JP2023506764A

JP2023506764A - 治療用細胞組成物ならびにそれを製造する方法およびその使用

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Publication number: JP2023506764A
Application number: JP2022535452A
Authority: JP
Inventors: ゲッツ，ダニエル; ワーン，ユーシャオ; ビサリア，ナミタ; オーストジェン，キャスリン; モリソン・ハービー，ケイトリン・アン; タバレス，パトリック・メンデス
Original assignee: マイエロイド・セラピューティクス，インコーポレーテッド
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2023-02-20
Also published as: CA3161488A1; CN115243700A; IL293718A; GB2608279A; BR112022011339A2; WO2021119538A1; EP4072574A1; GB202208953D0; AU2020403155A1; KR20220143642A; GB2608279B; MX2022007107A; US20230046472A1; EP4072574A4

Abstract

本開示は、増強された貪食活性を有するキメラ抗原受容体を発現させることにより、がんまたは感染症における免疫療法の改変されたキラー貪食細胞を作製および使用するための組成物および方法であって、キメラ受容体が組換え核酸によってコードされている、方法を提供する。【選択図】図２

Description

相互参照
[0001]本出願は、２０２０年３月２３日に出願された米国特許出願第１６／８２６，７０８号、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮出願第６２／９４６，８９６号、２０２０年４月１日に出願された米国仮特許出願第６３／００３，６１７号、および２０２０年４月２２日に出願された米国仮出願第６３／０１４，０６８号の利益を主張するものであり、これらのうちのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

[0002]循環する単球は、表現型、サイズ、形態、および転写プロファイルが異なり、血液中でのそれらの位置によって定義される、複数のサブセットから構成された多用途で動的な細胞集団を意味する。これらの個々の単球サブセットは、ヒトにおけるＣＤ１４およびＣＤ１６の発現、マウスにおけるＬｙ６Ｃ、ＣＣＲ２、およびＣＸ３ＣＲ１の発現によって区別することができる。ヒトでは、ＣＤ１４＋ＣＤ１６－（古典的）単球が循環する単球プールの約８５％を構成し、残りの約１５％がＣＤ１４＋ＣＤ１６＋（中間型）単球およびＣＤ１４ｌｏＣＤ１６＋（非古典的）単球から構成される。同様に、マウスでは、それぞれ古典的単球および非古典的単球を表している単球の２つの集団：Ｌｙ６ＣｈｉＣＣＲ２＋ＣＸ３ＣＲ１ｉｎｔとＬｙ６ＣｌｏＣＣＲ２－ＣＸ３ＣＲ１ｈｉが記載されている。骨髄からの単球の放出にはケモカイン受容体ＣＣＲ２の発現が必要であるが、これはＣＤ１４＋ＣＤ１６－古典的単球に限定される。

[0003]骨髄性細胞は、感染または病因の部位に効果的に動員される。古典的単球は、がん、感染症、自己免疫および傷害の部位に速やかに動員され、そこで著しい機能的可塑性を示し、多数の下流細胞、例えば樹状細胞およびマクロファージに分化する。古典的単球は、定常状態の条件下で、常在性の末梢単球由来細胞を補給する。しかし、いくつかの内因性因子および組織環境因子は病因の根絶および免疫記憶による強力な免疫応答の開始におけるマクロファージの有効性に影響を及ぼし、調節する。

[0004]マクロファージおよび樹状細胞を含む骨髄性細胞を使用する細胞療法の開発は、自然免疫と適応免疫の間の橋渡しとして作用するこれらの細胞が機能するので注目される。一方、例えば、ファゴサイトーシス、サイトカイン産生、ケモカイン産生、抗原提示／交差提示、およびＴ細胞活性化を含む、これらの細胞の炎症能力を利用することにより、がんの処置に革新をもたらす可能性を有する。また、これらの細胞の免疫制御能力を利用することにより、多くの自己免疫疾患、ならびに神経変性疾患、例えばアルツハイマー病および他のタンパク質蓄積障害の処置の可能性も有する。

[0005]本明細書では、ワクチンとして、または感染症に対する治療薬として、骨髄性細胞、詳しくは骨髄性細胞のサブクラスを使用するための組成物および方法が提供される。一部の実施形態では、骨髄性細胞、詳しくは本出願に記載の骨髄性細胞のサブクラスは、さらにｅｘｖｉｖｏで操作される。一部の実施形態では、骨髄性細胞、詳しくは骨髄性細胞のサブクラスは、組換えタンパク質を発現するようにさらに操作される。一部の実施形態では、骨髄性細胞は、ヒトドナーから得られる。一部の実施形態では、骨髄性細胞は、自己細胞療法に使用される。

[0006]治療薬の文脈における骨髄性細胞の過去の使用には、一般的に樹状細胞が含まれていた。樹状細胞は、免疫療法のワクチンとして使用されてきた。このような使用のための樹状細胞は、典型的には、ｅｘｖｉｖｏの単球またはマクロファージに由来する。

[0007]歴史的に、マクロファージおよび樹状細胞の産生は、血液からＣＤ１４＋単球をポジティブ選択し、その後、ＭＣＳＦ（マクロファージ）またはＧＭＣＳＦ＋ＩＬ４（もしくは他の因子）で５日を超えて培養することに依存してきた。このプロセスで単球はそれぞれマクロファージまたは樹状細胞に成熟する。このプロセスにより、これらの細胞に変化が生じ、疾患の部位に移動するのに必要な重要な機能の多くが低下する。そのような細胞が腫瘍ワクチンおよび他の目的に使用されてきた。これらの細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで強い機能的能力を有しているように見えるが、宿主に注入した際には次のような多くの問題がある：ヒトに再注入した際の寿命が短い；炎症／腫瘍の部位に輸送され得るのに必要な重要なケモカイン受容体がダウンレギュレーションされ、結果として輸送が不十分になる；ｉｎｖｉｖｏで適用するためにそれらを調製するには５日間より長く（通常は少なくとも７日）培養する必要性がある。

[0008]これらの問題は、マクロファージおよびＤＣの使用が試験されてきた臨床研究において、十分に満足する結果とならない可能性がある。これは、元の細胞が影響を及ぼすことができなかったためではなく、これらの細胞の生成に使用されたプロセスがそれらの能力を低下させたためである。本明細書で説明したプロセスは、ＣＤ１４＋単球の固有の能力を変化させることなく、それらの力を利用することに焦点をあてている。本明細書で説明したプロセスは、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－単球の固有の能力を変化させることなく、その力を利用することに焦点をあてている。

[0009]上記を考慮して、本明細書では、下流の前駆細胞に分化する能力、がん、感染症、炎症、神経変性および自己免疫の部位を追跡する能力、ならびに多数の下流のエフェクター細胞に分化する能力を示す、ヒト対象由来の生体試料、例えば血液から（いかなる形態の幹細胞動員を必要とせずに）骨髄性細胞の集団を生成するための方法および組成物が提供される。これらの細胞は、キメラ抗原受容体を用いて、ならびに／あるいは可溶性因子を発現するように、ならびに／あるいは免疫系の他のアームに分子および抗原を提示するように操作することができ、一方で、細胞はそれらの前駆体の機能およびｉｎｖｉｖｏで分化する能力を保持する。

[0010]また本明細書では、治療目的で改変（engineered）または修飾（modified）することができる（例えば、抗原による負荷、ＣＡＲで操作するなど）骨髄性細胞のプールを生成するための方法および組成物が提供される。

[0011]さらに、本明細書では、将来使用するために（例えば上記）凍結および解凍することができる骨髄性細胞のプールを生成する方法が提供される。
[0012]本明細書では、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞のｅｘｖｉｖｏ集団を含む組成物であって、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団が、細胞の改変された集団であり、および／または外因性物質を含む、組成物が提供される。

[0013]一部の実施形態では、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団は、ヒト細胞の集団である。
[0014]一部の実施形態では、細胞のｅｘｖｉｖｏ集団は、ＣＤ１６発現を欠失するＣＤ１１ｂ＋細胞およびＣＤ１４＋細胞である。

[0015]一部の実施形態では、細胞の集団は、非極性または未分化の骨髄性細胞の集団である。
[0016]一部の実施形態では、外因性物質は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団の細胞で発現されるタンパク質またはペプチドをコードする配列を含む組換え核酸である。一部の実施形態では、外因性物質は、細胞または隣接する細胞で、多能性もしくは幹細胞性またはそれらの誘導を誘導しないか、または妨げない。

[0017]一部の実施形態では、外因性物質は、キメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）をコードする配列を含む組換え核酸である。一部の実施形態では、ＣＦＰは、（ｉ）細胞外抗原結合性ドメイン、および（ｉｉ）膜貫通ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインおよび膜貫通ドメインは、作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＣＦＰは、（ａ）抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメイン、および（ｂ）細胞外ドメインに作動可能に連結された膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＦＰは、膜貫通ドメインに作動可能に連結された、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、膜表面に発現されるタンパク質またはペプチドは、抗原または疾患発症性物質に結合する細胞外抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原は、がん抗原である。一部の実施形態では、抗原は、微生物病原性抗原である。一部の実施形態では、ＣＦＰは、貪食受容体またはスカベンジャー受容体に由来する細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインは、キナーゼ動員ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＣＤ５結合ドメインまたはＨＥＲ２結合ドメインである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、またはＣＤ６８膜貫通ドメインに由来する。

[0018]一部の実施形態では、組換え核酸は、細胞の免疫応答を増強するタンパク質またはペプチドをコードする。一部の実施形態では、組換え核酸は、二重特異性エンゲージャーまたは三重特異性エンゲージャーをコードする。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、１つまたは複数の抗原またはその断片を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原のうちの抗原は、エンドソーム標的配列に融合される。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原のうちの抗原は、分泌配列を含む。一部の実施形態では、組換え核酸は、エンドソーム標的配列に融合される第１の抗原と、分泌配列を含む第２の抗原とをコードする。

[0019]一部の実施形態では、組換え核酸は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団中の細胞によって分泌されるタンパク質またはペプチドをコードする。
[0020]一部の実施形態では、第１の抗原および第２の抗原は、同じ遺伝子によってコードされる。

[0021]一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、エンドソームでプロセシングされたタンパク質である。
[0022]一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、細胞表面に提示される抗原のエピトープである。

[0023]一部の実施形態では、抗原は、ウイルス、細菌、原生動物、または真菌の抗原である。
[0024]一部の実施形態では、外因性物質は、細胞質タンパク質またはペプチドであるタンパク質またはペプチドをコードする配列を含む組換え核酸である。

[0025]一部の実施形態では、外因性物質は、免疫原性であるタンパク質またはペプチドをコードする配列を含む組換え核酸である。
[0026]一部の実施形態では、物質は、抗原である。

[0027]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の１０％未満は、樹状細胞である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－であり、細胞集団中の細胞の１０％未満は、樹状細胞である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１１ｂ＋である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｂ＋である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１６－である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１６－である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の５０％未満は、ＣＤ５６＋である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の５０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満は、ＣＤ５６＋である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の５０％未満は、ＣＤ４２ｂ＋である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の５０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満は、ＣＤ４２ｂ＋である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の５０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満は、ＣＤ３＋である。

[0028]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＣＲ２＋である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＣＲ５＋である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＣＲ２＋およびＣＣＲ５＋である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ６３＋である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ５６－、ＣＤ３－、および／またはＣＤ１９－である。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の４０％未満は、マクロファージ細胞である。

[0029]一部の実施形態では、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団は、少なくとも１×１０^７個の細胞を含む。
[0030]本明細書では、（ａ）組換え核酸を含むヒト細胞の集団であって、組換え核酸が、キメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）をコードする配列を含み、（ｉ）ヒト細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－であり、（ｉｉ）ヒト細胞の集団中の細胞の１０％未満が、樹状細胞である、集団と；（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１１ｂ＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｂ＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１６－である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１６－である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の５０％未満は、ＣＤ５６＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の５０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満は、ＣＤ５６＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の５０％未満は、ＣＤ４２ｂ＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の５０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満は、ＣＤ４２ｂ＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の５０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満は、ＣＤ３＋である。

[0031]本明細書では、ＣＦＰが、（ａ）（ｉ）ＣＤ５またはＨＥＲ２に特異的に結合するｓｃＦｖと、（ｉｉ）ＣＤ８に由来するヒンジドメイン、またはＣＤ２８またはＣＤ６８の細胞外ドメインまたはその一部とを含む細胞外ドメインと；（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、またはＣＤ６８膜貫通ドメインと；（ｃ）少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインであって、少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインが、（ｉ）ＦｃγＲまたはＦｃεＲに由来する第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、（ｉｉ）（Ａ）ＰＩ３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）動員ドメインを含むか、または（Ｂ）ＣＤ４０に由来する、第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、細胞内ドメインとを含む、上記の実施形態のいずれか１つの医薬組成物が提供される。

[0032]一部の実施形態では、ヒト細胞の集団は、ｅｘｖｉｖｏで改変された細胞である。
[0033]本明細書では、（ａ）組換え核酸を含むヒト細胞の集団であって、組換え核酸が、抗原ペプチドをコードする配列をコードする配列を含み、（ｉ）ヒト細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－であり、（ｉｉ）ヒト細胞の集団中の細胞の１０％未満が、樹状細胞である、集団と；（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１１ｂ＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｂ＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１６－である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１６－である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の５０％未満は、ＣＤ５６＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の５０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満は、ＣＤ５６＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の５０％未満は、ＣＤ４２ｂ＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の５０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満は、ＣＤ４２ｂ＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の５０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満は、ＣＤ３＋である。

[0034]一部の実施形態では、ヒト細胞の集団のＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞は、細胞表面上のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子と会合して微生物抗原またはその断片を提示する。

[0035]一部の実施形態では、組換え核酸は、ＣＭＶｐｐ６５ペプチド、変異体Ｒ１３２Ｈ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ）ペプチド、ＴＲＰ２ペプチド、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原ペプチドからなる群から選択される抗原ペプチドをコードする配列を含む。

[0036]一部の実施形態では、組換え核酸は、エンドソーム標的配列に融合される第１の抗原と、分泌配列を含む第２の抗原とをコードする。
[0037]一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞によってエンドソームでプロセシングされる。

[0038]一部の実施形態では、ヒト細胞の集団の細胞は、対象由来の生体試料から単離される。
[0039]一部の実施形態では、細胞は、末梢血から単離される。

[0040]一部の実施形態では、細胞は、ｅｘｖｉｖｏで改変される。
[0041]一部の実施形態では、医薬組成物は、（ａ）細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＣＲ２＋および／またはＣＣＲ５＋であり；（ｂ）細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ６３＋であり；（ｃ）細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ５６－、ＣＤ３－、および／またはＣＤ１９－であり；（ｄ）細胞の集団中の細胞の４０％未満が、マクロファージ細胞である、細胞の集団を含む。

[0042]一部の実施形態では、細胞の集団は、非極性または未分化の骨髄性細胞の集団である。
[0043]一部の実施形態では、医薬組成物は、約１０^７個の細胞～約１０^１０個の細胞を含む。

[0044]一部の実施形態では、医薬組成物の細胞は、２回以下の凍結／解凍サイクルに曝露されている。
[0045]一部の実施形態では、医薬組成物の細胞は、生体試料からの単離または濃縮後４８時間未満の間ｅｘｖｉｖｏで培養されている。

[0046]一部の実施形態では、投与前の医薬組成物の細胞の生存率は、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、または９５％を超える。
[0047]本明細書では、微生物感染症の処置を必要とする対象における微生物感染症を処置する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が提供される。

[0048]一部の実施形態では、この方法は、投与前に微生物抗原を発現するＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞を調製するステップであって、（ｉ）生体試料からＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞を単離または濃縮するステップと、（ｉｉ）細胞の表面に抗原を発現および提示するための少なくとも１つの抗原をコードする配列を含む組換え核酸を、細胞に導入するステップとを含む、ステップをさらに含む。

[0049]本明細書では、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
[0050]一部の実施形態では、この方法は、投与前にＣＦＰを発現するＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞を調製するステップであって、（ｉ）生体試料からＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞を単離または濃縮するステップと、（ｉｉ）ＣＦＰをコードする配列を含む組換え核酸を、細胞に導入するステップとを含む、ステップをさらに含む。

[0051]一部の実施形態では、細胞への導入は、組換え核酸による細胞の電気穿孔を実施するステップを含む。
[0052]一部の実施形態では、組換え核酸は、ＲＮＡである。

[0053]一部の実施形態では、組換え核酸は、ｍＲＮＡである。
[0054]一部の実施形態では、組換え核酸は、細胞に組み込まれる前に、水性混合物中で１つまたは複数の脂質と会合される。

[0055]一部の実施形態では、医薬組成物の細胞は、投与前に２回以下の凍結／解凍サイクルに曝露されている。
[0056]一部の実施形態では、医薬組成物の細胞は、投与前に４８時間未満の間ｅｘｖｉｖｏで培養されている。

[0057]一部の実施形態では、医薬組成物は、ｉｎｖｉｔｒｏで培養される場合には組換え核酸細胞を取り込んだ４８時間以内にヒト対象に投与されるか、または将来の投与のために凍結される。

[0058]一部の実施形態では、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団は、投与前に、３６時間未満、２４時間、１８時間未満、１２時間未満、または６時間未満の間ｅｘｖｉｖｏで培養されている。

[0059]一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞の集団中に少なくとも１０^７個の細胞を含む。
[0060]一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞の集団中に少なくとも１０^８個の細胞を含む。

[0061]一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞の集団中に少なくとも１０^９個の細胞を含む。
[0062]一部の実施形態では、医薬組成物は、１回投与される。

[0063]一部の実施形態では、医薬組成物は、２回以上投与される。
[0064]一部の実施形態では、医薬組成物は、２週間に１回、４週間に１回、６週間に１回、８週間に１回、１０週間に１回、１２週間に１回、１６週間に１回、２０週間に１回、２４週間に１回、または毎年１回投与される。

[0065]一部の実施形態では、細胞は、対象にとって自己由来である。
[0066]一部の実施形態では、医薬組成物の細胞は、（ａ）投与後に対象においてエフェクター細胞に分化する；（ｂ）投与後に対象の患部に浸潤するか、もしくは投与後に対象の患部に移動する；および／または（ｃ）投与後の対象において少なくとも５日間の寿命を有することを可能にする。

[0067]本明細書では、疾患または状態を処置する細胞ベースの治療薬を調製するための、本明細書に記載の組成物の使用であって、疾患または状態が、がん、感染症または自己免疫疾患である、使用が提供される。本明細書では、がんまたは感染症または自己免疫疾患を処置するための、本明細書に記載の組成物の使用が提供される。

[0068]本明細書では、本明細書に記載の医薬組成物を調製するための細胞をネガティブに選択する方法であって、（ａ）ヒト対象からの生体試料を、抗ＣＤ１６抗体、ならびに抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ１９抗体から選択される１つまたは複数の抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗ＣＤ１６抗体によって結合されておらず、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１９抗体によって結合されていない生体試料中の細胞を収集するステップと、（ｃ）ＣＦＰをコードする配列を含む組換え核酸を、（ｂ）から収集された細胞に導入し、それによって細胞の集団を形成するステップとを含み、（ｉ）細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６であり、（ｉｉ）細胞の集団中の細胞の１０％未満が、樹状細胞である、方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含む。

[0069]本明細書では、組換え核酸を含むＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団を含むワクチン組成物であって、細胞が、４８時間未満の間ｅｘｖｉｖｏで培養されている、ワクチン組成物が提供される。

[0070]一部の実施形態では、組換え核酸は、エンドソーム標的配列を含み、エンドソーム標的配列は、ＬＡＭＰ１配列である。
[0071]一部の実施形態では、組換え核酸は、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）シグナル配列、ヒト免疫グロブリン重鎖シグナル配列、ヒト免疫グロブリン軽鎖シグナル配列、ヒト血清アルブミンシグナル配列、ヒトアズロシジンシグナル配列、またはヒトシスタチン配列もしくはシグナル配列の分泌シグナルペプチド配列である分泌配列を含む。

[0072]本明細書では、疾患または状態の処置を必要とするヒト対象における疾患または状態を処置する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物をヒト対象に投与するステップを含む、方法が提供される。

[0073]一部の実施形態では、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団は、外因性遺伝子を安定的に発現するように遺伝子修飾された細胞の改変された集団である。一部の実施形態では、修飾は、遺伝子またはその断片を細胞のゲノムに安定的に組み込むために行われ得る。一部の実施形態では、トランスポゾンシステムを使用して、遺伝子またはその断片を細胞のゲノムに安定的に組み込むことができる。一部の実施形態では、トランスポゾンは、レトロトランスポゾンである。

[0074]本明細書では、細胞の集団を含む組成物であって、細胞の集団が、ヒト骨髄性細胞の改変された集団であり、および／または外因性物質を含み、細胞の集団の細胞の５０％超が、ＣＤ１４＋および／またはＣＤ１６－であり、（ａ）細胞の集団の細胞の５０％超が、ＣＣＲ２および／またはＣＣＲ５を発現し；（ｂ）細胞の集団の細胞の５０％超が、ＣＤ６３＋であり；（ｃ）細胞の集団の細胞の５０％超が、ＣＤ５６－、ＣＤ３－、および／またはＣＤ１９－であり；（ｄ）細胞の集団の細胞の４０％未満が、マクロファージ細胞であり、および／または細胞の集団の１０％未満の細胞が、樹状細胞（ＤＣ）であり；ならびに／あるいは（ｅ）外因性物質が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または抗原ペプチドをコードする配列を含む組換え核酸を含み、ならびに／あるいは（ｆ）細胞の集団が、ＣＡＲを介したトニック（ｔｏｎｉｃ）シグナル伝達を欠失する、組成物が提供される。

[0075]本明細書では、細胞の集団を含む組成物であって、細胞の集団が、ＣＤ１４＋および／またはＣＤ１６－細胞の改変された集団であり、（ａ）細胞の集団が、非極性の骨髄性細胞であり；（ｂ）細胞の集団が、投与後に対象においてエフェクター細胞に分化し；（ｃ）細胞の集団が、投与後に対象の患部に浸潤するか、もしくは投与後に対象の患部に移動し；および／または（ｄ）細胞の集団が、投与後の対象において少なくとも５日間の寿命を有する、組成物が提供される。

[0076]また本明細書では、本明細書に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
[0077]また本明細書では、疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物を、疾患または状態の処置を必要とする対象に投与するステップを含む、方法が提供される。

[0078]本明細書では、疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、細胞の集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、細胞の集団が、改変された細胞の集団であり、および／または外因性物質を含み、細胞の集団が、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、および／またはＣＤ１６－であり、（ａ）医薬組成物が、（ｉ）外因性物質が細胞の集団に導入されたか、または（ｉｉ）細胞の集団が改変された後７２時間以内に対象に投与され、（ｂ）骨髄性細胞の集団が、投与前に４８日未満の間ｅｘｖｉｖｏで培養されており；（ｃ）細胞の集団が、幹細胞動員を含まない方法によって得られ；ならびに／あるいは（ｄ）細胞の集団が、ネガティブ選択によって得られる、方法が提供される。

[0079]本明細書では、疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、骨髄性細胞を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、骨髄性細胞が、（ａ）（ｉ）強いＣＤ１４発現；（ｉｉ）低ＣＤ１６発現または検出不可能なＣＤ１６発現；（ｉｉｉ）ＣＣＲ２および／またはＣＣＲ５の発現；（ｉｖ）１つまたは複数の適切な刺激を受けた際に、複数の骨髄系統サブタイプに分化する能力を有すること、のうちの１つまたは複数によって特徴付けられ；（ｂ）外因性物質を含み、外因性物質によってｅｘｖｉｖｏで修飾された場合に、外因性物質が、骨髄性細胞の分化または極性化状態を変化させない、方法が提供される。

[0080]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、ＣＤ１６－（ＣＤ１６陰性）またはＣＤ１６ｌｏｗ（ＣＤ１６低）である。
[0081]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、ＣＤ１６－である。

[0082]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、ＣＤ１４＋（ＣＤ１４陽性）である。
[0083]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、ＣＤ１１ｂ＋（ＣＤ１１ｂ陽性）である。
[0084]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、ＣＣＲ２＋（ＣＣＲ２陽性）および／またはＣＣＲ５＋（ＣＣＲ５陽性）である。

[0085]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、医薬組成物を投与した後に、対象においてエフェクター細胞に分化することができる。一部の実施形態では、骨髄性細胞は、医薬組成物を投与した後に、対象の患部に移動することができる。一部の実施形態では、骨髄性細胞は、医薬組成物を投与した後に、対象の患部に浸潤することができる。

[0086]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、ＣＤ１４＋／ＣＣＲ２＋（ＣＤ１４およびＣＣＲ２二重陽性）である。
[0087]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、ＣＤ１４＋／ＣＣＲ５＋（ＣＤ１４およびＣＣＲ５二重陽性）である。

[0088]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、ＣＤ１４＋／ＣＣＲ２＋／ＣＣＲ５＋（ＣＤ１４、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５三重陽性）である。
[0089]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、ＣＤ６３＋（ＣＤ６３陽性）である。

[0090]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、外因性物質を含むか、またはｅｘｖｉｖｏで改変されたエフェクター骨髄性細胞であり、例えば、外因性遺伝子を発現するように改変され、例えば、外因性核酸を安定的に発現するか、もしくは外因性核酸を一時的に発現するようにゲノムの修飾を受けているか、またはそうでなければ、機能を果たすようにｅｘｖｉｖｏで物質によって修飾されており、そのようないかなる修飾も、幹細胞性または細胞自己再生能、老化経路を誘導、阻害もしくは変更すること、または分化経路を変更することを目的としてはいない。

[0091]一部の実施形態では、外因性物質は、組換え核酸、ペプチド、炭水化物、脂質または小分子である。一部の実施形態では、外因性物質は、ペプチドをコードする配列を含む組換え核酸を含み、ペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、本明細書に記載のＣＦＰである。

[0092]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、医薬組成物を投与する時点で、ｉｎｖｉｔｒｏで２日未満の間培養されている。
[0093]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、医薬組成物を投与する時点で、細胞の可塑性を保持する。

[0094]一部の実施形態では、投与する時点で、骨髄性細胞はＣＡＲを発現する。
[0095]一部の実施形態では、医薬組成物を投与する時点で、骨髄性細胞は、ＣＡＲまたはＣＦＰまたは抗原ペプチドによるトニックシグナル伝達を示さない。

[0096]一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、単離された複数の骨髄性細胞を、ｉｎｖｉｔｒｏでの操作に供するステップを含む方法によって得られる。
[0097]一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、幹細胞動員を含まない方法によって得られる。

[0098]一部の実施形態では、複数の骨髄性細胞は、生体試料中の１つまたは複数の骨髄性細胞の抗体媒介性結合を使用するネガティブ選択によって、生体試料から単離される。一部の実施形態では、ネガティブ選択は、フローサイトメトリーを使用して実施される。一部の実施形態では、複数の単離された骨髄性細胞は、（ｉ）ＣＤ３－（陰性）、（ｉｉ）ＣＤ１６－（陰性）またはＣＤ１６ｌｏｗ、（ｉｉｉ）ＣＤ１９－（陰性）；（ｉｖ）ＣＤ５６－（陰性）；および（ｖ）ＣＤ１４＋（陽性）である。一部の実施形態では、複数の単離された骨髄性細胞は、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６－、ＣＤ３－、ＣＤ１９－、ＣＤ５６－、およびＣＤ４２ｂ－である。

[0099]一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、生体試料からの複数の骨髄性細胞のネガティブ選択によって得られるＣＤ１６－／ＣＤ５６－／ＣＤ３－／ＣＤ１９－細胞である。

[0100]一部の実施形態では、生体試料は、末梢血試料である。一部の実施形態では、生体試料はアフェレーシス試料である。一部の実施形態では、生体試料は、骨髄性細胞を含む医薬組成物が投与される対象にとって異種由来または自己由来である。

[0101]一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の骨髄性細胞の少なくとも５０％は、未分化である。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の骨髄性細胞の少なくとも５０％は、非極性である。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、Ｍ０単球を含む。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、Ｍ１単球を含む。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、Ｍ２単球を含む。

[0102]一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、神経変性疾患、および一遺伝子性、多遺伝子性または多因子性の疾患または障害から選択される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。一部の実施形態では、疾患または状態は、細菌性、ウイルス性、真菌性または寄生虫性の感染症である。一部の実施形態では、疾患または状態は、神経変性である。

[0103]本明細書では、治療的に有効な骨髄性細胞を単離または濃縮する方法であって、（ａ）（ｉ）生体試料を、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ３抗体、および／または抗ＣＤ１９抗体を含む１つまたは複数の抗体と接触させるステップと、（ｉｉ）１つまたは複数の抗体に結合されていない生体試料中の細胞を収集または採取し、それによってこのプロセスで比較的無秩序でない治療的に有効な骨髄性細胞を単離または濃縮するステップによって、骨髄性細胞を含む生体試料から治療的に有効な骨髄性細胞をネガティブに選択するステップを含む、方法が提供される。

[0104]一部の実施形態では、治療的に有効な骨髄性細胞は、ポジティブ選択によって生体試料から単離される。例えば、治療的に有効な骨髄性細胞は、細胞を抗ＣＤ１４抗体と結合させることによって生体試料から単離することができる。

[0105]一部の実施形態では、単離された治療的に有効な骨髄性細胞は、ＣＤ１４＋である。
[0106]一部の実施形態では、単離された治療的に有効な骨髄性細胞は、ＣＤ１４ｈｉである。

[0107]一部の実施形態では、単離された治療的に有効な骨髄性細胞は、ＣＤ１１ｂ＋である。
[0108]一部の実施形態では、単離された治療的に有効な骨髄性細胞は、ＣＤ１６－またはＣＤ１６ｌｏｗである。

[0109]一部の実施形態では、単離された治療的に有効な骨髄性細胞は、適切な刺激に応答して骨髄系統サブセットに分化する能力を保持している。
[0110]一部の実施形態では、単離された治療的に有効な骨髄性細胞は、極性の単球、マクロファージ、ＤＣ１、ＤＣ２、ＤＣ３、ＤＣ４、ＤＣ５ＤＣ６樹状細胞、またはそれらの任意の組合せにさらに分化することができる。一部の実施形態では、単離された治療的に有効な骨髄性細胞は、適切な刺激に応答して、Ｍ１およびＭ２表現型に向かって極性化する能力を保持している。

[0111]本明細書では、処置を必要とする対象を処置するための骨髄性細胞の集団を生成する方法であって、（ｉ）複数の骨髄性細胞を生体試料から単離または濃縮するステップであって、複数の骨髄性細胞が、細胞可塑性を示す、ステップと；（ｉｉ）生体試料から単離された複数の骨髄性細胞を、外因性物質を使用してｉｎｖｉｔｒｏでの操作に供し、骨髄性細胞の集団を得るステップであって、ｉｎｖｉｔｒｏでの操作が、複数の骨髄性細胞の細胞可塑性を変化させない、ステップと；（ｉｉｉ）骨髄性細胞の集団と、許容される賦形剤とを含む治療用組成物を調製するステップとを含む方法が提供される。

[0112]一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
[0113]一部の実施形態では、生体試料は、末梢血試料、アフェレーシス試料、白血球アフェレーシス試料、または臍帯血試料である。一部の実施形態では、生体試料は、対象に由来する。一部の実施形態では、生体試料は、適切なヒトドナーに由来する。

[0114]一部の実施形態では、生体試料から複数の骨髄性細胞を単離または濃縮するステップは、ネガティブ選択によってＣＤ１４＋細胞を単離または濃縮するステップを含む。
[0115]一部の実施形態では、ネガティブ選択は、ヒト試料中の細胞を、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ３抗体、および抗ＣＤ１９抗体からなる群から選択される１つまたは複数の抗体と接触させ、１つまたは複数の抗体によって結合されたヒト試料中の細胞を固定化または除去することによって達成される。

[0116]一部の実施形態では、ネガティブ選択は、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳによって実施される。
[0117]一部の実施形態では、生体試料から単離された複数の骨髄性細胞は、ＣＤ１４＋であり、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ４２ｂ、および／またはＣＤ１６を発現しない。

[0118]一部の実施形態では、骨髄性細胞は、未分化であるか、または非極性である。
[0119]一部の実施形態では、外因性物質は、組換え核酸、ペプチド、炭水化物、脂質または小分子である。

[0120]一部の実施形態では、操作は、複数の骨髄性細胞を遺伝子改変するステップを含む。一部の実施形態では、操作は、ペプチドをコードする配列を含む組換え核酸を、複数の骨髄性細胞に導入するステップを含む。

[0121]一部の実施形態では、組換え核酸は、ＲＮＡである。
[0122]一部の実施形態では、組換え核酸は、ｍＲＮＡである。
[0123]一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、ペプチドをコードする配列を含む核酸を導入する際に、ペプチドを発現する。

[0124]一部の実施形態では、ペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
[0125]一部の実施形態では、ペプチドは、（ｉ）膜貫通ドメイン；（ｉｉ）第２の細胞の表面成分に結合する、少なくとも標的結合ドメインを含む細胞外領域；および（ｉｉｉ）１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含む。

[0126]一部の実施形態では、第２の細胞は、罹患細胞またはがん細胞である。一部の実施形態では、罹患細胞は、感染細胞である。
[0127]一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの細胞内貪食シグナル伝達ドメインを含む。

[0128]一部の実施形態では、細胞内貪食シグナル伝達ドメインは、細胞外標的結合ドメインと作動可能に連結され、細胞外標的結合ドメインが第２の細胞の表面成分に結合する際に活性化されるように構成される。

[0129]一部の実施形態では、組換え核酸を導入するステップは、電気穿孔またはヌクレオポレーションを介して導入するステップを含む。一部の実施形態では、組換え核酸を導入するステップは、化学的送達を介して導入するステップを含む。一部の実施形態では、組換え核酸は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。一部の実施形態では、組み込むステップは、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および逆転写酵素のうちの１つまたは複数の活性化を介する。

[0130]一部の実施形態では、組成物を調製するステップは、薬学的に許容される賦形剤に細胞を懸濁するステップを含む。
[0131]一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、細胞の可塑性と、適切な刺激後に複数の骨髄系統に分化する能力を保持する。

[0132]一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、ＣＡＲによるトニックシグナル伝達を示さない。上記の骨髄性細胞の集団は、機能性ＣＡＲを発現することができ、ＣＡＲ媒介性抗原特異的応答を示すことができる。一部の実施形態では、許容される賦形剤は、緩衝液、または栄養素、ＤＭＳＯ、グリセロールを含む細胞培養培地、またはそれらの組合せである。

[0133]一部の実施形態では、組成物は、さらなる使用まで凍結される。一部の実施形態では、ｅｘｖｉｖｏ法は、１２時間未満、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、４時間未満、または２時間未満で実施されるように調整される。一部の実施形態では、組成物は、単離された細胞に外因性組換え核酸を組み込んでから１時間または２時間または３時間または４時間以内に凍結される。

[0134]一部の実施形態では、この方法は、２時間以内に完了される。
[0135]一部の実施形態では、複数の骨髄性細胞は、遺伝子修飾および／または編集に供され、それにより骨髄性細胞の集団が得られる。一部の実施形態では、複数の骨髄性細胞は、１つまたは複数の抗原ペプチドとの接触に供され、それにより抗原負荷された骨髄性細胞の集団を得る。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、約６時間以内に製造することができる。一部の実施形態では、製造された骨髄性細胞の集団は、未分化または非極性であり、細胞可塑性を示し、および／またはトニックシグナル伝達を欠失している。

[0136]一部の実施形態では、細胞療法のための骨髄性細胞の集団は、（ａ）ＣＤ１４＋ＣＤ１６－である、集団中の約５０％を超える生細胞；（ｂ）ＣＣＲ２＋および／またはＣＣＲ５＋である、集団中の約５０％を超える生細胞；（ｃ）ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３１、ＣＤ７１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＤ１Ｃ、およびＡＸＬ／ＳＩＧＬＥＣ６のうちの１つまたは複数を発現する、集団中の５０％未満の生細胞；（ｄ）Ｍ０単球、（ｅ）Ｍ１単球、（ｆ）Ｍ２単球、（ｇ）樹状細胞、ならびに（ｈ）前駆樹状細胞（ｐｒｅ－ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ）または樹状前駆体細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｅｌｌ）のうちのいずれか１つまたは複数を含む。

[0137]本明細書では、生体試料から単離され、組換え核酸、ペプチド、炭水化物、化合物および小分子から選択される外部物質を使用してｉｎｖｉｔｒｏでさらに操作された、未分化または非極性の細胞を含む細胞療法で使用するための骨髄性細胞の集団であって、骨髄性細胞の集団中の骨髄性細胞がＣＤ１４＋ＣＤ１６－であり；またはＣＤ１４ｈｉおよびＣＤ１６ｌｏであり；（ｉ）細胞の可塑性、（ｉｉ）複数の骨髄系統に分化する能力、（ｉｉｉ）ｉｎｖｉｖｏで罹患組織に移動する能力、（ｉｖ）罹患組織に浸潤する能力、ならびに（ｖ）疾患発症性の細胞、組織、または生物を隔離および／または破壊する能力、のうちの１つまたは複数を示す、集団が提供される。

[0138]一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、ネガティブ選択を介して単離される。一部の実施形態では、外因性物質は、組換え核酸、ペプチド、炭水化物、脂質または小分子である。

[0139]一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ペプチドをコードする配列を有する組換え核酸を含む。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＡＲをコードする配列を有する組換え核酸を含む。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＡＲ媒介性活性化を示すＣＡＲを発現する。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＡＲを発現し、ＣＡＲによるトニックシグナル伝達を示さない。

[0140]一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＤ１４＋である。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＤ１６－である。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＤ１４ｈｉｇｈＣＤ１６ｌｏｗである。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＤ５６－である。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＤ３－である。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＤ１９－である。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、１つまたは複数のケモカイン受容体を発現する。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＣＲ２を発現する。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＣＲ５を発現する。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５を発現する。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団の細胞は、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－ＣＤ５６－ＣＤ３－ＣＤ１９－である。

[0141]本明細書では、骨髄性細胞の集団を含む医薬組成物が提供される。
[0142]本明細書では、がん治療で使用するための骨髄性細胞の集団が提供される。
[0143]一部の実施形態では、本明細書では、神経変性の治療で使用するための骨髄性細胞の集団が提供される。一部の実施形態では、集団中の細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで操作されていない細胞と比較して、細胞療法として投与された後に免疫原性の増強を示す。一部の実施形態では、集団中の細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで操作されていない細胞と比較して、細胞療法としての投与された後に罹患組織への細胞移動の増強を示す。一部の実施形態では、集団中の細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで操作されていない細胞と比較して、細胞療法として投与された後に貪食能力の増強を示す。一部の実施形態では、集団中の細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで操作されていない細胞と比較して、細胞療法として投与された後に細胞毒性の増強を示す。

[0144]一部の実施形態では、単独療法として使用するための、骨髄性細胞の集団。一部の実施形態では、併用療法として使用するための、骨髄性細胞の集団。
[0145]本明細書では、処置を必要とするヒト対象を処置するためのヒト骨髄性細胞を作製する方法であって、（ｉ）同種または自己の生体試料から、少なくとも抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ５６抗体および抗ＣＤ１９抗体を含む複数の抗体を使用してネガティブ選択により、未分化または非極性の骨髄性細胞を含む複数の骨髄性細胞を得るステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの細胞を改変、培養、安定化、活性化、濃縮、および／または増殖させるステップと；（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの細胞を対象に投与するステップとを含み、（ｉ）で得るステップから（ｉｉｉ）で投与するステップまでの経過時間が約３日未満である、方法が提供される。

[0146]一部の実施形態では、生体試料は、末梢血試料である。
[0147]一部の実施形態では、生体試料は、アフェレーシス試料である。
[0148]一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）からの細胞は、ＣＤ１４＋ＣＤ１６－またはＣＤ１４ｈｉおよびＣＤ１６ｌｏである。

[0149]一態様では、本明細書では、（ａ）組換え核酸を含む細胞の集団であって、組換え核酸が、キメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）をコードする配列または抗原ペプチドをコードする配列を含み、（ｉ）細胞の集団中の細胞の少なくとも６０％が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－であり、（ｉｉ）細胞の集団中の細胞の１０％未満が、樹状細胞である、集団と；（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＣＲ２＋および／またはＣＣＲ５＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ６３＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ５６－、ＣＤ３－、および／またはＣＤ１９－であり、細胞の集団中の細胞の４０％未満は、マクロファージ細胞である。

[0150]一態様では、本明細書では、（ａ）組換え核酸を含む細胞の集団であって、組換え核酸が、キメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）をコードする配列または抗原ペプチドをコードする配列を含み、（ｉ）細胞の集団中の細胞の少なくとも７０％が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－であり、（ｉｉ）細胞の集団中の細胞の１０％未満が、樹状細胞である、集団と；（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＣＲ２＋および／またはＣＣＲ５＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ６３＋である。一部の実施形態では、細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ５６－、ＣＤ３－、および／またはＣＤ１９－であり、細胞の集団中の細胞の４０％未満がマクロファージ細胞である。

[0151]一部の実施形態では、本明細書に記載の骨髄性細胞は、ワクチンを生成するためにｅｘｖｉｖｏで修飾される。一部の実施形態では、骨髄性細胞は、予防用ワクチンを生成するように修飾される。一部の実施形態では、骨髄性細胞は、治療用ワクチンを生成するように修飾される。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、上記の骨髄性細胞に組み込まれ、骨髄性細胞は、ＣＤ１４＋細胞、例えば、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞である。一部の実施形態では、骨髄性細胞は、組換え核酸によってコードされているペプチドまたはタンパク質を発現する。一部の実施形態では、組換え核酸は、病原体、例えば、病原性ウイルスまたはウイルス粒子などの微生物病原体、細菌、真菌性病原体、マラリア原虫病原体（ｐｌａｓｍｏｄｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎ）などのうちの１つまたは複数の抗原をコードする。

[0152]一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、１つまたは複数のウイルスエピトープをコードする核酸配列を含む。ポリヌクレオチドは、本出願に記載されているように骨髄性細胞に組み込まれ、骨髄性細胞は、ＣＤ１４＋細胞、例えばＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞である。次いで、骨髄性細胞はその表面にウイルス抗原を発現する。ウイルス抗原はリンパ球に提示され、次いで、免疫反応を活性化する。ウイルス抗原を発現するこのような骨髄性細胞は、骨髄性細胞の機能、例えば、移動、サイトカイン生成、および／または炎症反応のうちの１つまたは複数を増強するようにさらに修飾され得る。本明細書に記載の骨髄性細胞は、リンパ節に効率的に移動して、そこで、発現された抗原が多数のＴ細胞に提示され、強力な免疫を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の骨髄性細胞は、リンパ節への効率的な移動のために、高レベルのケモカイン受容体、例えばＣＣＲ２受容体を発現することができる。リンパ節はリンパ球を保有するだけでなく、ナイーブＴ細胞の貯蔵庫でもあり、骨髄性細胞によって提示される抗原に対する新しいＴ細胞特異性の生成を促進する。

[0153]一部の実施形態では、ポリ核酸は、完全長のウイルスタンパク質、例えばウイルス抗原タンパク質をコードする配列を含む。ポリ核酸は、ウイルス抗原または抗原性エピトープを発現させるために骨髄性細胞に組み込まれる。一部の実施形態では、ポリ核酸は、組換えタンパク質をコードする配列を含む。一部の実施形態では、組換えタンパク質は複数の抗原性エピトープを含み、１つまたは複数の抗原または抗原性エピトープはタンデムにコードされている。一部の実施形態では、組換え核酸は、２つのエピトープをコードする配列の間に介在配列を含み、介在配列は、リンカー、例えば、翻訳後ペプチダーゼ作用に対する感受性のための配列を有するリンカーであり得る。一部の実施形態では、核酸翻訳産物は、リソソーム輸送およびエピトープへの分解が促進され、骨髄性細胞の表面に提示される。一部の実施形態では、核酸は、リソソーム送達を促進するタグまたはペプチドを含む。

[0154]一部の実施形態では、ポリ核酸は、複数のエピトープ配列をコードする配列を含む。
[0155]一部の実施形態では、ウイルスは、インフルエンザウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である。一部の実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶ、ＨＰＶ、デング熱ウイルス、ヘルペスウイルス、ＣＭＶ、または任意の適切なウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスである。

[0156]一部の実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスである。一部の実施形態では、ウイルス抗原は、コロナウイルス抗原、例えば、スパイクタンパク質抗原（Ｓ）、核タンパク質（ＮＰ、またはＮ）抗原、非構造タンパク質（ＮＳＰ）抗原である。

[0157]一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、本明細書に記載のワクチンの開発のために生成され、骨髄性細胞の集団中の骨髄性細胞は、外因性または組換えのタンパク質またはペプチドをコードする配列を含むポリ核酸を細胞に組み込むことによってさらに修飾され、骨髄性細胞は、組換えタンパク質を発現する。一部の実施形態では、組換え核酸は、キメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）をコードする配列を含み、ＣＦＰは、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、骨髄性細胞の集団は、ＣＦＰを介したトニックシグナル伝達を欠失している。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、病原体または病原性抗原に結合することができる領域を含む。

[0158]一部の実施形態では、組換え核酸は、ＣＦＰをコードする配列を含み、ＣＦＰは、（ａ）抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメイン、および（ｂ）細胞外ドメインに作動可能に連結された膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＣＤ５結合ドメインまたはＨＥＲ２結合ドメインである。一部の実施形態では、ＣＦＰは、貪食受容体またはスカベンジャー受容体に由来する細胞内ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＦＰは、（ａ）（ｉ）ＣＤ５またはＨＥＲ２に特異的に結合するｓｃＦｖと、（ｉｉ）ＣＤ８に由来するヒンジドメイン、またはＣＤ２８またはＣＤ６８の細胞外ドメインまたはその一部とを含む細胞外ドメインと；（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、またはＣＤ６８膜貫通ドメインと；（ｃ）少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインであって、少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインが、（ｉ）ＦｃγＲまたはＦｃεＲに由来する第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、（ｉｉ）（Ａ）ＰＩ３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）動員ドメインを含むか、または（Ｂ）ＣＤ４０に由来する、第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、細胞内ドメインとを含む。

[0159]一部の実施形態では、組換え核酸は、抗原ペプチドをコードする配列を含み、抗原ペプチドは、ＣＭＶｐｐ６５ペプチドである。
[0160]一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、病原性抗原に結合する抗体またはその機能性断片である。一部の実施形態では、キメラ融合タンパク質を発現する骨髄性細胞は、ヒトなどの生物、例えば、患者または治療の対象において送達され、骨髄性細胞は、生物中、例えば、ヒトまたは対象中の病原体に結合し、病原体を貪食し、病原体を溶解し、それにより、組織から病原体負荷を軽減するか、または病原体負荷を除去することができる。一部の実施形態では、骨髄性細胞は、その貪食機能を増強するためにさらに修飾される。一部の実施形態では、骨髄性細胞は、１つまたは複数の活性化因子、免疫原、サイトカインまたはケモカインを発現して、オートクリン様式（ａｕｔｏｃｒｉｎｅｍａｎｎｅｒ）で骨髄性細胞を活性化するか、またはパラクリン様式（ｐａｒａｃｒｉｎｅｍａｎｎｅｒ）で近傍の免疫細胞を活性化する。一部の実施形態では、病原体に結合し、病原体を貪食し、病原体を溶解し、常在Ｔ細胞に抗原を提示することができるキメラ融合タンパク質を発現する骨髄性細胞は、強力な免疫応答および免疫記憶を活性化する。

[0161]一態様では、本明細書では、疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、上記の骨髄性細胞を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が提供される。投与するステップは、局所的に実施されてもよいし、全身的に行われてもよい。投与は、皮下、静脈内、または他の適切な手段によって実施され得る。

[0162]一部の実施形態では、細胞の集団の細胞は、（ａ）投与後に対象においてエフェクター細胞に分化する；（ｂ）投与後に対象の患部に浸潤するか、もしくは投与後に対象の患部に移動する；または（ｃ）投与後の対象において少なくとも５日間の寿命を有する。一部の実施形態では、細胞の集団は、対象に由来する。一部の実施形態では、医薬組成物は、組換え核酸が細胞の集団に導入された後、７２時間以内に対象に投与される。一部の実施形態では、細胞の集団は、投与前にｅｘｖｉｖｏで４８時間未満の間培養されている。

[0163]一部の実施形態では、本明細書に記載の骨髄性細胞、例えばＣＤ１４＋細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞は、本明細書および実施例に記載のように単離され、ウイルス抗原、例えばコロナウイルス抗原が負荷され、骨髄性細胞を必要としている対象に投与するために使用される。そのような骨髄性細胞は、ｉｎｖｉｖｏでＴ細胞に抗原を提示するのに効果的であり、したがって、対象にワクチン接種するために直接使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の骨髄性細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞は、ウイルス抗原または抗原ペプチド、例えばコロナウイルス抗原または抗原ペプチドを負荷され、ｅｘｖｉｖｏでＴ細胞を刺激するために、例えばｉｎｖｉｔｒｏ条件でＴ細胞を刺激するために使用することができ、刺激されたＴ細胞は順次治療のために使用される。

[0164]一部の実施形態では、本明細書では、細胞療法で使用するための、外因性遺伝子、例えばＣＦＰ、または組換え核酸によってコードされている抗原もしくは抗原結合タンパク質を発現するように改変されている骨髄性細胞の集団が記載されている。一部の実施形態では、本明細書では、免疫療法で、例えば、がんワクチンとして使用するための、外因性遺伝子、例えばＣＦＰを発現するように改変されている骨髄性細胞の集団が記載されている。一部の実施形態では、本明細書では、医薬組成物を調製するための、外因性遺伝子、例えばＣＦＰを発現するように改変されている骨髄性細胞の集団が記載されている。骨髄性細胞の集団は、外因性タンパク質、例えばＣＦＰ、または抗原をコードする組換え核酸を含むことができ、骨髄性細胞の集団は外因性タンパク質を発現し、集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－であり、集団中の細胞の１０％未満は、樹状細胞である。

[0165]一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原ペプチドをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチド構築物は、例えば、適切な用量および時間間隔でのポリ核酸の静脈内投与によって、対象にワクチン接種するために直接使用することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原ペプチドをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチド構築物は、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳による、抗原の生成に有用であり得、また、例えば、適切な用量および時間間隔での抗原ペプチドの静脈内投与などにより、ポリヌクレオチド構築物を必要とする対象のワクチン接種のための抗原として使用することができる。

[0166]一態様では、本明細書では、組換え核酸を含むヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団であって、組換え核酸が、キメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）をコードする配列を含み、（ｉ）ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－であり、（ｉｉ）ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団中の細胞の１０％未満が樹状細胞である、ｅｘｖｉｖｏ集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬ワクチン組成物が提供される。一部の実施形態では、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＣＲ２＋および／またはＣＣＲ５＋である。一部の実施形態では、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ６３＋である。一部の実施形態では、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ５６－、ＣＤ３－、および／またはＣＤ１９－である。

[0167]一部の実施形態では、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団中の細胞の４０％未満は、マクロファージ細胞である。
[0168]一部の実施形態では、医薬ワクチン組成物は、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団を含み、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＣＲ２＋および／またはＣＣＲ５＋であり；ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ６３＋であり；ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ５６－、ＣＤ３－、および／またはＣＤ１９－であり；および／またはヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団中の細胞の４０％未満は、マクロファージ細胞である。

[0169]一部の実施形態では、組換え核酸は、ｍＲＮＡを含む。
[0170]一部の実施形態では、組換え核酸は、ＣＦＰをコードする配列を含み、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団は、ＣＦＰを介したトニックシグナル伝達を欠失している。一部の実施形態では、ＣＦＰは、（ａ）抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメインと、（ｂ）細胞外ドメインに作動可能に連結された膜貫通ドメインとを含む。

[0171]一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＣＤ５結合ドメインまたはＨＥＲ２結合ドメインである。一部の実施形態では、ＣＦＰは、貪食受容体またはスカベンジャー受容体に由来する細胞内ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＦＰは、（ａ）ＣＤ５またはＨＥＲ２に特異的に結合するｓｃＦｖと、ＣＤ８に由来するヒンジドメイン、またはＣＤ２８またはＣＤ６８の細胞外ドメインまたはその一部とを含む細胞外ドメインと；（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、またはＣＤ６８膜貫通ドメインと；（ｃ）少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインであって、少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＦｃγＲまたはＦｃεＲに由来する第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、ＰＩ３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）動員ドメインを含むか、またはＣＤ４０に由来する、第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、細胞内ドメインとを含む。

[0172]また本明細書では、本明細書に記載の疾患または状態の処置を必要とするヒト対象における疾患または状態を処置する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物をヒト対象に投与するステップを含む、方法が提供される。

[0173]一部の実施形態では、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団の細胞は、（ａ）投与後に対象においてエフェクター細胞に分化する；（ｂ）投与後に対象の患部に浸潤するか、もしくは投与後に対象の患部に移動する；または（ｃ）投与後の対象において少なくとも５日間の寿命を有する。

[0174]一部の実施形態では、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団は、ヒト対象に由来する。
[0175]一部の実施形態では、医薬組成物は、組換え核酸がヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団に導入された後７２時間以内にヒト対象に投与されるか、または将来の使用のために凍結される。一部の実施形態では、医薬組成物は、組換え核酸がヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団に導入された後４８時間以内にヒト対象に投与されるか、または将来の使用のために凍結される。一部の実施形態では、細胞のｅｘｖｉｖｏ曝露は、合計で７２時間未満、４８時間未満、３６時間未満、または２４時間未満に限定される。一部の実施形態では、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団は、投与前に４８時間未満の間ｅｘｖｉｖｏで培養されている。

[0176]一部の態様では、本明細書では、医薬組成物を調製するための細胞をネガティブに選択する方法であって、（ａ）ヒト対象からの生体試料を、抗ＣＤ１６抗体、ならびに抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１９抗体から選択される１つまたは複数の抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗ＣＤ１６抗体によって結合されておらず、１つまたは複数の抗体によって結合されていない生体試料中の細胞を収集するステップと、（ｃ）ＣＦＰをコードする配列を含む組換え核酸を、（ｂ）から収集された細胞に導入し、それによって細胞の集団を形成するステップとを含み、（ｉ）細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６であり、（ｉｉ）細胞の集団中の細胞の１０％未満が、樹状細胞である、方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、フローサイトメトリーを含む。

[0177]一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、がん抗原結合性ドメインである。
[0178]一部の実施形態では、医薬品のヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団は、少なくとも１×１０^７個の細胞を含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、がん抗原結合性ドメインである。

[0179]本開示の追加の態様および利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示され、説明される、以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、すべて本開示から逸脱することなく、様々な明白な点での修正が可能である。したがって、図面および説明は、本質的に例示的として見なされるものであり、限定的なものとして見なされるものではない。

参照による組み込み
[0180]本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲において、本明細書は、そのような矛盾するいかなる材料にも取って代わり、および／または優先されるものとする。

[0181]本発明の新規特徴は、添付の請求項で詳細に示される。本発明の特徴および利点のより深い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明および付随する図面（さらに本明細書では「図」）への参照によって得られる。

[0182]図１は、単離された骨髄細胞の臨床プロセスの概要を表す図である。 [0183]図２は、本明細書に記載される骨髄エフェクター細胞の例示的な適用を示す模式図である。 [0184]図３は、高レベルのＣＤ１４を発現する細胞（ＣＤ１４^ｈｉ細胞）の分化可能性の図示である。 [0185]図４は、アフェレーシス生成物からのＣＤ１４＋細胞の抗体媒介の選択および単離または富化によって使用および回収された全細胞数、ならびに指示された細胞サブタイプのパーセンテージを示す表である。上パネル、選択前；下パネル、選択後。 [0186]図５Ａは、ＣＤ１４＋細胞の単離または富化の前のフローサイトメトリー分析データを示す図である。細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびＣＤ５６マーカーについて分析した。図５Ａは、ＣＤ１４＋細胞の単離または富化の前のフローサイトメトリー分析データを示す図である。細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびＣＤ５６マーカーについて分析した。 [0187]図５Ｂは、ＣＤ１４＋細胞の単離または富化の後のフローサイトメトリー分析データを示す図である。細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびＣＤ５６マーカーについて分析した。図５Ｂは、ＣＤ１４＋細胞の単離または富化の後のフローサイトメトリー分析データを示す図である。細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびＣＤ５６マーカーについて分析した。 [0188]図６は、ＣＤ１４＋の単離または富化の後のフローサイトメトリー分析データを示す図である。細胞は、ＣＤ１４およびＣＤ５６マーカーについて分析した。 [0189]図７は、分極刺激の存在下でのＭ０、Ｍ１およびＭ２細胞へのＣＤ１４＋細胞の分化を実証するデータを示す図である。 [0190]図８Ａは、分極刺激の存在下での２４時間培養におけるＭ０、Ｍ１およびＭ２分極化ＣＤ１４＋細胞の顕微写真を示す図である。 [0191]図８Ｂは、分極刺激の存在下での４８時間培養におけるＭ０、Ｍ１およびＭ２分極化ＣＤ１４＋細胞の顕微写真を示す図である。 [0192]図９Ａは、分極刺激の存在下でのＣＤ１４＋細胞におけるＣＤ２０６発現のフローサイトメトリーデータを示す図である。図９Ａは、分極刺激の存在下でのＣＤ１４＋細胞におけるＣＤ２０６発現のフローサイトメトリーデータを示す図である。図９Ａは、分極刺激の存在下でのＣＤ１４＋細胞におけるＣＤ２０６発現のフローサイトメトリーデータを示す図である。 [0193]図９Ｂは、分極刺激の存在下でのＣＤ１４＋細胞におけるＣＤ１４およびＣＤ１６発現のフローサイトメトリーデータを示す図である。図９Ｂは、分極刺激の存在下でのＣＤ１４＋細胞におけるＣＤ１４およびＣＤ１６発現のフローサイトメトリーデータを示す図である。図９Ｂは、分極刺激の存在下でのＣＤ１４＋細胞におけるＣＤ１４およびＣＤ１６発現のフローサイトメトリーデータを示す図である。 [0194]図９Ｃは、分極刺激の存在下でのＣＤ１４＋細胞におけるＣＣＲ２発現のフローサイトメトリーデータを示す図である。図９Ｃは、分極刺激の存在下でのＣＤ１４＋細胞におけるＣＣＲ２発現のフローサイトメトリーデータを示す図である。図９Ｃは、分極刺激の存在下でのＣＤ１４＋細胞におけるＣＣＲ２発現のフローサイトメトリーデータを示す図である。 [0195]図１０は、エフェクター骨髄細胞製造の図示である。 [0196]図１１は、組換え核酸の導入後の指示された時間のＣＤ１４＋細胞におけるＣＡＲ発現を実証するフローサイトメトリーデータを示す図である。図１１は、組換え核酸の導入後の指示された時間のＣＤ１４＋細胞におけるＣＡＲ発現を実証するフローサイトメトリーデータを示す図である。 [0197]図１２は、細胞の分極可能性を試験するための分極刺激によるＣＤ１４＋細胞の処理を示す模式図である。 [0198]図１３Ａは、分極刺激の存在下でのＣＡＲを発現するかまたは発現しない細胞のＣＤ１４（左）およびＣＤ１６（右）の発現レベルの変化を実証するフローサイトメトリーデータを示す図である。 [0199]図１３Ｂは、分極刺激の存在下でのＣＡＲを発現するかまたは発現しない細胞のＣＤ２０６（左）およびＣＤ１６３（右）の発現レベルの変化を実証するフローサイトメトリーデータを示す図である。 [0200]図１３Ｃは、分極刺激の存在下でのＣＡＲを発現するかまたは発現しない細胞のＰＤＬ１（左）およびＣＣＲ２（右）の発現レベルの変化を実証するフローサイトメトリーデータを示す図である。 [0201]図１３Ｄは、分極刺激の存在下でのＣＡＲを発現するかまたは発現しない細胞のＭＨＣＩ（上）およびＭＨＣＩＩ（下）の発現レベルの変化を実証するフローサイトメトリーデータを示す図である。 [0202]図１４Ａは、例示的な機能アッセイの模式的ワークフロー図である：ＨＥＲ－２特異的ＣＡＲを発現するＴＨＰ－１細胞を分極刺激で刺激し、ＨＥＲ２でコーティングされたビーズと接触させ、ＴＨＰ－１細胞によるサイトカインおよびケモカイン放出を、Ｌｕｍｉｎｅｘ多重アッセイキットを使用して分析した。 [0203]図１４Ｂは、指示されたケモカインのために図１４Ａに記載されるのと類似した例示的実験における、ＴＨＰ－１細胞のＬｕｍｉｎｅｘアッセイからのデータを示す図である。 [0204]図１４Ｃは、例示的な機能アッセイの模式的ワークフロー図である：ＨＥＲ－２特異的ＣＡＲを発現する単離されたヒト骨髄細胞を分極刺激で刺激し、ＨＥＲ２でコーティングされたビーズと接触させ、骨髄細胞によるサイトカインおよびケモカイン放出を、Ｌｕｍｉｎｅｘ多重アッセイキットを使用して分析した。 [0205]図１４Ｄは、指示されたケモカインのために図１４Ｃに記載されるのと類似した例示的実験における、単離されたヒト骨髄細胞のＬｕｍｉｎｅｘアッセイからのデータを示す図である。 [0206]図１５Ａは、例示的な機能アッセイの模式的ワークフロー図である：ＨＥＲ－２特異的ＣＡＲを発現するエフェクター骨髄細胞を分極刺激で刺激し、ＨＥＲ２発現腫瘍または非ＨＥＲ２発現腫瘍細胞（例えば、Ｈ９細胞）と接触させ、ＨＥＲ－２－ＣＡＲ骨髄細胞によるサイトカインおよびケモカイン放出を、Ｌｕｍｉｎｅｘ多重アッセイキットを使用して分析した。代替形態として、Ｃ５－ＣＡＲを発現するエフェクター骨髄細胞を同じ処理にかけ、Ｈ９Ｔ細胞リンパ腫または非リンパ腫細胞（例えば、ＨＥＲ－１発現腫瘍細胞）と接触させ、前記のように分析した。 [0207]図１５Ｂｉは、ＣＣＬ３、ＩＬ６およびＩＬ１０分泌のために図１５Ａに記載される実験からのＬｕｍｉｎｅｘアッセイのデータを示す図である。図１５Ｂｉは、ＣＣＬ３、ＩＬ６およびＩＬ１０分泌のために図１５Ａに記載される実験からのＬｕｍｉｎｅｘアッセイのデータを示す図である。 [0208]図１５Ｂｉｉは、ＣＤ８０もＣＤ２０６レベルも図１５Ａで指示される処理で変更されないことを示すデータを示す図である。 [0209]図１６Ａは、食作用アッセイからのデータ結果を示す図である。ＴＨＰ－１細胞を細胞外ＦＬＡＧサブユニット（緑色蛍光標識抗ＦＬＡＧ抗体で検出される）を含むＨＥＲ－２特異的ＣＡＲで形質導入し、赤色蛍光タンパク質を発現するＨＥＲ－２発現ＳＫＯＶ３（卵巣がん細胞系）細胞と接触させた。ＣＡＲの設計は、左側の画像で図示される。ＴＨＰ－１細胞は、ＰＭＡまたは対照で刺激した。画像化は、ＦＬＡＧを蛍光抗体とコンジュゲートさせた後に実行した。図１６Ａは、食作用アッセイからのデータ結果を示す図である。ＴＨＰ－１細胞を細胞外ＦＬＡＧサブユニット（緑色蛍光標識抗ＦＬＡＧ抗体で検出される）を含むＨＥＲ－２特異的ＣＡＲで形質導入し、赤色蛍光タンパク質を発現するＨＥＲ－２発現ＳＫＯＶ３（卵巣がん細胞系）細胞と接触させた。ＣＡＲの設計は、左側の画像で図示される。ＴＨＰ－１細胞は、ＰＭＡまたは対照で刺激した。画像化は、ＦＬＡＧを蛍光抗体とコンジュゲートさせた後に実行した。 [0210]図１６Ｂは、ＨＥＲ－２特異的ＣＡＲを発現するレンチウイルス形質導入一次エフェクター骨髄細胞を使用した食作用アッセイの結果を示す図であり、腫瘍呑食骨髄細胞を定量化するためにフローサイトメトリーを実行した。図１６Ｂは、ＨＥＲ－２特異的ＣＡＲを発現するレンチウイルス形質導入一次エフェクター骨髄細胞を使用した食作用アッセイの結果を示す図であり、腫瘍呑食骨髄細胞を定量化するためにフローサイトメトリーを実行した。 [0211]図１６Ｃは、骨髄細胞（マクロファージ、赤色蛍光性）に食作用のための負の標的、Ｊｕｒｋａｔ細胞、または正の標的、ＨＥＲ－２を発現するＳＫＯＶ３標的細胞（腫瘍細胞、緑色）を与えた食作用アッセイの顕微鏡画像化結果を示す図である。 [0212]図１７Ａは、マウスにおけるｉｎｖｉｖｏ腫瘍モデル確立のための模式的ワークフロー図を表し、続いて腫瘍特異的ＣＡＲを発現するエフェクター骨髄細胞の５回の注入、ならびに生存研究、サイトメトリー分析および画像化研究を実行した。１つの代表的な実験では、マウスを示されるようにグループ分けした。 [0213]図１７Ｂは、図１７Ａに示すようなスキームによる骨髄細胞注入の１回または３回の投与の後の、代表的な実験でのマウスにおける腫瘍退行を示す生体画像化結果を示す図である。図１７Ｂは、図１７Ａに示すようなスキームによる骨髄細胞注入の１回または３回の投与の後の、代表的な実験でのマウスにおける腫瘍退行を示す生体画像化結果を示す図である。 [0214]図１７Ｃおよび１７Ｄは、図１７Ａおよび１７Ｂに示すような実験セットアップにおける腫瘍退行の定量的調査を示す図である。 [0215]図１８Ａ－１８Ｂは、プロトコール１を使用したＣＤ５陽性ＣＡＲ細胞の生成の間に得られた、示された細胞分画のフローサイトメトリーデータを示す図である。図１８Ａ－１８Ｂは、プロトコール１を使用したＣＤ５陽性ＣＡＲ細胞の生成の間に得られた、示された細胞分画のフローサイトメトリーデータを示す図である。図１８Ａ－１８Ｂは、プロトコール１を使用したＣＤ５陽性ＣＡＲ細胞の生成の間に得られた、示された細胞分画のフローサイトメトリーデータを示す図である。 [0216]図１９Ａ－１９Ｂは、プロトコール２を使用したＣＤ５陽性ＣＡＲ細胞の生成の間に得られた、示された細胞分画のフローサイトメトリーデータを示す図である。図１９Ａ－１９Ｂは、プロトコール２を使用したＣＤ５陽性ＣＡＲ細胞の生成の間に得られた、示された細胞分画のフローサイトメトリーデータを示す図である。図１９Ａ－１９Ｂは、プロトコール２を使用したＣＤ５陽性ＣＡＲ細胞の生成の間に得られた、示された細胞分画のフローサイトメトリーデータを示す図である。 [0217]図２０は、指示された時間経過の間の、ＣＦＰをコードする核酸配列を含むウイルスベクターで形質導入したＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞におけるＣＤ１４およびＣＤ１６発現の変化を実証する例示的なデータを示す図である。 [0218]図２１Ａは、Ｍ－ＣＳＦ（各群の左の棒）またはＧＭ－ＣＳＦ（各群の右の棒）の存在下でのＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞のエレクトロポレーション（ＥＰ）後の一晩の培養からの生細胞および生存能力データを実証する例示的データを示す図である。エレクトロポレーション前（ＥＰ前）か、ｍｏｃｋエレクトロポレーションしたか、４つのＣＤ５結合剤ＣＦＰ構築物：ＣＤ５－ＦｃＲ－ＰＩ３Ｋ構築物、ＣＤ５－ＦｃＲ－ＣＤ４０構築物、ＣＤ５－ＦｃＲ－ＭＤＡ５構築物、ＣＤ５－ＦｃＲ－ＭｙＤ８８構築物のうちの１つをコードする組換え核酸でエレクトロポレーションした細胞を収集し、図中でデータセットはＦｃＲ－ＰＩ３Ｋ、ＦｃＲ－ＣＤ４０、ＦｃＲ－ＭＤＡ５およびＦｃＲ－ＭｙＤ８８とそれぞれマークされる。 [0219]図２１Ｂは、細胞をＭ－ＣＳＦ（上パネル）またはＧＭ－ＣＳＦ（下パネル）の存在下で一晩培養したときの、各ＣＤ５結合剤ＣＦＰ（ＣＤ５－ＣＦＰ）構築物の発現レベルを実証する例示的なフローサイトメトリーデータを示す図である。下のはめ込み図は、図で棒グラフとして提示されるドットプロットの定量的データを実証する；各セットで、左の棒、Ｍ－ＣＳＦ培養；右の棒、ＧＭ－ＣＳＦ培養。図２１Ｂは、細胞をＭ－ＣＳＦ（上パネル）またはＧＭ－ＣＳＦ（下パネル）の存在下で一晩培養したときの、各ＣＤ５結合剤ＣＦＰ（ＣＤ５－ＣＦＰ）構築物の発現レベルを実証する例示的なフローサイトメトリーデータを示す図である。下のはめ込み図は、図で棒グラフとして提示されるドットプロットの定量的データを実証する；各セットで、左の棒、Ｍ－ＣＳＦ培養；右の棒、ＧＭ－ＣＳＦ培養。図２１Ｂは、細胞をＭ－ＣＳＦ（上パネル）またはＧＭ－ＣＳＦ（下パネル）の存在下で一晩培養したときの、各ＣＤ５結合剤ＣＦＰ（ＣＤ５－ＣＦＰ）構築物の発現レベルを実証する例示的なフローサイトメトリーデータを示す図である。下のはめ込み図は、図で棒グラフとして提示されるドットプロットの定量的データを実証する；各セットで、左の棒、Ｍ－ＣＳＦ培養；右の棒、ＧＭ－ＣＳＦ培養。図２１Ｂは、細胞をＭ－ＣＳＦ（上パネル）またはＧＭ－ＣＳＦ（下パネル）の存在下で一晩培養したときの、各ＣＤ５結合剤ＣＦＰ（ＣＤ５－ＣＦＰ）構築物の発現レベルを実証する例示的なフローサイトメトリーデータを示す図である。下のはめ込み図は、図で棒グラフとして提示されるドットプロットの定量的データを実証する；各セットで、左の棒、Ｍ－ＣＳＦ培養；右の棒、ＧＭ－ＣＳＦ培養。図２１Ｂは、細胞をＭ－ＣＳＦ（上パネル）またはＧＭ－ＣＳＦ（下パネル）の存在下で一晩培養したときの、各ＣＤ５結合剤ＣＦＰ（ＣＤ５－ＣＦＰ）構築物の発現レベルを実証する例示的なフローサイトメトリーデータを示す図である。下のはめ込み図は、図で棒グラフとして提示されるドットプロットの定量的データを実証する；各セットで、左の棒、Ｍ－ＣＳＦ培養；右の棒、ＧＭ－ＣＳＦ培養。 [0220]図２１Ｃは、図２１Ａまたは２１Ｂの場合のように記載される各セットの食作用指数（％）を実証する例示的なデータを示す図である。各セットで、左の棒、Ｍ－ＣＳＦ培養；右の棒、ＧＭ－ＣＳＦ培養。 [0221]図２１Ｄは、指示される各群のサイトカイン分泌の例示的なデータを示す図である。各セットで、左の棒、Ｍ－ＣＳＦ培養；右の棒、ＧＭ－ＣＳＦ培養。図２１Ｄは、指示される各群のサイトカイン分泌の例示的なデータを示す図である。各セットで、左の棒、Ｍ－ＣＳＦ培養；右の棒、ＧＭ－ＣＳＦ培養。 [0222]図２２は、ＣＤ５結合剤ＣＦＰ（Ｃ５－ＣＦＰ）（左）またはＨＥＲ２結合剤ＣＦＰ（ＨＥＲ２ＣＦＰ）（右）を発現する細胞、ならびにＣＤ１４およびＣＤ１６の発現を示す例示的なフローサイトメトリーデータを示す図である。 [0223]図２３は、本開示の方法による例示的な細胞製造ランからのフローサイトメトリーデータを示す図であり、エレクトロポレーションから２４時間後にＣＤ５結合剤ＣＦＰを発現する細胞を示す。バッグまたは異なるフラスコ（フラスコ１およびフラスコ２）の中の細胞に及ぼす培養の影響が実証される。 ]図２３は、本開示の方法による例示的な細胞製造ランからのフローサイトメトリーデータを示す図であり、エレクトロポレーションから２４時間後にＣＤ５結合剤ＣＦＰを発現する細胞を示す。バッグまたは異なるフラスコ（フラスコ１およびフラスコ２）の中の細胞に及ぼす培養の影響が実証される。 [0224]図２４は、本開示の方法による例示的な細胞製造ランからのフローサイトメトリーデータを示す図であり、エルトリエーション後のヒトドナーからの細胞を示し、ドナーの全血と比較したＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ３細胞パーセンテージを例示する。図２４は、本開示の方法による例示的な細胞製造ランからのフローサイトメトリーデータを示す図であり、エルトリエーション後のヒトドナーからの細胞を示し、ドナーの全血と比較したＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ３細胞パーセンテージを例示する。 [0225]図２５Ａ－２５Ｄは、本開示の方法による例示的な細胞製造ランからの結果を示す図であり、エレクトロポレーションの後に冷凍され、解凍の０時間後に試験された１ドナーからの細胞を示す。図２５Ａ上、ＣＤ１４＋細胞のためのフローサイトメトリー、図２５Ａ下、ＣＤ１６＋細胞のためのフローサイトメトリー；図２５Ｂ上、ＣＤ１１ｂ＋細胞のためのフローサイトメトリー、図２５Ｂ下、ＣＤ３＋細胞のためのフローサイトメトリー。図２５Ｃ、解凍後０時間の時点での細胞中のＣＤ５結合剤ＣＦＰの発現（右）。左、対照、ｍｏｃｋ形質導入。図２５Ｄは、フローサイトメトリーによって検出される、アポトーシスマーカー７ＡＡＤによる細胞の染色を示す。ＵＮＴ－非トランスフェクト；ＣＤ５、ＣＤ５結合剤形質導入セット；Ｍｏｃｋ、ｍｏｃｋトランスフェクト。ＵＮＴおよびＭｏｃｋは、図で使用された対照である。図２５Ａ－２５Ｄは、本開示の方法による例示的な細胞製造ランからの結果を示す図であり、エレクトロポレーションの後に冷凍され、解凍の０時間後に試験された１ドナーからの細胞を示す。図２５Ａ上、ＣＤ１４＋細胞のためのフローサイトメトリー、図２５Ａ下、ＣＤ１６＋細胞のためのフローサイトメトリー；図２５Ｂ上、ＣＤ１１ｂ＋細胞のためのフローサイトメトリー、図２５Ｂ下、ＣＤ３＋細胞のためのフローサイトメトリー。図２５Ｃ、解凍後０時間の時点での細胞中のＣＤ５結合剤ＣＦＰの発現（右）。左、対照、ｍｏｃｋ形質導入。図２５Ｄは、フローサイトメトリーによって検出される、アポトーシスマーカー７ＡＡＤによる細胞の染色を示す。ＵＮＴ－非トランスフェクト；ＣＤ５、ＣＤ５結合剤形質導入セット；Ｍｏｃｋ、ｍｏｃｋトランスフェクト。ＵＮＴおよびＭｏｃｋは、図で使用された対照である。図２５Ａ－２５Ｄは、本開示の方法による例示的な細胞製造ランからの結果を示す図であり、エレクトロポレーションの後に冷凍され、解凍の０時間後に試験された１ドナーからの細胞を示す。図２５Ａ上、ＣＤ１４＋細胞のためのフローサイトメトリー、図２５Ａ下ＣＤ１６＋細胞のためのフローサイトメトリー；図２５Ｂ上、ＣＤ１１ｂ＋細胞のためのフローサイトメトリー、図２５Ｂ下、ＣＤ３＋細胞のためのフローサイトメトリー。図２５Ｃ、解凍後０時間の時点での細胞中のＣＤ５結合剤ＣＦＰの発現（右）。左、対照、ｍｏｃｋ形質導入。図２５Ｄは、フローサイトメトリーによって検出される、アポトーシスマーカー７ＡＡＤによる細胞の染色を示す。ＵＮＴ－非トランスフェクト；ＣＤ５、ＣＤ５結合剤形質導入セット；Ｍｏｃｋ、ｍｏｃｋトランスフェクト。ＵＮＴおよびＭｏｃｋは、図で使用された対照である。図２５Ａ－２５Ｄは、本開示の方法による例示的な細胞製造ランからの結果を示す図であり、エレクトロポレーションの後に冷凍され、解凍の０時間後に試験された１ドナーからの細胞を示す。図２５Ａ上、ＣＤ１４＋細胞のためのフローサイトメトリー、図２５Ａ下ＣＤ１６＋細胞のためのフローサイトメトリー；図２５Ｂ上、ＣＤ１１ｂ＋細胞のためのフローサイトメトリー、図２５Ｂ下、ＣＤ３＋細胞のためのフローサイトメトリー。図２５Ｃ、解凍後０時間の時点での細胞中のＣＤ５結合剤ＣＦＰの発現（右）。左、対照、ｍｏｃｋ形質導入。図２５Ｄは、フローサイトメトリーによって検出される、アポトーシスマーカー７ＡＡＤによる細胞の染色を示す。ＵＮＴ－非トランスフェクト；ＣＤ５、ＣＤ５結合剤形質導入セット；Ｍｏｃｋ、ｍｏｃｋトランスフェクト。ＵＮＴおよびＭｏｃｋは、図で使用された対照である。図２５Ａ－２５Ｄは、本開示の方法による例示的な細胞製造ランからの結果を示す図であり、エレクトロポレーションの後に冷凍され、解凍の０時間後に試験された１ドナーからの細胞を示す。図２５Ａ上、ＣＤ１４＋細胞のためのフローサイトメトリー、図２５Ａ下ＣＤ１６＋細胞のためのフローサイトメトリー；図２５Ｂ上、ＣＤ１１ｂ＋細胞のためのフローサイトメトリー、図２５Ｂ下、ＣＤ３＋細胞のためのフローサイトメトリー。図２５Ｃ、解凍後０時間の時点での細胞中のＣＤ５結合剤ＣＦＰの発現（右）。左、対照、ｍｏｃｋ形質導入。図２５Ｄは、フローサイトメトリーによって検出される、アポトーシスマーカー７ＡＡＤによる細胞の染色を示す。ＵＮＴ－非トランスフェクト；ＣＤ５、ＣＤ５結合剤形質導入セット；Ｍｏｃｋ、ｍｏｃｋトランスフェクト。ＵＮＴおよびＭｏｃｋは、図で使用された対照である。図２５Ａ－２５Ｄは、本開示の方法による例示的な細胞製造ランからの結果を示す図であり、エレクトロポレーションの後に冷凍され、解凍の０時間後に試験された１ドナーからの細胞を示す。図２５Ａ上、ＣＤ１４＋細胞のためのフローサイトメトリー、図２５Ａ下ＣＤ１６＋細胞のためのフローサイトメトリー；図２５Ｂ上、ＣＤ１１ｂ＋細胞のためのフローサイトメトリー、図２５Ｂ下、ＣＤ３＋細胞のためのフローサイトメトリー。図２５Ｃ、解凍後０時間の時点での細胞中のＣＤ５結合剤ＣＦＰの発現（右）。左、対照、ｍｏｃｋ形質導入。図２５Ｄは、フローサイトメトリーによって検出される、アポトーシスマーカー７ＡＡＤによる細胞の染色を示す。ＵＮＴ－非トランスフェクト；ＣＤ５、ＣＤ５結合剤形質導入セット；Ｍｏｃｋ、ｍｏｃｋトランスフェクト。ＵＮＴおよびＭｏｃｋは、図で使用された対照である。 [0226]図２６は、本開示の方法による例示的な細胞製造ランからの結果を示す図であり、トランスフェクションの後の細胞品質を示す、左端、単球をゲーティング；第２の欄、単一細胞パーセント；第３の欄、生細胞パーセント；右端、ＣＤ５結合剤ＣＦＰ発現。図２６は、本開示の方法による例示的な細胞製造ランからの結果を示す図であり、トランスフェクションの後の細胞品質を示す、左端、単球をゲーティング；第２の欄、単一細胞パーセント；第３の欄、生細胞パーセント；右端、ＣＤ５結合剤ＣＦＰ発現。 [0227]図２７Ａは、ＣＦＰをコードするｍＲＮＡが送達された細胞における低いサイトカイン生成を示す図である。 [0228]図２７Ｂは、ＣＦＰをコードするｍＲＮＡが送達された細胞におけるＣＦＰの長期発現を示す図である。 [0229]図２８は、無細胞または抗ＣＤ５ＣＦＰを発現する一次ヒト単球細胞の指示濃度のＣＣＬ２とのインキュベーションの後の経時的な相対蛍光単位（ＲＦＵ）の例示的なグラフである。対照に対する増加倍率は、アッセイバッファー単独で処理した細胞と比較したＣＣＬ２によって誘導された化学向性の比を表す。グラフの各棒は、２つの反復ウェルの平均±ＳＤを表す。 [0230]図２９は、健康ドナーＬｅｕｋｏｐａｋから単離され、細胞外ＨＥＲ２結合性ドメイン（ｓｃＦｖ）、細胞外Ｆｌａｇタグ、ＣＤ８に由来する細胞外ヒンジドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ならびにＦｃＲγに由来する第１の細胞内シグナル伝達ドメインおよびＰＩ３Ｋ補充ドメインを含有する第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する、ＣＦＰをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＣＦＳＥ標識ＣＤ１４＋細胞が、ＭＳＴＯ腫瘍をもつＮＳＧマウスへ投与されてから２４時間後に取り出された腫瘍試料の生体画像化を示す蛍光顕微鏡画像である。形質導入された細胞は腫瘍に移動し、腫瘍細胞周囲に蓄積するのが観察された。 [0231]図３０は、受容体ライゲーションが炎症誘発性表現型の上昇および持続を引き起こすことを示すグラフである。 [0232]図３１は、順化培地を使用したＴ細胞補充アッセイの例示的な結果のグラフである。

[0233]すべての用語は、当業者によって理解され得るように理解されるものとする。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

[0234]本明細書で使用されているセクションの見出しは、単なる構成的な目的のものであり、説明されている主題を限定するものとして解釈されるものではない。
[0235]本開示の様々な特徴は、単一の実施形態の文脈で記載され得るが、それらの特徴は、別々に、または任意の適切な組合せで提供することもできる。逆に、本開示は、明確化するために別々の実施形態の文脈で本明細書に記載され得るが、本開示はまた、単一の実施形態で実施され得る。

[0236]別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似のまたは同等の任意の方法および材料もまた、本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料がここに記載されている。１つまたは複数の特定の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。

[0237]本明細書を通じて、「約」または「ほぼ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容される誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるかに、すなわち、測定システムの限界に、部分的に依存する。例えば、「約」とは、当分野の慣例によって、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」とは、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。本願および特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、別段の明記のない限り、特定の値に対して許容される誤差範囲内を意味する「約」という用語が想定されるものとする。本明細書および特許請求の範囲（複数可）で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」の有する（ｈａｖｉｎｇ）任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含む（ｉｎｃｌｕｄｅｉｎｇ）の任意の形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）は、包括的であるか、またはオープンエンドであり、追加の引用されていないエレメントまたは方法のステップを排除するものではない。本明細書で論じられている任意の実施形態は、本開示の任意の方法または組成物に関して実施され得るものであり、その逆もまた同様であると考えられる。さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成することができる。

[0238]「物質」は、任意の小分子化学化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片である。
[0239]「変更」または「変化」は、増加または減少である。変更は、最小限度として１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％まで、または４０％、５０％、６０％まで、さらには７０％、７５％、８０％、９０％、または１００％まで可能である。

[0240]「抗原」は、免疫応答を刺激することができる分子である。Ｔ細胞によって認識される抗原は、ヘルパーＴリンパ球（ヘルパーＴ（ＴＨ）細胞）または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のいずれであっても、インタクトなタンパク質としてではなく、細胞表面のクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣタンパク質と結合する小さなペプチドとして認識される。天然に存在する免疫応答の過程で、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のクラスＩＩＭＨＣ分子と結合して認識される抗原は、細胞外から獲得され、内在化し、クラスＩＩＭＨＣ分子と結合する小さなペプチドにプロセシングされる。

[0241]「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」には、専門の抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）、ならびに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞（脳）、膵臓ベータ細胞、および血管内皮細胞）が含まれる。これらの細胞は、貪食細胞である。ＡＰＣはさらに主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子を発現し、ＭＨＣと複合体を形成した外来抗原をその表面に提示してＴ細胞と接触および認識し、Ｔ細胞の活性化および免疫応答を引き起こすことができる。専門の抗原提示細胞、特に樹状細胞は、ナイーブＴ細胞の刺激において重要な役割を果たすが、線維芽細胞などの非専門の抗原提示細胞も、このプロセスに寄与し得る。ＡＰＣはまた、外因性抗原をプロセシングし、プロセシングされた抗原をクラスＩＭＨＣ分子に提示することにより、ペプチド抗原を交差提示することもできる。クラスＩＭＨＣ分子と結合して認識されるタンパク質を生じる抗原は、一般に細胞内で生成されるタンパク質であり、これらの抗原はプロセシングされ、クラスＩＭＨＣ分子と結合される。

[0242]「生体試料」とは、生物に由来する組織、細胞、体液、または他の物質である。本明細書で使用される場合、「試料」という用語には、任意の組織、細胞、液体、または生物に由来する他の物質どの生体試料が含まれる。

[0243]本明細書で使用される場合の「細胞」は、生物の生物学的単位、例えば、真核細胞である。一部の実施形態では、それは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞でプラスミドを増殖させる場合、使用の文脈において理解されるように、原核細胞（例えば、細菌または藻類細胞）を表すことができる。他の実施形態では、本明細書で使用される場合の細胞は、組織または器官からの細胞などの真核細胞、例えば哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、患者由来の細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジの細胞、または生物に由来する任意の細胞である。一部の実施形態では、細胞は、骨髄性細胞、例えば、単球細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球前駆体、例えばＣＤ１４＋細胞などである。一部の実施形態では、ＣＤ１４＋細胞は、ＣＤ１６を発現しない（ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－）。ＣＤ１４を発現しない細胞は、ＣＤ１４－細胞である。当業者であれば、ＣＤ１４＋細胞は骨髄起源の細胞であると解釈することができる。同様に、ＣＤ３細胞、またはＣＤ３＋細胞と交換可能に表されるものは、リンパ球またはリンパ球系細胞である。一部の実施形態では、骨髄性細胞または単球は、抗原提示細胞、貪食性細胞、またはそれが貪食する細胞を溶解する溶解性細胞であり得る。

[0244]未分化の骨髄性細胞は、骨髄前駆細胞もしくは前駆体様細胞であり得るか、または後期単球（例えば、中間型もしくは非古典的単球表現型）、またはマクロファージ表現型、またはＤＣ表現型に分化していない細胞であり得る。非極性化骨髄性細胞は、Ｍ１またはＭ２表現型に極性化されていない骨髄性細胞であり得る。Ｍ１およびＭ２の特徴は、当分野において十分に理解されている。

[0245]「キメラ受容体」は、天然受容体にもともと存在しない１つまたは複数の領域、ドメイン、またはセグメントを含む受容体である。例えば、キメラ受容体は、細胞外ドメインもしくは膜貫通ドメイン、またはその両方もしくはそれらの断片を有し、受容体の残りの部分を構成する天然受容体タンパク質のタンパク質とは異なるタンパク質から置き換えられ得る。キメラ受容体は、一般的には組換えタンパク質である。一部の実施形態では、キメラ受容体は、融合タンパク質である。本明細書で使用される場合の「キメラ融合タンパク質」は、天然タンパク質の１つまたは複数の断片またはセグメントまたはドメインまたはその一部が、１つまたは複数の異なる非天然タンパク質の１つまたは複数の断片またはセグメントまたはドメインまたはその一部と置き換えられた融合タンパク質を意味する。キメラ融合タンパク質は、異なるタンパク質の異なる部分、セグメント、断片、またはドメインを融合することによって生成され得る。一部の実施形態では、キメラ融合タンパク質は、受容体である。一部の実施形態では、キメラ受容体は、キメラ融合タンパク質として交換可能に使用することができ、キメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ、もしくはＴＭＤもしくはＴＤ）および／または細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を有する。一部の実施形態では、ＣＦＰは、キメラ抗原受容体、ＣＡＲと交換可能に呼ばれ得る。一部の実施形態では、ＣＦＰまたはＣＡＲは、貪食受容体の１つまたは複数のドメイン、断片、セグメント、またはその一部を含むキメラ受容体であり得る。一部の実施形態では、ＣＦＰは、貪食またはテザリング受容体（ＰＲ）融合タンパク質（ＰＦＰ）と交換可能に呼ばれ得る。典型的には、ＣＦＰは、組換えＤＮＡ技術によって生成される。ＣＦＰは、組換えタンパク質である。同様に、ＣＡＲまたはＰＦＰは、組換えＤＮＡ技術によって生成され、組換えタンパク質である。一部の実施形態では、キメラ受容体の標的は、がん細胞上のがん抗原であり得る。一部の実施形態では、標的は、ＣＤ５であり得る。一部の実施形態では、標的は、ＨＥＲ２であり得る。したがって、一部の実施形態では、特定の標的に結合するキメラ受容体またはキメラ融合タンパク質は、標的の「バインダー」と呼ぶことができ、例えば、ＣＤ５結合ＣＦＰは、ＣＤ５バインダーと呼ぶことができるか、または抗ＣＤ５ＣＦＰもしくは抗ＣＤ５バインダー分子と交換可能に呼ぶことができる。この文脈で使用される場合のバインダーは、特定の結合標的を有するＣＦＰであり得る。

[0246]「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞共刺激のモジュレーションによって影響を受けるＴ細胞媒介性および／またはＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答には、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生、および細胞傷害性が含まれる。さらに、免疫応答という用語には、Ｔ細胞の活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答、例えば、抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化が含まれる。

[0247]「電気穿孔」という用語は、例えば、細胞膜を横切って核酸が一時的な通過することができるように、細胞膜を横切って電圧勾配を生成させるなどの、電気インパルスを伴って外因性核酸分子を細胞に組み込むプロセスを意味する。一部の実施形態では、電気穿孔は、哺乳動物細胞にＣＦＰをコードする核酸分子を組み込むために実施され得る。一部の実施形態では、電気穿孔は、ＣＦＰをコードする核酸分子を、ヒト骨髄性細胞などの骨髄性細胞に組み込むために実施され得る。電気穿孔は、ヌクレオポレーションまたはヌクレオフェクションであり得る。当業者には公知のように、電気穿孔は、細胞型ならびに組み込まれる核酸の型および性質に基づいて、エレクトロポレーター製造業者（例えば、ＡｍａｘａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｌｏｎｚａ）の推奨に従って実施することができる。一部の実施形態では、組み込まれる核酸は、ＤＮＡ、およびＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、またはｃｉｒｃＲＮＡ）であってもよく、またプラスミドＤＮＡまたはネイキッドＤＮＡであってもよい。一部の実施形態では、電気穿孔は、トランスフェクションの一形態と考えることができる。細胞数、培地、電気穿孔プログラム、および電気穿孔からの細胞の回収は、使用する細胞型および構築物ごとに最適化される。

[0248]「エピトープ」という用語には、本明細書で定義される抗体、抗体ペプチド、および／または抗体様分子（Ｔ細胞受容体を含むがこれに限定されない）に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基が含まれる。

[0249]本明細書で使用される場合の「エンゲージャー」は、特定の標的、例えば、細胞表面タンパク質、抗原、受容体などに結合するための結合ドメインを有するポリペプチド、タンパク質または複合タンパク質であり、それによって、エンゲージャーは、その標的への結合の際に、細胞と係合する。一部の実施形態では、エンゲージャーは、２つ以上の特異的結合ドメインを含むことができ、それによって、２つ以上の標的に係合することが可能であり、結合標的が２つ以上の異なる細胞に存在し２つ以上の標的細胞である場合、エンゲージャーは２つ以上の別々の細胞に係合する。一部の実施形態では、エンゲージャーは、２つの非同一標的に特異的な２つの結合ドメインを有する２つのエンゲージャーを含み得る（二重特異性エンゲージャー）。一部の実施形態では、エンゲージャーは、３つの非同一結合標的に特異的な３つの異なる結合ドメインを有する３つのエンゲージャーを含み得る（二重特異性エンゲージャー）。二重特異性または三重特異性エンゲージャーは、２つ以上の細胞型上の標的に係合する。例えば、１つの結合ドメイン（またはバインダー）は、単球またはマクロファージの細胞表面タンパク質に結合し、別の結合ドメインは、がん細胞、感染細胞または壊死細胞に結合し、それによりエンゲージャーは２つの細胞を並置し、その結果、貪食細胞は標的細胞をそこで貪食することができる。一部の実施形態では、エンゲージャーは、細胞上の細胞表面分子と係合し、細胞を活性化または非活性化することができる。結合ドメインは、他の箇所で説明されているバインダーの結合ドメインと同じ成分、またはその断片、例えば、抗原、細胞表面タンパク質、受容体などの標的分子に特異的に結合することができる、可変ドメイン、ＣＤＲもしくはＣＤＲと抗体のフレームワーク領域の組合せ、またはｓｃＦｖもしくはその断片を含み得る。

[0250]改変された細胞は、例えば遺伝子工学的方法によって、融合タンパク質、例えばＣＡＲなどの１つまたは複数の外因性タンパク質を発現するように機能を増強する操作を行った細胞であり得る。一部の実施形態では、本明細書で使用される場合の改変された細胞とは、導入遺伝子を発現するか、または遺伝子編集された骨髄性細胞を指す。一部の実施形態では、改変された細胞または改変された骨髄性細胞は、組換え融合タンパク質、例えば、貪食受容体融合タンパク質を発現する骨髄性細胞である。一部の実施形態では、本明細書で使用される場合、貪食受容体融合タンパク質（ＣＡＲ）は、貪食受容体に融合された、標的細胞の抗原に特異的な細胞外抗原結合性ドメインを含む。標的細胞は、例えば、がん細胞である。一部の実施形態では、改変された貪食細胞は、がん細胞を取り込んだ後、がん抗原をその細胞表面に提示して、Ｔ細胞を活性化することができる。

[0251]エフェクター骨髄性細胞は、骨髄性細胞または骨髄前駆細胞であり得、これは機能的に有能であり、医薬組成物を必要とする対象に医薬組成物を投与することによって、細胞療法のための医薬組成物にさらに製剤化することができる。一部の実施形態では、エフェクター骨髄性細胞は、生体試料、例えば末梢血単核細胞から単離（および／または濃縮）され、例えば、導入遺伝子を発現するように、または外因的に編集されたゲノムを含むように、また、限定するものではないが、標的細胞または病原体を特異的に貪食および排除する能力；分化誘発シグナルに応答してさらに分化する能力、活性化シグナルに応答してさらに活性化される能力を含み得る特徴を示し、比較的長持ちし、最終的に分化した骨髄性細胞と比較して長い寿命を有し、ｉｎｖｉｖｏに投与された場合にリンパ節に移動することができるように、さらに操作され得る。

[0252]「リガンド」は、受容体と複合体を形成することが可能な分子である。本開示によれば、リガンドは、例えば、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、リポタンパク質、または受容体に結合する任意の成分を意味するものと理解されたい。一部の実施形態では、受容体は、特異的リガンドを有する。一部の実施形態では、受容体は、そのリガンドへの無差別的な結合を有することが可能であり、その場合、受容体は、構造配置、電荷分布、または他の任意の物理化学的特性において少なくとも類似性を共有する複数のリガンドに結合することができる。リガンドは、生体分子であり得る。リガンドは、非生物材料であってもよく、例えば、ＴｉＯ_２はスカベンジャー受容体ＳＲＡ１のリガンドである。

[0253]本明細書で使用される場合の「貪食」とは、「食作用（ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ）」と交換可能に使用することができる。貪食のプロセスは、免疫応答と密接に関係しており、最も重要なのは、抗原提示である免疫応答の最初のステップである。外因性抗原のプロセシングは、ある種のエンドサイトーシス事象による専門の抗原提示細胞へ取り込まれた後に続く。また貪食も、抗原提示を促進する：がん抗原を含めた、貪食された細胞または病原体からの抗原はプロセシングされ、ＡＰＣの細胞表面に提示される。

[0254]がん細胞上の抗原またはエピトープに結合することをコードする組換え核酸を発現する本開示の「貪食細胞」は、がん細胞に食作用を及ぼし、それを体外に除去する。
[0255]本明細書で使用される場合の「抗体」という用語は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ならびにＩｇＹを含み、単鎖全抗体、およびその抗原結合（Ｆａｂ）断片を含めた、抗体全体を含むことを意味する。抗原結合抗体断片には、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ（ＶＨおよびＣＨ１からなる）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合可変断片（ｄｓＦｖ）、ならびにＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片が含まれる。抗体は、任意の動物起源に由来し得る。単鎖抗体を含む抗原結合性抗体断片は、可変領域（複数可）を単独で含むことができるか、または以下：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体または一部と組み合わせて含むことができる。可変領域（複数可）およびヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの任意の組合せも含まれる。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ならびにヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体であってもよく、これらは、例えば、ＨＬＡ結合ポリペプチドまたはＨＬＡ－ペプチド複合体に特異的に結合する。当業者には、可溶性タンパク質、例えば、膜からタンパク質分解的に切断された、可溶性ＨＬＡ－ペプチド複合体または膜結合ＨＬＡ結合ポリペプチドを濃縮するのに様々な免疫親和性技術が適していることは理解されよう。これらには、（１）可溶性タンパク質に特異的に結合することが可能な１つまたは複数の抗体が、固定基質または可動基質（例えば、プラスチックウェルまたは樹脂、ラテックスまたは常磁性ビーズ）に固定化される技術、および（２）生体試料からの可溶性タンパク質が、抗体をコーティングした基質を通過し、可溶性タンパク質をその抗体に結合させる技術が含まれる。抗体および結合した可溶性タンパク質を有する基質を溶液から分離し、必要に応じて、抗体および可溶性タンパク質を、例えば、抗体を浸漬した溶液のｐＨおよび／またはイオン強度および／またはイオン組成を変えることによって分離させる。あるいは、抗体と可溶性タンパク質を組み合わせて、巨大分子凝集体を形成させる免疫沈降技術が使用され得る。巨大分子凝集体は、サイズ排除技術または遠心分離によって、溶液から分離され得る。

[0256]「ペプチド」または「ポリペプチド」は交換可能に使用することができ、本明細書で使用される場合、限定するものではないが、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞タンパク質または膜タンパク質を含む「タンパク質」であり得る。ポリペプチドは、タンパク質の１つまたは複数のサブユニットを含み得る。ポリペプチドは、組換え核酸によってコードされ得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、単一のアミノ酸鎖中に２つ以上のペプチドを含むことができ、これは、スペーサー、リンカーまたはペプチド切断配列によって単離され得る。ポリペプチドは、融合ポリペプチドであり得る。ポリペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数のドメインを含み得る。ドメインは、定義された機能を有するタンパク質の構造上の一部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、ポリペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数のモジュールを含み得る。モジュールとは、ドメインまたは特定の機能を有するドメインの一部分またはタンパク質の一部分である。モジュールは、その構造的な実施形態によって指定される、タンパク質の構造モジュールであり得る。部分（ｍｏｉｅｔｙ）は、特定の構造を有するか、または特定の機能を果たす、ポリペプチド、タンパク質、または核酸の一部分である。例えば、シグナル伝達部分は、ポリペプチドまたはタンパク質または組換え核酸のより大きな構造内の特定のユニットであり、これは（または核酸の場合にはそれによってコードされているタンパク質の一部分）、シグナル伝達プロセス、例えばリン酸化に関与する。モジュール、ドメイン、および部分は、本明細書で使用される場合、特定の構造的または機能的配向が、本文中で別途定義されていない限り、交換可能に使用され得る。モチーフは、生体分子の構造実体である。タンパク質またはポリペプチドのシグナル伝達モチーフとは、例えば、リン酸化、脱リン酸化され得るか、または別のシグナル伝達分子の結合部位として機能し得るアミノ酸を含有するタンパク質またはポリペプチド上のひと続きのアミノ酸を指す。同様に、核酸の場合、例えば、ＴＮＦｍＲＮＡは、ジンクフィンガー結合タンパク質３６ファミリーメンバーなどのｍＲＮＡ不安定化酵素が結合する３’ＵＴＲ中の保存されたモチーフ、ＵＵＡＵＵＵＡＵＵを有する。

[0257]「受容体」は、リガンドに結合することが可能な生体分子または分子群を意味するものと理解されたい。受容体は、細胞外ドメインを通じて、例えば、細胞外ドメインが結合することが可能な物質（例えば、細胞外標的結合ドメイン）との接触を介して、情報を受け取った細胞膜結合分子であり得る。受容体は、細胞、細胞形成、または生物において情報を伝達する役割を果たし得る。一部の実施形態では、受容体は、細胞膜貫通ドメインである膜貫通ドメインに作動可能に連結された、細胞外ドメイン、または２つ以上の細胞外ドメインを含み得る。一部の実施形態では、受容体は、細胞内ドメイン、または２つ以上の細胞内ドメインを含み得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞内ドメインは、膜貫通ドメインの細胞質末端に作動可能に連結されることが可能であり、これは、次に、受容体の細胞外ドメインに連結される。一部の実施形態では、細胞外結合ドメインに標的（例えば、リガンド）が結合すると、受容体が「活性化」され、その結果、受容体の１つまたは複数のドメインが構造的変化または化学的変化を受け、次に、細胞内にいくつかの生化学的変化、例えば、細胞の活性化、サイトカイン放出の活性化、または貪食の誘導、または例えば、細胞の非活性化、アポトーシスの誘導を誘導することができる。構造変化は、受容体がオリゴマー化するように、膜貫通領域もしくは別の細胞外領域、またはそれらの断片で起こり得る。一部の実施形態では、リガンドの会合または標的との結合の際に、細胞内ドメインは、リン酸化、脱リン酸化、ユビキチン化、または任意の他の生化学的もしくは立体配座的変化、またはそれらの組合せを受け、細胞内シグナル伝達を誘導することができる。そのようなドメインは、一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインと呼ばれ得る。受容体は、少なくとも１つの受容体ユニットを含み、２つ以上の受容体ユニットを含むことができ、各受容体ユニットは、タンパク質分子、例えば、糖タンパク質分子からなり得る。受容体は、リガンドの構造を補完する構造を有し、結合パートナーとしてリガンドを複合体化することができる。シグナル伝達情報は、細胞表面のリガンドと結合した後の受容体の構造的変化によって伝達され得る。本開示によれば、受容体は、リガンド、例えば、適切な長さのペプチドまたはペプチド断片と受容体／リガンド複合体を形成することが可能なＭＨＣクラスＩおよびＩＩのタンパク質を指すことができる。

[0258]「特異的に結合する」とは、分子（例えば、ポリペプチド）を認識して結合するが、試料、例えば、生体試料中の他の分子を実質的に認識および結合しない化合物（例えば、ペプチド）を指す。

[0259]「組換え核酸」という用語は、組換えクローニング技術によって作製された核酸を指す。組換え核酸は、実験室で合成され得る。組換え核酸は、ＤＮＡの酵素的修飾、例えば、制限酵素消化、ライゲーション、およびＤＮＡクローニングなどを使用することによる組換えＤＮＡ技術を使用することによって調製することができる。本明細書で使用される場合の組換え核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。組換えＤＮＡをｉｎｖｉｔｒｏで転写してメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を生成することができ、組換えｍＲＮＡを単離、精製し、細胞をトランスフェクトするために使用することができる。組換え核酸は、タンパク質またはポリペプチドをコードし得る。組換え核酸は、適切な条件下で、生細胞に組み込むことができ、生細胞内で発現され得る。本明細書で使用される場合、核酸の「発現」とは、通常、核酸の転写および／または翻訳を指す。核酸発現の産物は、通常、タンパク質であるが、ｍＲＮＡでもあり得る。組換え核酸を組み込んだ細胞で組換え核酸によってコードされているｍＲＮＡが検出されることは、その核酸が細胞内で「発現される」ことの確かな証拠と考えられる。

[0260]核酸を細胞に挿入または組み込むプロセスは、形質転換、トランスフェクション、または形質導入を介し得る。形質転換は、細菌細胞による外来核酸の取り込みのプロセスである。このプロセスは、プラスミドＤＮＡの増殖、タンパク質生産、および他の適用に適している。形質転換は、環境から細胞外ＤＮＡを取り込むコンピテント細菌細胞に組換えプラスミドＤＮＡを導入する。一部の細菌種は、特定の環境条件下で自然にコンピテント化されるが、コンピテンスは、実験室設定で人工的に誘導される。トランスフェクションとは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体などの小分子を真核細胞に強制的に導入することである。少々紛らわしいが、「トランスフェクション」は、バクテリオファージを細菌細胞に導入することも指す。「形質導入」は、主に、組換えウイルスベクター粒子を標的細胞に導入することを説明するために使用されるが、「感染」は、野生型ウイルスによるヒトまたは動物の自然感染を指す。

[0261]「ベクター」という用語は、異種核酸の発現を輸送または媒介することが可能な核酸分子を指す。プラスミドは、「ベクター」という用語に包含される属の一種である。ベクターとは、通常、宿主細胞における複製および／または維持に必要な複製起点および他の実体を含む核酸配列を指す。作動可能に連結されている遺伝子および／または核酸配列の発現を方向付けることが可能なベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、有用性の発現ベクターは、多くの場合「プラスミド」の形態であり、これはベクター形態では、染色体に結合されておらず、典型的には、安定的なもしくは一過性の発現のための実体またはコードされたＤＮＡ含む、環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。本明細書に開示の方法で使用することができる他の発現ベクターには、限定するものではないが、プラスミド、エピソーム、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージまたはウイルスベクターが含まれ、そのようなベクターは、宿主のゲノムに組み込まれるか、または細胞内で自律的に複製することができる。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。同等の機能を果たす当分野で公知の他の形態の発現ベクター、例えば、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込むことが可能なベクターも使用することができる。例示的なベクターは、それらが連結されている核酸の自律的複製および／または発現が可能なベクターである。

[0262]融合タンパク質に関して使用される場合の「スペーサー」または「リンカー」という用語は、融合タンパク質を含むタンパク質を結合するペプチドを指す。一般に、スペーサーは、タンパク質またはＲＮＡ配列間を連結し、または最小限の距離もしくは他の空間的関係を維持すること以外には、特定の生物活性を有していない。しかし、一部の実施形態では、スペーサーの構成アミノ酸は、分子のいくつかの特性、例えば、分子のフォールディング、正味電荷、または疎水性に影響を及ぼすように選択することができる。本開示の一実施形態で使用するのに適したリンカーは、当業者に周知であり、また、限定するものではないが、直鎖または分枝鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれる。リンカーは、一部の実施形態では、各抗原ペプチドが適切にフォールドされることを確実にするのに十分な距離だけ２つの抗原ペプチドを離すために使用される。例示的なペプチドリンカー配列は、可動性の拡張型コンフォメーションを採用し、順序だった二次構造を形成する傾向を示さない。可動性タンパク質領域の典型的なアミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒが含まれる。Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の実際のすべての順列は、リンカー配列についての上記の基準を満たすことが期待される。他の中性に近いアミノ酸、例えば、ＴｈｒおよびＡｌａもリンカー配列に使用することができる。

[0263]本明細書で使用される場合、「決定する」、「評価する」、「分析する」、「測定する」、「検出する」という用語、およびそれらの文法的な等価物は、定量的および／または定性的な決定を指し得る。定量的な決定が意図される場合、分析物の「量を測定する」などの句を使用することができる。定性的および／または定量的な決定が意図される場合、分析物の「レベルを決定する」または分析物を「検出する」という句を使用することができる。

[0264]「単離された」、「精製された」、「生物学的に純粋な」という用語、およびそれらの文法的な等価物は、通常、その天然の状態で確認されるようなそれに付随する成分から様々な程度にまで排除されている物質を指し得る。「単離」とは、元の供給源または周囲からの分離の程度を示す。「精製」とは、単離または濃縮よりも分離が高いことを示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、他の物質を十分に排除しており、その結果、不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を与えず、他の有害な結果を引き起こさない。すなわち、本開示の核酸またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって生成される場合には細胞物質、ウイルス物質、もしくは培養培地を、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないならば、精製されている。純度および均質性は、通常、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどを使用して決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１本のバンドを生じさせることを示し得る。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化などを受けることができるタンパク質の場合、異なる修飾によって異なる単離されたタンパク質が生じる可能性があり、これらは別々に精製することができる。

[0265]「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、または一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖形態のいずれかのそれらのアナログを指し得る。ポリヌクレオチドは、細胞にとって外因性または内因性であり得る。ポリヌクレオチドは、無細胞環境下に存在し得る。ポリヌクレオチドは、遺伝子またはその断片であり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有していてもよく、既知または未知の任意の機能を果たし得る。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアナログ（例えば、変更された骨格、糖、または核酸塩基）を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与することができる。アナログの一部の非限定的な例には、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コーディセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に結合したローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧアイランド、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウルジン、ジヒドロウリジン、クエオシン、およびウイオシンが含まれる。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される座位（遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｅＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む無細胞ポリヌクレオチド、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。

[0266]本明細書で使用される場合の「標的ポリヌクレオチド」および「標的核酸」という用語は、本開示の核酸編集部分によって標的とされる核酸またはポリヌクレオチドを指し得る。例えば、「標的核酸」は、本明細書に記載の核酸切断部分を含む核酸組込み部分によって標的化され得る。標的核酸はＤＮＡであり得る。標的核酸はＲＮＡであり得る。標的核酸は、染色体配列または染色体外配列（例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列など）を指し得る。標的核酸は、単一のヌクレオチド置換によって核酸試料中の任意の他の配列に関連していなくてもよい核酸配列であり得る。標的核酸は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド置換によって核酸試料中の任意の他の配列に関連していなくてもよい核酸配列であり得る。一部の実施形態では、置換は、標的核酸の５’末端の５、１０、１５、２０、２５、３０、または３５ヌクレオチド内では起こり得ない。一部の実施形態では、置換は、標的核酸の３’末端の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５ヌクレオチド内では起こり得ない。一般に、「標的配列」という用語は、標的核酸の一本鎖上の核酸配列を指す。標的配列は、遺伝子の一部、制御配列、ゲノムＤＮＡ、ｃｆＤＮＡおよび／またはｃｆＲＮＡを含む無細胞核酸、ｃＤＮＡ、融合遺伝子、ならびにｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡなどを含むＲＮＡであり得る。

[0267]本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡなどのＤＮＡ）、ならびにＲＮＡ転写物のコード化に関与するその対応するヌクレオチド配列を指し得る。ゲノムＤＮＡに関して本明細書で使用される場合の用語は、介在する非コード領域ならびに制御領域を含み、５’末端および３’末端を含み得る。一部の使用では、この用語は、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域（５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲ）、エクソンならびにイントロンを含む転写された配列を包含する。一部の遺伝子では、転写された領域には、ポリペプチドをコードする「オープンリーディングフレーム」を含有する。この用語の一部の使用では、「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするために必要なコード配列（例えば、「オープンリーディングフレーム」または「コード領域」）のみを含む。一部の場合には、遺伝子はポリペプチドをコードしておらず、例えば、リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）および転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）遺伝子などである。一部の場合には、「遺伝子」という用語は、転写された配列だけでなく、さらに、上流および下流の制御領域、エンハンサーおよびプロモーターを含む非転写領域も含む。遺伝子は、「内因性遺伝子」または生物のゲノム内の天然の位置にある天然遺伝子を指し得る。遺伝子は、「外因性遺伝子」または非天然遺伝子を指してもよい。非天然遺伝子は、通常、宿主生物では確認されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子を指し得る。非天然遺伝子は、生物のゲノム内の天然の位置にない遺伝子も指し得る。非天然遺伝子はまた、変異、挿入および／または欠失を含む天然に存在する核酸またはポリペプチド配列（例えば、非天然配列）も指し得る。

[0268]「ゲノム編集」という用語は、細胞のゲノム内の１つまたは複数のヌクレオチドを変更することを指し得る。細胞は、ｉｎｖｉｖｏであり得る。細胞は、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏであり得る。ゲノム編集方法の非限定的な例には、ＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子修飾ポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、もしくは他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターおよびヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、発現ベクター、トランスポゾン系（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ）、またはそれらの任意の組合せが含まれる。デザイナージンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼは、標的ゲノム摂動を生成するために利用され得る。

[0269]標的ゲノム編集は、ＣａｓまたはＣａｓ様エンドヌクレアーゼを使用するＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子修飾を介して可能である。ＳＰＩＤＲ（ＳＰａｃｅｒＩｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄＤｉｒｅｃｔＲｅｐｅａｔｓ）としても公知である、ＣＲＩＳＰＲ（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ）は、通常、特定の細菌種に特異的なＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌で認識された異なるクラスの散在性短鎖配列反復（ＳＳＲ）と関連遺伝子から構成されている。

[0270]「導入遺伝子」という用語は、細胞に導入される任意の核酸分子を指し得る。導入遺伝子を受け入れた後に得られた細胞は、トランスジェニック細胞と呼ばれる。導入遺伝子は、トランスジェニック生物またはトランスジェニック細胞に対して部分的もしくは全体的に異種である（すなわち、外来性である）遺伝子を含み得るか、または生物もしくは細胞の内因性遺伝子に相同な遺伝子を表し得る。一部の場合には、導入遺伝子には、任意のポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチドまたはタンパク質をコードする遺伝子、阻害性ポリヌクレオチドに転写されるポリヌクレオチド、または転写されない（例えば、転写を駆動するプロモーターなどの発現調節エレメントを欠失する）ポリヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態では、導入遺伝子または外来ポリヌクレオチドは、部位特異的組換えプロセスによって、ゲノム内に安定的に組み込まれるように細胞に導入され得る。本明細書で交換可能に使用される場合の「組換え」または「ＤＮＡ組換え」という用語は、一般に、２つの異なるポリヌクレオチド配列からの核酸断片が交換されるプロセスを指し得る。組換えには、２本のＤＮＡ鎖間のＤＮＡセグメントの切断および交換が含まれ得る。組換えは、組換え部分、例えば、小分子またはポリペプチド、例えば酵素によって制御され得る。一例では、組換えは、少なくとも１、２、３、４、５つまたはそれ以上の酵素によって制御され得る。組換えは、最大５、４、３、２、または１つの酵素によって制御され得る。ＤＮＡ組換えを実施または促進する１つまたは複数の酵素は、切断（切除）を作製するステップ、交換鎖を切断部位に近づけるステップ、既存の鎖を除去するステップ、切断した端部を封鎖またはライゲーションするステップを実施する単一または複数の酵素であり得る。１つまたは複数の酵素は、例えば、切断を作製するための１つまたは複数のエンドヌクレアーゼと；ライゲーション用の１つまたは複数のリガーゼを含み得る。ＤＮＡ組換えは、リコンビナーゼによって行われ得る。本明細書で交換可能に使用される場合の「配列特異的組換え」および「部位特異的組換え」という用語は、組換え部分（例えば、酵素）、例えば、短鎖核酸部位または「配列特異的リコンビナーゼ標的部位」、すなわちリコンビナーゼ認識部位を認識して結合し、これらの部位に関して核酸の組換えを触媒するリコンビナーゼによって行われる機能を指す。これらの酵素には、リコンビナーゼ、トランスポサーゼ、およびインテグラーゼが含まれ得る。「配列特異的リコンビナーゼ標的部位」、「部位特異的リコンビナーゼ標的部位」、「配列特異的標的部位」および「部位特異的標的部位」という用語は、配列特異的または部位特異的リコンビナーゼによって認識され、部位特異的組換え事象の際に交差領域になる、短鎖核酸部位または配列、すなわちリコンビナーゼ認識部位を指し得る。配列特異的リコンビナーゼ標的部位の例には、限定するものではないが、ｌｏｘ部位、ａｔｔ部位、ｄｉｆ部位およびｆｒｔ部位が含まれる。Ｃｒｅ／ｌｏｘシステムは、ＤＮＡの配列特異的組換えに頻繁に使用される。Ｃｒｅリコンビナーゼは、２つの離れたＣｒｅ認識配列、すなわちｌｏｘＰ部位間の交差によって部位特異的組換えを触媒する、Ｃｒｅ／ｌｏｘシステムの制御因子である。ｌｏｘＰ部位とは、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ遺伝子の産物であるＣｒｅリコンビナーゼが部位特異的組換え事象を触媒することができるヌクレオチド配列を指す。ｌｏｘＰ部位には、８ｂｐのスペーサー配列によって分離された２つの１３ｂｐの逆方向反復配列が含まれる。２つの３４ｂｐのｌｏｘＰ配列間に導入される任意のＤＮＡ配列（「ｆｌｏｘｅｄ」ＤＮＡと呼ばれる）は、Ｃｒｅ媒介性組換えの理由により切除される。Ｃｒｅリコンビナーゼの存在は、第１および第２のポリヌクレオチド配列の交換に必要である。

[0271]トランスポゾン、または転位性エレメント（ＴＥ）は、トランスポサーゼとして公知の酵素を使用することにより遺伝物質をゲノムに転位させる能力を有する遺伝エレメントである。哺乳動物ゲノムは、多数の転位性エレメント（ＴＥ）由来の配列を含有しており、我々のゲノムの最大７０％までがＴＥ由来の配列を示す（ｄｅＫｏｎｉｎｇら２０１１；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら２０１５）。これらのエレメントを利用して、細胞のゲノムに遺伝物質を導入することができる。ＴＥエレメントは、ゲノム内の「ジャンピング」遺伝物質と呼ばれることが多い、動員が可能である。ＴＥは、一般に、真核生物のゲノム中に可逆的に不活性で、後成的に発現抑制された形態で存在する。

[0272]「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」という用語は、非ウイルスまたはウイルスベースの方法による細胞への核酸の導入を指す。核酸分子は、完全タンパク質またはその機能的部分をコードする遺伝子配列であり得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、１８．１～１８．８８を参照されたい。

[0273]「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ転写物などに）転写される１つまたは複数のプロセス、および／またはｍＲＮＡなどのＲＮＡがペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指し得る。転写物およびコードされたポリペプチドは、総称して「遺伝子産物」と呼ぶことができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。発現に関して、「上方調節された」とは、野生型状態でのその発現レベルと比較して、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）および／またはポリペプチド配列の発現レベルの増加を指し、一方、「下方調節された」とは、野生型状態でのその発現と比較して、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）および／またはポリペプチド配列の発現レベルの低下を指す。トランスフェクトされた遺伝子の発現は、細胞内で一過的に、または安定的に起こり得る。「一過的発現」の際、トランスフェクトされた遺伝子は、細胞分裂中に娘細胞に導入されない。その発現は、トランスフェクトされた細胞に限定されているので、遺伝子の発現は、時間の経過とともに失われる。反対に、トランスフェクトされた遺伝子の安定的発現は、その遺伝子が、トランスフェクトされた細胞に選択の利点を付与する別の遺伝子と同時トランスフェクトされた場合に起こる場合がある。そのような選択の利点は、細胞に提示されるある特定の毒素に対する耐性であり得る。トランスフェクトされた遺伝子を発現させる必要がある場合、本出願はコドン最適化配列の使用を意図する。コドン最適化配列の例は、真核生物、例えば、ヒトにおける発現に対して最適化された（すなわち、ヒトにおける発現のために最適化された）配列、または別の真核生物、動物もしくは哺乳動物に対して最適化された配列であり得る。ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化、または特定の臓器に対するコドン最適化は、公知である。一部の実施形態では、タンパク質をコードするコード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現に対してコドン最適化され得る。真核細胞は、本明細書で論じられているヒト、または非ヒト真核生物もしくは動物もしくは哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、または非ヒト哺乳動物もしくは霊長類を含むがこれらに限定されない、植物または哺乳動物などの特定の生物のもの、またはそれに由来するものであり得る。コドン最適化とは、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然の配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれ以上のコドン）を、その宿主細胞の遺伝子でより頻繁に、または最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、目的の宿主細胞における発現を増強するために核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用の違い）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関する場合が多く、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存していると考えられる。細胞内で選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映し得る。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現について調整され得る。コドン使用表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン使用データベース」で容易に利用することが可能であり、これらの表は、いくつかの方法で適合され得る。特定の宿主細胞における発現に対する特定の配列を最適化するコドンのコンピューターアルゴリズム、例えば、ＧｅｎｅＦｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、ＰＡ）なども利用することができる。

[0274]「発現カセット」、「発現構築物」または「発現ベクター」という用語は、コード配列および鋳型配列などのヌクレオチド配列、ならびにコード配列の発現に必要な配列を含む核酸を指す。発現カセットは、ウイルス性であってもよく、または非ウイルス性であってもよい。例えば、発現カセットは、宿主細胞に導入された場合、それぞれ、ＲＮＡまたはポリペプチドの転写および／または翻訳をもたらす核酸構築物を含む。翻訳されない、または翻訳できないアンチセンス構築物またはセンス構築物は、この定義に明示的に含まれる。当業者には、挿入されたポリヌクレオチド配列が同一である必要はなく、それが由来する遺伝子の配列と実質的に類似しているだけでもよいということが認識されよう。

[0275]本明細書で使用される場合の「プラスミド」は、非ウイルス発現ベクター、例えば、遺伝子の発現に必要な遺伝子および／または制御エレメントをコードする核酸分子を指し得る。本明細書で使用される場合の「ウイルスベクター」は、別の核酸を細胞に輸送することが可能なウイルス由来の核酸を指す。ウイルスベクターは、適切な環境に存在する場合、ベクターによって運ばれる１つまたは複数の遺伝子によってコードされている１つまたは複数のタンパク質の発現を方向付けることができる。ウイルスベクターの例には、限定するものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。

[0276]本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、細胞内のコード配列の転写を駆動することが可能なポリヌクレオチド配列を指し得る。したがって、本開示のポリヌクレオチド構築物において使用されるプロモーターには、遺伝子の転写のタイミングおよび／または速度を制御するか、またはモジュレートすることに関与するシス作用性転写制御エレメントおよび制御配列が含まれる。例えば、プロモーターは、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組込み配列、５’および３’非翻訳領域、またはイントロン配列を含む、シス作用性転写制御エレメントであってもよく、これらは転写制御に関与している。これらのシス作用性配列は、典型的には、タンパク質または他の生体分子と相互作用して、遺伝子転写を行う（オン／オフする、制御する、モジュレートするなど）。「構成的プロモーター」は、ほぼすべての組織型において転写を開始することが可能なプロモーターであり得る。「組織特異的プロモーター」は、１つまたはいくつかの特定の組織型で転写を開始することができる。「誘導性プロモーター」は、特定の環境条件、発生条件、または薬物もしくは化学的条件下でのみ、転写を開始するプロモーターであり得る。例示的な誘導性プロモーターは、ドキシサイクリンまたはテトラサイクリン誘導性プロモーターであり得る。テトラサイクリン制御プロモーターは、ｔｅｔ－ｏｎおよびｔｅｔ－ｏｆｆシステムと呼ばれる、テトラサイクリン誘導性またはテトラサイクリン抑制性の両方であり得る。ｔｅｔ制御システムは、すなわちテトラサイクリン制御レギュレーター（トランス活性化因子とも呼ばれる）（ｔＴＡまたはｒｔＴＡ）と、テトラサイクリン依存的に下流のｃＤＮＡの発現を制御するｔＴＡ／ｒｔＴＡ依存プロモーターの２つの構成要素に依存している。ｔＴＡは、大腸菌のＴｎ１０テトラサイクリン耐性オペロンのリプレッサーと、単純ヘルペスウイルスのタンパク質１６（ＶＰ１６）のカルボキシル末端部分とを含む融合タンパク質である。ｔＴＡ依存プロモーターは、ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列（７つの同族オペレーター配列のアレイ）に融合した最小ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターからなる。この融合は、真核細胞においてｔｅｔリプレッサーを強力な転写活性化因子に変換する。テトラサイクリンまたはその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）が存在しない場合、ｔＴＡは、ｔｅｔＯ配列に結合し、ｔＴＡ依存プロモーターの転写活性化を可能にする。しかし、ドキシサイクリンが存在する場合、ｔＴＡは、その標的と相互作用することができず、転写は起こらない。ｔＴＡを使用するｔｅｔシステムは、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンが転写の下方調節を可能にすることから、ｔｅｔ－ＯＦＦと呼ばれる。反対に、ｔｅｔ－ＯＮシステムでは、ｒｔＴＡと呼ばれるｔＴＡの変異型がランダム変異誘発を使用して単離されている。ｔＴＡとは対照的に、ｒｔＴＡは、ドキシサイクリンの非存在下では機能しないが、トランス活性化にはリガンドの存在を必要とする。

[0277]「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認もしくは認可されたもの、または米国薬局方もしくはヒトを含む動物において使用するための他の一般的に認められた薬局方に記載されているもの指し得る。「薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤」は、物質ととともに対象に投与することができ、その薬理活性を破壊することなく、物質の治療量を送達するのに十分な用量で投与された場合に無毒である、賦形剤、担体または希釈剤を指し得る。「薬学的に許容される塩」は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なく、ヒトまたは動物の組織と接触して使用するのに適していると当分野で一般に考えられている酸または塩基の塩であり得る。そのような塩には、アミンなどの塩基性残基の無機塩および有機酸塩、ならびにカルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩が含まれる。特定の医薬塩には、限定するものではないが、塩酸、リン、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、２－アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、アルカン酸、例えば、酢酸、ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは０～４である）などが含まれる。同様に、薬学的に許容されるカチオンには、限定するものではないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、およびアンモニウムが含まれる。当業者には、本明細書で提供されるプールされた疾患特異的抗原のためのさらに薬学的に許容される塩は、本開示と、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈ編、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、ｐ．１４１８（１９８５）にリストされているものを含めた当分野での知識から理解されよう。

[0278]一部の場合には、外因性物質で細胞を操作することは、異種遺伝子または核酸を細胞に組み込むことを指し得る。一部の場合には、操作することは、細胞を活性化するためにペプチドまたは小分子などの物質を添加することを指し得る。

[0279]本明細書で使用される場合の「実質的に」は、「相当に」または「完全に」を指すことができ、既知の、比較可能な、または期待される結果と比較してのみ定量化可能な文脈において設定され得る。例えば、実質的に少ないＴ細胞試料は、８０％以上のＴ細胞を含む比較試料と比較して、２０％未満を含む場合の試料を指すことができる。同様の文脈における「実質的に欠如している」とは、１０％未満または５％未満または約０％のＴ細胞であり得る。

[0280]「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置された」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置」などの用語は、それに関連する障害および／または症状（例えば、新生物または腫瘍または感染性物質または自己免疫疾患）を軽減、予防、または改善することを指すことを意味する。「処置する」とは、疾患（例えば、がん、または感染性物質による感染、または自己免疫疾患）の発症、または発症が疑いの後に、対象に本治療を施すことを指し得る。「処置する」には、「緩和」の概念が含まれ、これは、疾患および／または治療に伴う副作用に関連する任意の症状または他の悪影響の発生頻度もしくは再発頻度、または重症度を軽減することを指す。「処置する」という用語はまた、患者の疾患または障害の重症度を軽減すること、例えば、疾患を有する患者の寿命を延ばすこと、または生存能力を延ばすこと、またはその再発を遅らせること、例えば、疾患に罹患している患者の寛解期間を長くすることを指す「管理」の概念も包含している。排除されるものではないが、障害または状態を処置することは、それに関連する障害、状態、または症状が完全に除去されることを必要としないと理解されたい。

[0281]本明細書で使用される場合の「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防」という用語およびそれらの文法的な等価物は、物質または化合物の投与が開始された時点で、そのような症状を発症していない対象における疾患または状態に関連する症状の発症を回避または遅延させることを意味し得る。

[0282]「治療効果」という用語は、障害（例えば、新生物、腫瘍、もしくは感染性物質による感染、もしくは自己免疫疾患）またはそれに関連する病態の１つまたは複数の症状がある程度緩和されることを指し得る。本明細書で使用される「治療有効量」は、細胞または対象への単回投与または複数回投与の際、そのような障害を有する患者の生存能力を延ばし、その障害の１つまたは複数の兆候または症状を軽減し、予防または遅延させ、その処置をしない場合に予想されること以上の有効性がある物質の量を指し得る。「治療有効量」は、治療効果を達成するために必要な量を得るものとする。当分野の通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる医薬組成物の「治療有効量」（例えば、ＥＤ５０）を容易に決定し、処方することができる。

[0283]がんは、本開示において排他的に詳細に記載されている１つの例示的な実施形態であるが、本明細書に記載の方法および技術は、体内の感染細胞または他の罹患細胞を標的とするのに有用であると考えられる。同様に、改変された細胞を使用する治療用組成物およびワクチン組成物が本明細書に記載されている。

免疫療法のための骨髄細胞
[0284]一態様では、本出願は有効な免疫療法、例えば有効なワクチン接種のために使用することができる骨髄細胞のサブセットに注目する。本明細書において、有効な免疫療法のために使用することができる骨髄細胞のサブセットを単離または富化し、選択し、富化し、機能アッセイによって検証する方法が提供される。一態様では、エフェクター骨髄細胞を生成するために適切にさらに改変することができる骨髄細胞のサブセットの同定および単離または富化の方法が本明細書で提供される。

[0285]免疫療法で広く現在使用されている骨髄細胞は、抗原提示樹状細胞または活性化成熟マクロファージである。抗原提示ＤＣまたは活性化マクロファージは、細胞が末期であり、それらの増殖限界に到達しており、さらに分裂することができなく、短寿命であり、消耗しており、ｉｎｖｉｖｏの循環内での励起が劣っているのでｉｎｖｉｖｏ移入のために治療的に有効になることがしばしばできない。一部の場合には、そのような細胞は、組織環境の中で作動する場合は任意の導入遺伝子を十分に発現しないか、またはそれらは導入遺伝子発現を全部失うことがある。一部の場合には、ＤＣまたは活性化マクロファージは乏しい移動を示すことがあり、リンパ節にアクセスすることができず、したがって、リンパ節中でナイーブＴ細胞を活性化することによって誘発することができる適応免疫結果を活性化することにおいてより有効でない。

[0286]他方、有効な免疫療法は、細胞、好ましくは適用対象の骨髄細胞が柔軟であるべきであり、柔軟性を損なうことなく工学操作することができ、例えば細胞中で導入遺伝子を発現することができ、緊張性シグナル伝達を示すことができず、組織微小環境だけで活性化することができ、ｉｎｖｉｖｏで有効な移動を示すことができ、リンパ節にアクセスしてリンパ球を活性化して、活性適応性免疫応答を起こさせることができることを必要とする。

[0287]上記のために、さらに操作して有効な免疫療法のために使用することができる骨髄細胞を生成するために、正しい細胞集団を特定することが重要である。
[0288]一部の実施形態では、骨髄細胞は前駆体細胞である。一部の実施形態では、骨髄細胞は、それを必要とする対象に投与する前に形質転換も活性化もされない。一部の実施形態では、骨髄は、対象に投与する時点で緊張性シグナル伝達を示さない。一部の実施形態では、細胞はエフェクター細胞に分化することができ；投与後に対象の患部に浸潤するかもしくは投与後に対象の患部に移動することができ；または投与後に対象において少なくとも５日間の寿命を有する。

[0289]一部の実施形態では、骨髄細胞は、対象に投与する前に、または外部の刺激により、例えばサイトカイン、または増殖因子で、または食作用の標的の存在下でｅｘｖｉｖｏで活性化する前に低い食作用を示す。一部の実施形態では、骨髄細胞は、対象に投与する前に、または外部の刺激により、例えばサイトカイン、または増殖因子で、または食作用の標的の存在下でｅｘｖｉｖｏで活性化する前に中等度の食作用を示す。一部の実施形態では、骨髄細胞は、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＴＮＦ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１またはその組合せのいずれか１つまたは複数への応答性を示す。

[0290]一部の実施形態では、骨髄細胞は、外部の刺激により、例えばサイトカイン、または増殖因子で、または食作用の標的の存在下でｅｘｖｉｖｏで活性化された後に増強した食作用を示す。一部の実施形態では、骨髄細胞は、外部の刺激により、例えばサイトカイン、または増殖因子で、または食作用の標的の存在下でｅｘｖｉｖｏで活性化された後に、成熟した活性化後マクロファージなどの活性化された最終分化骨髄細胞と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．５倍、１．７倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１４倍、１７倍、２０倍、またはそれ以上増強された食作用を示す。一部の実施形態では、骨髄細胞は、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＴＮＦ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１またはその組合せのいずれか１つまたは複数によって例示されるサイトカインまたはケモカインへの応答性を示す。

[0291]一部の実施形態では、骨髄細胞はｅｘｖｉｖｏで操作することができる。ｅｘｖｉｖｏで操作することは、限定されずに、骨髄細胞の遺伝子操作、骨髄細胞で導入遺伝子を発現させること、骨髄細胞を核酸と接触させること、骨髄細胞を化学的または小さい分子と接触させること、骨髄細胞をサイトカイン、増殖因子、ケモカイン、接触刺激、熱刺激またはその組合せで活性化することを含むことができる。

[0292]一部の実施形態では、骨髄細胞は、ｅｘｖｉｖｏで操作した後に、活性化前および分化前の骨髄細胞、例えば類似の状況下の成熟したマクロファージ細胞のそれと比較してより長い寿命を示し、それは、例えば、少なくとも２４時間より長く、４８時間より長く、５０時間より長く、５５時間より長く、６０時間より長く、７０時間より長く、８０時間より長く、９０時間より長く、１００時間より長く、１１０時間より長く、１２０時間より長く、１３０時間より長く、１４０時間より長く、１５０時間より長く、１６０時間より長く、１７０時間より長く、１８０時間より長く、１９０時間より長く、２００時間より長く、２１０時間より長く、２２０時間より長く、２３０時間より長く、２４０時間より長く、２５０時間より長く、３００時間より長く、３５０時間より長く、４００時間より長く、５００時間より長く、１０００時間より長くてもよい。

[0293]一部の実施形態では、骨髄細胞は、それを必要とする対象に投与する前に細胞柔軟性（ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を示す。一部の実施形態では、骨髄細胞は、それを必要とする対象に投与する前に、活性化されたおよび／または成熟した細胞に自然発生的に形質転換されず、または形態も生理も変更されず、または進行した加齢も示さない。一部の実施形態では、骨髄細胞は細胞分裂が可能であってよい。

[0294]一部の実施形態では、骨髄細胞は一次細胞である。一部の実施形態では、骨髄細胞は、ｅｘｖｉｖｏで形質転換される形質転換細胞である。一部の実施形態では、骨髄細胞は幹細胞ではない。一部の実施形態では、骨髄細胞はｅｘｖｉｖｏで工学操作することができる。

[0295]一部の実施形態では、骨髄細胞は、化学向性アッセイによって決定されるように、化学向性刺激、例えば走化剤、ケモカインに応答して、活性化マクロファージと比較してより高い化学向性を示す。一部の実施形態では、骨髄細胞は、化学向性アッセイによって決定されるように、化学向性刺激、例えば走化剤、ケモカインに応答して、活性化マクロファージなどの活性化された末期分化骨髄細胞と比較して少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍より高い化学向性を示す。

[0296]一部の実施形態では、骨髄細胞はドナーなどのヒト対象から単離される。一部の実施形態では、骨髄細胞は、細胞集団の中の骨髄細胞の割合を上げるために富化される。
[0297]一部の実施形態では、骨髄細胞は自家である。一部の実施形態では、骨髄細胞は同種異系である。

[0298]一態様では、本明細書で、治療的に有効な骨髄細胞の生成のために好適である骨髄細胞のためにさらに富化される、ヒト末梢血から単離される細胞の集団が提供され、ここで、細胞の集団は５％未満のＣＤ３＋細胞を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞の富化された集団は４％未満のＣＤ３＋細胞を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞の富化された集団は３％未満のＣＤ３＋細胞を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞の富化された集団は５％未満のＣＤ１９＋細胞を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞の富化された集団は４％未満のＣＤ１９＋細胞を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞の富化された集団は３％未満のＣＤ１９＋細胞を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞の富化された集団は５％未満のＣＤ５６＋細胞を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞の富化された集団は４％未満のＣＤ５６＋細胞を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞の富化された集団は３％未満のＣＤ５６＋細胞を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞の富化された集団は１０％未満のＣＤ４２ｂ＋細胞を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞の富化された集団は５％未満のＣＤ４２ｂ＋細胞を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞の富化された集団は３％未満のＣＤ４２ｂ＋細胞を含む。

[0299]一部の実施形態では、骨髄細胞は富化され、ｅｘｖｉｖｏで改変されて治療的に有効な骨髄細胞を生成する。本明細書で使用されるように骨髄細胞をｅｘｖｉｖｏで改変することは、細胞をｅｘｖｉｖｏで操作することを意味することができる。本明細書で使用されるようにｅｘｖｉｖｏで操作することは、限定されずに、骨髄細胞の遺伝子操作、骨髄細胞で導入遺伝子を発現させること、骨髄細胞を核酸と接触させること、骨髄細胞を化学的または小さい分子と接触させること、骨髄細胞をサイトカイン、増殖因子、ケモカイン、接触刺激、熱刺激またはその組合せで活性化することを含むことができる。

[0300]一部の実施形態では、骨髄細胞は、がんの治療薬を生成するために操作される。一部の実施形態では、骨髄細胞は、がんワクチンを生成するために操作される。一部の実施形態では、骨髄細胞は、ウイルス、細菌、真菌、変形体または寄生虫感染症などの感染症の治療薬を生成するために操作される。一部の実施形態では、骨髄細胞は、結核の治療薬を生成するために操作される。一部の実施形態では、骨髄細胞は、炎症性疾患の治療薬を生成するために操作される。一部の実施形態では、骨髄細胞は、自己免疫性疾患の治療薬を生成するために操作される。

ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－単球キー「前駆体」細胞
[0301]早期の単球または単球前駆体細胞は、細胞療法におけるそれらの可能性についてよく調査されていない。単球は、循環血液集団ならびに腫瘍を含む組織中の免疫活性部位のはるかに豊富な細胞の大きな割合を占める。これらの細胞はほとんど全ての病理組織に移動し、任意の数の下流の骨髄エフェクター細胞に分化することができる。これらの細胞を利用してそれらを工学操作と組み合わせることによって、これらの骨髄細胞は、少し例を挙げれば、がん、神経変性、心臓および感染性の疾患の治療薬として広範囲の適用を有する有効な細胞療法ツールのために設計することができる。

[0302]治療的に有効な骨髄細胞の候補は、成熟した骨髄細胞、例えばマクロファージと比較してより長い寿命の可能性を有する前駆体細胞であってよい；それらは、マクロファージなどの骨髄系統または樹状細胞系統に成熟または分化する可能性を有し、多様な刺激によって刺激される可能性を有し、免疫学的に活性な組織位置へ容易に移動する可能性を有し、適応性組織系を活性化することができる。本出願で記載される骨髄前駆体細胞は、骨髄性の前駆体幹細胞を指さなくてもよい。本開示に記載される方法は、幹細胞可動化プロセスに対応しない。

[0303]本出願は、本明細書に記載される治療目的の骨髄細胞の表現型が単核球性前駆体系統、特に、単球、樹状細胞に分化するかまたはＭ０、Ｍ１もしくはＭ２マクロファージサブタイプに分極化する柔軟性を有するものであってよいという知見に少なくとも一部基づく。一態様では、そのような細胞はＣＤ１４＋であってよい。一態様では、そのような細胞はＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、治療的に有効な骨髄細胞系統は、高レベルのＣＤ１４（ＣＤ１４^ｈｉまたはＣＤ１４ｈｉｇｈ）を発現することができ、低レベルのＣＤ１６を発現することができ、または検出可能なＣＤ１６を発現しない。一実施形態では、本明細書に記載される治療目的の骨髄細胞は、対象の患部への移動のために高レベルのＣＣＲ２および／またはＣＣＲ５、および／またはケモカインを発現することができる。一実施形態では、細胞は低レベルのＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＣＤ８０、ＣＤ８６および／またはＣＤ６３を発現する。

[0304]一実施形態では、骨髄細胞は、それらが、成熟したマクロファージ細胞より球状であり、偽足がなく、高レベルのケモカインおよびサイトカインを発現することができるかまたは発現するように誘導することができ、免疫学的に活性な組織位置に活発に移動することができる点で、成熟したマクロファージ細胞から表現型的に識別可能である。一実施形態では、本開示の骨髄細胞は抗原にナイーブであってよい。

[0305]本明細書に記載される高い治療能力の骨髄細胞は、健康なヒトに全末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）の２０％より高いレベルで末梢血に通常存在してもよい。
[0306]臨床目的のためにこの特異的細胞を単離または富化および使用することについて、まだほとんど知られていない。一部の場合には、樹状細胞（ＤＣ）療法に関して、ＤＣは、対象への注入のために使用できる有効な細胞を生成するために少なくとも１週間単球を培養し、ｅｘｖｉｖｏで細胞を刺激することを含むプロセスによって単離された単球からｉｎｖｉｔｒｏで生成することができる。そのようなプロセスは、細胞の単離または富化の時間（または、冷凍状態からの解凍）から投与時点まで約１０日以上を必要とする。一態様では、本明細書で、骨髄細胞を調製する方法であって、対象の生体試料から細胞を単離または富化し、外因性因子により細胞を操作して細胞を必要とする対象に投与することができるようにすることによる方法が提供され、この方法は３日以内に完了することができる（図１）。一部の実施形態では、細胞を操作することは、抗原提示細胞を生成するために抗原またはペプチドで細胞を活性化することによって実行することができる。一部の実施形態では、操作することは、１つまたは複数の治療剤で細胞を活性化することを含むことができる。一部の実施形態では、操作することは、異種核酸の遺伝子操作または組込みを指すことができる。

[0307]一態様では、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団を含む組成物が本明細書で提供され、ここで、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団は細胞の工学操作集団であり、および／または外因性因子を含む。

[0308]一部の実施形態では、細胞の集団は、分極していないか未分化の骨髄細胞の集団である。一部の実施形態では、外因性因子は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団の細胞で発現されるタンパク質またはペプチドをコードする組換え核酸である。一部の実施形態では、外因性因子は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団の中の細胞の膜表面で発現されるタンパク質またはペプチドをコードする組換え核酸である。一部の実施形態では、膜表面で発現されるタンパク質またはペプチドは、融合タンパク質である。一部の実施形態では、膜表面で発現されるペプチドは、抗原または疾患原因因子に結合することができる。

[0309]一部の実施形態では、抗原はがん抗原である。一部の実施形態では、抗原は微生物病原体抗原である。一部の実施形態では、膜表面で発現されるタンパク質またはペプチドは、エンドソームでプロセシングされるタンパク質である。一部の実施形態では、膜表面で発現されるタンパク質またはペプチドは抗原である。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス、細菌、原生動物または真菌の抗原である。

[0310]一部の実施形態では、外因性因子は、キメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）をコードする配列を含む組換え核酸である。一部の実施形態では、組換え核酸はＣＦＰをコードする配列を含み、ＣＦＰは：（ａ）抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメイン、および（ｂ）細胞外ドメインに作動可能に連結される膜貫通ドメインを含む。

[0311]一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＣＤ５結合性ドメインまたはＨＥＲ２結合性ドメインである。
[0312]一部の実施形態では、外因性因子は、抗原性ペプチドをコードする組換え核酸である。一部の実施形態では、外因性因子は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団の中の細胞から分泌されるタンパク質またはペプチドをコードする組換え核酸である。一部の実施形態では、外因性因子は、エンドソームでプロセシングされるタンパク質をコードする組換え核酸である。

[0313]一部の実施形態では、組換え核酸は、細胞質タンパク質であるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、組換え核酸は、免疫原性であるタンパク質またはペプチドをコードする。一部の実施形態では、組換え核酸は、細胞の免疫応答を増強するタンパク質またはペプチドをコードする。

[0314]一部の実施形態では、外因性因子は抗原である。
[0315]一部の実施形態では、本方法は、７２時間以下、７０時間以下、６５時間以下、６０時間以下、５５時間以下、５０時間以下、４５時間以下、４０時間以下、または３５時間以下で完了することができる。

[0316]一部の実施形態では、骨髄細胞は異種核酸をｉｎｖｉｔｒｏで組み込むことによって操作される。一部の実施形態では、細胞は操作の後に短時間培養される。一部の実施形態では、操作は、操作が細胞の柔軟性を変更しないようなものである。操作された細胞は、高いＣＤ１４発現を保持する。操作された細胞は、ＣＤ１６をより高いレベルで発現しない。操作された細胞は、刺激の存在下でＣＣＲ２およびまたはＣＣＲ５を発現する。一部の実施形態では、操作された細胞は、４８時間（ｈ）未満、または３６時間未満、または２４時間未満、または２０、１８、１６、１４１２、１０、８、６または４時間未満培養することができる。一部の実施形態では、細胞は冷凍で得ることができ、操作の前または後またはその両方で１機会または複数機会に解凍することができる。一部の実施形態では、凍結および解凍は、そのプロセスが細胞の柔軟性を変更しないように用心して実行される。

[0317]一態様では、本明細書に記載される治療目的の骨髄細胞は、神経変性疾患の細胞療法で治療細胞として効果的に使用するために高い柔軟性を有する。単離されたＣＤ１４＋／ＣＤ１６－骨髄細胞は、アルツハイマー病のための治療戦略として神経変性プラークのアミロイドベータ細胞に結合してそこから除去することができ、アミロイドクリアランスを促進することができる、キメラ抗原受容体（例えば、ｓｃＦｖを有する）を発現させるために使用することができる。別の態様では、そのような細胞は抗ＶＥＧＦ抗体を発現するように操作することができるか；または、病原体感染に対するより優れたワクチンおよび歩哨細胞を生成するために使用することができる（図２）。

[0318]一態様では、治療目的の骨髄細胞は高レベルの柔軟性によって特徴付けられ、細胞がｉｎｖｉｖｏで適切な刺激に遭遇するときの免疫応答が高度に有効であるいくつかの細胞サブタイプに分化することができるか分化するように刺激することができる。例えば、図３に示すように、本明細書に記載されるＣＤ１４を発現する骨髄細胞は、組織炎症または免疫応答の部位で複数の樹状細胞サブタイプに適切に分化させることができる。一実施形態では、治療目的の骨髄細胞は、エフェクター細胞をｉｎｖｉｖｏで生成するように活性化、分化および／または分極させることができ、例えば、全身投与したときに感染または炎症部位に移動することができ、免疫学的に活性な部位、例えば腫瘍に浸潤することができ、免疫学的に活性な部位、例えば腫瘍微小環境の部位で免疫機能を効果的に発揮することができる。

[0319]一態様では、本明細書で提供される方法は拡張縮小可能であり、臨床スケールで治療的に有効である骨髄細胞を製造するために使用することができる。一部の実施形態では、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－骨髄細胞は、負の選択により、および市販されているカラムを使用して単離および精製することができ、臨床スケールでプロセシングすることができ；必要に応じて、単離された細胞を操作し、治療的に有効な組成物を調製することができる。

がん免疫療法で使用するための骨髄細胞
[0320]一態様では、例示として、または原理の証拠として、がん免疫療法において本明細書に記載される治療目的の骨髄細胞を利用する組成物および方法が本明細書で提供される。骨髄性のエフェクター細胞は、これらの細胞の柔軟性を変更しない方法を使用して、治療目的の単離された骨髄細胞から生成することができる。単核球系統細胞は食細胞であり、効率的な抗原提示細胞である。食細胞は免疫系の天然の歩哨であり、体内で最初の防御線を形成する。それらは病原体、病原体感染細胞、異物またはがん性細胞を呑食して、それを体から除去する。ほとんどの潜在的病原体は、それらが例えば注目すべき感染症を引き起こし得る前に、この系によって速やかに無力化される。これは、クラスリン被覆ピット系、ピノサイトーシス、特に膜波打ち運動および食作用の結果としてのマクロピノサイトーシスを通した受容体媒介取り込みを含むことができる。したがって、食細胞は様々な非自己（および、自己）エレメントで活性化することができ、それらの「標的」の認識において一定レベルの柔軟性を示すことができる。ほとんどの食細胞はそれらの表面でスカベンジャー受容体を発現し、それらはパターン認識分子であり、広範囲の外来粒子ならびに体内の死細胞、破片および望ましくない粒子に結合することができる。一態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする組換え核酸は、細胞内で発現させることができる。ＣＡＲは特異的腫瘍細胞を攻撃するように様々に設計することができ、ＣＡＲを発現する骨髄エフェクター細胞は腫瘍細胞を貪食して殺すように活性化することができる。ＣＡＲは標的係合に応答して特異的に活性化される食細胞受容体を生成するように設計することができ、マクロファージの食細胞能力は受容体の特異的に工学操作された細胞内ドメインによって増強される。さらに、ＣＡＲを発現する骨髄エフェクター細胞はリンパ節に移動して、リンパ節の中のナイーブＴ細胞に抗原を交差提示することができ、それによって適応性応答を活性化する。

[0321]一部の実施形態では、生体試料から単離され、組換えタンパク質を発現するようにｅｘｖｉｖｏで工学操作され、医薬組成物の骨髄細胞がｉｎｖｉｖｏで免疫活性化の誘導が効率的な「エフェクター」骨髄細胞であるような医薬組成物に製剤化される骨髄細胞を生成するための組成物および方法が本明細書で開示される。一部の実施形態では、組成物の骨髄細胞は「ＡＴＡＫ」骨髄細胞と呼ばれ、ここで細胞は標的細胞を攻撃および破壊することが効率的である骨髄である。

[0322]キメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）、例えば食細胞受容体（ＰＲ）融合タンパク質（ＰＦＰ）、スカベンジャー受容体（ＳＲ）融合タンパク質（ＳＦＰ）、インテグリン受容体（ＩＲ）融合タンパク質（ＩＦＰ）またはカスパーゼ動員受容体（カスパーゼ－ＣＡＲ）融合タンパク質をコードする組換え核酸を含む組成物が本明細書で提供される。組換え核酸によってコードされるＣＦＰは、標的細胞の抗原に結合する抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むことができる。細胞外ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ６８、食細胞受容体、スカベンジャー受容体またはインテグリン受容体などの、受容体に由来するヒンジドメインまたは細胞外ドメインに融合することができる。組換え核酸によってコードされるＣＦＰは、ＣＤ２、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ６８、食細胞受容体、スカベンジャー受容体またはインテグリン受容体に由来する膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインをさらに含むことができる。一部の実施形態では、組換え核酸によってコードされるＣＦＰは、食細胞受容体、スカベンジャー受容体またはインテグリン受容体に由来する細胞内シグナル伝達ドメインなどの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインをさらに含む。例えば、細胞内ドメインは、食細胞受容体、スカベンジャー受容体またはインテグリン受容体に由来する１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。例えば、細胞内ドメインは、食細胞活性、炎症応答、一酸化窒素生成、インテグリン活性化、エフェクター細胞移動の増強（例えば、ケモカイン受容体発現を通して）、抗原提示および／または交差提示の増強を促進する１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。一部の実施形態では、ＣＦＰは食細胞受容体融合タンパク質（ＰＦＰ）である。一部の実施形態では、ＣＦＰは食細胞スカベンジャー受容体融合タンパク質（ＰＦＰ）である。一部の実施形態では、ＣＦＰはインテグリン受容体融合タンパク質（ＩＦＰ）である。一部の実施形態では、ＣＦＰは炎症受容体融合タンパク質である。一部の実施形態では、組換え核酸によってコードされるＣＦＰは、補充ドメインを含む細胞内ドメインをさらに含む。例えば、細胞内ドメインは、１つまたは複数のＰＩ３Ｋ補充ドメイン、カスパーゼ補充ドメインまたはカスパーゼ活性化および補充ドメイン（ＣＡＲＤ）を含むことができる。

[0323]（ｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉ）食細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン；ならびに抗原、例えば標的細胞のまたはその上に提示される抗原に特異的である細胞外抗原結合性ドメインを含む食細胞または連結受容体（ＰＲ）サブユニット（例えば、食細胞受容体融合タンパク質（ＰＦＰ））を含むＣＦＰをコードする組換え核酸を含む組成物が本明細書で提供され；ここで、膜貫通ドメインおよび細胞外抗原結合性ドメインは、融合受容体の細胞外抗原結合性ドメインによる標的への抗原結合が食細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化するように作動可能に連結される。

[0324]膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン；ならびに標的細胞の抗原に特異的である抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメインを含むＰＲサブユニットを含む食細胞または連結受容体（ＰＲ）サブユニット（例えば、食細胞受容体融合タンパク質（ＰＦＰ））を含むＣＦＰをコードする組換え核酸配列を含む組成物が本明細書で提供され；ここで、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインは作動可能に連結され；標的細胞の抗原へのＣＦＰの結合により、ＣＦＰを発現する好中球、単球、骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）、肥満細胞またはマクロファージなどの骨髄細胞による殺滅または食作用活性は、ＣＦＰを発現しない細胞と比較して、少なくとも５％を超えて、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％または１０００％増加する。

[0325]一態様では、本明細書で、医薬組成物であって、（ａ）組換え核酸を含む単球、前駆体単球またはマクロファージ細胞などの骨髄細胞であって、組換え核酸はキメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）をコードする配列を含み、ＣＦＰは：（ｉ）抗ＣＤ５結合性ドメインを含む細胞外ドメイン、および（ｉｉ）細胞外ドメインに作動可能に連結される膜貫通ドメイン；を含む骨髄細胞、ならびに（ｂ）薬学的に許容される担体；を含む医薬組成物が提供され、ここで、骨髄細胞はＣＦＰを発現し、ＣＦＰを発現しない骨髄細胞と比較してＣＤ５を発現する標的細胞の食作用における少なくとも１．１倍の増加を示す。一部の実施形態では、ＣＤ５結合性ドメインは、抗体の抗原結合性フラグメント、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖドメインまたはｓｄＡｂドメインを含むＣＤ５結合性タンパク質である。例示的なＣＦＰは、下の表に掲載されるアミノ酸配列の１つまたは複数を含むことができる（表１）。

[0326]一部の実施形態では、本開示は、がん免疫療法につながるエンゲージャー媒介骨髄細胞活性化を増強するための組成物および方法を提供する。本明細書で提供される方法は、がん細胞を標的にして効率的な食作用によってそれらを排除する効率的なキラー細胞になるように常在ヒト単球またはマクロファージを誘導することができるツールを設計するのを助ける。一部の実施形態では、単球またはマクロファージは、がん細胞に対して持続した免疫学的応答を提供する。様々な実施形態が本明細書に記載される。

[0327]特異的構築物が本明細書で提供され、キメラ「エンゲージャー」と呼ばれるそのようなキメラタンパク質のための設計が開示される。エンゲージャーは、ｉｎｖｉｖｏで骨髄細胞を活性化することができ、ｉｎｖｉｖｏで骨髄細胞が標的細胞、例えばがん細胞または感染細胞と係合するのを助けることができる核酸治療薬またはタンパク質治療薬として、それを必要とする対象に直接的に投与することができる。

[0328]一部の実施形態では、キメラエンゲージャーは２つ以上の融合抗体を含み、各々は標的細胞、例えばがん細胞または単球もしくはマクロファージの上に特異的結合領域を有する。ある特定の実施形態では、２つ以上の融合抗体または免疫融合体は、免疫グロブリン定常領域のヒンジ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメインまたはヒンジ－Ｃ_Ｈ３ドメインによって、単球またはマクロファージの細胞表面成分に特異的に結合するエフェクター結合ドメインに作動可能に連結した標的結合性ドメインを含む。

[0329]一態様では、キメラタンパク質は、二重特異性単球またはマクロファージエンゲージャーである。一部の実施形態では、二重特異性エンゲージャーは、第１の治療剤を含み、第１の治療剤は：（ｉ）標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗原結合性ドメイン、および（ｉｉ）単球またはマクロファージ細胞の受容体の細胞外領域と特異的に相互作用する第２の抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、治療剤は二重特異性エンゲージャーである。一実施形態では、二重特異性単球またはマクロファージエンゲージャーは、２つの抗体単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）のみ（Ｆｃアミノ酸セグメントは含まれなかった）をフレキシブルリンカーと含み、片方のｓｃＦｖは標的細胞の細胞表面成分に結合し、他方は単球またはマクロファージ細胞表面の受容体に結合する。ＩｇＧの完全に未改変の形では、可変軽鎖ドメイン（Ｖ_Ｌ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）は別々のポリペプチド鎖である、すなわち、それぞれ軽鎖および重鎖に位置する。抗体軽鎖および抗体重鎖の相互作用、特にＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインの相互作用、抗体のエピトープ結合部位の１つが形成される。対照的に、ｓｃＦｖ構築物では、しかし、抗体のＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインは単一のポリペプチド鎖に含まれる。２つのドメインは、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈドメインの機能的エピトープ結合部位への自己集合を可能にするのに十分長いフレキシブルリンカーによって分離される。

[0330]一部の実施形態では、二重特異性単球またはマクロファージエンゲージャーは：（ａ）標的細胞の細胞表面成分、例えばがん抗原に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、（ｂ）エフェクター細胞、例えば単球またはマクロファージの細胞表面成分に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、（ｃ）（ａ）と（ｂ）を作動可能に連結する短いリンカーを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖはそれらのＣ末端で融合する。各ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーによって作動可能に連結される、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖはヒト化される。ヒト化ｓｃＦｖは、そのＣＤＲが由来する親免疫グロブリンのそれと比較して、異なる種の免疫グロブリンのフレームワークに存在する「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を含む。例えば、「ヒト化抗体」を調製するために、マウスＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に移植することができる。一部の実施形態では、二重特異性エンゲージャーはダイアボディである。二重特異性ダイアボディは、異なる（同一でない）エピトープへの結合特異性を有する単一のポリペプチド鎖の上のＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインで構築される。さらに、Ｖ_ＬとＶ_Ｈを連結するリンカーは、機能的エピトープへの再組み立てに不十分である１２アミノ酸の長さより短い。一般的に、１つのポリペプチド鎖構築物は、第１の抗原への結合特異性を有するＶ_Ｌおよび第２の抗原への結合特異性を有するＶ_Ｈを含み、別のポリペプチド鎖構築物は、第２の抗原への結合特異性を有するＶ_Ｌおよび第１の抗原への結合特異性を有するＶ_Ｈを含み；２つのポリペプチド鎖は二重特異性ダイアボディに自己集合することが可能である。一部の実施形態では、エンゲージャー分子の結合特性に干渉することなく２つの鎖間でジスルフィド結合の形成を可能にする、システイン残基を構築物のＣ末端に導入することができる。一部の実施形態では、二重特異性エンゲージャーはタンデム－二－ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーをコードする組換え核酸構築物を調製することができる。二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーを発現させるための組換え核酸構築物は、（ａ）標的細胞結合性ｓｃＦｖ軽鎖の可変ドメイン、リンカー、標的細胞結合性ｓｃＦｖ重鎖の可変ドメインをコードする核酸配列；（ｂ）リンカーをコードする核酸配列；（ｃ）エフェクター（単球またはマクロファージ）細胞結合性ｓｃＦｖ軽鎖の可変ドメイン、リンカー、エフェクター（単球またはマクロファージ）細胞結合性ｓｃＦｖ重鎖の可変ドメインをコードする核酸配列をコードする１つまたは複数のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーを発現させるための核酸構築物は、二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーの分泌のためにＮ末端シグナルペプチド配列を含む。

[0331]一部の実施形態では、（ａ）と（ｂ）を作動可能に連結する短いリンカーは、追加の機能をさらに有することができる。一部の実施形態では、ペプチドは特異的細胞表面受容体、例えばＴＬＲ受容体に結合することができ、単球またはマクロファージ細胞における受容体媒介細胞シグナル伝達経路を活性化することができる。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、単球もしくはマクロファージ細胞における少なくとも炎症性経路に結合して活性化することができるように、または単球もしくはマクロファージによって媒介される食作用および標的細胞の殺滅を強化することができるように設計される。一部の実施形態では、リンカーペプチドは、標的細胞によって媒介される単球またはマクロファージ細胞機能の下方制御をブロックまたは阻害する機能を有することができる。

[0332]一部の実施形態では、二重特異性Ｖ_ＨＨエンゲージャーのための：（ａ）標的細胞の細胞表面成分、例えばがん抗原に結合するＶ_ＨＨドメイン、（ｂ）エフェクター細胞、例えば単球またはマクロファージの細胞表面成分に結合するＶ_ＨＨドメイン、（ｃ）（ａ）と（ｂ）を作動可能に連結する短いリンカーをコードする核酸配列を含む核酸構築物を生成することができる。一部の実施形態では、二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーを発現させるための核酸構築物は、二重特異性ｓｃＦｖエンゲージャーの分泌のためにＮ末端シグナルペプチド配列を含む。

[0333]当業者に公知であるように、Ｖ_ＨＨまたはｓｃＦｖ結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列は、１つまたは複数のプロモーター、例えばポリペプチドをコードする配列の５’末端のＣＭＶおよび３’末端のポリアデニル化シグナルの下で好適な発現ベクターに挿入することができる。

[0334]一部の実施形態では、キメラタンパク質は二重特異性エンゲージャーである。
[0335]三重特異性エンゲージャーは第１の治療剤を含み、ここで第１の治療剤は：標的細胞の抗原と特異的に相互作用する第１の抗原結合性ドメイン；単球またはマクロファージ細胞の第１の受容体の細胞外領域と特異的に相互作用する第２の抗原結合性ドメイン；単球またはマクロファージ細胞の第２の受容体の細胞外領域と特異的に相互作用する第３の抗原結合性ドメインを含む。

[0336]一部の実施形態では、三重特異性エンゲージャーは、標的がん細胞の上の細胞表面成分に特異的である第１のｓｃＦｖ、単球またはマクロファージの上の細胞表面成分、例えばキメラ食細胞受容体に特異的である第２のｓｃＦｖ、および単球またはマクロファージの上の別の細胞表面成分に特異的である第３のｓｃＦｖを含む３つのｓｃＦｖの融合構築物である。一部の実施形態では、三重特異性エンゲージャーは、第３のｓｃＦｖが結合することができる単球またはマクロファージの上の細胞表面成分が、食作用および標的細胞の殺滅を引き起こすために単球またはマクロファージに追加の活性化シグナルを提供するように設計される。一部の実施形態では、第３のｓｃＦｖは単球またはマクロファージの上の別の食細胞受容体に結合する。一部の実施形態では、第３のｓｃＦｖは、危険関連の単球またはマクロファージシグナル伝達経路（ＤＡＭＰ）に結合する。一部の実施形態では、第３のｓｃＦｖは、ＴＬＲ受容体に結合する。一部の実施形態では、第３のｓｃＦｖは、サイトカイン受容体を活性化し、単球またはマクロファージ細胞内シグナル伝達を誘発するサイトカイン受容体に結合する。一部の実施形態では、第３のｓｃＦｖは食作用阻害シグナルを生成することが公知の単球またはマクロファージ受容体に結合し、第３のｓｃＦｖの受容体へのその結合は受容体をブロックし、食作用の増強を可能にする。一部の実施形態では、第３のｓｃＦｖは１つまたは複数の膜貫通ドメインと係合する受容体に結合し、食細胞シグナル伝達を増強する。

[0337]一部の実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、チミジンキナーゼ（ＴＫ１）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ムチン－１、ムチン－１６（ＭＵＣ１６）、ＭＵＣ１、上皮増殖因子受容体ｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、メソテリン、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン、ＥＢＮＡ－１、ＬＥＭＤ１、ホスファチジルセリン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、濾胞性刺激ホルモン受容体、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、エリスロポイエチン産生肝細胞癌Ａ２（ＥｐｈＡ２）、ＥｐｈＢ２、ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５６ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ２１３Ａ２、ＣＤ２４８、ＣＤ２７６、ＰＳＣＡ、ＣＳ－１、ＣＬＥＣＬ１、ＧＤ３、ＰＳＭＡ、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＥＰＣＡＭ、ＩＬ－１、インテグリン受容体、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧＭ３、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ＩＧＬＬ１およびその組合せからなる群から選択されるがん細胞の上の抗原に結合する。一部の実施形態では、例えば、標的がん細胞のがん抗原は、突然変異／がん抗原：ＭＵＣ１６、ＣＣＡＴ２、ＣＴＡＧ１Ａ、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＰＲＡＭＥ、ＰＣＡ３、ＭＡＧＥＣ１、ＭＡＧＥＣ２、ＭＡＧＥＤ２、ＡＦＰ、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥ９、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ１２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＰＬＡＣ１、ＳＤＣＣＡＧ８、ＬＳＰ１、ＣＴ４５Ａ１、ＣＴ４５Ａ２、ＣＴ４５Ａ３、ＣＴ４５Ａ５、ＣＴ４５Ａ６、ＣＴ４５Ａ８、ＣＴ４５Ａ１０、ＣＴ４７Ａ１、ＣＴ４７Ａ２、ＣＴ４７Ａ３、ＣＴ４７Ａ４、ＣＴ４７Ａ５、ＣＴ４７Ａ６、ＣＴ４７Ａ８、ＣＴ４７Ａ９、ＣＴ４７Ａ１０、ＣＴ４７Ａ１１、ＣＴ４７Ａ１２、ＣＴ４７Ｂ１、ＳＡＧＥ１およびＣＴ５５の１つまたは複数であってよい。一部の実施形態では、がん細胞の上の抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＣＲ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４５、ＣＤ５６からなる群から選択される。

[0338]一部の実施形態では、抗原は卵巣がん抗原またはＴリンパ腫抗原である。
[0339]一部の実施形態では、例えば、標的がん細胞のがん抗原は、突然変異／がん抗原：ＩＤＨ１、ＡＴＲＸ、ＰＲＬ３またはＥＴＢＲの１つまたは複数であってよく、がんは神経膠芽腫である。

[0340]一部の実施形態では、例えば、標的がん細胞のがん抗原は、突然変異／がん抗原：ＣＡ１２５、ベータ－ｈＣＧ、尿ゴナドトロピン断片、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＳＣＣ、インヒビンまたはエクストラジオールの１つまたは複数であってよく、がんは卵巣がんである。一部の実施形態では、標的がん細胞のがん抗原は、ＣＤ５であってよい。一部の実施形態では、標的がん細胞のがん抗原は、ＨＥＲ２であってよい。一部の実施形態では、標的がん細胞のがん抗原は、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩであってよい。一部の実施形態では、標的がん細胞のがん抗原は、ＣＤ１９であってよい。一部の実施形態では、抗原はインテグリン受容体である。一部の実施形態では、抗原は、α１、α２、αＩＩｂ、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１０、α１１、αＤ、αＥ、αＬ、αＭ、αＶ、αＸ、β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７およびβ８からなる群から選択されるインテグリン受容体である。一部の実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、インテグリンβ_２サブファミリーα_Ｍβ_２（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、Ｍａｃ－１、ＣＲ３、Ｍｏ－１）、α_Ｌβ_２（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＬＦＡ－１）、α_Ｘβ_２（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）およびα_Ｄβ_２（ＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８）のメンバーからの単球またはマクロファージ受容体の細胞外ドメインに結合する。一部の実施形態では、エンゲージャーは、接着分子、例えばインテグリンまたはセレクチン、例えばＰ－セレクチン、Ｌ－セレクチンまたはＥ－セレクチンの細胞外ドメインに結合することができる結合性ドメインを含む。

[0341]食作用を活性化するマクロファージ受容体は、１つまたは複数のＩｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒＴｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄＡｃｔｉｖａｔｉｏｎＭｏｔｉｆ（ＩＴＡＭ）モチーフを有するドメインを含む細胞内食作用シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、二重および三重特異性エンゲージャーは、単球またはマクロファージスカベンジャー受容体に結合する結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、単球またはマクロファージの上のこれらの受容体の１つまたは複数へのエンゲージャーの結合は、単球またはマクロファージによる食作用を活性化するように設計される。現在、８クラスのスカベンジャー受容体（クラスＡ～Ｈ）がある。一部の場合には、複数の名称が同じ受容体に割り当てられている（例えば、ＭＳＲ１、ＳＲ－ＡＩ、ＣＤ２０４およびＳＣＡＲＡ１）。さらに、他の判定基準に基づいて命名され、一般的なスカベンジャー受容体命名法に含まれていないスカベンジャー受容体活性を示すタンパク質がある。一部の例には、ＲＡＧＥ（ＳＲ－Ｅ１）、ＬＲＰ１、ＬＲＰ２、ＡＳＧＰ、ＣＤ１６３、ＳＲ－ＰＳＯＸおよびＣＸＣＬ１６が含まれる。一部の実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、レクチン、デクチン１、マンノース受容体（ＣＤ２０６）、スカベンジャー受容体Ａ１（ＳＲＡ１）、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ３６、ＣＤ１６３、ＭＳＲ１、ＳＣＡＲＡ３、ＣＯＬＥＣ１２、ＳＣＡＲＡ５、ＳＣＡＲＢ１、ＳＣＡＲＢ２、ＣＤ６８、ＯＬＲ１、ＳＣＡＲＦ１、ＳＣＡＲＦ２、ＣＸＣＬ１６、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＢ２、ＳＲＣＲＢ４Ｄ、ＳＳＣ５Ｄ、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ２０９、ＲＡＧＥ、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、Ｔｉｅ２、ＨｕＣＲＩｇ（Ｌ）およびＣＤ１６９受容体から選択されるスカベンジャー受容体に結合する結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、二重または三重特異性エンゲージャーは、例えば：ＭＲＣ１、ＩｔｇＢ５、ＭＥＲＴＫ、ＥＬＭＯ、ＢＡＩＬＴｙｒｏ３、Ａｘｌ、Ｔｒａｆ６、Ｓｙｋ、ＭｙＤ８８、Ｚａｐ７０、ＰＩ３Ｋ、ＦｃγＲ１、ＦｃｙＲ２Ａ、ＦｃｙＲ２Ｂ２、ＦｃｙＲ２Ｃ、ＦｃｙＲ３Ａ、ＦｃＥＲ１、ＦｃαＲｌ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＤＡＰ１２、ＮＦＡＭ１およびＣＤ７９ｂのいずれか１つの活性化を通して食作用活性化シグナルまたは炎症誘発性シグナルを生成することができるタンパク質に結合する結合性ドメインを含む。

[0342]一部の実施形態では、エンゲージャーは、結合性ドメインがＴＬＲと係合することができるように、骨髄細胞の炎症活性を促進するドメインを含むように設計することができる。一部の実施形態では、エンゲージャーは、骨髄細胞の細胞接着および炎症活性を促進するドメインで設計される。一部の実施形態では、エンゲージャーは、骨髄細胞の抗食作用および抗炎症活性を阻害する結合性ドメインで設計される。例えば、二重または三重特異性エンゲージャーは、単球またはマクロファージ食作用のＣＤ４７媒介下方制御を阻害するさらなる機能的ドメインを含むことができる。腫瘍細胞は、単球またはマクロファージ受容体ＳＩＲＰ－αに結合して食作用を阻害する「ｄｏｎ’ｔｅａｔｍｅ」シグナルＣＤ４７を一般的に発現する。二重または三重特異性エンゲージャーの１つの腕は、ＣＤ４７ブロッカーを含むことができる。エンゲージャーに関連したＣＤ４７ブロッカーは、おとり受容体または無力化受容体として作用するＳＩＲＰ－αの細胞外ＣＤ４７結合性ドメインであってよい。

[0343]例示的な二重または三重特異性エンゲージャーは、配列番号８～１４に開示されるように、結合性ドメインまたはその断片のいずれか１つを含む、結合剤または結合性ドメインまたはその一部のためのアミノ酸配列を含むことができる。

[0344]結合性ドメインはそれらのそれぞれのリガンドに、１０^－５～１０^－１２Ｍ以下、または１０^－７～１０^－１２Ｍ以下、または１０^－８～１０^－１２Ｍ（すなわち、１０^５～１０^１２Ｍ以上、または１０^７～１０^１２Ｍ以上または１０^８～１０^１２Ｍの会合定数（Ｋ_Ａ）で）の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合する。

[0345]例示的な抗ＣＤ５結合剤は、配列：ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶ（配列番号３６）またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号３７）または配列番号３６もしくは配列番号３７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む重鎖を含むことができる。

[0346]別の例示的な抗ＣＤ５結合剤は、配列：ＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶ（配列番号３８）または配列番号３８と少なくとも９０％の同一性を有する配列、またはＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号３９）または配列番号３９と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む重鎖を含むことができる。

[0347]例示的な抗ＣＤ５結合剤は、アミノ酸配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＹＥＤＦＧＩＹＹＣＱＱＹＤＥＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号４０）または配列番号４０と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む軽鎖を含むことができる。

[0348]例示的な、二重特異性または三重特異性エンゲージャー、例えば抗ＣＤ５ｓｃＦｖを含有する二重特異性または三重特異性エンゲージャーは、配列：ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）またはＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４３）またはＧＧＧＧ（配列番号４４）を有する、例示的な重鎖および例示的な軽鎖を連結する短いペプチドリンカーを含むことができる。

[0349]例示的な抗ＣＤ５ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＹＥＤＦＧＩＹＹＣＱＱＹＤＥＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号４５）または配列番号４５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことができる。

[0350]例示的な抗ＣＤ１６ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＡＹＹＹＤＦＡＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４６）または配列番号４６と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む重鎖可変配列を含むことができる。

[0351]例示的な抗ＣＤ１６ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：ＳＹＶＬＴＱＰＳＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＴＩＳＣＧＧＨＮＩＧＳＫＮＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＮＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＮＹＳＶＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４７）または配列番号４７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変配列を含むことができる。

[0352]一態様では、組成物の骨髄細胞は、抗原または免疫原性タンパク質をコードする配列を含む外因性核酸を含むことができる。細胞は、免疫疾患、例えばがんまたは微生物感染症の処置のために使用することができる。一部の実施形態では、抗原特異的免疫応答は、抗原または免疫原性タンパク質をコードする配列を含む外因性核酸を含む骨髄細胞を含むワクチン組成物の有効量を対象に投与することによって対象で誘導される。抗原性ポリペプチドは、適応性免疫系が特異的に認識することが可能であるポリペプチドである。抗原性ポリペプチドは、免疫原性である任意のポリペプチドを含む。抗原性ポリペプチドには、限定されずに、病原体関連、アレルゲン関連、腫瘍関連、がん関連または他の疾患関連の抗原が含まれる。病原体は、ウイルス、寄生虫、真菌および細菌の病原体ならびにプリオンなどのタンパク質病原体であってよい。抗原性ポリペプチドは、完全長タンパク質またはその一部であってよい。多くのタンパク質の免疫系認識は、しばしばエピトープと呼ばれる比較的少数のアミノ酸に基づくことが立証されている。エピトープは、わずか８～１０アミノ酸であってよい。したがって、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドは、完全長タンパク質、８アミノ酸の長いエピトープ、または１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０アミノ酸の長さ、またはこれらの両極端の間の任意の一部であってよい。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、複数のエピトープを含むことができる。細胞をベースとした抗腫瘍ワクチン組成物を含む医薬組成物（すなわち、抗原を積んだ単球および薬学的に許容される担体）が本明細書で提供される。本明細書に記載される免疫原性ワクチン組成物または治療組成物は、生物源から単離され、本明細書に開示される方法を使用して１つまたは複数の腫瘍抗原を発現する外因性核酸を発現するように工学操作され、それを必要とする対象に投与されるとき、抗腫瘍Ｔ細胞免疫の生成に有効である、本開示の骨髄細胞を含む組成物を含むことができる。ワクチン組成物は、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－である少なくとも５０％の細胞を含むことができ、そのようなＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞は１つまたは複数の抗原性ペプチドを発現する。一部の実施形態では、組成物中の細胞の１０％未満は樹状細胞である。一部の実施形態では、細胞組成物中のマクロファージの総数は、細胞総数の４０％を超えて存在しない。マクロファージは、複数の細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＣＲ５、ＣＤ２０６、Ｆ４／８０等を発現すると特徴付けることができる。一部の実施形態では、細胞組成物中のマクロファージの総数は、３０％未満、２０％または１０％であってよい。

[0353]一部の実施形態では、骨髄細胞は、突然変異ペプチドである免疫原性または抗原性ペプチドをコードする組換え核酸を含む。一部の実施形態では、抗原性ペプチドは腫瘍関連ペプチドである。一部の実施形態では、抗原性ペプチドは、がん組織、例えば腫瘍のみに存在する突然変異ペプチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原性ペプチド、および１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質アジュバントは、骨髄細胞を工学操作するために使用される組換え核酸によってコードすることができる。一部の実施形態では、抗原は、卵巣がん抗原またはＴリンパ腫抗原である。一部の実施形態では、例えば、組換え核酸によってコードされるがん抗原性ポリペプチドは、突然変異／がん抗原：ＭＵＣ１６、ＣＣＡＴ２、ＣＴＡＧ１Ａ、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＰＲＡＭＥ、ＰＣＡ３、ＭＡＧＥＣ１、ＭＡＧＥＣ２、ＭＡＧＥＤ２、ＡＦＰ、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥ９、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ１２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＰＬＡＣ１、ＳＤＣＣＡＧ８、ＬＳＰ１、ＣＴ４５Ａ１、ＣＴ４５Ａ２、ＣＴ４５Ａ３、ＣＴ４５Ａ５、ＣＴ４５Ａ６、ＣＴ４５Ａ８、ＣＴ４５Ａ１０、ＣＴ４７Ａ１、ＣＴ４７Ａ２、ＣＴ４７Ａ３、ＣＴ４７Ａ４、ＣＴ４７Ａ５、ＣＴ４７Ａ６、ＣＴ４７Ａ８、ＣＴ４７Ａ９、ＣＴ４７Ａ１０、ＣＴ４７Ａ１１、ＣＴ４７Ａ１２、ＣＴ４７Ｂ１、ＳＡＧＥ１およびＣＴ５５の１つまたは複数から選択することができる抗原またはその断片またはそのエピトープを含む。

[0354]一部の実施形態では、治療的に有効な骨髄細胞は、１つまたは複数の外因性または組換えの腫瘍抗原を含むか、提示するか、発現する。一部の実施形態では、腫瘍抗原は組織特異的抗原である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、内因性の過剰発現される抗原である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、突然変異したタンパク質抗原である。一部の実施形態では、治療的に有効な骨髄細胞は、黒色腫抗原、例えばチロシナーゼ関連のタンパク質２（ＴＲＰ２）抗原、例えばＴＲＰ２エピトープ、例えばＴＲＰ２のアミノ酸１８０～１８８（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）を含むか、提示するか、発現する。一部の実施形態では、治療的に有効な骨髄細胞は、突然変異抗原、例えば神経膠芽腫抗原、例えば、イソクエン酸脱水素酵素１（ｍＩＤＨＩ）抗原、例えば突然変異ＩＤＨ１抗原（Ｒ１３２Ｈ）、例えばＧＷＶＫＰＩＩＩＧＨＨＡＹＧＤＱＹＲＡＴＤＦＶＶＰを含むか、提示するか、発現する。一部の実施形態では、方法は、がん、例えば脳がん、神経膠腫または神経膠芽腫を処置するために、１つまたは複数の外因性または組換えの抗原を含むか、提示するか、発現する骨髄細胞を投与することを含むことができる。

[0355]一部の実施形態では、例えば、骨髄細胞は免疫原性または抗原性のペプチドをコードする組換え核酸を含み、ここで、免疫原性または抗原性のペプチドは、突然変異／がん抗原：ＩＤＨ１、ＡＴＲＸ、ＰＲＬ３またはＥＴＢＲの１つまたは複数であってよく、がんは神経膠芽腫（ＧＢＭ）である。一部の実施形態では、ＧＢＭの抗原性ペプチドは突然変異したＩＤＨである。一部の実施形態では、突然変異したＩＤＨはＲ１３Ｈ突然変異を含み、アミノ酸配列ＧＷＶＫＰＩＩＩＧＨＨＡＹＧＤＱＹＲＡＴＤＦＶＶＰ（配列番号４８）を含むことができる。

[0356]一部の実施形態では、免疫原性ペプチドはＴＲＰ２（１８０～１８８）ペプチドであり、アミノ酸配列ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号４９）を有するエピトープを含む。
[0357]一部の実施形態では、抗原性ペプチドはＣＭＶｐｐ６５ペプチドである。

[0358]一部の実施形態では、組換え核酸はエンドソーム標的化配列を含み、エンドソーム標的化配列はＬＡＭＰ１配列である。
[0359]一部の実施形態では、組換え核酸は、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）シグナル伝達配列、ヒト免疫グロブリン重鎖シグナル伝達配列、ヒト免疫グロブリン軽鎖シグナル伝達配列、ヒト血清アルブミンシグナル伝達配列またはヒトアズロシジンシグナル伝達配列、ヒトシスタチンの分泌シグナルペプチド配列である分泌配列を含む。

[0360]一実施形態では、骨髄細胞を操作するために使用される組換え核酸は、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは逆転写され、精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはエレクトロポレーションによって細胞に組み込まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは長い半減期を有するように設計される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは長いポリＡテールを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、ベータグロビンｍＲＮＡの３’－ＵＴＲからの領域を含む。

[0361]一部の実施形態では、組換え核酸はｃｉｒｃＲＮＡである。
[0362]一部の実施形態では、組換え核酸をコードするｍＲＮＡは、レトロトランスポゾン配列を含む。一部の実施形態では、組換えＣＡＲをコードする核酸配列は、レトロトランスポゾンエレメントの中に置かれる。一部の実施形態では、レトロトランスポゾンはＡｌｕエレメントを含む。

[0363]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、細胞のゲノムに導入遺伝子を安定して組み入れることを含み、この方法は：細胞に：（ａ）導入遺伝子をコードする配列；（ｂ）導入遺伝子をコードする配列に連なる５’ＵＴＲ核酸配列および３’ＵＴＲ核酸配列；を含むｍＲＮＡを導入することを含み、ここで、５’ＵＴＲ核酸配列または３’ＵＴＲ核酸配列は：（ｉ）エンドヌクレアーゼ結合部位、（ｉｉ）逆転写酵素結合部位、（ｉｉｉ）リボソーム結合部位、（ｉｖ）レトロトランスポザーゼ結合部位、および（ｖ）ポリＡ配列；の１つまたは複数を含み、導入遺伝子をコードする配列はセンスまたはアンチセンス方向性であり、導入遺伝子は細胞のゲノムに安定して組み込まれる。一部の実施形態では、本方法は、エンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする配列を細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、エンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素をコードする配列を含む。

[0364]一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素はＯＲＦ２ｐである。
[0365]一部の実施形態では、レトロトランスポザーゼはＬ１ＯＲＦタンパク質である。一部の実施形態では、レトロトランスポザーゼはＬ１ＯＲＦ２ｐタンパク質である。一部の実施形態では、レトロトランスポザーゼはＬ１ＯＲＦ１ｐタンパク質である。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ゲノムＤＮＡプライミング配列である。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、逆転写のための標的部位プライマーである。

[0366]一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡプライミング配列は、ポリＡ配列に隣接して少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡ配列に隣接する少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つのヌクレオチドは、逆転写のための標的部位プライマーを形成する。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡプライミング配列は、特異的ゲノムターゲッティングが可能な配列を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲはＳＩＮＥ配列を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲはＡｌｕ配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲはＡｌｕ配列を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲはＬ１配列を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲはＬ１配列を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子はゲノムＤＮＡにレトロ転位される。導入遺伝子は、ＣＦＰ、エンゲージャーまたは本明細書のどこかに記載される抗原性ポリペプチドをコードする配列を含むことができる。一部の実施形態では、導入遺伝子はトランスでレトロ転位される。一部の実施形態では、導入遺伝子はシスでレトロ転位される。一部の実施形態では、導入遺伝子は特異的ゲノム遺伝子座でレトロ転位される。一部の実施形態では、本方法は、導入遺伝子の３’末端に隣接して１つまたは複数の終止コドンをさらに含む。一部の実施形態では、導入遺伝子の３’末端に隣接する１つまたは複数の終止コドンは、導入遺伝子に作動可能に連結される。一部の実施形態では、導入遺伝子の３’末端に隣接する１つまたは複数の終止コドンは、タンデムに配置される。一部の実施形態では、導入遺伝子の３’末端に隣接する１つまたは複数の終止コドンは、別個の読み枠に配置される。一部の実施形態では、本方法は、骨髄細胞にＬ１－ＯＲＦ２をコードする核酸を導入することをさらに含む。

[0367]一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、キメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸、および１つまたは複数のさらなるタンパク質またはペプチドをコードする１つまたは複数のさらなる核酸を骨髄細胞に導入することを含む。例えば、本方法は、ＣＡＲをコードする核酸および第２のタンパク質またはペプチドをコードする第２の核酸を骨髄細胞に導入することを含む。例えば、本方法は、ＣＡＲをコードする核酸、および第２のタンパク質または第２のペプチドをコードする第２の核酸、および第３のタンパク質または第３のペプチドをコードする第３の核酸を骨髄細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現の増加を促進するために、１つまたは複数のさらなるタンパク質またはペプチドをコードする１つまたは複数のさらなる核酸を骨髄細胞にさらに導入することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなる核酸は骨髄細胞のための増殖因子をコードすること、または食作用機能もしくは任意の他の関連した機能を増強することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなる核酸は、化学向性を正に調節するタンパク質をコードすることができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなる核酸は、骨髄細胞に組み込まれる導入遺伝子の発現を増強するタンパク質をコードすることができる。

[0368]一実施形態では、１つまたは複数のさらなる核酸は、ギャップジャンクションタンパク質をコードする核酸を含む。一実施形態では、ギャップジャンクションタンパク質の同時発現は、骨髄細胞に組み込まれるＣＡＲ導入遺伝子の発現を増強する。ギャップジャンクションは動的構造であり、擬似結晶性アレイに組織されるコネキシンで構成される、何百から何千のチャネルからなる。これらの細胞間構造は、イオンおよび小さい代謝産物およびさらに核酸の通行を可能にすることによって、隣接細胞が直通で係合するのを許す。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなる核酸は、接着分子をコードする。細胞接着分子は、細胞が互いとおよび細胞外マトリックスに接着することを可能にする能力を有し、さらに、細胞が互いと、およびそれらの環境と相互作用し、通信することも可能にし、それによって、増殖、遺伝子発現、分化、アポトーシスおよび移動を含む様々な細胞機能を調節する。例示的な接着分子には、インテグリンファミリーのメンバー、セレクチン、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するメンバーおよびＣＤ４４ファミリーのメンバーが限定されずに含まれる。一部の実施形態では、例えば、ＩＣＡＭ－１をコードする第２の核酸配列が骨髄細胞に導入され、同じ細胞の中でＣＡＲと同時発現される。一部の実施形態では、ＶＣＡＭ－１をコードする第２の核酸配列は、ＣＡＲと一緒に骨髄細胞の中で同時発現される。一部の実施形態では、第２の核酸はセレクチンをコードする。一部の実施形態では、第２の核酸は、ＣＤ４９ａ／ＣＤ２９、またはＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、またはＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、またはＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、またはＣＤ４９ｅ／ＣＤ２９、またはＣＤ４９ｆ／ＣＤ２９をコードする。一部の実施形態では、第２のタンパク質またはペプチドまたはさらなるタンパク質ペプチドをコードする第２の核酸および／または任意のさらなる核酸はベクターに、例えば発現ベクターに含まれ、発現ベクターは、制御される発現、例えば転写「オン－オフ」スイッチによって制御される発現のために設計することができる調節エレメントを有する。転写オン－オフスイッチを有する例示的なベクターは、当業者に公知であるかまたは当業者が容易に考案することができる、テトラサイクリンで調節される系（Ｔｅｔ－オン、Ｔｅｔ－オフ系）を含むことができる。

[0369]一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなる核酸、例えば第２の核酸は、コネキシンをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなる核酸は、コネキシン４３をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、コネキシン４３をコードする核酸は発現ベクターにパッケージされ、ベクターは、コネキシンをコードする核酸領域に作動可能に連結される、プロモーター、場合によりエンハンサー、５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲ、３’ＵＴＲの安定化部分、例えばＢＧＨ３’領域、ならびにポリＡポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、コネキシン４３は細胞中で過剰発現される。一部の実施形態では、コネキシンをコードする核酸は、キメラ抗原受容体ＣＡＲをコードする核酸と別である。一部の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸はＣＡＲと異なるベクターにある。一部の実施形態では、ＣＡＲは裸の核酸として骨髄細胞に送達されるが、ＣＡＲをコードする１つの核酸を含む１つまたは複数の核酸は発現ベクターの中で発現される。一部の実施形態では、発現ベクターはＣＭＶプロモーターを含む。一部の実施形態では、実施形態コネキシン４３は過剰発現される。一部の実施形態では、第２のタンパク質またはペプチドまたはさらなるタンパク質ペプチドをコードする第２の核酸および／または任意のさらなる核酸はベクターに、例えば発現ベクターに含まれ、発現ベクターは、制御される発現、例えば転写「オン－オフ」スイッチによって制御される発現のために設計することができる調節エレメントを有する。転写オン－オフスイッチを有する例示的なベクターは、当業者に公知であるかまたは当業者が容易に考案することができる、テトラサイクリンで調節される系（Ｔｅｔ－オン、Ｔｅｔ－オフ系）を含むことができる。

[0370]一部の実施形態では、核酸、例えばキメラタンパク質をコードする組換え核酸は、化学的トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって骨髄細胞に導入される。一部の実施形態では、核酸はエレクトロポレーションによって骨髄細胞に導入される。

[0371]一部の実施形態では、核酸はｍＲＮＡである。
[0372]一部の実施形態では、ｍＲＮＡは療法のために対象に直接的に注射される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは脂質に封入される。一部の実施形態では、ＲＮＡはｉｎｖｉｖｏで導入されたときに骨髄細胞による優先的取り込みを促進するために改変される。ＲＮＡ改変は、グリコシル化を含むことができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、食細胞によって取り込まれる前に循環中での長期安定性のためにグリコシル化によって特異的に改変される。

[0373]一部の実施形態では、核酸は対象に静脈内注射される。
[0374]一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、１つまたは複数の内因性遺伝子の発現を低減するようにさらに操作することができる。一部の実施形態では、操作は、ＣＡＲをコードする核酸を導入する前か後に、内因性遺伝子を骨髄細胞のゲノムレベルで編集することを含むことができる。例えば、骨髄細胞の１つまたは複数の機能を増強するために、骨髄細胞で遺伝子またはその調節断片を編集することができる。

[0375]一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、ＣＡＲを発現しない細胞と比較してサイトカインおよびケモカインの生成の増加を示す。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ３、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－２３、ＴＮＦ、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＣＳＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ１７、ＩＰ－１０、ＲＡＮＴＥＳ、インターフェロンおよびその組合せからなる群から選択される。

[0376]一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、ＣＡＲを発現しない細胞と比較してエフェクター活性の増加を示す。
[0377]一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、ＣＡＲを発現しない細胞と比較して、食作用のＣＤ４７媒介の阻害への抵抗性の増加を示す。

[0378]一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、ＣＡＲを発現しない細胞と比較して、食作用のＬＩＬＲＢ１媒介の阻害への抵抗性の増加を示す。
[0379]一部の実施形態では、細胞外ドメインはＩｇ結合性ドメインを含む。

感染性疾患療法のための骨髄細胞
[0380]一態様では、本明細書に記載される骨髄細胞は、感染性疾患を処置するための治療的に有効な細胞を開発するために使用される。骨髄細胞は、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、ある特定の原虫感染症などの感染症を処置するための強力なツールである可能性がある。一実施形態では、本発明に記載されるように単離される骨髄細胞は、病原細菌の上の抗原に結合することができる細胞外抗原結合性ドメイン、ならびに食作用を誘発および／または増強し、および／または骨髄細胞の中のインフラマソーム成分を活性化する細胞内ドメインを有するキメラ抗原性受容体（ＣＡＲ）を発現するように、さらに操作または改変される。

[0381]一部の実施形態では、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）などの細菌表面抗原に特異的である細胞外結合性ドメインを有するＣＡＲを設計することができ、結核菌の食菌で有益である可能性がある。結核菌などの病原体を効果的に食菌する骨髄細胞は、抗原をリンパ球に提示し、長期免疫応答および免疫記憶を起こさせることもできる。活性化により骨髄細胞による食作用を増強する細胞内シグナル伝達ドメインに作動可能に連結されている、例えば肺炎球菌、インフルエンザ菌または髄膜炎菌からの抗原に特異的である細胞外結合性ドメインを有するＣＡＲを設計することができる。

[0382]一部の実施形態では、ＣＡＲは、ウイルス抗原を標的にした、ウイルスに向けられた結合性ドメインを含むことができる。一部の実施形態では、ウイルス抗原はインフルエンザ抗原、例えばＨＡ（血球凝集素）抗原（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５）、ノイラミニダーゼ抗原（例えば、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３など）またはマトリックスタンパク質抗原（Ｍ１）、イオンチャネルタンパク質（Ｍ２）である。本明細書に記載される例示的な抗原に向けられるＣＡＲを発現する骨髄細胞は、インフルエンザに対する骨髄細胞をベースとしたワクチンとして有益かもしれない。

[0383]一部の実施形態では、ＣＡＲはＨＢＶタンパク質に向けられる結合性ドメインを含むことができ、ＣＡＲを発現する骨髄細胞は骨髄細胞をベースとしたＨＢＶワクチンの開発で有益かもしれない。例示的なＨＢＶ抗原には、Ｍ－ＨｂｓＡｇ、Ｓ－ＨＢｓＡｇおよびＬ－ＨＢｓＡｇが限定されずに含まれる。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のキャプシドタンパク質に向けられた結合性ドメインを含むことができる。

[0384]一実施形態では、ＣＯＶＩＤパンデミックを引き起こす、新規コロナウイルス－１９または２０１９－ｎＣＯＶ－２を限定されずに含むコロナウイルスに対して強力なＴ細胞応答を生成することができる。コロナウイルス抗原、例えばＳタンパク質抗原、ＮＳＰタンパク質抗原、Ｅタンパク質抗原、Ｍタンパク質抗原、Ｎタンパク質抗原またはＮＳＰ抗原を発現する骨髄細胞が本明細書で企図され、ここで、コロナウイルス抗原は組換え核酸によってコードされる。ｎＣＯＶ－２抗原、例えばＳタンパク質抗原、ＮＳＰタンパク質抗原、Ｅタンパク質抗原、Ｍタンパク質抗原、Ｎタンパク質抗原またはＮＳＰ抗原に向けられるＣＡＲを発現する骨髄細胞も本明細書で企図される。

[0385]一部の実施形態では、病原体に向けられるＣＡＲを発現する骨髄細胞療法は、食作用および排除による初期の病原体負荷を低減しつつ、宿主で強力なＢ細胞応答を編成するのを助けることができる。

[0386]一部の実施形態では、病原体に向けられるＣＡＲを発現する骨髄細胞療法は、食作用および排除による初期の病原体負荷を低減しつつ、宿主で強力なＴ細胞応答を編成するのを助けることができる。

[0387]一部の実施形態では、Ｔ細胞活性化のための抗原をｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏでその表面に提示する骨髄細胞が本明細書で企図される。一部の実施形態では、骨髄細胞は、外因性または組換えの病原体抗原を含むか、提示するか、発現する。一部の実施形態では、骨髄細胞は、外因性または組換えのウイルス抗原を含むか、提示するか、発現する。一部の実施形態では、骨髄細胞は、外因性または組換えの細菌抗原を含むか、提示するか、発現する。一部の実施形態では、骨髄細胞は、外因性または組換えの腫瘍抗原を含むか、提示するか、発現する。

[0388]一部の実施形態では、骨髄細胞は、ワクチン接種のために治療的に有効である。一部の実施形態では、骨髄細胞は１つまたは複数の特異的抗原を積んでいる。一部の実施形態では、骨髄細胞は、本開示に記載される前駆細胞である。一部の実施形態では、骨髄細胞はＣＤ１４＋である。一部の実施形態では、骨髄細胞はＣＤ１６－である。一部の実施形態では、骨髄細胞はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－である。一部の実施形態では、骨髄細胞はＣＣＲ２＋である。

[0389]一部の実施形態では、骨髄細胞は、１つまたは複数の外因性または組換えのウイルス抗原を含むか、提示するか、発現する。
[0390]一部の実施形態では、骨髄細胞は、外因性または組換えのインフルエンザ抗原、例えばＨＡ抗原、ＮＡ抗原、Ｍ１抗原、Ｍ２抗原、ＮＰ抗原、ＰＢ１抗原、ＰＢ２抗原、ＰＡ抗原またはその組合せを含むか、提示するか、発現する。一部の実施形態では、インフルエンザ抗原を発現する骨髄細胞は、本開示に記載される前駆細胞である。一部の実施形態では、骨髄細胞はＣＤ１４＋である。一部の実施形態では、骨髄細胞はＣＤ１６－である。一部の実施形態では、骨髄細胞はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－である。一部の実施形態では、骨髄細胞はＣＣＲ２＋である。

[0391]一部の実施形態では、骨髄細胞は、外因性または組換えの２０１９－ｎＣＯＶ２抗原を含むか、提示するか、発現する。一部の実施形態では、治療的に有効な骨髄細胞は、２０１９－ＣＯＶ２に特異的である１つまたは複数の抗原を積んでいる。一部の実施形態では、２０１９－ｎＣＯＶ２抗原を含むか、提示するか、発現する治療的に有効な骨髄細胞は、本開示に記載される前駆骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的に有効な骨髄細胞はＣＤ１４＋である。一部の実施形態では、骨髄細胞はＣＤ１６－である。一部の実施形態では、骨髄細胞はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－である。一部の実施形態では、骨髄細胞はＣＣＲ２＋である。一部の実施形態では、コロナウイルスワクチン接種のための治療的に有効な骨髄細胞は、外因性または組換えのレプリカーゼタンパク質抗原、Ｓタンパク質抗原、ＮＳＰタンパク質抗原、Ｅタンパク質抗原、Ｍタンパク質抗原、Ｎタンパク質抗原またはその組合せを含むか、提示するか、発現する。

[0392]一実施形態では、ＣＯＶＩＤパンデミックを引き起こす、新規コロナウイルス－１９または２０１９－ｎＣＯＶ－２を限定されずに含むコロナウイルスに対して強力なＴ細胞応答を生成することができる。ｎＣＯＶ－２（互換的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）抗原、例えばＳタンパク質抗原、ＮＳＰタンパク質抗原、Ｅタンパク質抗原、Ｍタンパク質抗原、Ｎタンパク質抗原またはＮＳＰ抗原に向けられるＣＡＲを発現する骨髄細胞が本明細書で企図される。

[0393]一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードする融合タンパク質をコードする組換え核酸が本明細書に記載される骨髄細胞に導入され、例えば、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－は骨髄細胞である。一部の実施形態では、組換え抗原または抗原（複数）は、骨髄細胞、例えばＣＤ１４＋およびＣＤ１６－を発現する骨髄細胞によってエンドソームでプロセシングされる。

[0394]一部の実施形態では、ワクチンに開発することができる組成物が本明細書で提供され、例示的なワクチン組成物は組換え核酸を含む細胞を含むことができる。
[0395]一部の実施形態では、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、７－メチル－ＧＴＰキャップでキャップされる５’末端を含む。一部の実施形態では、改変されたＲＮＡの約７０％は、７－メチル－ＧＴＰキャップを有する。一部の実施形態では、改変されたＲＮＡの約８０％は、７－メチル－ＧＴＰキャップを有する。一部の実施形態では、改変されたＲＮＡの約９０％は、７－メチル－ＧＴＰキャップを有する。一部の実施形態では、改変されたＲＮＡの９０％超は、７－メチル－ＧＴＰキャップを有する。一部の実施形態では、３’－ポリＡテールを含む融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ。一部の実施形態では、ポリＡテールは長さが２０～２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは長さが５０～１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは長さが５０ヌクレオチド未満か、それを超えるかまたは約５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは長さが１００ヌクレオチド未満か、それを超えるかまたは約１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリＡテールは長さが２００ヌクレオチド未満か、それを超えるかまたは約２００ヌクレオチドである。

[0396]一部の実施形態では、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、２’－Ｏメチル化ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、２’－Ｏメチル化ヌクレオチドは第１のヌクレオチドである。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、５－メトキシウリジンを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、１つまたは複数の５－メトキシウリジンによる１つまたは複数のウリジンヌクレオチドの置換を含む。

[0397]一部の実施形態では、その後骨髄細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞を含む様々なリンパ球細胞型を活性化することができるように、骨髄細胞を活性化するために使用することができる、向上した免疫原性薬剤が開示される。

[0398]一部の実施形態では、抗原は骨髄細胞の中で発現され、骨髄細胞はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－骨髄細胞である。抗原は、組換え抗原であってよい。抗原は、それがＭＨＣプロセシング経路に向けられるように設計することができる。抗原は、それが分泌経路に向けられるように設計することができる。抗原は、それがＭＨＣプロセシング経路および分泌経路の両方に向けられるように設計することができる。そのような抗原性デザインをコードするのに好適な例示的組換え核酸は、抗原のプロセシングおよび提示のためにエンドソームコンパートメントへの同時翻訳トラフィッキングを促進するペプチドに抗原性ペプチドが融合される、融合タンパク質をコードする構築物であってよい。一部の実施形態では、エンドソーム標的化配列は、ＬＡＭＰタンパク質、例えばＬＡＭＰ１またはＬＡＭＰ２に由来する標的化配列であってもよい。

[0399]例示的なＬＡＭＰ１配列は、ＬＩＰＩＡＶＧＧＡＬＡＧＬＶＬＩＶＬＩＡＹＬＶＧＲＫＲＳＨＡＧＹＱＴＩ（配列番号５４）である。ペプチド配列は、抗原配列のＣ末端に融合させることができる。

[0400]一部の実施形態では、構築物は、分泌のための標的であるシグナル配列またはリーダー配列を含む抗原をコードする配列を含むことができる。そのような配列は、分泌シグナル配列である。分泌されるタンパク質はリーダーまたはシグナル配列を通常Ｎ末端に含み、それは長さが約８～２０アミノ酸である。例示的な分泌タンパク質は、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、アルブミン等である。そのような配列は、天然の抗原シグナル配列を置き換えるために使用することができる。他の実施形態では、抗原配列のＮ末端にシグナル配列を加えることができる。例示的な分泌シグナルペプチド配列はヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）シグナル伝達配列：ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号７）である。別の例示的な分泌シグナル配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖シグナル伝達配列：ＭＤＷＴＷＲＶＦＣＬＬＡＶＴＰＧＡＨＰ（配列番号５７）、またはヒト免疫グロブリン軽鎖シグナル伝達配列：ＭＡＷＳＰＬＦＬＴＬＩＴＨＣＡＧＳＷＡ（配列番号５８）である。別の例示的な分泌シグナル配列は、ヒト血清アルブミンシグナル伝達配列：ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ（配列番号５９）である。別の例示的な分泌シグナル配列は、ヒトアズロシジンシグナル伝達配列：ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号６０）である。分泌を促進するために使用することができる例示的な分泌シグナルペプチドは：ヒトシスタチン：ＭＡＲＰＬＣＴＬＬＬＬＭＡＴＬＡＧＡＬＡ（配列番号６１）である。それがＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞を活性化するように、任意の抗原を細胞からの放出のために改変することができる。

[0401]一部の実施形態では、組換え核酸は、Ｔ２Ａ配列などの自己切断配列によって分離される複数の抗原をコードする。例示的な組換え構築物は、エンドソーム標的化タンパク質配列、例えばＬＡＭＰ１タンパク質配列に融合している抗原のコピー、および分泌シグナルを有する別のコピーを含む融合構築物であり、ここで、２つのコピーは、Ｔ２Ａ配列などの切断可能な配列によって分離される。

[0402]一部の実施形態では、組換え核酸は、エンドソーム標的化配列に融合させることができる１つまたは複数の抗原をコードすることができる。一部の実施形態では、組換え核酸は、少なくとも１つの分泌配列を含む１つまたは複数の抗原をコードすることができる。

[0403]一部の実施形態では、組換え核酸は、エンドソーム標的化配列に融合される第１の抗原、および分泌配列を含む第２の抗原をコードする。一部の実施形態では、第１の抗原および第２の抗原は同じ遺伝子によってコードされる。

[0404]一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、長さが１００～１０，０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、長さが１０００～５０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、長さが５００～２０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、長さが５００～８０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、長さが３０００ヌクレオチド未満かそれを超えるか、または約３０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、長さが４０００ヌクレオチド未満かそれを超えるか、または約４０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、長さが５０００ヌクレオチド未満かそれを超えるか、または約５０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、長さが６０００ヌクレオチド未満かそれを超えるか、または約６０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、長さが７０００ヌクレオチド未満かそれを超えるか、または約７０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、長さが８０００ヌクレオチド未満かそれを超えるか、または約８０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、長さが９０００ヌクレオチド未満かそれを超えるか、または約９０００ヌクレオチドである。

[0405]一部の実施形態では、組換え核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）の１つまたは複数のＴ細胞エピトープおよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）の１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含む融合タンパク質をコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、リソソーム標的化部分であってよいタグに融合される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）の１つまたは複数のＴ細胞エピトープおよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）の１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含む。

[0406]組換え核酸によってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の例示的なＴ細胞エピトープは、配列：ＭＲＡＬＷＶＬＧＬＣＣＶＬＬＴＦＧＳＶＲＡ（配列番号５０）を有するペプチドであってよい。

[0407]一部の実施形態では、核酸、例えばｍＲＮＡまたはプラスミドは、配列番号５１：ＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＰＰＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱ（配列番号５１）で表されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１つまたは複数のＴ細胞エピトープをコードする。

[0408]一部の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１つまたは複数のＴ細胞エピトープをコードする核酸、例えばｍＲＮＡまたはプラスミドは、配列番号５２：ＩＳＡＭＶＲＳ（配列番号５２）で表される配列を有するペプチドをコードする。

[0409]一部の実施形態では、核酸、例えばｍＲＮＡまたはプラスミドは、配列番号５３：ＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＱＱＱＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＱＫＲＴＡＴＫＡＹＮＶＴＱＡＦＧＲＲＧＰＥＱＴＱＧＮＦＧＤＱＥＬＩＲＱＧＴＤＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩＧＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＡＡＩＫＬＤＤＫＤＰＮＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰＰＴＥＰＫＫＤＫＫＫＫＡＤＥＴＱＡＬＰＱＲＱＫＫＱＱＴＶＴＬＬＰＡＡＤＬＤＤＦＳＫＱＬＱＱＳＭＳＳＡＤＳＴＱＡ（配列番号５３）で表されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１つまたは複数のＴ細胞エピトープをコードする。

[0410]一部の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１つまたは複数のＴ細胞エピトープをコードする核酸、例えばｍＲＮＡまたはプラスミドは、配列番号５４：ＬＩＰＩＡＶＧＧＡＬＡＧＬＶＬＩＶＬＩＡＹＬＶＧＲＫＲＳＨＡＧＹＱＴＩ（配列番号５４）で表される配列を有するペプチドをコードする。

[0411]一部の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１つまたは複数の抗原をコードする核酸、例えばｍＲＮＡまたはプラスミドは、配列番号５５：ＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＧａｇｃＧＴａｃｇｔＧＣＴ（配列番号５５）の配列を含む。

[0412]一部の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１つまたは複数の抗原をコードする核酸、例えばｍＲＮＡまたはプラスミドは、配列番号５６：ＧＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＴＡＴＴＣＣＡＡＣＡＡＣＴＣＴＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＧＣＧＴＣＡＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＧＣＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＴＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＧＧＡＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＣＡＡＡＡＡＴＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＣＡＣＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＴＡＧＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＴＴＡＴＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＧＡＴＧＣＣＧＧＣＴＴＴＡＴＣＡＡＡＣＡＧＴＡＴＧＧＣＧＡＴＴＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＴＡＧＣＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧＡＣＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＴＡＴＡＧＡＴＴＣＡＡＣＧＧＡＡＴＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＴＡＴＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＴＡＡＣＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＣＡＴＣＧＧＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＴＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＡＡＣＧＣＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴＴＧＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＡＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＧＣＡＡＡＣＣＴＡＣＧＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＣＡＡＴＣＴＣＧＣＣＧＣＴＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＴＡＡＡＣＧＣＧＴＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＴＡＴＣＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＡＴＧＴＧＡＣＡＴＡＣＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＣＣＡＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＣＴＴＣＴＡＣＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＴＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＧＴＧＧＣＡＡＴＴＧＴＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＧＡＡＴＣＧＴＧＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴＧＴＡＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＴＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴＡＡＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＴＣＧＡＣＡＧＡＣＴＧＡＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＣＧＧＣＡＡＡＴＡＣＧＡＧＣＡＧ（配列番号５６）の配列を含むことができる。

治療的に有効な骨髄細胞の作製方法
骨髄細胞の単離および／または富化
[0413]骨髄細胞は、ヒト末梢血から単離することができる。一部の実施形態では、骨髄細胞は末梢血の直接的引き抜きによって対象から単離することができる。一部の実施形態では、骨髄細胞は容器中の利用可能な白血球分離試料から単離することができる。一部の実施形態では、骨髄細胞の供与源として、健康ドナーからの末梢血が使用される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは健康なドナーの血液試料から単離される。

[0414]一部の実施形態では、ＰＢＭＣは無菌の閉鎖系の中に単離される。
[0415]一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、単球または単球前駆細胞の上の細胞表面分子に結合する抗体と接触させることができ、抗体は目的の細胞を単離するために使用される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣ細胞は、ＰＢＭＣの中の特異的細胞、抗体が結合する特異的細胞表面マーカーを発現する細胞、に結合する抗体でコーティングされたビーズと接触させる。一部の実施形態では、抗原は固定化すること、例えば、容器もしくはカラムの表面に接着させるか、またはＰＢＭＣ細胞懸濁液の中を通過させたとき、抗体が結合する細胞表面分子を発現する細胞を捕捉するビーズの上に付着させることができる。この方法は、正の選択方法と呼ばれる。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは抗ＣＤ１４抗体または抗ＣＤ１４抗体でコーティングされたビーズと接触させる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるように目的の骨髄細胞の上で発現される表面マーカーの１つまたは複数に結合することができる以下の抗体の１つまたは複数が正の選択のために使用されるが、そのようなマーカーは、ＣＤ６４、ＣＤ１９２（ＣＣＲ２）、ＣＤ１９５（ＣＣＲ５）、ＣＤ１２０ａ（ＴＮＦＲ１）およびＣＤ１２０ｂ（ＴＮＦＲ２）からなるリストに限定されない。一部の実施形態では、本明細書で使用されるように任意の抗体は完全抗体、またはその機能的断片、Ｆａｂ’、組換え抗体、工学操作された抗体、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディまたは他の工学操作された捕捉分子であってよい。一部の実施形態では、結合により１つまたは複数の細胞表面分子を活性化しない抗体、および／または骨髄細胞で緊張性シグナル伝達へ導かない抗体を工学操作することができる。

[0416]抗体でコーティングされたビーズに結合した細胞は、密度勾配遠心分離によって；磁気分離（ビーズは磁気ビーズである）によって；または、任意の他の好適な手段によって、例えば、表面に前もって固定化されたビーズを使用し、移動相として固定化されたビーズの床の上にＰＢＭＣを通過させることによって分離することができる。ビーズに結合した細胞から未結合の細胞を分離し、好適なバッファーで洗浄した後、細胞を好適な方法によって、例えば、好適なバッファーを使用して、または抗体でコーティングしたビーズへの細胞の結合をかい離させるペプチダーゼもしくは任意の他の好適な酵素もしくは化合物を使用して、リガンド－抗体結合をかい離させることによって、ビーズから溶出させる。細胞は、さらなる分析のために回収される。

[0417]一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、単球でも単球前駆細胞でもない細胞で発現される細胞表面分子に結合する抗体と接触させることができ、抗体は、ＰＢＭＣから望ましくない細胞を除去し、目的の残った細胞を単離するために使用される。これは、負の選択方法と呼ばれる。一部の実施形態では、この方法は、例えば、単球は、抗体などの細胞表面結合性分子との接触により活性化させることができるという事実を考慮すると好ましいかもしれない。早発性の活性化は、負の選択によって回避することができる。一部の実施形態では、本発明と関連した負の選択は、リンパ球、ＮＫ細胞、樹状細胞、成熟マクロファージおよび／または消耗した食細胞の１つまたは複数を除去することによって達成することができる。一部の実施形態では、本方法は、最後に採取される残りの細胞が本明細書に記載される単球または前駆単球細胞であるように、任意の生体試料からのリンパ球、ＮＫ細胞、樹状細胞、成熟マクロファージおよび／または消耗した食細胞の１つまたは複数の選択的枯渇を含む。一部の実施形態では、上記の前記細胞を除去するために好適に使用される１つまたは複数の抗体は、限定されずにＣＤ３抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ５６抗体を含むことができる。一部の実施形態では、例えば、負の選択は、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体ビーズと接触させることによって目的の細胞を得るために実行される。一部の実施形態では、例えば、負の選択は、ＰＢＭＣを抗ＣＤ１６抗体ビーズと接触させることによって目的の細胞を得るために実行される。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体が使用され、例えば抗ＣＤ１９抗体でコーティングされたビーズが使用される。一部の実施形態では、負の選択のために抗ＣＤ５６抗体を使用することができる。一部の実施形態では、負の選択のために抗ＴＮＦＲ２抗体を使用することができる。一部の実施形態では、ＣＤ３結合抗体、ＣＤ８結合抗体、ＣＤ１６結合抗体、ＣＤ１９結合抗体、ＣＤ５６結合抗体、ＣＸ３ＣＲ１（フラクタルキン）結合抗体およびＴＮＦＲ２結合抗体を含む選択肢からの抗体の任意の１つまたは任意の数の組合せを使用することができる。

[0418]１つの決定的な問題はＰＢＭＣを得るための密度勾配の必要性であるが、その理由は、ＧＭＰ目的のために密度勾配が直ちに利用できなく、および／または閉鎖系で容易に実行することができないからである。プラスチック接着に頼る方法は比較的安価であるが、抗ｈｕＣＤ１４－ミクロビーズによる正の選択または負の選択のような他のアプローチは経済的であるとは言えない。さらに、正の選択では、異種抗体の使用に対するさらなる懸念がある。一部の実施形態では、単球は、細胞を早期に活性化することを回避するために自然のままで単離される。このプロセスは負の選択であると言うこともでき、エラトリエーションによって実行することができる。

[0419]単球のエラトリエーションは、閉鎖系の中で大量の自然のままの単球の迅速で安価な単離または富化を可能にするＥｌｕｔｒａｋで実行することができる。末梢血単球は、細胞分離器（Ｅｌｕｔｒａｋ、ＧａｍｂｒｏＢＣＴ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）および４０ｍｌエラトリエーションチャンバーを有する１回きりの機能的に密封された使い捨て式セットを使用して、未固定化白血球分離生成物から直接的に富化することができる。細胞分離は、細胞のサイズおよびまたは密度に依存する沈降速度に基づいて起こる。白血球分離生成物は、細胞注入ポンプを使用してエラトリエーションチャンバーにロードし、２４００ｒｐｍの速度で遠心分離にかけることができる。その後、遠心分離速度を一定に保ち、前もって取り付けた収集バッグへの特異的細胞分画のエラトリエーションを可能にするために、２つの３ｌプーリングバッグ（Ｔ３００６、Ｃｅｌｌ－ＭａｘＧｍｂＨ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に含有されるエラトリエーション媒体（ＰＢＳ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ、１％ヒト血清アルブミンを追加；Ａｖｅｎｔｉｓ－Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のフローを段階的に増加することができる。

[0420]一部の実施形態では、少なくとも１０^８から約１０^１２のＰＢＭＣが必要であり、そこから目的の細胞が単離（富化）される。一部の実施形態では、目的の細胞はＣＤ１４＋細胞である。一部の実施形態では、目的の細胞はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞である。一部の実施形態では、目的の細胞はＣＤ１４またはＣＤ１６以外の細胞表面タンパク質の高いレベルを発現することができる、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞である。一部の実施形態では、目的の細胞は高レベルのＣＣＲ２を発現することができる。一部の実施形態では、目的の細胞の単離または富化より前の全細胞数は、約１０^８、５×１０^８、１０^９、５×１０^９、１０^１０、５×１０^１０、１０^１１、５×１０^１１、１０^１２、５×１０^１２個の細胞またはそれより多くてもよい。一部の実施形態では、目的の細胞の単離または富化の前のＰＢＭＣの総数は、少なくとも１０^９から約１０^１２個の細胞であってよい。一部の実施形態では、目的の細胞の単離または富化の前の全細胞数は、約２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９または１０^１０個の細胞；約２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０個の細胞または１０^１１個の細胞；約２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１または１０^１２個の細胞；約５×１０^１２またはそれより多くてもよい。

[0421]一部の実施形態では、例えば前記のように抗体でコーティングされたビーズを使用した単離または富化手順の後に回収される目的の細胞は、単離または富化の前の時点でカウントされる全ＰＢＭＣの分画であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、少なくとも１０^７個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、少なくとも１０^８個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、少なくとも１０^９個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、少なくとも１０^１０個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約２×１０^７個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約３×１０^７個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約４×１０^７個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約５×１０^７個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約６×１０^７個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約７×１０^７個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約８×１０^７個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約９×１０^７個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約１０^８個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約２×１０^８個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約３×１０^８個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約４×１０^８個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約５×１０^８個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約６×１０^８個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約７×１０^８個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約８×１０^８個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約９×１０^８個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約１０^９個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約２×１０^９個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約５×１０^９個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約８×１０^９個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約９×１０^９個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約１０^１０個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約５×１０^１０個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約１０^１１個の細胞であってよい。一部の実施形態では、単離または富化の後の目的の細胞は、約５×１０^１１個の細胞またはそれより多くてもよい。

[0422]一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を２倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を３倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を４倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を５倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を６倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を７倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を８倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を９倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を１０倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を１２倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を１４倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を１５倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を２０倍を超えて富化することができる。一部の実施形態では、単離または富化プロセスは、目的の細胞を２５倍を超えて富化することができる。

単離した細胞の特徴付け
[0423]目的の細胞の単離または富化の後、細胞は特徴付けられる。ほとんどの場合、回収された目的の細胞からのアリコートは、性質および機能的特徴をサンプリングするためにさらなるアッセイにかけられる。細胞は、好適な細胞生存能力アッセイを使用して細胞生存能力について検査される。例示的なアッセイには、トリパンブルー排除アッセイ、ＬＤＨ放出アッセイおよびＮＣ２００アッセイが含まれる。一部の実施形態では、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒＮＣ２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）などの自動生細胞カウンターが使用され、ここでは生細胞だけが数えられ、全細胞数は全生細胞数に等しい。

[0424]一部の実施形態では、回収された細胞のアリコートを使用してフローサイトメトリーアッセイなどの好適なアッセイによって決定したとき、単離された細胞の少なくとも５０％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の少なくとも６０％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の少なくとも７０％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％または８０％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％または９０％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９１％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９２％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９３％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９４％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９５％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９６％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９７％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９８％より多くがＣＤ１４＋であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９９％より多くがＣＤ１４＋であってよい。

[0425]回収された細胞のアリコートを使用してフローサイトメトリーアッセイによって決定したとき、単離された細胞はＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、回収された細胞のアリコートを使用してフローサイトメトリーアッセイによって決定したとき、単離された細胞の少なくとも５０％はＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の少なくとも６０％はＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の少なくとも７０％はＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％または８０％より多くがＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％または９０％より多くがＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９１％より多くがＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９２％より多くがＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９３％より多くがＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９４％より多くがＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９５％より多くがＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９６％より多くがＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９７％より多くがＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９８％より多くがＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離された細胞の９９％より多くがＣＤ１６－であってよい。

[0426]一部の実施形態では、単離または富化された細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％または７０％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離または富化された細胞の少なくとも７５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離または富化された細胞の少なくとも８０％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離または富化された細胞の少なくとも８５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離または富化された細胞の少なくとも９０％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－であってよい。一部の実施形態では、単離または富化された細胞の少なくとも９５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－であってよい。

[0427]回収された細胞のアリコートを使用してフローサイトメトリーアッセイによって決定したとき、単離または富化された細胞は少なくとも５％未満のＣＤ３＋細胞を含むことができる。単離された細胞は、少なくとも４％未満のＣＤ３＋細胞を含むことができる。単離された細胞は、少なくとも３％未満のＣＤ３＋細胞を含むことができる。単離された細胞は、少なくとも２％未満のＣＤ３＋細胞を含むことができる。回収された細胞のアリコートを使用してフローサイトメトリーアッセイによって決定したとき、単離された細胞は少なくとも５％未満のＣＤ１９＋細胞を含むことができる。単離された細胞は、少なくとも４％未満のＣＤ１９＋細胞を含むことができる。単離された細胞は、少なくとも４％未満のＣＤ３＋細胞を含むことができる。単離された細胞は、少なくとも３％未満のＣＤ１９＋細胞を含むことができる。単離された細胞は、少なくとも２％未満のＣＤ１９＋細胞を含むことができる。回収された細胞のアリコートを使用してフローサイトメトリーアッセイによって決定したとき、単離された細胞の少なくとも５％はＣＤ５６－細胞であってよい。単離された細胞の少なくとも４％はＣＤ５６－細胞であってよい。単離された細胞の少なくとも３％はＣＤ５６－細胞であってよい。単離された細胞の少なくとも２％はＣＤ５６－細胞であってよい。

[0428]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の１０％未満は樹状細胞である。例えば、細胞の集団は、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満の樹状細胞を含むことができる。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％はＣＣＲ２＋である。例えば、細胞の集団は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＣＲ２＋細胞を含むことができる。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％はＣＣＲ５＋である。例えば、細胞の集団は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＣＲ５＋細胞を含むことができる。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％はＣＤ１１ｂ＋である。例えば、細胞の集団は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１１ｂ＋細胞を含むことができる。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％はＣＤ６３＋である。例えば、細胞の集団は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ６３＋細胞を含むことができる。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％はＣＤ１６－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１６－細胞を含むことができる。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％はＣＤ５６－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ５６－細胞を含むことができる。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％はＣＤ３－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ３－細胞を含むことができる。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％はＣＤ１９－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１９－細胞を含むことができる。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも５０％はＣＤ４２ｂ－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ４２ｂ－細胞を含むことができる。一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の４０％未満はマクロファージ細胞である。例えば、細胞の集団は、３５％未満、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％またはそれ以下のマクロファージ細胞を含むことができる。

[0429]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも２５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ３－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ３－細胞を含むことができる。

[0430]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも２５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞を含むことができる。

[0431]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも２５％はＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－細胞を含むことができる。

[0432]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも２５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋である。例えば、細胞の集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋細胞を含むことができる。

[0433]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも２５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－細胞を含むことができる。

[0434]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも２５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ５６－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ５６－細胞を含むことができる。

[0435]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも２５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－細胞を含むことができる。

[0436]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも２５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－細胞を含むことができる。

[0437]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも２５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－でる。例えば、細胞の集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－細胞を含むことができる。

[0438]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも２５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－細胞を含むことができる。

[0439]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも２５％はＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－細胞を含むことができる。

[0440]一部の実施形態では、細胞集団中の細胞の少なくとも２５％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－である。例えば、細胞の集団は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上のＣＤ１４＋／ＣＤ１６－／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９－／ＣＤ４２ｂ－／ＣＤ５６－細胞を含むことができる。

[0441]以下の単離または富化細胞は、機能アッセイ、例えば食作用アッセイまたは化学向性アッセイによってさらに特徴付けることができる。一部の実施形態では、上記の特徴を有する細胞は、治療的に有効な骨髄細胞に開発するためにさらに前に進められる。細胞は単離もしくは富化の後に冷凍することができるか、または医薬組成物の調製のために次のステップに進めることができる。一部の実施形態では、骨髄細胞は、それを必要とする対象に投与する前に形質転換も活性化もされない。

[0442]一部の実施形態では、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞集団は、負の選択によって生体試料、例えば末梢血から、例えば白血球分離試料から単離し、その後、ＣＦＰタンパク質などの１つまたは複数の組換えタンパク質をコードする核酸を組み込むためにｉｎｖｉｔｒｏ（すなわち、ｅｘｖｉｖｏ）で操作する（例えば、工学操作する）ことができる。一部の実施形態では、骨髄細胞の工学操作は、トランスフェクションによる外因性核酸の組込み、または、外因性核酸、例えば組換え核酸のエレクトロポレーションもしくはヌクレオフェクションを含む。一部の実施形態では、核酸の組込みは、エレクトロポレーションによって実行される。核酸の組込みは、組換えタンパク質、例えばＣＦＰを発現する工学操作された細胞をもたらす。一部の実施形態では、組換えタンパク質を発現するＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞集団は、ｉｎｖｉｔｒｏで細胞を安定させるために、および細胞中の外来核酸の組込みからの回収のために、２～２０時間培養される。一部の実施形態では、細胞集団は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－である細胞を末梢血、例えばＰＢＭＣから得るための本明細書に記載される方法によって単離され、１～１０時間以内にエレクトロポレーションされる。一部の実施形態では、単離された集団から等分される試料は、細胞表面分子の生存能力および発現、例えばＣＤ１４発現、ＣＤ１６発現、ＣＤ１１ｂ発現、ＣＤ３発現、ＣＤ１９発現、ＣＤ５６発現、ＣＤ４２ｂ発現、ＣＤ６３発現、ＣＣＲ２発現、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ１発現について試験される。一部の実施形態では、細胞集団は、単離または富化から１時間以内にエレクトロポレーションされる。一部の実施形態では、細胞集団は、単離または富化の時間から２時間以内、１～３時間以内、２～４時間以内、１～５時間、３～６時間以内、６時間未満、８時間未満または１０時間未満以内にエレクトロポレーションされる。一部の実施形態では、エレクトロポレーションされた細胞集団は、（ｉ）対象に投与する前に、または（ｉｉ）将来の使用のために冷凍する前に最高でも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間、ｉｎｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、エレクトロポレーションされた細胞集団は、（ｉ）対象に投与する前に、または（ｉｉ）将来の使用のために冷凍する前に１２時間未満、ｉｎｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、エレクトロポレーションされた細胞集団は、（ｉ）対象に投与する前に、または（ｉｉ）将来の使用のために冷凍する前に１８時間未満、ｉｎｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、エレクトロポレーションされた細胞集団は、（ｉ）対象に投与する前に、または（ｉｉ）将来の使用のために冷凍する前に２４時間未満、ｉｎｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、エレクトロポレーションされた細胞集団は、（ｉ）対象に投与する前に、または（ｉｉ）将来の使用のために冷凍する前に０～２時間、ｉｎｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、本発明の方法により工学操作され、ｅｘｖｉｖｏで培養された細胞集団の少なくとも５０％は、ＣＦＰも発現するＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞を含む。一部の実施形態では、本発明の方法により工学操作され、ｅｘｖｉｖｏで培養された細胞集団は、ＣＦＰも発現するＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞である細胞を５０％を超えて含み、細胞集団は１０％未満の樹状細胞を含む。一部の実施形態では、本発明の方法により工学操作され、ｅｘｖｉｖｏで培養された細胞は、ＤＣ様表現型にもマクロファージ様表現型にも分化していない細胞、またはＣＤ１６＋もしくはＣＤ１４－細胞の表現型を有する細胞を７０～９０％を超えて含む。一部の実施形態では、細胞はさらなる分化可能性を保持する。一部の実施形態では、細胞はＭ１表現型にもＭ２表現型にも分極されず、ｉｎｖｉｖｏ投与されるときに分化する能力を保持する。

[0443]一部の実施形態では、骨髄は、対象に投与する時点で緊張性シグナル伝達を示さない。
[0444]一部の実施形態では、骨髄細胞は、対象に投与する前に、または外部の刺激により、例えばサイトカイン、または増殖因子で、または食作用の標的の存在下でｅｘｖｉｖｏで活性化する前に低い食作用を示す。一部の実施形態では、骨髄細胞は、対象に投与する前に、または外部の刺激により、例えばサイトカイン、または増殖因子で、または食作用の標的の存在下でｅｘｖｉｖｏで活性化する前に中等度の食作用を示す。一部の実施形態では、骨髄細胞は、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＴＮＦ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１またはその組合せのいずれか１つまたは複数への応答性を示す。

[0445]一部の実施形態では、骨髄細胞は、外部の刺激により、例えばサイトカイン、または増殖因子で、または食作用の標的の存在下でｅｘｖｉｖｏで活性化された後に増強した食作用を示す。一部の実施形態では、骨髄細胞は、外部の刺激により、例えばサイトカイン、または増殖因子で、または食作用の標的の存在下でｅｘｖｉｖｏで活性化した後に、成熟した活性化後マクロファージなどの活性化された最終分化骨髄細胞と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．５倍、１．７倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１４倍、１７倍、２０倍またはそれ以上増強された食作用を示す。一部の実施形態では、骨髄細胞は、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＴＮＦ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１またはその組合せのいずれか１つまたは複数によって例示されるサイトカインまたはケモカインへの応答性を示す。

[0446]一部の実施形態では、生体試料から単離される骨髄細胞は、Ｍ１またはＭ２系統にさらに分化させることができる。単離または富化の後の骨髄細胞が、ｉｎｖｉｖｏ投与の後にＭ１細胞へのさらなる分化の可能性を保持することが望ましい。

骨髄細胞の改変：
[0447]一部の実施形態では、骨髄細胞は治療的に有効な骨髄細胞を開発するためにさらに改変または操作することができる。単離された細胞は、その機能的および発達上の柔軟性、分化可能性および細胞生存能力を変更することなく、細胞内で遺伝子またはその断片を発現させることによって操作することができる。

[0448]一部の実施形態では、骨髄細胞は、細胞の中で非内因性ポリヌクレオチドを発現させることによって、治療的に有効な骨髄細胞を開発するためにさらに改変または操作することができる。非内因性ポリヌクレオチドは、タンパク質またはペプチドをコードすることができる。あるいは、非内因性ポリペプチドは、非コード配列、例えば阻害性ＲＮＡまたはモルホリノであってよい。

[0449]一部の実施形態では、骨髄細胞は、細胞のゲノム配列を安定して変更することによって、治療的に有効な骨髄細胞を開発するためにさらに改変または操作することができる。一部の実施形態では、骨髄細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ系を使用して骨髄細胞ゲノムを編集することによって操作される。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子を編集して遺伝子発現を静止することができる。一部の実施形態では、遺伝子を欠失させるように骨髄細胞が操作される。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子を編集して遺伝子発現を増強することができる。一部の実施形態では、遺伝物質がメッセンジャーＲＮＡの形で骨髄細胞に導入され、ここで、メッセンジャーＲＮＡはタンパク質またはペプチドをコードし、それによって骨髄細胞を治療的に有効にする。一部の実施形態では、骨髄細胞の中に核酸を導入するために、裸のＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用することができる。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）封入によって食細胞に導入される。ｍＲＮＡは一本鎖であり、コドン最適化することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは１つまたは複数の改変された、または非天然の塩基、例えば５’－メチルシトシン、またはプソイドウリジンもしくはメチルプソイドウリジンを含むことができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの５０％を超えるか約５０％のウリジン（「Ｕ」）残基は、メチルプソイドウリジンに変換することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは長さが５０～１０，０００塩基であってよい。一態様では、導入遺伝子はｍＲＮＡとして送達される。ｍＲＮＡは、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００塩基より多く含むことができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは長さが１０，０００塩基を超えてもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは長さが約１１，０００塩基であってよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは長さが約１２，０００塩基であってよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、融合タンパク質をコードする導入遺伝子配列を含む。ＬＮＰ封入ＤＮＡまたはＲＮＡは、マクロファージをトランスフェクトするために使用することができるか、または対象に投与することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは一時的トランスフェクションによってエフェクター骨髄細胞集団に組み込まれる。一部の実施形態では、一時的トランスフェクション方法は、ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを含む。一部の実施形態では、一時的トランスフェクションは化学的トランスフェクションを含む。一部の実施形態では、上記の方法の好適なプロトコールを使用したトランスフェクションのために、１～５，０００マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡを使用することができる。一部の実施形態では、トランスフェクションのために１～２，０００マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡを使用することができる。一部の実施形態では、トランスフェクションのために１～１，０００マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡを使用することができる。一部の実施形態では、トランスフェクションのために１～１，０００マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡを使用することができる。一部の実施形態では、トランスフェクションのために１～５００マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡを使用することができる。一部の実施形態では、トランスフェクションのために１～２５０マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡを使用することができる。一部の実施形態では、トランスフェクションのために約５００マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡまたはそれ以下を使用することができる。一部の実施形態では、トランスフェクションのために約２５０マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡまたはそれ以下を使用することができる。一部の実施形態では、約１０マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡが使用される。一部の実施形態では、約２０マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡが使用される。一部の実施形態では、約３０マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡが使用される。一部の実施形態では、約４０マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡが使用される。一部の実施形態では、約５０マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡが使用される。一部の実施形態では、約６０マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡが使用される。一部の実施形態では、約８０マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡが使用される。一部の実施形態では、約１００マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡが使用される。一部の実施形態では、約１５０マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡが使用される。一部の実施形態では、約２００マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡが使用される。一部の実施形態では、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００または約１０００マイクログラム／ｍｌのｍＲＮＡが使用される。方法および機器および／または試薬、製造業者の使用説明書に基づき、または当業者に周知であるように、好適な細胞密度がトランスフェクションのために選択される。

[0450]一部の実施形態では、組換え核酸はｍＲＮＡである。ｍＲＮＡ構築物は氷上で解凍し、単球に静かにピペットで加え、プレミックスすることができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは細胞にエレクトロポレーションされる。エラトリエーションの後の細胞をプールし、遠心分離し、前記目的のために最適化されたＭａｘＣｙｔｅＡＴＸ系を使用してｍＲＮＡによるエレクトロポレーションにかけることができる。一部の実施形態では、各構築物のための各プロトコールのために最適化されたエレクトロポレーションバッファー、細胞密度および／またはｍＲＮＡ濃度が使用される。

[0451]一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の形で骨髄細胞に導入することができる。環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）では、３’および５’末端は共有結合される。ＣｉｒｃＲＮＡは、ＬＮＰを使用して細胞の中に送達することができる。

[0452]一部の実施形態では、マクロファージおよび他の食作用細胞への導入遺伝子の安定した組入れは、トランスポザーゼおよび転位性因子、特にｍＲＮＡコードトランスポザーゼの使用を通して達成することができる。一実施形態では、導入遺伝子のレトロトランスポジションおよびマクロファージまたは食細胞への安定した組入れのために、長い散在性反復配列－１（Ｌ１）ＲＮＡを企図することができる。食作用または拘束性受容体（ＰＲ）融合タンパク質（ＰＦＰ）をコードする組換え核酸の安定した組入れのために、レトロトランスポゾンを使用することができる。

[0453]一部の実施形態では、一時的発現ベクターへの導入遺伝子の組込みを通して導入遺伝子を発現させることによって、骨髄細胞を改変することができる。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、細胞外からの調節因子によって一時的に調節することができる。例としてはＴｅｔ－ｏｎＴｅｔ－ｏｆｆ系が挙げられ、ここでは導入遺伝子の発現はテトラサイクリンの有無を通して調節される。

[0454]一部の実施形態では、細胞を化合物と接触させることによって治療的に有効な細胞を開発するために骨髄細胞を改変することができ、この化合物は骨髄細胞の中のタンパク質または酵素の阻害剤または活性化剤であってよい。

[0455]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを、前のセクションで記載される方法によって得られる単離された骨髄細胞に導入することができ、ここで、キメラ抗原受容体は、骨髄細胞で発現された後に骨髄細胞の先天性免疫応答機能を増強する。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の発現は、骨髄細胞をｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで特異的標的に向けることができる。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、骨髄細胞の食作用能力を増加させることができる。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、骨髄細胞の免疫原性を増加させる。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、細胞内シグナル伝達を増加増強することができる。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、細胞の中の１つまたは複数のタンパク質と協力して機能することができる。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、骨髄細胞の中の第２の受容体または膜貫通タンパク質と二量体化または多量体化することができ、ここで、第２の受容体または膜貫通タンパク質は内因性タンパク質である。一部の実施形態では、細胞は解凍の直後または核酸の組込みの後にｅｘｖｉｖｏで培養される。一部の実施形態では、ｅｘｖｉｖｏ培養は、調節された血清成分、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むことができる好適な培地の存在下で実行される。一部の実施形態では、ｅｘｖｉｖｏ培養および操作は、血清低含有培地で実行することができる。一部の実施形態では、血清は補体失活のために特異的に処理される。一部の実施形態では、骨髄細胞は、Ｍ－ＣＳＦの存在下で前記のようにｅｘｖｉｖｏで培養することができる。一部の実施形態では、骨髄細胞は、ＧＭ－ＣＳＦの存在下で前記のようにｅｘｖｉｖｏで培養することができる。一部の実施形態では、骨髄細胞は、１つまたは複数のサイトカインの存在下で培養することができる。一部の実施形態では、骨髄細胞は、ある期間増殖因子またはサイトカインの不在下でｅｘｖｉｖｏで培養または操作することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、７２時間未満、７０時間、６５時間、６０時間、５５時間、５０時間、４５時間、４０時間または３５時間、または３０時間、または２８時間、または２６時間または２４時間内の骨髄細胞の単離または富化および操作を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞は、２４時間未満、または２０時間未満または１６時間未満、または１４時間未満、または１２時間未満、または１０時間未満、または８時間未満、または６時間未満または約４時間未満培養することができる。単離または富化および操作の後の骨髄細胞は、短時間培養し、さらなる使用まで冷凍することができる。一部の実施形態では、骨髄細胞は１回、または最高でも２回解凍される。

[0456]一部の実施形態では、治療的にコンピテントな細胞は、ポリペプチドをコードする組換え核酸でエレクトロポレーションされ、冷凍、解凍され、２４時間未満培養が安定化された細胞であり、投与時点で細胞集団中の細胞は、（ｉ）少なくとも７０％を超える生存能力、（ｉｉ）少なくとも５０％を超えるＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞；および／または５０％を超えるＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞；（ｉｉｉ）５％未満のＣＤ３＋細胞、５％未満のＣＤ１９＋細胞、約１０％未満のＣＤ５６＋細胞、約１０％未満のＣＤ４２ｂ＋細胞、（ｉｖ）５０％を超える、エレクトロポレーションされた核酸によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を示す。一部の実施形態では、治療的にコンピテントな細胞は、ポリペプチドをコードする組換え核酸でエレクトロポレーションされ、２４時間未満培養が安定化され、冷凍および解凍された細胞であり、投与時点で細胞集団中の細胞は、（ｉ）少なくとも７０％を超える生存能力、（ｉｉ）少なくとも５０％を超えるＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞；および／または５０％を超えるＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞；（ｉｉｉ）５％未満のＣＤ３＋細胞、５％未満のＣＤ１９＋細胞、約１０％未満のＣＤ５６＋細胞、約１０％未満のＣＤ４２ｂ＋細胞、（ｉｖ）５０％を超える、エレクトロポレーションされた核酸によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を示す。一部の実施形態では、治療的にコンピテントな細胞は、２４時間未満培養が安定化され、ポリペプチドをコードする組換え核酸でエレクトロポレーションされ、冷凍、解凍された細胞であり、投与時点で細胞集団中の細胞は、（ｉ）少なくとも７０％を超える生存能力、（ｉｉ）少なくとも５０％を超えるＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞；および／または５０％を超えるＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞；（ｉｉｉ）５％未満のＣＤ３＋細胞、５％未満のＣＤ１９＋細胞、約１０％未満のＣＤ５６＋細胞、約１０％未満のＣＤ４２ｂ＋細胞、（ｉｖ）５０％を超える、エレクトロポレーションされた核酸によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を示す。細胞は、病原体未感染でなければならない。上記の実施形態では、治療的にコンピテントな細胞は、２回以下、好ましくは１回冷凍および解凍されていてもよく、解凍から２４時間以内、解凍から１８時間以内、解凍から８時間以内、または解凍から２時間以内に投与することができる。細胞は投与する前に本開示の明細書に記載されるような基準を満たすために、品質保証のために試験される。

医薬組成物
[0457]本明細書で、組換え核酸を含む細胞の集団を含む医薬組成物が提供され、組換え核酸はキメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）をコードする配列または抗原性ペプチドをコードする配列を含む。細胞の集団は、エフェクター骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、エフェクター骨髄細胞は生体試料から単離されるＰＢＭＣの集団から単離、富化され、医薬組成物は、（ｉ）少なくとも５０％の、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－である細胞の集団中の細胞、および（ｉｉ）１０％未満の、樹状細胞である細胞の集団中の細胞；ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む。

[0458]一部の実施形態では、組換え核酸はＣＦＰをコードする配列を含み、ＣＦＰは以下を含む：（ａ）抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメイン、および（ｂ）細胞外ドメインに作動可能に連結される膜貫通ドメイン。一部の実施形態では、組換え核酸はＣＦＰをコードする配列を含み、ＣＦＰは：（ａ）抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメイン、および（ｂ）膜貫通ドメインおよび（ｃ）１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、その全ては、細胞外ドメインが標的抗原に結合するとき、細胞内ドメインが活性化され、細胞内シグナル伝達を活性化し、骨髄細胞を活性化するように互いに作動可能に連結される。活性化された骨髄細胞は、以下の１つまたは複数を示す：より高い食作用活性、より高い化学走性、増加した炎症性機能および食菌された細胞または生物体のより高い殺滅。

[0459]一部の実施形態では、医薬組成物は、感染性疾患のための治療組成物であり、医薬組成物は、病原体抗原または感染細胞の上で提示される抗原、例えば、細菌の上の抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、原生動物抗原等に結合する細胞外抗原結合性ドメインを有するＣＦＰを含む細胞の集団を含む。

[0460]一部の実施形態では、本明細書に記載される技術的詳細を使用した他の例示的医薬組成物はがん治療組成物であり、医薬組成物は、がん抗原に結合する細胞外抗原結合性ドメインを有するＣＦＰを含む細胞の集団を含む。一部の実施形態では、がん抗原はリンパ腫抗原である。一部の実施形態では、医薬組成物は組換えＣＦＰを発現するエフェクター骨髄細胞を含み、抗原結合性ドメインはＣＤ５結合性ドメインまたはＨＥＲ２結合性ドメインである。一部の実施形態では、医薬組成物は、ＣＤ５またはＨＥＲ２抗原結合性ドメインを有する組換えＣＦＰを発現するエフェクター骨髄細胞を含み、食作用受容体またはスカベンジャー受容体に由来する細胞内ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、前記の医薬組成物はＣＦＰを発現し、ＣＦＰは：（ａ）（ｉ）ＣＤ５またはＨＥＲ２に特異的に結合するｓｃＦｖ、および（ｉｉ）ＣＤ８またはＣＤ２８またはＣＤ６８の細胞外ドメインまたはその一部に由来するヒンジドメイン；を含む細胞外ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはＣＤ６８膜貫通ドメイン；ならびに（ｃ）少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含み、少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインは：（ｉ）ＦｃγＲまたはＦｃεＲに由来する第１の細胞内シグナル伝達ドメイン、および（ｉｉ）（Ａ）ＰＩ３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）補充ドメインを含むか、または（Ｂ）ＣＤ４０に由来する第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、組換え核酸は抗原性ペプチドをコードする配列を含み、抗原性ペプチドはＣＭＶｐｐ６５ペプチドである。

[0461]一部の実施形態では、治療的に有効な骨髄細胞は、それを必要とする対象への投与のための医薬組成物に直接的に製剤化される。あるいは、保存された骨髄細胞（冷凍）は一度解凍され、生存能力を試験され、富栄養培地で少なくとも１～４時間安定化され、その後医薬組成物に製剤化される。医薬組成物は、骨髄細胞および少なくとも１つの賦形剤を含む。一部の実施形態では、賦形剤は中性ｐＨの無菌バッファー（例えばＨＥＰＥＳまたはＰＢＳ）を含む。一部の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．５である。一部の実施形態では、ｐＨは許容される範囲内で異なることができる。一部の実施形態では、工学操作された細胞は、不活性化された補体または合成血清を含む無菌の富化細胞懸濁培地に含まれてもよい。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞の保存および機能のためにサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子をさらに含む。一部の実施形態では、単一の治療投与量は、１ｍｌ～１００ｍｌの全量に懸濁させることができる。一部の実施形態では、単一の治療投与量は、１～２５ｍｌ、または１～２０ｍｌ、または１～１５ｍｌ、または１～１０ｍｌ、または１～５ｍｌの全量に懸濁させることができる。一部の実施形態では、懸濁液量は約１ｍｌである。一部の実施形態では、懸濁液量は約５ｍｌである。一部の実施形態では、懸濁液量は約１０ｍｌである。一部の実施形態では、医薬組成物は、約１０^６エフェクター骨髄細胞から約１０^１２エフェクター骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、１ｍｌにつき約１０^６エフェクター骨髄細胞から１ｍｌにつき約１０^８エフェクター骨髄細胞を含む。

[0462]一部の実施形態では、医薬組成物は、ＣＦＰを発現する工学操作されたエフェクター骨髄細胞と同時投与される、さらなる治療剤を含むことができる。
処置方法
[0463]免疫学的疾患、例えば感染性疾患またはがんを処置する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、本方法は、細菌性疾患を処置するのに有益である。一部の実施形態では、本方法はウイルス疾患を処置するためにウイルスを処置するのに有益である。一部の実施形態では、本方法は、免疫学的疾患を処置するのに有益である。

[0464]一部の実施形態では、医薬組成物は、骨髄細胞の治療的有効用量を含む細胞の集団を含む。一部の実施形態では、細胞の集団は：投与後に対象においてエフェクター細胞に分化し；投与後に対象の患部に浸潤するかもしくは投与後に対象の患部に移動し；および／または投与後に対象において少なくとも５日間の寿命を有する。

[0465]本明細書において、がん細胞を標的にして攻撃し、死滅させるように特異的に設計されている、食作用受容体（ＰＲ）融合タンパク質（ＰＦＰ）をコードする組換え核酸を発現する、工学操作された食作用細胞、特にマクロファージを含む医薬組成物を使用して、対象でがんを処置する方法が提供される。ＰＦＰは食作用（ＣＡＲ－Ｐ）のためのキメラ抗原性受容体とも呼ばれ、両方の用語は本明細書で互換的に使用することができる。工学操作された食作用細胞は、本明細書の記載においてＣＡＲ－Ｐ細胞とも呼ばれる。

[0466]がんには、限定されずに、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚リンパ腫、Ｂ細胞がん（例えば、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症）、重鎖疾患（例えば、アルファ鎖疾患、ガンマ鎖疾患およびミュー鎖疾患）、良性モノクローナル高ガンマグロブリン血症および免疫細胞アミロイド症、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん（例えば、転移性のホルモン難治性前立腺がん）、膵がん、胃がん、卵巣がん、尿膀胱がん、脳または中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜がん、口腔または咽頭のがん、肝がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または盲腸がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎腺がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織のがんなどが含まれる。本開示によって包含される方法にとって適用可能ながんのタイプの他の非限定的な例には、ヒト肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉種、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、骨髄原発性肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂性腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄質癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、肝がん、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、骨がん、脳腫瘍、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、耳神経腫、希突起膠細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ球性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単核球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄球（顆粒球）白血病および慢性リンパ球性白血病）；ならびに、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症および重鎖病が含まれる。一部の実施形態では、がんは上皮がん、例えば限定されずに、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、婦人科がん、腎臓がん、喉頭がん、肺がん、口腔がん、頭頸部がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がんまたは皮膚がんである。他の実施形態では、がんは乳がん、前立腺がん、肺がんまたは結腸がんである。さらに他の実施形態では、上皮がんは、非小細胞肺がん、非乳頭状腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌（例えば、漿液卵巣癌）または乳癌である。上皮がんは、漿液、類子宮内膜、粘液、明細胞または未分化を限定されずに含む、様々な他の方法で特徴付けることができる。一部の実施形態では、本開示は、リンパ腫またはマントル細胞リンパ腫を限定されずに含むそのサブタイプの処置、診断および／または予後診断で使用される。リンパ増殖性障害も、増殖性疾患であるとみなされる。

[0467]一般に、細胞性免疫療法は、生細胞を含む医薬を患者に提供することを含む。一部の態様では、がんを有する患者または対象は自家細胞で処置され、この方法は、ＰＢＭＣ由来のマクロファージの単離または富化、食作用受容体融合タンパク質（ＰＦＰ）である食作用のためのキメラ抗原性受容体をコードする組換え核酸をマクロファージに導入することによって、腫瘍溶解が可能である高度に食作用性のマクロファージを生成するためにｅｘｖｉｖｏでマクロファージを改変すること、および改変されたマクロファージを患者または対象に投与することを含む。

[0468]一態様では、対象は、治療的食作用細胞を含む医薬組成物の１または複数用量を投与され、ここで、細胞は同種異系である。ＨＬＡは対象との適合性のために、および細胞が移植片対宿主病ＧＶＨＤに導かないように、マッチさせることができる。クリニックに来る対象は、治療薬または治療レジメンを決定する前に、対象によって発現されるＨＬＡ抗原を決定するためにＨＬＡ型を検査する。

[0469]一部の実施形態では、治療的有効用量は、１回の注入につき１０^７個の細胞から１０^１２個の骨髄細胞の範囲内である。細胞数は、年齢、体重および他の対象関連のパラメータにより異なることができ、治療医師が決定することができる。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約１０^７個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約２×１０^７個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約３×１０^７個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約４×１０^７個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約５×１０^７個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約６×１０^７個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約７×１０^７個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約８×１０^７個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約９×１０^７個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約１０^８個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約２×１０^８個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約３×１０^８個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約４×１０^８個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約５×１０^８個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約６×１０^８個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約７×１０^８個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約８×１０^８個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約９×１０^８個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約１０^９個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約２×１０^９個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約３×１０^９個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約４×１０^９個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約５×１０^９個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約６×１０^９個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約７×１０^９個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約８×１０^９個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約９×１０^９個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約１０^１０個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約５×１０^１０個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約１０^１１個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約５×１０^１１個の骨髄細胞である。一部の実施形態では、治療的有効用量は、約１０^１２個の骨髄細胞である。

実施形態
１．ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団を含む組成物であって、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団が、細胞の改変された集団であり、および／または外因性物質を含む、組成物。
２．細胞の集団を含む組成物であって、細胞の集団が、細胞の改変された集団であり、および／または外因性物質を含み、細胞の集団が、ＣＤ１４＋および／またはＣＤ１６－であり、（ａ）細胞の集団が、ＣＣＲ２および／またはＣＣＲ５および／またはＣＤ１１ｂを発現し；ならびに／あるいは（ｂ）細胞の集団が、ＣＤ６３＋であり；ならびに／あるいは（ｃ）細胞の集団が、ＣＤ５６－、ＣＤ３－、および／またはＣＤ１９－であり；ならびに／あるいは（ｄ）骨髄性細胞の集団が、４０％未満のマクロファージ細胞、および／または１０％未満の樹状細胞（ＤＣ）、および／または１０％未満のＮＫ細胞、および／または１０％未満の顆粒球を含み；（ｅ）外因性物質が、キメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））をコードする配列を含む組換え核酸を含み；ならびに／あるいは細胞の集団が、ＣＡＲを介したトニックシグナル伝達を欠失する、組成物。
３．細胞の集団を含む組成物であって、細胞の集団が、細胞の改変された集団であり、および／または外因性物質を含み、細胞の集団が、ＣＤ１４＋および／またはＣＤ１６－であり、（ａ）細胞の集団が、非極性の骨髄性細胞であり；（ｂ）細胞の集団が、投与後に対象においてエフェクター細胞に分化し；（ｃ）細胞の集団が、投与後に対象の患部に浸潤するか、もしくは投与後に対象の患部に移動し；または（ｄ）細胞の集団が、投与後の対象において少なくとも５日間の寿命を有する、組成物。
４．上記の実施形態のいずれか１つの組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
５．疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、パラグラフ４に記載の実施形態の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
６．疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、細胞の集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、細胞の集団が、改変された細胞の集団であり、および／または外因性物質を含み、細胞の集団が、ＣＤ１４＋および／またはＣＤ１６－であり、（ａ）医薬組成物が、（ｉ）外因性物質が細胞の集団に導入されたか、または（ｉｉ）細胞の集団が改変された後７２時間以内に対象に投与され、（ｂ）骨髄性細胞の集団が、投与前に４８日未満の間ｅｘｖｉｖｏで培養されており；（ｃ）細胞の集団が、幹細胞動員を含まない方法によって得られ；ならびに／あるいは（ｄ）細胞の集団が、ネガティブ選択によって得られる、方法。
７．疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、骨髄性細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含み、骨髄性細胞が、（ａ）（ｉ）強いＣＤ１４発現；（ｉｉ）低ＣＤ１６発現または検出不可能なＣＤ１６発現；（ｉｉｉ）ＣＣＲ２および／またはＣＣＲ５の発現；（ｉｖ）１つまたは複数の適切な刺激を受けた際に、複数の骨髄系統サブタイプに分化する能力を有すること、のうちの１つまたは複数によって特徴付けられ；（ｂ）外因性物質を含み、外因性物質によってｅｘｖｉｖｏで修飾された場合に、外因性物質が、骨髄性細胞の分化または極性化状態を変化させない、方法。
８．骨髄性細胞がＣＤ１６－（ＣＤ１６陰性）またはＣＤ１６ｌｏｗ（ＣＤ１６低）である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
９．骨髄性細胞がＣＤ１４＋（ＣＤ１４陽性）である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１０．骨髄性細胞がＣＣＲ２＋（ＣＣＲ２陽性）および／またはＣＣＲ５＋（ＣＣＲ５陽性）である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１１．骨髄性細胞が、医薬組成物を投与した後に、対象においてエフェクター細胞に分化することができる、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１２．骨髄性細胞が、医薬組成物を投与した後に、対象の患部に移動することができる、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１３．骨髄性細胞が、医薬組成物を投与した後に、対象の患部に浸潤することができる、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１４．骨髄性細胞がＣＤ１４＋／ＣＣＲ２＋である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１５．骨髄性細胞がＣＤ１４＋／ＣＣＲ５＋である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。骨髄性細胞がＣＤ１４＋／ＣＣＲ２＋／ＣＣＲ５＋である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１６．骨髄性細胞がＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＣＲ２＋／ＣＣＲ５＋である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１７．骨髄性細胞がＣＤ６３＋である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１８．外因性物質が組換え核酸、ペプチド、炭水化物、脂質または小分子である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
１９．外因性物質が、ペプチドをコードする配列を含む組換え核酸を含み、ペプチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
２０．骨髄性細胞が、医薬組成物を投与する時点で、ｉｎｖｉｔｒｏで２日未満の間培養されている、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
２１．骨髄性細胞が、医薬組成物を投与する時点で、細胞の可塑性を保持する、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
２２．投与する時点で、骨髄性細胞がＣＡＲを発現する、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
２３．医薬組成物を投与する時点で、骨髄性細胞が、ＣＡＲよるトニックシグナル伝達を示さない、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
２４．骨髄性細胞の集団が、単離された複数の骨髄性細胞を、ｉｎｖｉｔｒｏでの操作に供するステップを含む方法によって得られる、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
２５．骨髄性細胞の集団が、幹細胞動員を含まない方法によって得られる、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
２６．複数の骨髄性細胞が、生体試料中の１つまたは複数の骨髄性細胞の抗体媒介性結合を使用するネガティブ選択によって、生体試料から単離される、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
２７．ネガティブ選択が、フローサイトメトリーを使用して実施される、パラグラフ２６に記載の実施形態の方法。
２８．複数の単離された骨髄性細胞が、（ｉ）ＣＤ３－（陰性）、（ｉｉ）ＣＤ１６－（陰性）またはＣＤ１６ｌｏｗ、（ｉｉｉ）ＣＤ１９－（陰性）；（ｉｖ）ＣＤ５６－（陰性）；および（ｖ）ＣＤ１４＋（陽性）である、パラグラフ２６に記載の実施形態の方法。
２９．骨髄性細胞の集団が、生体試料から単離された複数の骨髄性細胞のネガティブ選択によって得られるＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３またはＣＤ１９を発現しない（ＣＤ１６－／ＣＤ５６－／ＣＤ３－／ＣＤ１９－細胞）、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
３０．生体試料が末梢血試料である、パラグラフ２９に記載の実施形態の方法。
３１．生体試料がアフェレーシス試料である、パラグラフ２９に記載の実施形態の方法。一部の実施形態では、アフェレーシス試料の１つ、２つ、または３つの適切な画分のみが、本明細書に開示の治療用細胞の調製に利用される。
３２．生体試料が、対象にとって異種または自己である、パラグラフ２４に記載の実施形態の方法。
３３．骨髄性細胞の集団の骨髄性細胞の少なくとも５０％が未分化である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
３４．骨髄性細胞の集団がＭ０単球を含む、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
３５．骨髄性細胞の集団がＭ１単球を含む、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
３６．骨髄性細胞の集団がＭ２単球を含む、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
３７．骨髄性細胞の集団の骨髄性細胞の少なくとも５０％が非極性である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
３８．対象がヒトである、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
３９．疾患または状態が、がん、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、神経変性疾患、および一遺伝子性、多遺伝子性または多因子性の疾患または障害から選択される、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
４０．疾患または状態ががんである、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
４１．疾患または状態が、細菌性、ウイルス性、真菌性または寄生虫性の感染症である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
４２．疾患または状態が神経変性である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物または方法。
４３．治療的に有効な骨髄性細胞を単離または濃縮する方法であって、（ａ）（ｉ）生体試料を、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ３抗体、および抗ＣＤ１９抗体から選択される１つまたは複数の抗体と接触させるステップと、（ｉｉ）１つまたは複数の抗体に結合されている生体試料中の細胞を除去し、それによってこのプロセスで比較的無秩序でない治療的に有効な骨髄性細胞を単離または濃縮するステップによって、骨髄性細胞を含む生体試料から治療的に有効な骨髄性細胞をネガティブに選択するステップを含む、方法。一部の実施形態では、濃縮は、例えば、フローサイトメトリーによって、サイズおよび／または粒度に基づいて実施される。
４４．単離された治療的に有効な骨髄性細胞がＣＤ１４＋である、パラグラフ４３に記載の実施形態の方法。
４５．単離された治療的に有効な骨髄性細胞がＣＤ１４ｈｉである、パラグラフ４３に記載の実施形態の方法。
４６．単離された治療的に有効な骨髄性細胞がＣＤ１６－またはＣＤ１６ｌｏｗである、パラグラフ４３に記載の実施形態の方法。
４７．単離された治療的に有効な骨髄性細胞が、適切な刺激に応答して骨髄系統サブセットに分化する能力を保持している、パラグラフ４３に記載の実施形態の方法。
４８．単離された治療的に有効な骨髄性細胞が、極性の単球、マクロファージ、ＤＣ１、ＤＣ２、ＤＣ３、ＤＣ４、ＤＣ５、ＤＣ６樹状細胞、またはそれらの任意の組合せにさらに分化することができる、パラグラフ４３に記載の実施形態の方法。
４９．単離された治療的に有効な骨髄性細胞が、適切な刺激に応答して、Ｍ１およびＭ２表現型に向かって極性化する能力を保持している、パラグラフ４３に記載の実施形態の方法。
５０．処置を必要とする対象を処置するための骨髄性細胞の集団を生成する方法であって、（ｉ）複数の骨髄性細胞を生体試料から単離または濃縮するステップであって、複数の骨髄性細胞が、細胞可塑性を示す、ステップと；（ｉｉ）生体試料から単離された複数の骨髄性細胞を、外因性物質を使用するｉｎｖｉｔｒｏでの操作に供し、骨髄性細胞の集団を得るステップであって、ｉｎｖｉｔｒｏでの操作が、複数の骨髄性細胞の細胞可塑性を変化させない、ステップと；（ｉｉｉ）骨髄性細胞の集団と、許容される賦形剤とを含む治療用組成物を調製するステップとを含む方法。
５１．対象がヒトである、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
５２．生体試料が、末梢血試料、アフェレーシス試料、白血球アフェレーシス試料、または臍帯血試料である、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
５３．生体試料が対象に由来する、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
５４．生体試料が適切なヒトドナーに由来する、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
５５．生体試料から複数の骨髄性細胞を単離または濃縮するステップが、ネガティブ選択によってＣＤ１４＋細胞を単離または濃縮するステップを含む、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
５６．ネガティブ選択が、ヒト試料中の細胞を、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ３抗体、および抗ＣＤ１９抗体からなる群から選択される１つまたは複数の抗体と接触させ、１つまたは複数の抗体によって結合されたヒト試料中の細胞を固定化または除去することによって達成される、パラグラフ５５に記載の実施形態の方法。
５７．ネガティブ選択がフローサイトメトリーによって行われる、パラグラフ５５に記載の実施形態の方法。
５８．生体試料から単離された複数の骨髄性細胞が、ＣＤ１４＋であり、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６、および／またはＣＤ１６を発現しない、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
５９．骨髄性細胞が、未分化であるか、または非極性である、実施形態４３～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．外因性物質が、組換え核酸、ペプチド、炭水化物、脂質または小分子である、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
６１．操作が、複数の骨髄性細胞を遺伝子改変するステップを含む、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
６２．操作が、ペプチドをコードする配列を含む組換え核酸を、複数の骨髄性細胞に導入するステップを含む、パラグラフ５０または６１に記載の実施形態の方法。
６３．組換え核酸がＲＮＡである、パラグラフ６０に記載の実施形態の方法。
６４．組換え核酸がｍＲＮＡである、パラグラフ６３に記載の実施形態の方法。
６５．骨髄性細胞の集団が、ペプチドをコードする配列を含む核酸を導入する際に、ペプチドを発現する、パラグラフ６３に記載の実施形態の方法。
６６．ペプチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、パラグラフ６３に記載の実施形態の方法。
６７．ペプチドが、（ｉ）膜貫通ドメイン；（ｉｉ）第２の細胞の表面成分に結合する、少なくとも標的結合ドメインを含む細胞外領域；および（ｉｉｉ）１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含む、パラグラフ６６に記載の実施形態の方法。
６８．第２の細胞が、罹患細胞またはがん細胞である、パラグラフ６７に記載の実施形態の方法。
６９．ペプチドが、少なくとも１つの細胞内貪食シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ６７に記載の実施形態の方法。
７０．細胞内貪食シグナル伝達ドメインが、細胞外標的結合ドメインと作動可能に連結され、細胞外標的結合ドメインが、第２の細胞の表面成分に結合する際に活性化されるように構成される、実施形態６１～６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．組換え核酸を導入するステップが、電気穿孔またはヌクレオポレーションを介して導入するステップを含む、実施形態６１～７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．組換え核酸を導入するステップが、化学的送達を介して導入するステップを含む、実施形態６１～７０のいずれか１つに記載の方法。
７３．組換え核酸が、細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、実施形態６１～７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．組み込むステップが、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および逆転写酵素のうちの１つまたは複数の活性化を介する、パラグラフ７３に記載の実施形態の方法。
７５．組成物を調製するステップが、薬学的に許容される賦形剤に細胞を懸濁するステップを含む、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
７６．骨髄性細胞の集団が、細胞の可塑性と、適切な刺激後に複数の骨髄系統に分化する能力を保持する、実施形態６１～７５のいずれか１つに記載の方法。
７７．骨髄性細胞の集団が、ＣＡＲによるトニックシグナル伝達を示さない、実施形態６１～７６のいずれか１つに記載の方法。
７８．骨髄性細胞の集団が、機能性ＣＡＲを発現し、ＣＡＲ媒介性抗原特異的応答を示すことができる、実施形態６１～７７のいずれか１つに記載の方法。
７９．許容される賦形剤が、緩衝液、または栄養素、ＤＭＳＯ、グリセロールを含む細胞培養培地、またはそれらの組合せである、パラグラフ５０または７５に記載の実施形態の方法。
８０．組成物が、さらなる使用まで凍結される、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
８１．方法が、１２時間未満、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、４時間未満、または２時間未満で実施され得る、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
８２．方法が２時間以内に完了される、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
８３．複数の骨髄性細胞が、遺伝子修飾および／または編集に供され、それにより骨髄性細胞の集団が得られる、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
８４．複数の骨髄性細胞が、１つまたは複数の抗原ペプチドとの接触に供され、それにより抗原負荷された骨髄性細胞の集団が得られる、パラグラフ５０に記載の実施形態の方法。
８５．実施形態４３～８４のいずれか１つの方法を使用して骨髄性細胞の集団を製造する方法であって、方法が約６時間以内に実施されることが可能であり；骨髄性細胞の集団が、未分化または非極性であり、細胞可塑性を示し、およびトニックシグナル伝達を欠失している、方法。
８６．細胞療法のための骨髄性細胞の集団が、（ａ）ＣＤ１４＋ＣＤ１６－である、集団中の約５０％を超える生細胞；（ｂ）ＣＣＲ２＋および／またはＣＣＲ５＋である、集団中の約５０％を超える生細胞；（ｃ）ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３１、ＣＤ７１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＤ１Ｃ、およびＡＸＬ／ＳＩＧＬＥＣ６のうちの１つまたは複数を発現する、集団中の５０％未満の生細胞；（ｄ）Ｍ０単球、（ｅ）Ｍ１単球、（ｆ）Ｍ２単球、（ｇ）樹状細胞、ならびに（ｈ）前駆樹状細胞または樹状前駆体細胞のうちのいずれか１つまたは複数を含む、実施形態５０～８４のいずれかに記載の方法。
８７．生体試料から単離され、組換え核酸、ペプチド、炭水化物、化合物および小分子から選択される外部物質を使用してｉｎｖｉｔｒｏでさらに操作された、未分化または非極性の細胞を含む細胞療法で使用するための骨髄性細胞の集団であって、骨髄性細胞の集団中の骨髄性細胞がＣＤ１４＋ＣＤ１６－であり；またはＣＤ１４ｈｉおよびＣＤ１６ｌｏであり；（ｉ）細胞の可塑性、（ｉｉ）複数の骨髄系統に分化する能力、（ｉｉｉ）ｉｎｖｉｖｏで罹患組織に移動する能力、（ｉｖ）罹患組織に浸潤する能力、ならびに（ｖ）疾患発症性の細胞、組織、または生物を隔離および／または破壊する能力、のうちの１つまたは複数を示す、集団。
８８．ネガティブ選択を介して単離される、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
８９．外因性物質が、組換え核酸、ペプチド、炭水化物、脂質または小分子である、パラグラフ８０に記載の実施形態の方法。
９０．骨髄性細胞の集団の細胞が、ペプチドをコードする配列を有する組換え核酸を含む、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
９１．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＡＲをコードする配列を有する組換え核酸を含む、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
９２．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＡＲ媒介性活性化を示すＣＡＲを発現する、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
９３．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＡＲを発現し、ＣＡＲによるトニックシグナル伝達を示さない、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
９４．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＤ１４＋である、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
９５．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＤ１６－である、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
９６．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＤ１４ｈｉｇｈＣＤ１６ｌｏｗである、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
９７．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＤ５６－である、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
９８．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＤ３－である、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
９９．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＤ１９－である、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１００．骨髄性細胞の集団の細胞が、１つまたは複数のケモカイン受容体を発現する、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１０１．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＣＲ２を発現する、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１０２．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＣＲ５を発現する、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１０３．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５を発現する、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１０４．骨髄性細胞の集団の細胞が、ＣＤ１６－／ＣＤ５６－／ＣＤ３－／ＣＤ１９－である、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１０５．パラグラフ８７～１０４に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団を含む医薬組成物。
１０６．がん治療で使用するための、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１０７．神経変性の治療で使用するための、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１０８．集団中の細胞が、ｉｎｖｉｔｒｏで操作されていない細胞と比較して、細胞療法として投与された後に免疫原性の増強を示す、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１０９．集団中の細胞が、ｉｎｖｉｔｒｏで操作されていない細胞と比較して、細胞療法としての投与された後に罹患組織への細胞移動の増強を示す、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１１０．集団中の細胞が、ｉｎｖｉｔｒｏで操作されていない細胞と比較して、細胞療法として投与された後に貪食能力の増強を示す、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１１１．集団中の細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで操作されていない細胞と比較して、細胞療法として投与された後に細胞毒性の増強を示す、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１１２．単独療法として使用するための、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１１３．併用療法として使用するための、パラグラフ８７に記載の実施形態の骨髄性細胞の集団。
１１４．処置を必要とするヒト対象を処置するためのヒト骨髄性細胞を作製する方法であって、（ｉ）同種または自己の生体試料から、少なくとも抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ５６抗体および抗ＣＤ１９抗体を含む複数の抗体を使用するネガティブ選択により、未分化または非極性の骨髄性細胞を含む複数の骨髄性細胞を得るステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの細胞を改変、培養、安定化、活性化、濃縮、および／または増殖させるステップと；（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの細胞を対象に投与するステップとを含み、（ｉ）で得るステップから（ｉｉｉ）で投与するステップまでの経過時間が約３日未満である、方法。
１１５．生体試料が末梢血試料である、パラグラフ１０３に記載の実施形態の方法。
１１６．生体試料がアフェレーシス試料である、パラグラフ１０３に記載の実施形態の方法。
１１７．ステップ（ｉｉ）からの細胞が、ＣＤ１４＋ＣＤ１６－またはＣＤ１４ｈｉおよびＣＤ１６ｌｏである、パラグラフ１０３に記載の実施形態の方法。

実施例

実施例１．ＣＤ１４＋骨髄細胞の単離／富化および特徴付け
[0470]この実施例では、治療的使用のための骨髄エフェクター細胞の調製のために、目的の骨髄細胞を白血球分離試料から単離した。単球は、ＣＤ１４抗体媒介選択、および細胞特異的表面マーカーを検出する抗体を使用した単離／富化前後の細胞の特徴付けを使用して、ヒト末梢血からの市販の白血球分離試料（Ｌｅｕｋｏｐａｋ、Ｈｅｍａｃａｒｅ．ｃｏｍ）から単離した。抗ＣＤ１４抗体を使用した正の選択は、細胞分離器カラム（ＬＳＣｏｌｕｍｎ．ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）で実行した。図４、図５および図６に示す結果は、ＣＤ１４抗体結合を使用して白血球分離試料から富化させた細胞は、ほとんど様々なリンパ球系統マーカーＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ５６を発現する細胞が実質的に含まれない単球であることを示す。図４の上下のパネルは、ＣＤ１４＋単球の単離／富化の前（上パネル）および後（下パネル）の指示された表面マーカー発現に基づく細胞サブタイプの相対組成を示す。特異的マーカーおよびフローサイトメトリー分析を使用すると、細胞の９５％より多くは生存能力があることが見出され；ｌｅｕｋｏｐａｋ試料からの細胞の９１．６％はＣＤ１４＋細胞であって高い回収を示していた。ＣＤ１４抗体媒介細胞単離／富化の前の白血球分離試料は、５７．８％のＣＤ３＋細胞を含んでいた。ＣＤ１４＋抗体は、ＣＤ３＋であったわずか２％の細胞、ＣＤ５６＋陽性であった２．５３％の細胞、およびＣＤ１９＋陽性であった０．２９％の細胞を有する単球富化細胞の集団を引き抜いた。６６．９％の細胞はＣＤ１４＋およびＣＤ１６－であって、２２％の細胞はＣＤ１４およびＣＤ１６陽性であった。図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ単離／富化前後のフローサイトメトリーデータを示す、上パネル：アイソタイプ対照を使用したフローサイトメトリー；下パネル：それぞれの抗体を使用したフローサイトメトリー。図６は、ＣＤ１４およびＣＤ１６抗体：６％ＣＤ１４－ＣＤ１６＋；２２％ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋；および６６．９％ＣＤ１４＋ＣＤ１６－細胞で染色した単離／富化後のＣＤ１４＋のサイトメトリーデータを示す。

[0471]単離したＣＤ１４＋細胞がＭ０、Ｍ１およびＭ２分極化マクロファージにさらに分化する可能性を有するかどうか決定するために、単離した細胞はｉｎｖｉｔｒｏで短時間培養し、外因性因子で刺激した。刺激のために使用した外因性因子は、下の表２に掲載される。

[0472]通常の組織培養プレートの上で、または低接着プレート（細胞忌避培養プレート）の上で細胞培養を実行した（図７）。細胞は、図７に示すように所与の刺激に応答してＭ０、Ｍ１、Ｍ２細胞に容易に分化し、細胞忌避プレートの上で培養した細胞は、通常の組織培養プレートの上で培養した細胞と比較して、Ｍ２系統分極にわずかにより良好に応答した。図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれ２４および４８時間後に光学顕微鏡検査で観察された細胞表現型を示す。Ｍ１またはＭ２分極化刺激は、ＣＤ２０６およびＣＤ８０発現の変化につながった。ＣＤ２０６は、Ｍ２細胞で容易に増加した。他方、Ｍ０またはＭ１細胞は高いＣＤ２０６発現を示さなかった。他方、ＣＤ８０発現はＭ１細胞で上方制御され、Ｍ２細胞ではそうでなかった（図９Ａ）。ＣＤ１６発現分析は、それが培養で容易に上方制御され、上方制御はＭ２刺激に応答して有意により高いことを示す。Ｍ１分極化細胞は、ＣＤ１６発現の上方制御を示さない（図９Ｂ）。ＣＣＲ２発現レベルは、ＣＤ１４＋細胞で高い。それは、Ｍ１およびＭ２表現型で上昇し、細胞が炎症もしくは感染部位への、または腫瘍部位への走化性移動を受けることが可能なことを示す（図９Ｃ）。

実施例２．骨髄細胞（ＣＡＲ発現エフェクター骨髄細胞）製造プロセス
[0473]この実施例では、治療的に有効な骨髄細胞（ＣＡＲ発現エフェクター骨髄細胞とも呼ばれる）の単離または富化および開発のためのプロセスが記載され、それはスケーリングのために追従することができる。このプロセスは、生体試料からのＣＤ１４＋細胞の単離または富化、ペプチドをコードする核酸を細胞に導入することによって単離された細胞を改変すること、および骨髄細胞をベースとした療法を必要とする対象への送達のために治療組成物を調製することを含む。図１０は、プロセスワークフローの模式図を示す。細胞の単離または富化の前に、細胞に導入するための組換え核酸が調製される。この実施例では、メッセンジャーＲＮＡが導入される。

ＣＡＲをコードする組換え核酸の調製：
[0474]キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする組換え核酸構築物を調製し、真核細胞での増幅および／または試験発現のためにプラスミドベクターに組み込む。この実施例では、いくつかの組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が調製される。当技術分野で公知の分子クローニング技術を使用して、組換えＣＡＲが構築される。組換えＣＡＲタンパク質は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含む。各ドメインまたはドメインのサブセクションは、異種のソース配列からＰＣＲによって生成され、ベクターに個々にクローニングすることによって一緒にされるか、またはより長い核酸にライゲーションされ、それは増幅のために適当なプロモーターおよび３’調節エレメントを有する好適なプラスミドまたはベクターの多クローニング部位に次に挿入される、核酸配列によってコードすることができる。簡潔には、例示的なＣＡＲは、１つまたは複数のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＰＩ３キナーゼ動員ドメイン）をコードする核配列、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインをコードする核酸配列、細胞外末端にＨＥＲ２結合性ｓｃＦｖ（ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）をコードする配列を有する、細胞外ドメインをコードする核酸配列を組み込むことによって調製される。ある特定の構築物は、それがその標的、例えばこの場合ＨＥＲ２、へのｓｃＦｖ結合を妨害しないように設計されるＦＬＡＧペプチド配列を細胞外末端に含む。これらの成分は、完全に機能的な膜貫通ＣＡＲをコードする配列の中に一緒にライゲーションされる。組換えタンパク質の個々のドメインをコードする核酸サブユニットは、２つのドメインの間に介在する短いフレキシブルリンカー配列を含むように設計される。構築物は、プロモーターおよび３’安定化構造単位を有するプラスミドの中でライゲーションされる。一変形形態では、構築物は、ＯＲＦ２ｐをコードし、それぞれの５’－および３’－ＵＴＲ配列、ＣＭＶプロモーターを有するＡｌｕレトロトランスポゾンエレメントの中に置かれる。プラスミドは大腸菌で増幅され、シークエンシングによって検証されるか、－８０℃で保存される。

ｍＲＮＡ調製
[0475]ｍＲＮＡは鋳型として消化されたプラスミドを使用したｉｎｖｉｔｒｏ転写によって調製し、混入ＤＮＡを除去するために精製し、ポリアデニル化した。ＲＮＡ生成物を精製し、ＲＮアーゼが含まれない水で１ｍｇ／ｍｌに再懸濁させ、クリオバイアルに保存する。

ＣＤ１４＋細胞の単離／富化
[0476]白血球分離容器（Ｌｅｕｋｏｐａｋ、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）からの細胞を希釈し、フィコール分離にかけた。遠心分離を４００ｇで４０分間実行した。単球富化バフィー層を除去し、バッファーで洗浄し、軽く遠心分離し、バッファーに再懸濁し、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６に結合する抗体の混合物を使用した負の選択にかけ、細胞分離器カラム（ＬＳＣｏｌｕｍｎ。ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）に通した。カラムは抗体結合細胞を保持するように設計され、溶出した細胞にはＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６を発現する細胞が実質的に含まれない。カラムに繰り返し通した後、細胞を遠心分離し、洗浄し、一晩培養した後安定化させた。

エレクトロポレーションおよび保存／放出
[0477]エレクトロポレーションのために、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ試料を氷上で解凍した。キュベットエレクトロポレーションを使用して、細胞をｍＲＮＡでエレクトロポレーションした。細胞を数時間培養した後、放出または低温保存または投与のための処理のための特徴付けまたは検証にそれらをかけた。

[0478]細胞の単離／富化から保存／放出までのステップは、７２時間以内に起こった。
[0479]ＣＤ１４＋細胞中のＣＡＲの３日発現プロファイルは、図１１に実証される。発現レベルは１日目に最も高く、ＣＡＲ発現は７２時間後に検出可能であるが、それはピーク発現から徐々に低下する。これらの発現プロファイルは、これらの細胞におけるＣＡＲによる緊張性シグナル伝達の欠如を示唆する。

[0480]実施例のセクションの残りの記載において、これらの細胞はエフェクター骨髄細胞と呼ぶことができる。

実施例３．ＣＡＲを発現する単離したＣＤ１４＋細胞の分極化可能性の特徴付け。
[0481]この実施例は、細胞表面マーカーの発現によって決定される、ＣＡＲを発現する単離したＣＤ１４＋細胞（エフェクター骨髄細胞）の異なる骨髄細胞系に分化する可能性の特徴付けを実証する。例えば実施例２に記載されているように調製し、冷凍した細胞は、解凍し、２４時間培養する。これらのエフェクター骨髄細胞は、次に例えば図１２に示すように分極化刺激にかけた、（ｉ）ＧＭＣＳＦ、（ｉｉ）ＩＬ４、ＩＬ１０およびＴＧＦベータ（Ｍ２刺激）、（ｉｉｉ）活性化Ｔ細胞順化培地（ＴＣＭ）および（ｉｖ）ＭＣＳＦ。２４、４８および７２時間後にフローサイトメトリーによって細胞を分析し、サイトカイン分析はＬｕｍｉｎｅｘによって実行した。解凍の１日後にＣＡＲ発現によってＣＤ１４発現は変化せず、２日後にほとんどの分極化刺激で増加したが、Ｍ２細胞ではわずかにより低かった（図１３Ａ、左）。１日目、ＣＤ１６発現が上方制御されたＭ２細胞を除いて、ＣＡＲを発現するかまたは発現しない細胞におけるＣＤ１６レベルは変化しなかった。しかし、２日目、ＭＣＳＦで誘導されたＣＡＲ発現細胞を除いて、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ４、ＩＬ１０およびＴＧＦベータ、およびＴＣＭとＣＡＲを発現するかまたはしないほとんどの系でＣＤ１６発現レベルは誘導された（図１３Ａ）。

[0482]図１３Ｂに示すように、ＣＤ２０６は刺激のいずれでも容易に誘導され、変化はＣＡＲを発現しない細胞と比較してＣＡＲを発現する細胞でより高かったが、ＣＤ１６３は１日でほとんど変化せず、変化はＣＡＲを発現するおよび発現しない細胞で、および様々な刺激に応答して均一だった。ＣＤ２０６およびＣＤ１６３は、マクロファージ活性化マーカーである。増加したＣＤ２０６またはマンノース受容体はより高い食作用活性を示し、増加したＣＤ１６３はより高い炎症性応答を示す。１日目に他の刺激に対してＰＤＬ１発現はＭ２細胞でより高く、２日目に全セットで増加した。ＣＡＲ発現の有無にかかわらずＣＣＲ発現はＣＤ１４細胞で高く、一般的に２日目にさらに増加した（図１３Ｃ）。様々に刺激したＣＡＲ発現および対照細胞で、ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ発現を分析した。各場合に、ＣＡＲ発現細胞は、対照（ＣＡＲ－）細胞と比較して、わずかにより高いＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ発現レベルを有する。

実施例４．ＣＡＲ発現細胞は高い標的特異性を有し、標的認識に応答性である
[0483]ＨＥＲ２－ＣＡＲコードｍＲＮＡは、ＴＨＰ－１細胞、ヒト単球細胞系で発現され、ＨＥＲ２でコーティングしたビーズとインキュベートした。ＨＥＲ２－ＴＨＰ－１細胞は、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイキットを使用して上清を分析することによって検出された炎症性サイトカインを分泌することによって応答した（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。図１４Ｂに示すように、ＨＥＲ２－ＴＨＰ－１細胞は、ＢＳＡでコーティングしたビーズでなくＨＥＲ２でコーティングしたビーズのみに応答して、ＭＩＰ－１アルファ、ＩＬ－８、エオタキシンおよびＰＩＧＦ－１を発現放出する。

[0484]次に、実施例３に記載されるプロトコールに従って、ＨＥＲ２－ＦＣＲ－ＰＩ３Ｋ発現エフェクター骨髄細胞を、解凍後に分極刺激にかけた。分極化刺激で細胞を培養し（表２）、次に細胞をＨＥＲ２ビーズまたは対照ＢＳＡビーズと接触させることによって、ＣＡＲ媒介活性化の可能性および特異性をこれらの細胞で試験した。１８時間後に、サイトカイン分泌をＬｕｍｉｎｅｘ多重キットによって分析した（図１４Ｃ）。結果を、図１４Ｄに示す。Ｍ１刺激でさらに分極化したＨＥＲ２標的化ＣＤ１４＋ＣＡＲ細胞は、ＨＥＲ２ビーズで処理したとき、ＨＥＲ２ビーズで処理したＭ０またはＭ２で分極化したＨＥＲ２－ＣＡＲ発現骨髄細胞と比較して、最も高いレベルのＩＬ１ベータおよびＴＮＦアルファを発現し、分泌した。Ｍ２で分極化したＨＥＲ２－ＣＡＲ発現エフェクター骨髄細胞は、ＨＥＲ２ビーズと接触させたとき、高レベルのＩＦＮ－ガンマを分泌し、それはＨＥＲ２－ＣＡＲを同様に発現するＭ１またはＭ０細胞より高く、ＨＥＲ２ビーズによって活性化された。標的の不在下では、緊張性炎症性サイトカイン発現は観察されなかった。

[0485]これらのエフェクター骨髄細胞の腫瘍細胞または非腫瘍対照細胞への影響をさらに理解するために、ＨＥＲ２特異的およびＣＤ５特異的ＣＡＲ発現骨髄細胞をＭ０、Ｍ１またはＭ２分極シグナルに曝露させ、培養の腫瘍細胞または非腫瘍対照細胞の存在下で１８時間インキュベートした（図１５Ａ）。サイトカインおよびケモカインプロファイルは図１５Ｂｉに示され、ＣＤ８０またはＣＤ２０６発現プロファイルは図１５Ｂｉｉに示される。ＨＥＲ２－ＣＡＲまたはＣ５－ＣＡＲを発現するＭ１細胞は、ＳＫＯＶ３またはＭＳＴＯ細胞系の存在下でインキュベートしたとき、ＣＣＬ３を容易に分泌し、そのことは細胞が活性化されたことを示す。ＣＣＬ３ケモカインは、腫瘍細胞への単球の移動を助ける。腫瘍または対照細胞の不在下で、Ｍ２分化細胞は高いレベルのＩＬ１０を放出した（図１５Ｂｉ）。全ての細胞は、Ｈ９（リンパ腫細胞）の存在下でケモカインＣＣＬ３またはＩＬ６またはＩＬ１０の上昇したレベルで応答する。理論によって縛られることを望まないが、一部の場合にはＨ９細胞に応答した上昇したＣＣＬ３に関する観察は、骨髄細胞のリンパ腫細胞との相互作用に帰することができる。様々な処理にもかかわらず、ＣＤ８０およびＣＤ２０６の発現レベルはこれらの細胞で変化せず、細胞が柔軟性を維持し、成熟した細胞マーカーを発現しないことを示した。さらに、Ｍ１条件による分極は類似の結果を示し、例えば、ＣＡＲの発現は細胞がこれらの条件下で分極する能力を変更しない。腫瘍細胞との同時インキュベーションは分極を変更しないが、強力なＭＨＣ発現およびケモカインの変化があった（データ示さず）。

[0486]この実施例で議論される結果は、ＣＡＲを発現するＣＤ１４＋細胞が活性であり、ＣＡＲが認識して結合するように設計されている標的（例えば、ＨＥＲ２）を発現する特異的腫瘍細胞に応答性であることを実証する。

実施例５．ＣＤ１４＋骨髄細胞の食作用可能性
[0487]この実施例では、細胞外ＨＥＲ２結合性ドメインおよび標識のためのＦＬＡＧ配列を有するＣＡＲを発現する第１のＴＨＰ－１細胞；および活性細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン、またはＭｅｇｆ１０－ＰＩ３キナーゼ補充ドメイン；またはＦｃＲシグナル伝達およびＰＩ３キナーゼ補充ドメインを使用した。細胞を標識した腫瘍細胞とインキュベートし、ＰＭＡまたは対照で刺激した食作用を画像化によりモニタリングした。ＨＥＲ２発現腫瘍細胞の食作用は、全ての群で観察された（図１６Ａ）。

[0488]前記のようにＨＥＲ２ＣＡＲを発現するレンチウイルスで形質導入した骨髄細胞をＨＥＲ２陽性腫瘍細胞（標的細胞）またはＨＥＲ２陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞とインキュベートし、食菌された細胞をフローサイトメトリーによって定量化した（図１６Ｂ）。ＨＥＲ２発現骨髄細胞は、ＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ３細胞を特異的に食菌したが、Ｊｕｒｋａｔ細胞はしなかった。図１６Ｃは、サイトメトリーデータと一致する画像化結果を示す。

実施例６．マウス腫瘍モデルに及ぼす特異的ＣＡＲ発現エフェクター骨髄細胞の影響
[0489]この実施例では、ＣＡＲ発現エフェクター骨髄細胞のｉｎｖｉｖｏ影響を調査した。目的は、マウス腫瘍モデルを設立し、マウスに好適な骨髄細胞を注射して結果をモニタリングし、有効用量レベルを決定することであった。その部位に約７～１０日で約２００ｍｍ^３の腫瘍を生じる、ＣＤ５－ＨＵ９Ｓｚｅａｒｙ症候群腫瘍細胞系の１×１０^６個の細胞を健康なマウスの皮下に導入した。この腫瘍モデルを、実験のために使用した。マウスを４つの群に分けた、（ａ）ビヒクル、（ｂ）処置群：Ｉ（０．８×１０^６個のエフェクター骨髄細胞／マウス）；（ｃ）ＩＩ（０．１．４×１０^６個のエフェクター骨髄細胞／マウス）；および（ｄ）ＩＩＩ（０．１．４×１０^６個のエフェクター骨髄細胞／マウス）。図１７Ａに示すように５回の注入を３日ごとに投与し、生存ならびにフローサイトメトリーおよび生体画像化を含む最終アッセイについてマウスをモニタリングした。図１７Ｂは、３回の処置投与の後の１週間の画像データを示す。驚くべきことに、単回投与の後でさえ数匹のマウスで腫瘍退行が観察され、完全寛解は３回投与の後に二、三匹のマウスで観察された（図１７Ｂ）。定量的腫瘍退行データは、図１７Ｃおよび図１７Ｄで提供される。

実施例７．骨髄細胞の単離／富化およびＣＡＲ＋骨髄細胞の生成
[0490]この実施例では、ＣＡＲ＋骨髄細胞の生成のための骨髄細胞は、プロトコール１またはプロトコール２を使用して、健康なドナーまたはＬｅｕｋｏｐａｋ容器から単離された末梢血試料から単離し、富化した。

[0491]プロトコール１。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、フィコール－Ｐａｑｕｅ密度遠心分離を使用して健康なドナーから収集したＬｅｕｋｏｐａｋから単離した。古典的単球は、複数の細胞集団を消去するために、抗体カクテル（ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３およびＣＤ２３５ａに対する市販の抗ヒト抗体）を使用して単離（富化）した。

[0492]プロトコール２。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、フィコール－Ｐａｑｕｅ密度遠心分離を使用して健康なドナーから収集したＬｅｕｋｏｐａｋから単離した。ＣＤ１４＋単球は、ＣＤ１４＋細胞を標識して単離するために抗ヒト抗体を使用して単離（富化）した。

[0493]単離／富化の前および単離／富化の後に、細胞生存能力および総数を各試料について検査した。ＣＡＲ＋骨髄細胞（ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－）の生成のための骨髄細胞を、各試料で数えた。プロトコール１およびプロトコール２を使用して富化した単球は、ＣＤ１４、ＣＤ１６に対する抗ヒト抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。両方のプロトコールは、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の高い富化を示した。表３に示すように、ドナー試料１、２、３、５および６は、プロトコール１を使用してそれぞれＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の４．７４倍、７．０６倍、７．６倍、２４．９６倍および９．６１倍の富化を示し；各場合で細胞生存能力は９０％を超えた。ドナー試料４、８、９および２つの白血球分離試料は、プロトコール２を使用してそれぞれＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の５．１４倍、４．５１倍、５．４９倍、４．３倍および３．０２倍の富化を示し；同じく、各場合で細胞生存能力は９０％を超えた。

[0494]プロトコール３。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、エラトリエーションを使用して健康なドナーから収集したＬｅｕｋｏｐａｋから単離した。ＣＤ１４＋単球は、サイズおよび密度に基づいて富化した。

[0495]表３は、プロトコール１、プロトコール２およびプロトコール３を使用した、単離／富化前および単離／富化後の細胞数、生存能力およびＣＤ１４＋／ＣＤ１６－集団を示す。

[0496]ＰＢＭＣならびにプロトコール１およびプロトコール２富化単球の免疫表現型は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ５６に対する抗ヒト抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図１８Ａでは、表３のドナー試料６を使用した１つの代表的なアッセイを示す。ＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ５６陽性細胞の１％未満が試料中に存在し、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の効率的な回収および富化を示し、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の混入は無視できる。同様に、図１９Ａは、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ５６に対する抗ヒト抗体でさらに染色し、フローサイトメトリーによって分析した、選択された単球のプロトコール２を使用したＰＢＭＣのドナー試料９の代表的な免疫表現型検査を示す。この実験から選択された単球は、７８％のＣＤ１４＋ＣＤ１６－と５％未満のＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ５６陽性細胞である。

[0497]この実施例で示すＣＤ１４＋／ＣＤ１６－単球の回収および富化の後、ＣＤ５ＣＡＲ組換え構築物をコードするｍＲＮＡで細胞をエレクトロポレーションした。
[0498]エレクトロポレーションの１８時間または２４時間後に、単球をＣＤ１４およびＣＤ１６に対する抗ヒト抗体ならびにＣＤ５－ＣＡＲ導入遺伝子発現を検出する試薬で染色し、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。結果は、細胞が８２．５％のＣＤ１４＋ＣＤ１６－であり、プロトコール１を使用して７９．１％の細胞がＣＤ５ＣＡＲ発現を有し（図１８Ｂ）；プロトコール２を使用して６８．８％のＣＤ１４＋ＣＤ１６－および９４％の細胞がＣＤ５ＣＡＲ発現を有する（図１９Ｂ）ことを示す。プロトコール３からの結果は、図２３で実証される。

[0499]代表的なＣＤ５－ＣＡＲおよびＨＥＲ２－ＣＡＲアミノ酸配列は、下で提供する。
[0500]ＣＤ５－ＦｃＲ－ＰＩ３Ｋ
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＹＥＤＦＧＩＹＹＣＱＱＹＤＥＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＳＧＧＧＧＳＧＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＲＲＬＫＩＱＶＲＫＡＡＩＴＳＹＥＫＳＤＧＶＹＴＧＬＳＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬＫＨＥＫＰＰＱＧＳＧＳＹＥＤＭＲＧＩＬＹＡＡＰＱＬＲＳＩＲＧＱＰＧＰＮＨＥＥＤＡＤＳＹＥＮＭ（配列番号１）
[0501]ＨＥＲ２－ＦｃＲ－ＰＩ３Ｋ
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＳＧＧＧＧＳＧＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＲＲＬＫＩＱＶＲＫＡＡＩＴＳＹＥＫＳＤＧＶＹＴＧＬＳＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬＫＨＥＫＰＰＱＧＳＧＳＹＥＤＭＲＧＩＬＹＡＡＰＱＬＲＳＩＲＧＱＰＧＰＮＨＥＥＤＡＤＳＹＥＮＭ（配列番号２）
[0502]ＣＤ５－ＦｃＲ－ＣＤ４０
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＹＥＤＦＧＩＹＹＣＱＱＹＤＥＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＳＧＧＧＧＳＧＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＲＬＫＩＱＶＲＫＡＡＩＴＳＹＥＫＳＤＧＶＹＴＧＬＳＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬＫＨＥＫＰＰＱＫＫＶＡＫＫＰＴＮＫＡＰＨＰＫＱＥＰＱＥＩＮＦＰＤＤＬＰＧＳＮＴＡＡＰＶＱＥＴＬＨＧＣＱＰＶＴＱＥＤＧＫＥＳＲＩＳＶＱＥＲＱ（配列番号３）

実施例８．細胞に及ぼすウイルス形質導入の影響
[0503]この実施例は、ＣＦＰ発現細胞の生成および冷凍前に形質導入細胞を安定させるためにそれらをｅｘｖｉｖｏで培養するためのプロセスの試験ランを実証する。その期間中のＣＤ１４およびＣＤ１６の発現のために、細胞をモニタリングした。本明細書に記載される例示的な試験では、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－単球をドナー血液から単離し、その後５０ＭＯＩのＨＥＲ２－ＣＦＰを発現する第４世代レンチウイルスで形質導入し、冷凍した。単球を解凍し（０日目）、コーニングＵｌｔｒａＬｏｗ接着プレートの中で１００ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦを含むＴｅｘＭＡＣＳに２．５×１０^６／ｍｌで４日間培養した。毎日、細胞をピペッティングによって再懸濁させ、１００，０００個の細胞をＡｌｅｘａ７００コンジュゲート抗ＣＤ１４抗体（１：２０希釈）およびＰＥコンジュゲート抗ＣＤ１６抗体（１：２０希釈）またはマッチするアイソタイプ対照抗体で染色した。抗体染色細胞は、次にＡｔｔｕｎｅＮＸＴフローサイトメーターで分析した。データは、ＦｌｏｗＪｏで分析した。図２０のドットプロットで示すように、０日目に細胞の７２％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－であり、ＣＤ１６の発現レベルはそれらが培養されるにしたがって徐々に増加した。２日目に、細胞のわずか約２７．３％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－であり；３日目に、細胞のわずか約１９．６％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－であり；４日目に、細胞のわずか約１２％はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－であった。これは、ウイルス形質導入の結果ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞はそれらのＣＤ１１４＋／ＣＤ１６－サインを保持することができず、治療薬製造プロセスに不適当である可能性があることを示した。

実施例９．ｅｘｖｉｖｏ培養のＭ－ＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦの影響
[0504]この実施例は、ＣＦＰ発現細胞の生成およびＭ－ＣＳＦまたはＧＭ－ＣＳＦの存在下でそれらをｅｘｖｉｖｏで培養するためのプロセスの試験ランを実証する。この試験では、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－単球をドナー血液から単離し、冷凍した。細胞を解凍し、１００ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦまたは１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦと一晩培養し、次に、４つのＣＤ５結合剤ＣＦＰ構築物：ＣＤ５－ＦｃＲ－ＰＩ３Ｋ構築物、ＣＤ５－ＦｃＲ－ＣＤ４０構築物、ＣＤ５－ＦｃＲ－ＭＤＡ５構築物、ＣＤ５－ＦｃＲ－ＭｙＤ８８構築物のうちの１つをコードする構築物でエレクトロポレーションした。２セットの対照は、エレクトロポレーション前の対照およびｍｏｃｋエレクトロポレーションした対照であった。エレクトロポレーション（ＥＰ）に続いて、コーニングＵｌｔｒａＬｏｗ接着プレートの中で１００ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦまたは１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含むＴｅｘＭＡＣＳ中に２．５×１０^６／ｍｌで細胞を４日間培養した。本開示の他の場所で記載されるように、細胞を採取し、結合剤発現、サイトカイン発現および食作用アッセイについて試験した。一般的なアッセイスキームは：０日目の単離／富化－１日目のエレクトロポレーション（ＥＰ）－２日目の食作用－３日目のサイトカイン収集にしたがった。

[0505]データは、図２１Ａ（細胞生存能力）、図２１Ｂ（受容体（結合剤）発現アッセイ）、図２１Ｃ（食作用アッセイ）および図２１Ｄ（サイトカイン生成）に示す。これらの試験は、Ｍ－ＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦが細胞表現型および受容体活性に影響を与えるかもしれないことを実証した。図２１Ａに記載されるデータは、ＧＭ－ＣＳＦで細胞を培養することが細胞の生存能力および数をわずかに低下させたことを実証する。しかし、図２１Ｂに示すように、ＧＭ－ＣＳＦは構築物の発現レベルを増強した。しかし、３７℃でのＨ９腫瘍細胞取り込みによって実証された食作用アッセイからのデータは、ＧＭ－ＣＳＦがＣＦＰ発現細胞の食作用能力を低減したことを示す（図２１Ｃ）。同時に、図２１Ｄは、ＧＭ－ＣＳＦがＣＦＰ発現細胞で様々なサイトカインのレベルを抑圧したことを示す。これらの研究は、ＧＭ－ＣＳＦが、炎症能力の消耗を非常に速やかに実証することができる炎症性単球様表現型を誘導する点で、ＧＭ－ＣＳＦがＭ－ＣＳＦより複雑な役割を有することを示すことができる。それは、ＧＭ－ＣＳＦが免疫寛容を促進して、免疫調節サイトカインとして作用することができることを示すこともできる。その役割は、濃度および状況次第である可能性がある。他方、Ｍ－ＣＳＦは短期（例えば一晩）培養に、およびそれらの表現型を速やかに変換することから細胞を維持することのために好適である。

実施例１０．組換え核酸を発現するヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団の生成
[0506]以下の実施例は、医薬組成物への組入れのための、抗ＣＤ５ＣＦＰ（ＣＤ５－ＣＦＰ発現細胞）または抗ＨＥＲ－２ＣＦＰ（ＨＥＲ２－ＣＦＰ発現細胞）をコードする配列を有する組換え核酸を含むヒト細胞の首尾よく生成されたｅｘｖｉｖｏ集団を実証し、ここで、ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団中の細胞の７０％より多くはＣＤ１４＋およびＣＤ１６－である。図２２に例示される試験に関して、ヒトＣＤ１４＋／ＣＤ１６－単球を単離し、ＣＤ５結合性ＣＦＰ（左）またはＨＥＲ２結合性ＣＦＰ（右）をコードするそれぞれの核酸を細胞に組み込み、続いて細胞を一晩培養してタンパク質の発現を可能にした。１００，０００個の細胞をＡｌｅｘａ７００コンジュゲート抗ＣＤ１４抗体（１：２０希釈）およびＰＥコンジュゲート抗ＣＤ１６抗体（１：２０希釈）またはマッチするアイソタイプ対照抗体で染色した。抗体染色細胞は、次にＡｔｔｕｎｅＮＸＴフローサイトメーターで分析した。データは、ＦｌｏｗＪｏで分析した。ＣＤ５－ＣＦＰまたはＨＥＲ２－ＣＦＰの発現は、抗ＣＤ５－ＣＦＰおよび抗ＨＥＲ２－ＣＦＰ抗体を使用して分析した。図２２に示すように：７１．３％の細胞はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－（左）であり、細胞の７６％はＣＤ５－ＣＦＰ（中央）を発現し；７６．７％の細胞はＣＤ１４＋／ＣＤ１６－であり、細胞の９５％はＨＥＲ２－ＣＦＰ（右）を発現した。

[0507]別の例示的ランでは、臨床グレード製造プロトコール、臨床スケールドナーＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞を白血球分離試料から負の選択によって単離し、構築物（表４に示す）（ＣＤ５－ＦｃＲ－ＰＩ３Ｋ、ＨＥＲ２－ＦｃＲ－ＰＩ３Ｋ、ＣｏＶＩＤ１９抗原配列、および神経膠芽腫抗原配列（ＧＢＭ））を単離したヒトＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞へ送達した。ＣＤ５－ＦｃＲ－ＰＩ３Ｋ構築物のために１ドナー試料を使用し；ＨＥＲ２－ＦｃＲ－ＰＩ３Ｋ構築物のために１ドナー試料を使用した。ＣｏＶＩＤ１９抗原構築物によるセットのために、４人の独立したドナーによる４つの臨床スケールランを使用し、データは全４つの平均を実証する。ＧＢＭ抗原によるセットのために、３人の独立したドナーによる３つの臨床スケールランを実行した。これらの細胞は、直後に冷凍した。投与（注射による）の時に細胞を解凍し、試料アリコートを前のセクションに記載したフローサイトメトリーによって分析した。

[0508]別の例示的なランでは、細胞を単離し、エレクトロポレーションの前、またはエレクトロポレーションした細胞を、細胞培養バイオプロセッサーバッグ、または、製造業者、製造もしくはモデル、または表面積が異なる、異なる種類の培養フラスコの中で解凍した後に培養した。図２３の試験ランから示された結果は、培養バッグでより培養フラスコで培養されたときに治療的に有効な細胞のより優れた収量を示し、例えば、フラスコで培養した後にバッグより高いパーセンテージのＣＤ５結合剤ＣＦＰ発現細胞が得られた。しかし、一部の試料セットは、トランスフェクションの４８時間後または７２時間後に組換え核酸の発現の低下を示した。

[0509]例示的な白血球分離採血では、関連する白血球分離分画を収集し、分画からの細胞型を、例えば分画のプールでＣＤ１４＋およびＣＤ１１ｂ陽性細胞を得ることにおける細胞型一貫性について評価した。白血球分離アッセイからの３連続分画（例えば、分画２～５の間）からプールした細胞は、ＣＤ１４およびＣＤ１１ｂを発現した細胞で一貫して富化され、ＣＤ１６－およびＣＤ３－であった細胞が高いパーセンテージであった。１人のヒトドナーからの例示的な採血を図２４に表し、エラトリエーション後の評価の結果を示す。例示的なアッセイでは、前記のように白血球分離試料からの細胞を収集した後のエレクトロポレーションによる細胞のトランスフェクションは、図２５Ａおよび２５Ｂに示すように高いＣＤ１４＋、高いＣＤ１１ｂ＋、低いＣＤ１６＋および低いＣＤ３＋細胞による細胞集団をもたらし；細胞はエレクトロポレーションの結果高いトランスフェクション効率を示した（図２５Ｃ）。図２５Ｄは、エレクトロポレーションの後の例示的なランにおける７ＡＡＤで染色した生細胞のパーセンテージを実証する。ＣＤ５結合剤ＣＦＰを発現するトランスフェクトされていない細胞およびトランスフェクトされた細胞で、高いパーセンテージの細胞が生きていた。細胞は、エレクトロポレーションの後に冷凍した。分析は、解凍の０時間後に実行した。ＵＮＴ－トランスフェクトされていない；ＣＤ５、ＣＤ５結合剤ＣＦＰでトランスフェクトされた。

[0510]開示で記載される方法およびプロトコールを使用して、治療的使用のための高品質の細胞を生成し、ヒト患者での投与の前に品質について検査した。図２６に示すように、放出前に試験した細胞は例示的な判定基準を示す。単球は、示すようにゲーティングした。細胞の８０％より多くは、フローサイトメトリーにより単一細胞（シングレット）であり、細胞の９０％より多くは、並行フローサイトメトリーアッセイでアポトーシスのためのマーカーとして７ＡＡＤを使用して生細胞であった。細胞の９０％より多くは、試料中のＣＦＰの発現が陽性であった。試料は、エレクトロポレーションの１８時間後に分析した。

Claims

ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞のｅｘｖｉｖｏ集団を含む組成物であって、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞のｅｘｖｉｖｏ集団が、細胞の改変されたｅｘｖｉｖｏ集団であり、および／または外因性物質を含む、組成物。
ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞のｅｘｖｉｖｏ集団が、ヒト細胞の集団である、請求項１に記載の組成物。
ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞のｅｘｖｉｖｏ集団が、非極性または未分化の骨髄性細胞の集団である、請求項１に記載の組成物。
外因性物質が、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団の細胞で発現されるタンパク質またはペプチドをコードする配列を含む組換え核酸である、請求項１に記載の組成物。
組換え核酸が、キメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）をコードする配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
ＣＦＰが、（ａ）抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメイン、および（ｂ）細胞外ドメインに作動可能に連結された膜貫通ドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
組換え核酸が、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団の細胞の膜表面に発現されるタンパク質またはペプチドをコードする配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
膜表面に発現されるタンパク質またはペプチドが、抗原または疾患発症性物質に結合する細胞外抗原結合性ドメインを含む、請求項７に記載の組成物。
抗原が、がん抗原である、請求項８に記載の組成物。
抗原が、微生物病原性抗原である、請求項８に記載の組成物。
組換え核酸が、細胞の免疫応答を増強するタンパク質またはペプチドをコードする、請求項１に記載の組成物。
組換え核酸が、二重特異性エンゲージャーまたは三重特異性エンゲージャーをコードする、請求項１１に記載の組成物。
タンパク質またはペプチドが、１つまたは複数の抗原またはその断片を含む、請求項１～４に記載の組成物。
１つまたは複数の抗原のうちの抗原が、エンドソーム標的配列に融合される、請求項１３に記載の組成物。
１つまたは複数の抗原のうちの抗原が、分泌配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
組換え核酸が、エンドソーム標的配列に融合される第１の抗原と、分泌配列を含む第２の抗原とをコードする、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の組成物。
組換え核酸が、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団中の細胞によって分泌されるタンパク質またはペプチドをコードする、請求項１～４または１３～１６のいずれか一項に記載の組成物。
第１の抗原および第２の抗原が、同じ遺伝子によってコードされる、請求項１６に記載の組成物。
タンパク質またはペプチドが、エンドソームでプロセシングされたタンパク質である、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の組成物。
タンパク質またはペプチドが、細胞表面に提示される抗原のエピトープである、請求項１３～１９に記載のいずれか一項に記載の組成物。
抗原が、ウイルス、細菌、原生動物、または真菌の抗原である、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の組成物。
外因性物質が、細胞質タンパク質またはペプチドであるタンパク質またはペプチドをコードする配列を含む組換え核酸である、請求項１に記載の組成物。
外因性物質が、免疫原性であるタンパク質またはペプチドをコードする配列を含む組換え核酸である、請求項１に記載の組成物。
外因性物質が、抗原である、請求項１に記載の組成物。
（ｉ）細胞の集団中の細胞の少なくとも２５％が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－であり、（ｉｉ）細胞の集団中の細胞の２５％未満が、樹状細胞である、請求項１～２４に記載の組成物。
細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＣＲ２＋および／またはＣＣＲ５＋である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ６３＋である、請求項１～２６に記載の組成物。
細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ５６－、ＣＤ３－、および／またはＣＤ１９－である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
細胞の集団中の細胞の４０％未満が、マクロファージ細胞である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団が、少なくとも１×１０^７個の細胞を含む、請求項１～２９に記載の組成物。
請求項１～３０のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
（ａ）組換え核酸を含むヒト細胞の集団であって、組換え核酸が、キメラ融合タンパク質（ＣＦＰ）をコードする配列を含み、（ｉ）ヒト細胞の集団中の細胞の少なくとも２５％が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－であり、（ｉｉ）ヒト細胞の集団中の細胞の２５％未満が、樹状細胞である、集団と；
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤と
を含む、医薬組成物。
ＣＦＰが、（ｉ）細胞外抗原結合性ドメインと（ｉｉ）膜貫通ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインおよび膜貫通ドメインが、作動可能に連結されている、請求項３２に記載の医薬組成物。
ＣＦＰが、膜貫通ドメインに作動可能に連結された、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項３２または３３に記載の医薬組成物。
ＣＦＰが、貧食受容体またはスカベンジャー受容体に由来する細胞内ドメインを含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
抗原結合性ドメインが、ＣＤ５結合ドメインまたはＨＥＲ２結合ドメインである、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、またはＣＤ６８膜貫通ドメインに由来する、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインが、キナーゼ動員ドメインを含む、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
ＣＦＰが、（ａ）（ｉ）ＣＤ５またはＨＥＲ２に特異的に結合するｓｃＦｖと、（ｉｉ）ＣＤ８に由来するヒンジドメイン、またはＣＤ２８またはＣＤ６８の細胞外ドメインまたはその一部とを含む細胞外ドメインと；（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、またはＣＤ６８膜貫通ドメインと；（ｃ）少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインであって、少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインが、（ｉ）ＦｃγＲまたはＦｃεＲに由来する第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、（ｉｉ）（Ａ）ＰＩ３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）動員ドメインを含むか、または（Ｂ）ＣＤ４０に由来する、第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、細胞内ドメインとを含む、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
ヒト細胞の集団が、ｅｘｖｉｖｏで改変された細胞である、請求項３２に記載の医薬組成物。
（ａ）組換え核酸を含むヒト細胞の集団であって、組換え核酸が、抗原性ペプチドをコードする配列をコードする配列を含み、（ｉ）ヒト細胞の集団中の細胞の少なくとも２５％が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－であり、（ｉｉ）ヒト細胞の集団中の細胞の２５％未満が、樹状細胞である、集団と；
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤と
を含む、医薬組成物。
ヒト細胞の集団のＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞が、細胞表面上のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子と会合して微生物抗原またはその断片を提示する、請求項４１に記載の医薬組成物。
組換え核酸が、ＣＭＶｐｐ６５ペプチド、変異体Ｒ１３２Ｈ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ）ペプチド、ＴＲＰ２ペプチド、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原ペプチドから選択される抗原ペプチドをコードする配列を含む、請求項４１または４２に記載の医薬組成物。
組換え核酸が、エンドソーム標的配列に融合される第１の抗原と、分泌配列を含む第２の抗原とをコードする、請求項４１～４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
抗原が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞によってエンドソームでプロセシングされる、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
ヒト細胞の集団の細胞が、対象由来の生体試料から単離される、請求項１に記載の組成物、または請求項３２～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
細胞が、末梢血から単離される、請求項１に記載の組成物、または請求項３２～４６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
細胞が、ｅｘｖｉｖｏで改変される、請求項１に記載の組成物、または請求項３２～４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（ａ）細胞の集団中の細胞の少なくとも２５％が、ＣＣＲ２＋および／またはＣＣＲ５＋であり；
（ｂ）細胞の集団中の細胞の少なくとも２５％が、ＣＤ６３＋であり；
（ｃ）細胞の集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ５６－、ＣＤ３－、および／またはＣＤ１９－であり；
（ｄ）細胞の集団中の細胞の４０％未満が、マクロファージ細胞である、
請求項３２～４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
細胞の集団が、非極性または未分化の骨髄性細胞の集団である、請求項３２～４９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
約１０^７個の細胞～約１０^１０個の細胞を含む、請求項３２～５０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
組成物の細胞が、２回以下の凍結／解凍サイクルに曝露されている、請求項３２～５１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
細胞が、生体試料からの単離または濃縮後４８時間未満の間ｅｘｖｉｖｏで培養されている、請求項１に記載の組成物、または請求項３２～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
投与前の細胞の生存率が、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、または９５％を超える、請求項１に記載の組成物、または請求項３２～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
微生物感染症の処置を必要とする対象における微生物感染症を処置する方法であって、請求項４１～５４のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
投与前に微生物抗原を発現するＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞を調製するステップであって、
（ｉ）生体試料からＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞を単離または濃縮するステップと、
（ｉｉ）細胞の表面に抗原を発現および提示するための少なくとも１つの抗原をコードする配列を含む組換え核酸を、（ｉ）からの細胞に導入するステップと
を含む、ステップをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
疾患または状態の処置を必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、請求項３１～４０のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
疾患または状態が、がんである、請求項５７に記載の方法。
投与前にＣＦＰを発現するＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞を調製するステップであって、
（ｉ）生体試料からＣＤ１４＋およびＣＤ１６－細胞を単離または濃縮するステップと、
（ｉｉ）ＣＦＰをコードする配列を含む組換え核酸を、（ｉ）からの細胞に導入するステップと
を含む、ステップをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
細胞に導入するステップが、組換え核酸による細胞の電気穿孔を実施するステップを含む、請求項５５または５７に記載の方法。
組換え核酸が、ＲＮＡである、請求項５５～６０のいずれか一項に記載の方法。
組換え核酸が、ｍＲＮＡである、請求項６１に記載の方法。
組換え核酸が、細胞に取り込まれる前に、水性混合物中で１つまたは複数の脂質と会合される、請求項５５～６２のいずれか一項に記載の方法。
ＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞が、投与前に２回以下の凍結／解凍サイクルに曝露される、請求項５５～６３のいずれか一項に記載の方法。
医薬組成物中の細胞が、投与前に４８時間未満の間ｅｘｖｉｖｏで培養されている、請求項５５～６４のいずれか一項に記載の方法。
医薬組成物が、ｉｎｖｉｔｒｏで培養された場合には組換え核酸細胞を取り込んだ４８時間以内にヒト対象に投与されるか、または将来の投与のために凍結される、請求項５５～６５のいずれか一項に記載の方法。
ヒト細胞のｅｘｖｉｖｏ集団が、投与前に３６時間未満、２４時間、１８時間未満、１２時間未満、または６時間未満の間ｅｘｖｉｖｏで培養されている、請求項５５～６６のいずれか一項に記載の方法。
医薬組成物が、細胞の集団中に少なくとも１０^７個の細胞を含む、請求項５５～６７のいずれか一項に記載の方法。
医薬組成物が、細胞の集団中に少なくとも１０^８個の細胞を含む、請求項５５～６８のいずれか一項に記載の方法。
医薬組成物が、細胞の集団中に少なくとも１０^９個の細胞を含む、請求項５５～６９のいずれか一項に記載の方法。
医薬組成物が、１回投与される、請求項５５～６８のいずれか一項に記載の方法。
医薬組成物が、２回以上投与される、請求項５５～７１のいずれか一項に記載の方法。
医薬組成物が、２週間に１回、４週間に１回、６週間に１回、８週間に１回、１０週間に１回、１２週間に１回、１６週間に１回、２０週間に１回、２４週間に１回、または毎年１回投与される、請求項５５～７２のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、対象にとって自己由来である、請求項５５～７３のいずれか一項に記載の方法。
医薬組成物が、
（ａ）投与後に対象においてエフェクター細胞に分化する；
（ｂ）投与後に対象の患部に浸潤するか、もしくは投与後に対象の患部に移動する；または
（ｃ）投与後の対象において少なくとも５日間の寿命を有する
ことを可能にする細胞を含む、請求項５５～７４のいずれか一項に記載の方法。
疾患または状態を処置する細胞ベースの治療薬を調製するための、請求項１～５４のいずれか一項に記載の組成物または医薬組成物の使用。
疾患または状態が、がん、感染症または自己免疫疾患である、請求項７６に記載の使用。
疾患または状態を処置するための、請求項１～５４のいずれか一項に記載の組成物または医薬組成物の使用。
疾患または状態が、がん、感染症または自己免疫疾患である、請求項７８に記載の使用。
医薬組成物を調製するための細胞をネガティブに選択する方法であって、
（ａ）ヒト対象からの生体試料を、抗ＣＤ１６抗体、ならびに抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１９抗体から選択される１つまたは複数の抗体と接触させるステップと、
（ｂ）抗ＣＤ１６抗体によって結合されておらず、１つまたは複数の抗体によって結合されていない生体試料中の細胞を収集するステップと、
（ｃ）ＣＦＰをコードする配列を含む組換え核酸を、（ｂ）から収集された細胞に導入し、それによって細胞の集団を形成するステップと
を含み、
（ｉ）細胞の集団中の細胞の少なくとも２５％が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６であり、
（ｉｉ）細胞の集団中の細胞の２５％未満が、樹状細胞である、
方法。
フローサイトメトリーまたは蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含む、請求項８０に記載の方法。
組換え核酸を含むＣＤ１４＋／ＣＤ１６－細胞の集団を含むワクチン組成物で
あって、細胞が、４８時間未満の間ｅｘｖｉｖｏで培養されている、ワクチン組成物。
組換え核酸が、エンドソーム標的配列を含み、エンドソーム標的配列が、ＬＡＭＰ１配列である、請求項１４または８２に記載の組成物。
組換え核酸が、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）シグナル配列、ヒト免疫グロブリン重鎖シグナル配列、ヒト免疫グロブリン軽鎖シグナル配列、ヒト血清アルブミンシグナル配列、ヒトアズロシジンシグナル配列、またはヒトシスタチンの分泌シグナルペプチド配列である分泌配列を含む、請求項１５または８２に記載の組成物。
疾患または状態の処置を必要とするヒト対象における疾患または状態を処置する方法であって、請求項８２～８４のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物をヒト対象に投与するステップを含む、方法。