所述组合物的制备包括将所述细胞悬浮在药学上可接受的赋形剂中。
76.实施方案61-75中任一项的方法，其中所述髓样细胞群保留细胞可塑性和在合适的刺激后分化成多个骨髓谱系的能力。
77.实施方案61-76中任一项的方法，其中所述髓样细胞群不表现出通过所述CAR的紧张性信号传导。
78.实施方案61-77中任一项的方法，其中所述髓样细胞群表达功能性CAR，并且能够表现出CAR介导的抗原特异性反应。
79.段落50或75中的实施方案的方法，其中所述可接受的赋形剂是缓冲液、包含营养物的细胞培养基、DMSO、甘油或其组合。
80.段落50中的实施方案的方法，其中冷冻所述组合物直至进一步使用。
81.段落50中的实施方案的方法，其中所述方法能够在少于12小时、少于10小时、少于8小时、少于6小时、少于4小时或少于2小时内进行。
82.段落50中的实施方案的方法，其中所述方法在2小时或更短的时间内完成。
83.段落50中的实施方案的方法，其中对所述多种髓样细胞进行基因修饰和/或编辑，从而获得所述髓样细胞群。
84.段落50中的实施方案的方法，其中使所述多种髓样细胞与一种或多种抗原肽接触，从而获得负载抗原的髓样细胞群。
85.一种使用实施方案43-84中任一项中的方法制造髓样细胞群的方法，其中所述方法能够在约6小时或更短的时间内进行；并且其中所述髓样细胞群是未分化或未极化的，表现出细胞可塑性并缺乏紧张性信号传导。
86.实施方案50-84中任一项的方法，其中用于细胞疗法的所述髓样细胞群包括以下中的任一项或多项：(a)群中大于约50％的CD14+CD16-活细胞；(b)群中大于约50％的CCR2+和/或CCR5+活细胞；(c)群中少于至少50％表达CD64、CD68、CD80、CD86、CD163、CD206、CD200R、CD31、CD71、CLEC9A、CD1C和AXL/SIGLEC6中的一种或多种的活细胞；(d)M0单核细胞，(e)M1单核细胞，(f)M2单核细胞，(g)树突状细胞，以及(h)前树突状细胞或树突状前体细胞。
87.一种用于细胞疗法中的髓样细胞群，其包含未分化或未极化的细胞，这些细胞已从生物样品分离，并且进一步使用选自重组核酸、肽、碳水化合物、化合物和小分子的外部剂进行体外操纵，其中所述髓样细胞群中的髓样细胞是CD14+CD16-；或者是CD14hi和CD16lo；并且展示以下中的一项或多项：(i)细胞可塑性，(ii)分化成多个骨髓谱系的能力，(iii)在体内迁移到病变组织的能力，(iv)渗入病变组织的能力，以及(v)隔离和/或破坏致病细胞、组织或生物体的能力。
88.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其通过负选择被分离。
89.段落80中的实施方案的方法，其中所述外源性剂是重组核酸、肽、碳水化合物、脂质或小分子。
90.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞包含具有编码肽的序列的重组核酸。
91.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞包含具有编码CAR的序列的重组核酸。
92.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞表达CAR，其表现出CAR介导的激活。
93.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞表达CAR并且不表现出通过所述CAR的紧张性信号传导。
94.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞是CD14+。
95.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞是CD16-。
96.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞是CD14highCD16low。
97.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞是CD56-。
98.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞是CD3-。
99.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞是CD19-。
100.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞表达一种或多种趋化因子受体。
101.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞表达CCR2。
102.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞表达CCR5。
103.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞表达CCR2和CCR5。
104.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中所述髓样细胞群中的细胞是CD16-/CD56-/CD3-/CD19-。
105.一种药物组合物，其包含段落87-104中的实施方案的髓样细胞群。
106.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其用于癌症疗法中。
107.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其用于神经退行性变的疗法中。
108.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中与未经体外操纵的细胞相比，所述群中的细胞在作为细胞疗法施用后表现出提高的免疫原性。
109.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中与未经体外操纵的细胞相比，所述群中的细胞在作为细胞疗法施用后表现出增强的向病变组织的细胞迁移。
110.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中与未经体外操纵的细胞相比，所述群中的细胞在作为细胞疗法施用后表现出增强的吞噬能力。
111.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其中与未经体外操纵的细胞相比，所述群中的细胞在作为细胞疗法施用后表现出提高的细胞毒性。
112.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其用作单一疗法。
113.段落87中的实施方案的髓样细胞群，其用作组合疗法。
114.一种制备用于治疗有需要的人对象的人髓样细胞的方法，其包括：(i)通过使用至少包含抗CD16抗体、抗CD3抗体、抗CD56抗体和抗CD19抗体的多种抗体的负选择，从同种异体或自体生物样品中获得包含未分化或未极化的髓样细胞的多种髓样细胞；(ii)工程改造、培养、稳定、激活、富集和/或扩增来自步骤(i)的细胞；以及(iii)向所述对象施用来自步骤(ii)的细胞；其中从(i)中的获得至(iii)中施用的时间间隔小于约3天。
115.段落103中的实施方案的方法，其中所述生物样品是外周血样品。
116.段落103中的实施方案的方法，其中所述生物样品是单采血液成分术样品。
117.段落103中的实施方案的方法，其中所述来自步骤(ii)的细胞是CD14+CD16-或CD14hi和CD16lo。
实施例
实施例1.CD14+髓样细胞的分离/富集和表征
在本实施例中，从白细胞单采术样品分离目标髓样细胞，以制备用于治疗用途的骨髓效应细胞。使用CD14抗体介导的选择从来自人外周血的商用白细胞单采术样品(Leukopak,Hemacare.com)分离单核细胞，并使用抗体对分离/富集前和后的细胞进行表征以检测细胞特异性表面标志物。使用抗CD14抗体的正选择在细胞分离器柱(LSColumn.Miltenyi Biotec)中进行。图4、图5和图6中所示的结果显示使用CD14抗体结合从白细胞单采术样品中富集的细胞主要是单核细胞，其实质上不含表达各种淋巴细胞谱系标志物CD3、CD19和CD56的细胞。图4的上图和下图显示基于在CD14+单核细胞分离/富集之前(上图)和之后(下图)所指示的表面标志物表达的细胞亚型的相对组成。使用特定标志物和流式细胞术分析，发现大于95％的细胞是有活力的；并且leukopak样品中91.6％的细胞是CD14+细胞，表明回收率很高。在CD14抗体介导的细胞分离/富集之前的白细胞单采术样品包含57.8％的CD3+细胞。CD14+抗体吸引了富含单核细胞的细胞群，其中只有2％的细胞是CD3+，2.53％的细胞是CD56+阳性的，且0.29％的细胞是CD19+阳性的。66.9％的细胞是CD14％和CD16-，且22％的细胞是CD14和CD16阳性的。图5A和5B分别示出了分离/富集前和后的流式细胞术数据，上图：使用同型对照的流式细胞术；下图：使用各自抗体的流式细胞术。图6示出了CD14+分离/富集后的细胞计数数据，用CD14和CD16抗体染色：6％CD14-CD16+；22％CD14+CD16+；以及66.9％CD14+CD16-细胞。
将分离的细胞在体外短暂培养并用外源性剂刺激以确定分离的CD14+细胞是否具有进一步分化为M0、M1和M2极化巨噬细胞的潜能。用于刺激的外源性剂列于下表2中。
表2.诱导单核细胞的刺激
Figure BDA0003794054840001231
Figure BDA0003794054840001241
在常规组织培养板或低粘附板(细胞排斥培养板)上进行细胞培养(图7)。如图7所示，响应于给定的刺激，细胞容易分化成M0、M1、M2细胞，并且与在常规组织培养板上培养的细胞相比，在细胞排斥板上培养的细胞对M2谱系极化的响应略好。图8A和图8B分别示出了在24和48小时在光学显微镜下观察到的细胞表型。M1或M2极化刺激都会导致CD206和CD80表达的改变。CD206在M2细胞中容易增加。另一方面，M0或M1细胞未显示出CD206表达升高。另一方面，CD80表达在M1细胞中上调，而不是在M2细胞中(图9A)。CD16表达分析显示它在培养中很容易上调，并且在响应M2刺激时上调显著更高。M1极化细胞不显示CD16表达的上调(图9B)。CCR2在CD14+细胞中的表达水平很高。它在M1和M2表型中升高，表明细胞能够趋化迁移到炎症或感染部位或肿瘤部位(图9C)。
实施例2.髓样细胞(表达CAR的效应髓样细胞)制造过程
在本实施例中，描述了一种用于分离或富集和开发治疗有效的髓样细胞(也称为表达CAR的效应髓样细胞)的过程，其可以按照规模进行。该过程涉及从生物样品分离或富集CD14+细胞，通过将编码肽的核酸引入细胞来改变分离的细胞，并制备治疗性组合物以递送到需要基于髓样细胞的疗法的对象中。图10示出了过程工作流程的示意图。在分离或富集细胞之前，制备用于引入细胞中的重组核酸。在此实施例中，引入信使RNA。
制备编码CAR的重组核酸：
制备编码嵌合抗原受体(CAR)的重组核酸构建体，并将其掺入质粒载体中，以用于在真核细胞中扩增和/或测试表达。在本实施例中，制备几种重组嵌合抗原受体(CAR)。使用本领域已知的分子克隆技术构建重组CAR。重组CAR蛋白包含胞内结构域、跨膜结构域和胞外结构域。每个结构域或结构域的子部分可由核酸序列编码，所述核酸序列通过PCR从异源性源序列产生，并通过单独克隆到载体中而拼凑在一起，或连接成更长的核酸，然后插入到合适的质粒或载体的多克隆位点中，所述质粒或载体具有适当的启动子和3'-调控元件以进行扩增。简言之，示例性CAR通过掺入编码一个或多个信号传导结构域(例如PI3激酶募集结构域)的核酸序列、编码CD8铰链和跨膜结构域的核酸序列、编码胞外结构域的核酸序列、在胞外端处安置编码HER2结合scFv(HER2 scFv)的序列来制备。某些构建体在胞外端处包括FLAG肽序列，被设计使其不会阻碍scFv与其靶标的结合，例如在这种情况下为HER2。这些组分连接在一起形成编码全功能跨膜CAR的序列。编码重组蛋白的各个结构域的核酸亚基被设计成在两个结构域之间包括插入的短柔性接头序列。将构建体连接到具有启动子和3'稳定结构单元的质粒中。在一种变体中，构建体被置于编码ORF2p并具有各自的5'-和3'-UTR序列、CMV启动子的Alu逆转录转座子元件中。质粒在大肠杆菌中扩增，通过测序验证或储存在-80℃下。
mRNA制备
使用消化的质粒作为模板通过体外转录制备mRNA，并纯化以去除污染DNA，并进行多聚腺苷酸化。将RNA产物纯化，在无RNA酶的水中重悬至1mg/ml，并储存在冷冻管中。
CD14+细胞分离/富集
将来自白细胞单采术容器(Leukopak,Miltenyi Biotec)的细胞稀释并进行Ficoll分离。以400g离心40分钟。去除富含单核细胞的血沉棕黄层，在缓冲液中洗涤，轻轻离心并重悬于缓冲液中，并且使用结合CD3、CD16、CD19、CD56的抗体混合物并穿过细胞分离器柱(LS Column.Miltenyi Biotec)进行负选择。柱被设计为保留抗体结合的细胞，并且所洗脱的细胞实质上不含表达CD3、CD16、CD19、CD56的细胞。在反复穿过柱后，将细胞离心、洗涤并培养过夜，之后稳定化。
电穿孔和储存/释放
将编码CAR的mRNA样品在冰上解冻以进行电穿孔。使用比色皿电穿孔将细胞以mRNA电穿孔。将细胞培养几个小时，然后对其进行表征或验证以进行释放，或冷冻保存或加工以便施用。
从细胞分离/富集到储存/释放的步骤在72小时内完成。
CAR在CD14+细胞中的三天表达谱在图11中展示。第1天表达水平最高，虽然CAR表达在72小时可检测到，但从表达峰值逐渐降低。这些表达谱提示在这些细胞中缺乏通过CAR的紧张性信号传导。
出于在其余实施例部分中描述的目的，这些细胞可被称为效应髓样细胞。
实施例3.表征所分离的表达CAR的CD14+细胞的极化电位
本实施例展示了所分离的表达CAR的CD14+细胞(效应髓样细胞)分化成不同髓样细胞系的潜能的表征，如由细胞表面标志物的表达所确定。将如例如实施例2中所述制备和冷冻的细胞解冻并培养24小时。这些效应髓样细胞随后受到极化刺激，例如，如图12所示，(i)GMCSF，(ii)IL4、IL10和TGFβ(M2刺激)，(iii)活化的T细胞条件培养基(TCM)以及(iv)MCSF。通过流式细胞术在24、48和72小时分析细胞，并通过Luminex进行细胞因子分析。CD14表达在解冻后第1天不受CAR表达的影响，并且在第2天随着大多数极化刺激而增加，但在M2细胞中略低(图13A，左)。在第1天，CAR表达或非表达细胞中的CD16水平没有变化，M2细胞除外，其中CD16表达上调。然而，在第2天，在大多数表达或不表达CAR的细胞系中，使用GMCSF、IL4、IL10和TGFβ和TCM都诱导了CD16表达水平，用MCSF诱导的CAR表达细胞除外(图13A)。
如图13B所示，任何刺激都容易诱导CD206，并且与不表达CAR的细胞相比，表达CAR的细胞中的变化更高，而CD163在第1天几乎没有变化，并且在表达和不表达CAR的细胞中以及对各种刺激的响应中，这些变化是一致的。CD206和CD163都是巨噬细胞活化标志物。CD206或甘露糖受体的增加表明吞噬活性更高，而CD163的增加表明炎症反应更高。M2细胞中的PDL1表达在第1天相对于其他刺激更高，并且在第2天在所有组中均增加。CCR表达在有或没有CAR表达的CD14细胞中是高的，并且通常在第2天进一步增加(图13C)。在经各种刺激的CAR表达细胞和对照细胞中分析MHCI和MHCII表达。在每种情况下，与对照(CAR-)细胞相比，表达CAR的细胞的MHC I和MHCII表达水平略高。
实施例4.表达CAR的细胞具有高靶标特异性并且对靶标识别有响应
编码HER2-CAR的mRNA在人单核细胞系THP-1细胞中表达，并与HER2包被的珠粒一起培育。HER2-THP-1细胞通过分泌炎性细胞因子作出响应，这些细胞因子通过使用Luminex测定试剂盒分析上清液来检测(图14A和图14B)。如图14B所示，HER2-THP-1细胞仅响应HER2包被的珠粒而不是BSA包被的珠粒额表达释放MIP-1α、IL-8、Eotaxin和PIGF-1。
接下来，按照实施例3中描述的方案，在解冻后对表达HER2-FCR-PI3K的效应髓样细胞进行极化刺激。通过用极化刺激(表2)培养细胞，然后将细胞与HER2珠粒或对照BSA珠粒接触，在这些细胞中测试CAR介导的活化潜能和特异性。18小时后，通过Luminex多重试剂盒分析细胞因子分泌(图14C)。结果示于图14D中。与用HER2珠粒处理的M0或M2极化的HER2-CAR表达髓样细胞相比，当用HER2珠粒处理时，用M1刺激进一步极化的靶向HER2的CD14+CAR细胞表达并分泌最高水平的IL1β和TNFα。M2极化的HER2-CAR表达效应髓样细胞在与HER2珠粒接触时分泌高水平的IFN-γ，这高于类似表达HER2-CAR并被HER2珠粒激活的M1或M0细胞。在不存在靶标的情况下，没有观察到紧张性炎性细胞因子的表达。
为了进一步了解这些效应髓样细胞对肿瘤细胞或非肿瘤对照细胞的影响，使HER2特异性和CD5特异性CAR表达髓样细胞经受M0、M1或M2极化信号，并在存在培养中的肿瘤细胞或非肿瘤对照细胞下培育18小时(图15A)。细胞因子和趋化因子谱示于图15Bi中，并且CD80或CD206表达谱示于图15Bii中。M1细胞当在易于分泌CCL3的SKOV3或MSTO细胞系存在下培育时表达HER2-CAR或C5-CAR，这表明细胞被激活。CCL3趋化因子有助于单核细胞向肿瘤细胞迁移。M2分化细胞在没有肿瘤或对照细胞的情况下释放高水平的IL10(图15Bi)。在H9(淋巴瘤细胞)存在下，所有细胞都会以升高的趋化因子CCL3或IL6和IL10水平作出响应。不希望受理论束缚，在一些情况下与响应H9细胞的CCL3升高有关的观察结果可归因于髓样细胞与淋巴瘤细胞的相互作用。尽管进行了各种处理，但这些细胞中CD80和CD206的表达水平没有改变，表明细胞保持了可塑性并且不表达成熟的细胞标志物。此外，M1条件下的极化显示出类似的结果，例如，CAR的表达不会改变细胞在这些条件下极化的能力。与肿瘤细胞共培育不会改变极化，但是有强烈的MHC表达和趋化因子的变化(数据未显示)。
本实施例中讨论的结果表明，表达CAR的CD14+细胞是活跃的，并且对表达CAR旨在识别和结合的靶标(例如HER2)的特定肿瘤细胞有响应。
实施例5.CD14+髓样细胞的吞噬潜能
在本实施例中，首先使用表达CAR的THP-1细胞，所述CAR具有胞外HER2结合结构域和用于标记的FLAG序列；以及活性胞内信号传导结构域，例如CD3z胞内结构域或Megf10-PI3激酶募集结构域；或FcR信号传导和PI3激酶募集结构域。将细胞与标记的肿瘤细胞一起培育，并通过成像监测用PMA或对照刺激的吞噬作用。在所有组中都观察到表达HER2的肿瘤细胞的吞噬作用(图16A)。
将如上所述表达HER2 CAR的慢病毒转导的髓样细胞与HER2阳性肿瘤细胞(靶细胞)或HER2阴性Jurkat细胞一起培育，并通过流式细胞术对吞噬的细胞进行定量(图16B)。表达HER2的髓样细胞特异性吞噬HER2阳性SKOV3细胞，而不是Jurkat细胞。图16C示出了与细胞计数数据一致的成像结果。
实施例6.特异性CAR表达效应髓样细胞对小鼠肿瘤模型的影响
在此实施例中，研究了表达CAR的效应髓样细胞的体内效应。目的是建立小鼠肿瘤模型，给小鼠注射合适的髓样细胞，监测结果并确定有效剂量水平。将CD5-HU9 Sezary综合征肿瘤细胞系的1x10^6个细胞皮下引入健康小鼠体内，在约7-10天内在该部位形成约200mm^3的肿瘤。此肿瘤模型用于实验。将小鼠分为四组，(a)媒介物，(b)治疗组：I(0.8x10^6个效应髓样细胞/小鼠)；(c)II(0.1.4x10^6个效应髓样细胞/小鼠)；以及(d)III(0.1.4x10^6个效应髓样细胞/小鼠)。如图17A所示，每3天进行五次输注，并且监测小鼠的存活，以及包括流式细胞术和生物成像在内的终末测定。图17B示出了3次治疗剂量后一周内的成像数据。令人惊讶的是，即使在单次给药后，也有几只小鼠观察到肿瘤消退，而在三剂给药后，在几只小鼠中观察到完全缓解(图17B)。定量肿瘤消退数据在图17C和图17D中提供。
实施例7.髓样细胞分离/富集和CAR+髓样细胞的生成
在本实施例中，使用方案1或方案2，从分离自健康供体或从Leukopak容器的外周血样品分离和富集髓样细胞用于生成CAR+髓样细胞。
方案1.使用Ficoll-Paque密度离心，从收集自健康供体的Leukopak分离外周血单核细胞(PBMC)。通过使用抗体混合物(针对CD3、CD7、CD16、CD19、CD56、CD123和CD235a的商购抗人抗体)来分离(富集)经典的单核细胞以消耗多个细胞群。
方案2.使用Ficoll-Paque密度离心，从收集自健康供体的Leukopak分离外周血单核细胞(PBMC)。通过使用抗人抗体标记和分离CD14+细胞，由此分离(富集)CD14+单核细胞。
在分离/富集前和分离/富集后测试每个样品的细胞活力和总计数。在每个样品中计数用于生成CAR+髓样细胞(CD14+/CD16-)的髓样细胞。使用方案1和方案2富集的单核细胞用针对CD14、CD16的抗人抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。两种方案均显示CD14+/CD16-细胞的高度富集。如表3所示，使用方案1，供体样品1、2、3、5和6分别显示出CD14+/CD16-细胞的4.74倍、7.06倍、7.6倍、24.96倍和9.61倍富集；在每种情况下细胞活力都大于90％。使用方案2，供体样品4、8、9和两个白细胞单采术样品分别显示出CD14+/CD16-细胞的5.14倍、4.51倍、5.49倍、4.3倍和3.02倍富集；而且，在每种情况下，细胞活力都大于90％。
方案3.使用淘析从收集自健康供体的Leukopak分离外周血单核细胞(PBMC)。CD14+单核细胞根据大小和密度进行富集。
表3显示了使用方案1方案2和方案3，在分离/富集前和分离/富集后的细胞计数、活力和CD14+/CD16-群。
表3
Figure BDA0003794054840001301
Figure BDA0003794054840001311
用针对CD14、CD16、CD3、CD19和CD56的抗人抗体染色PBMC以及方案1和方案2富集的单核细胞的免疫表型，并通过流式细胞术进行分析。图18A中示出了使用表3的供体样品6的一种代表性测定，样品中存在少于1％的CD3、CD19和CD56阳性细胞，显示CD14+/CD16-细胞的有效回收和富集，其中T细胞、B细胞和NK细胞污染可忽略不计。类似地，图19A示出了使用方案2对选择的单核细胞进行的PBMC供体样品9的代表性免疫表型分析，所选单核细胞进一步用抗人CD14、CD16、CD3、CD19和CD56的抗体染色并通过流式细胞术分析。从这个实验中选择的单核细胞为78％CD14+CD16-，其中CD3、CD19和CD56阳性细胞少于5％。
如实施例所示，在回收和富集CD14+/CD16-单核细胞后，用编码CD5 CAR重组构建体的mRNA对细胞进行电穿孔。
电穿孔后18h或24h，单核细胞用抗人CD14和CD16抗体以及检测CD5-CAR转基因表达的试剂染色，并且通过流式细胞术分析细胞。结果显示，细胞为82.5％的CD14+CD16-并且79.1％的细胞使用方案1具有CD5 CAR表达(图18B)；并且68.8％的CD14+CD16-和94％的细胞使用方案2具有CD5 CAR表达(图19B)。来自方案3的结果示于图23中。
下面提供了代表性的CD5-CAR和HER2-CAR氨基酸序列。
CD5-FcR-PI3K
MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKSGGGGSGALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQGSGSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENM(SEQ ID NO:1)
HER2-FcR-PI3K
MWLQSLLLLGTVACSISDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSSGGGGSGALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQGSGSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENM(SEQ ID NO:2)
CD5-FcR-CD40
MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKSGGGGSGALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ(SEQ ID NO:3).
实施例8.病毒转导对细胞的影响
本实施例展示了用于生成CFP表达细胞并将其离体培养以在冷冻前稳定转导细胞的过程的试验运行。在一段时间内监测细胞的CD14和CD16表达。在本文所述的示例性研究中，CD14+/CD16-单核细胞从供体血液分离，然后用表达50MOI的HER2-CFP的第四代慢病毒转导并冷冻。将单核细胞解冻(第0天)并在TexMACS中以2.5x106/ml与100ng/ml MCSF一起在Corning UltraLow粘附板中培养四天。每天通过移液重悬细胞，并用Alexa700缀合的抗CD14抗体(1:20稀释度)和PE缀合的抗CD16抗体(1:20稀释度)或匹配的同型对照抗体染色100,000个细胞。然后在Attune NXT流式细胞仪上分析抗体染色的细胞。在FlowJo上分析数据。如图20中的点图所示，在第0天，72％的细胞为CD14+/CD16-，且随着培养，CD16的表达水平逐渐升高。在第2天，只有约27.3％的细胞是CD14+/CD16-；在第3天，只有约19.6％的细胞是CD14+/CD16-；并且在第4天，只有约12％的细胞是CD14+/CD16-。这表明CD14+/CD16-细胞在病毒转导后无法保留其CD114+/CD16-特征，并且可能不适合治疗剂制造过程。
实施例9.离体培养的M-CSF和GM-CSF的影响
本实施例展示了在M-CSF或GM-CSF存在下生成CFP表达细胞并离体培养它们的过程的试验运行。在这项研究中，CD14+/CD16-单核细胞从供体血液分离并冷冻。将细胞解冻并用100ng/ml MCSF或100ng/ml GM-CSF培养过夜，然后用编码四种CD5结合物CFP构建体之一的构建体进行电穿孔：CD5-FcR-PI3K构建体、CD5-FcR-CD40构建体、CD5-FcR-MDA5构建体、CD5-FcR-MyD88构建体。两组对照是电穿孔前对照和模拟电穿孔对照。电穿孔(EP)后，细胞以2.5x106/ml在具有100ng/ml MCSF或100ng/ml GM-CSF的TexMACS中在CorningUltraLow粘附板中培养四天。如本公开中别处所述，收获细胞并分析结合物表达、细胞因子表达和吞噬作用测定。一般测定方案如下：第0天分离/富集-第1天电穿孔(EP)-第2天吞噬作用-第3天收集细胞因子。
数据示于图21A(细胞活力)、图21B(受体(结合物)表达测定)、图21C(吞噬作用测定)和图21D(细胞因子生成)中。这些研究表明，M-CSF和GM-CSF可以影响细胞表型和受体活性。图21A中描述的数据表明在GM-CSF中培养细胞略微降低了细胞活力和数量。然而，GM-CSF提高了构建体的表达水平，如图21B所示。然而，在37℃下通过H9肿瘤细胞摄取展示的吞噬作用测定的数据表明GM-CSF降低了CFP表达细胞的吞噬能力(图21C)。同时，图21D显示GM-CSF抑制CFP表达细胞中各种细胞因子的水平。这些研究可表明GM-CSF比M-CSF具有更复杂的作用，因为GM-CSF诱导炎性单核细胞样表型，这可能会非常迅速地表现出炎症潜能的耗尽。这也可表明GM-CSF促进免疫耐受，并且可充当免疫调节细胞因子。它的作用可以是浓度和背景依赖性的。另一方面，M-CSF适用于短期(例如过夜)培养并维持细胞快速转变其表型。
实施例10.表达重组核酸的离体人细胞群的生成
以下实施例展示用于包含在药物组合物中的成功生成的离体人细胞群，其包含具有编码抗CD5 CFP(表达CD5-CFP的细胞)或抗HER-2CFP(表达HER2-CFP的细胞)的序列的重组核酸，其中离体人细胞群中多于70％的细胞是CD14+和CD16-。对于图22中所例示的研究，分离人CD14+/CD16-单核细胞，并将编码CD5结合CFP(左)或HER2结合CFP(右)的各自核酸掺入细胞中，然后培养细胞过夜以允许蛋白质表达。用Alexa700缀合的抗CD14抗体(1:20稀释度)和PE缀合的抗CD16抗体(1:20稀释度)或匹配的同型对照抗体染色100,000个细胞。然后在Attune NXT流式细胞仪上分析抗体染色的细胞。在FlowJo上分析数据。使用抗CD5-CFP和抗HER2-CFP抗体分析CD5-CFP或HER2-CFP的表达。如图22所示：71.3％的细胞为CD14+/CD16-(左)且76％的细胞表达CD5-CFP(中)；并且76.7％的细胞为CD14+/CD16-且95％的细胞表达HER2-CFP(右)。
在另一个示例性运行、临床级制造方案中，临床规模供体CD14+/CD16-细胞通过负选择从白细胞单采术样品分离，并且构建体(如表4所示)(CD5-FcR-PI3K、HER2-FcR-PI3K、CoVID 19抗原序列和胶质母细胞瘤抗原序列(GBM))被递送至分离的人CD14+/CD16-细胞。一个供体样品用于CD5-FcR-PI3K构建体；一个供体样品用于HER2-FcR-PI3K构建体。对于具有CoVID 19抗原构建体的组，使用了4个独立供体的4个临床规模运行，数据显示所有四个的平均值。对于具有GBM抗原的组，已经运行了3个独立供体的3次临床规模运行。之后立即冷冻这些细胞。在施用(通过注射)时解冻细胞，并如先前部分所述通过流式细胞术分析样品等分试样。
表4
Figure BDA0003794054840001361
在另一个示例性运行中，在电穿孔之前或在细胞培养生物处理器袋或在制造商、品牌或型号或表面积方面不同的不同类型培养瓶中解冻电穿孔的细胞后，分离和培养细胞。图23中示出的测试运行结果表明当在培养瓶中培养时治疗有效细胞的产量比在培养袋中更高，例如，在瓶中培养后获得的CD5结合物CFP表达细胞的百分比高于在袋中培养。然而，一些样品组在转染后48小时或72小时后显示出重组核酸的表达下降。
在示例性白细胞单采术图中，收集相关的白细胞单采术级分，并评估来自级分的细胞类型的细胞类型一致性，例如，在获得级分池中的CD14+和CD11b阳性细胞时。从白细胞单采术测定的三个连续级分中汇集的细胞(例如，介于级分2-5之间)始终富含表达CD14和CD11b的细胞，其中高百分比的细胞是CD16-和CD3-。图24中描绘了来自一个人类供体的示例性图，示出了淘析后的评价结果。在示例性测定中，在如上所述收集来自白细胞单采术样品的细胞后，通过电穿孔转染细胞产生具有高CD14+、高CD11b+、低CD16+和低CD3+细胞的细胞群，如图25A和25B所示；并且细胞在电穿孔时显示出高转染效率(图25C)。图25D展示了电穿孔后在示例性运行中用7AAD染色的活细胞的百分比。在表达CD5结合物CFP的未转染和转染细胞中都有高百分比的细胞存活。电穿孔后将细胞冷冻。解冻后0小时进行分析。UNT-未转染的；CD5，CD5-结合物CFP转染的。
使用本公开中描述的方法和方案，生成用于治疗用途的高质量细胞，并在对人患者施用之前对其进行质量测试。如图26所示，释放前测试的细胞表现出示例性标准。如图所示，单核细胞被门控。通过流式细胞术，大于80％的细胞是单细胞(单态)，在平行流式细胞术测定中，使用7AAD作为细胞凋亡标志物，大于90％的细胞是活细胞。大于90％的细胞在样品中的CFP表达呈阳性。电穿孔后18小时分析样品。

Claims (85)

1.一种包含离体CD14+/CD16-细胞群的组合物，其中所述离体CD14+/CD16-细胞群是工程改造的离体细胞群并且/或者包含外源性剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述离体CD14+/CD16-细胞群是人细胞群。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述离体CD14+/CD16-细胞群是未极化或未分化的髓样细胞群。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述外源性剂是重组核酸，其包含编码在所述CD14+/CD16-细胞群的细胞中表达的蛋白质或肽的序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述CFP包含：(a)包含抗原结合结构域的胞外结构域；和(b)与所述胞外结构域可操作地连接的跨膜结构域。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸包含编码在所述CD14+/CD16-细胞群中的细胞的膜表面上表达的蛋白质或肽的序列。
8.如权利要求7所述的组合物，其中在所述膜表面上表达的所述蛋白质或所述肽包含与抗原或致病剂结合的胞外抗原结合结构域。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述抗原是癌抗原。
10.如权利要求8所述的组合物，其中所述抗原是微生物致病抗原。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述重组核酸编码增强所述细胞的免疫应答的蛋白质或肽。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述重组核酸编码双特异性或三特异性接合体。
13.如权利要求1-4所述的组合物，其中所述蛋白质或所述肽包含一种或多种抗原或其片段。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述一种或多种抗原中的抗原与内体靶向序列融合。
15.如权利要求13所述的组合物，其中所述一种或多种抗原中的抗原包含分泌序列。
16.如权利要求13-15中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸编码与内体靶向序列融合的第一抗原和包含分泌序列的第二抗原。
17.如权利要求1-4或13-16中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸编码由所述CD14+/CD16-细胞群中的细胞分泌的蛋白质或肽。
18.如权利要求16所述的组合物，其中所述第一抗原和所述第二抗原由相同基因编码。
19.如权利要求13-18中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质或所述肽是内体加工的蛋白质。
20.如权利要求13-19中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质或所述肽是展示在所述细胞表面上的抗原的表位。
21.如权利要求13-20中任一项所述的组合物，其中所述抗原是病毒、细菌、原生动物或真菌抗原。
22.如权利要求1所述的组合物，其中所述外源性剂是包含编码蛋白质或肽的序列的重组核酸，所述蛋白质或肽是胞质蛋白或肽。
23.如权利要求1所述的组合物，其中所述外源性剂是包含编码免疫原性蛋白质或肽的序列的重组核酸。
24.如权利要求1所述的组合物，其中所述外源性剂是抗原。
25.如权利要求1-24所述的组合物，其中(i)所述细胞群中至少25％的细胞是CD14+和CD16-，并且(ii)所述细胞群中少于25％的细胞是树突状细胞。
26.如权利要求1-25中任一项所述的组合物，其中所述细胞群中至少50％的细胞是CCR2+和/或CCR5+。
27.如权利要求1-26中任一项所述的组合物，其中所述细胞群中至少50％的细胞是CD63+。
28.如权利要求1-27中任一项所述的组合物，其中所述细胞群中至少50％的细胞是CD56-、CD3-和/或CD19-。
29.如权利要求1-28中任一项所述的组合物，其中所述细胞群中少于40％的细胞是巨噬细胞。
30.如权利要求1-29所述的组合物，其中所述离体人细胞群包含至少1x107个细胞。
31.一种药物组合物，其包含如权利要求1-30中任一项所述的组合物和药学上可接受的赋形剂。
32.一种药物组合物，其包含：
(a)包含重组核酸的人细胞群，其中所述重组核酸包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列，其中：(i)所述人细胞群中至少25％的细胞是CD14+和CD16-，并且(ii)所述人细胞群中少于25％的细胞是树突状细胞；和
(b)药学上可接受的赋形剂。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述CFP包含：(i)胞外抗原结合结构域；和(ii)跨膜结构域，其中所述胞外抗原结合结构域与所述跨膜结构域可操作地连接。
34.如权利要求32或33所述的药物组合物，其中所述CFP还包含一个或多个胞内信号传导结构域，其可操作地连接到所述跨膜结构域。
35.如权利要求32-34中任一项所述的药物组合物，其中所述CFP包含衍生自吞噬受体或清道夫受体的胞内结构域。
36.如权利要求32-35中任一项所述的药物组合物，其中所述抗原结合结构域是CD5结合结构域或HER2结合结构域。
37.如权利要求32-36中任一项所述的药物组合物，其中所述跨膜结构域衍生自CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域或CD68跨膜结构域。
38.如权利要求32-37中任一项所述的药物组合物，其中所述一个或多个胞内信号传导结构域包括激酶募集结构域。
39.如权利要求32-38中任一项所述的药物组合物，其中所述CFP包含：(a)胞外结构域，其包含：(i)特异性结合CD5或HER2的scFv，和(ii)衍生自CD8或CD28的铰链结构域、或CD68的胞外结构域或其一部分；(b)CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域或CD68跨膜结构域；以及(c)包含至少两个胞内信号传导结构域的胞内结构域，其中所述至少两个胞内信号传导结构域包含：(i)衍生自FcγR或FcεR的第一胞内信号传导结构域，和(ii)第二胞内信号传导结构域，其：(A)包含PI3-激酶(PI3K)募集结构域，或(B)衍生自CD40。
40.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述人细胞群是离体工程改造的细胞。
41.一种药物组合物，其包含：
(a)包含重组核酸的人细胞群，其中所述重组核酸包含编码抗原肽的序列，其中：(i)所述人细胞群中至少25％的细胞是CD14+和CD16-，并且(ii)所述人细胞群中少于25％的细胞是树突状细胞；和
(b)药学上可接受的赋形剂。
42.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述人细胞群中的CD14+和CD16-细胞在细胞表面上展示与MHCI类或MHCII类分子缔合的微生物抗原或其片段。
43.如权利要求41或42所述的药物组合物，其中所述重组核酸包含编码选自以下的抗原肽的序列：CMVpp65肽、突变体R132H、异柠檬酸脱氢酶1(IDH)肽、TRP2肽和SARS-CoV-2抗原肽。
44.如权利要求41-42中任一项所述的药物组合物，其中所述重组核酸编码与内体靶向序列融合的第一抗原和包含分泌序列的第二抗原。
45.如权利要求41-44中任一项所述的药物组合物，其中所述抗原由所述CD14+和CD16-细胞进行内体加工。
46.如权利要求1所述的组合物，或如权利要求32-45中任一项所述的药物组合物，其中所述人细胞群的细胞是从对象的生物样品分离的。
47.如权利要求1所述的组合物，或如权利要求32-46中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞是从外周血分离的。
48.如权利要求1所述的组合物，或如权利要求32-47中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞是离体工程改造的。
49.如权利要求32-48中任一项所述的药物组合物，其中：(a)所述细胞群中至少25％的细胞是CCR2+和/或CCR5+；(b)所述细胞群中至少25％的细胞是CD63+；(c)所述细胞群中至少50％的细胞是CD56-、CD3-和/或CD19-；并且(d)所述细胞群中少于40％的细胞是巨噬细胞。
50.如权利要求32-49中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞群是未极化或未分化的髓样细胞群。
51.如权利要求32-50中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约10^7个细胞至约10^10个细胞。
52.如权利要求32-51中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物的所述细胞已经暴露于两个或更少的冷冻/解冻循环。
53.如权利要求1所述的组合物，或如权利要求32-52中任一项所述的药物组合物，其中从生物样品分离或富集后，所述细胞已离体培养少于48小时。
54.如权利要求1所述的组合物，或如权利要求32-52中任一项所述的药物组合物，其中施用前细胞的活力大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。
55.一种治疗有需要的对象的微生物感染的方法，所述方法包括向所述对象施用如权利要求41-54中任一项所述的药物组合物。
56.如权利要求55所述的方法，还包括在施用前制备表达微生物抗原的CD14+和CD16-细胞，包括：(i)从生物样品分离或富集CD14+和CD16-细胞，(ii)将包含编码至少一种抗原的序列的重组核酸引入来自(i)的所述细胞中以用于在所述细胞的表面上表达和呈递所述抗原。
57.一种治疗有需要的对象的疾病或病况的方法，所述方法包括向所述对象施用如权利要求31-40中任一项所述的药物组合物。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述疾病或病况是癌症。
59.如权利要求57所述的方法，还包括在施用前制备表达CFP的CD14+和CD16-细胞，包括：(i)从生物样品分离或富集CD14+和CD16-细胞，(ii)将包含编码CFP的序列的重组核酸引入来自(i)的所述细胞中。
60.如权利要求55或57所述的方法，其中所述引入细胞中包括用所述重组核酸对所述细胞进行电穿孔。
61.如权利要求55-60中任一项所述的方法，其中所述重组核酸是RNA。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述重组核酸是mRNA。
63.如权利要求55-62中任一项所述的方法，其中在掺入所述细胞中之前，所述重组核酸与水性混合物中的一种或多种脂质缔合。
64.如权利要求55-63中任一项所述的方法，其中所述CD14+/CD16-细胞在施用前暴露于两个或更少的冷冻/解冻循环。
65.如权利要求55-64中任一项所述的方法，其中所述药物组合物中的所述细胞在施用前已离体培养少于48小时。
66.如权利要求55-65中任一项所述的方法，其中当在体外培养时在掺入所述重组核酸细胞的48小时内将所述药物组合物施用于所述人对象，或将所述药物组合物冷冻以备将来施用。
67.如权利要求55-66中任一项所述的方法，其中在施用前，所述离体人细胞群已经离体培养少于36小时、24小时、少于18小时、少于12小时或少于6小时。
68.如权利要求55-67中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含所述细胞群中至少10^7个细胞。
69.如权利要求55-68中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含所述细胞群中至少10^8个细胞。
70.如权利要求55-69中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含所述细胞群中至少10^9个细胞。
71.如权利要求55-68中任一项所述的方法，其中所述药物组合物施用一次。
72.如权利要求55-71中任一项所述的方法，其中所述药物组合物施用超过一次。
73.如权利要求55-72中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的施用每两周一次、每4周一次、每6周一次、每8周一次、每10周一次、每12周一次、每16周一次、每20周一次、每24周一次或每年一次。
74.如权利要求55-73中任一项所述的方法，其中所述细胞对所述对象是自体的。
75.如权利要求55-74中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含细胞，所述细胞能够：(a)在施用后于所述对象中分化成效应细胞；(b)在施用后渗入所述对象的病变部位或在施用后迁移到所述对象的病变部位；或者(c)在施用后于所述对象中具有至少5天的寿命。
76.如权利要求1-54中任一项所述的组合物或药物组合物在制备用于治疗疾病或病况的基于细胞的治疗剂中的用途。
77.如权利要求76所述的用途，其中所述疾病或病况是癌症、感染或自身免疫性疾病。
78.如权利要求1-54中任一项所述的组合物或药物组合物用于治疗疾病或病况的用途。
79.如权利要求78所述的用途，其中所述疾病或病况是癌症、感染或自身免疫性疾病。
80.一种负选择细胞以用于制备药物组合物的方法，所述方法包括：(a)使来自人对象的生物样品与抗CD16抗体和选自抗CD56抗体、抗CD3抗体和抗CD19抗体的一种或多种抗体接触，以及(b)收集所述生物样品中未被所述抗CD16抗体结合且未被所述一种或多种抗体结合的细胞，(c)将包含编码CFP的序列的重组核酸引入从(b)收集的细胞中，从而形成细胞群，其中：(i)所述细胞群中至少25％的细胞是CD14+和CD16-，并且(ii)所述细胞群中少于25％的细胞是树突状细胞。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述方法包括流式细胞术或荧光激活细胞分选(FACS)。
82.一种疫苗组合物，其包含含有重组核酸的CD14+/CD16-细胞群，其中所述细胞已离体培养少于48小时。
83.如权利要求14或82所述的组合物，其中所述重组核酸包含内体靶向序列，所述内体靶向序列是LAMP1序列。
84.如权利要求15或82所述的组合物，其中所述重组核酸包含分泌序列，所述分泌序列是以下各项的分泌信号肽序列：人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)信号传导序列、人免疫球蛋白重链信号传导序列、人免疫球蛋白轻链信号传导序列、人血清白蛋白信号传导序列、人天青霉素信号传导序列或人胱抑素。
85.一种治疗有需要的人对象的疾病或病况的方法，其包括：向所述人对象施用包含如权利要求82-84中任一项所述的组合物的药物组合物。
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