CN115236041A - 基于无酶toehold介导的链置换反应催化的单分子荧光生物传感器及其应用 - Google Patents

基于无酶toehold介导的链置换反应催化的单分子荧光生物传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于无酶toehold介导的链置换反应催化的单分子荧光生物传感器及其应用，属于单分子荧光检测技术领域。本发明构建了一个基于无酶toehold‑介导的链置换反应催化的单个分子福斯特共振能量转移生物传感器，用于UDG活性的体外检测和体内成像。目标UDG信号通过无酶催化反应被放大，整个反应可以一步完成，无需费力的洗涤和分离步骤，可以极大地简化实验过程，节省实验时间，降低检测成本，具有极佳的灵敏度和特异性，为基于UDG的生物医学基础研究、临床诊断和治疗提供了一个有价值的平台，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

基于无酶toehold介导的链置换反应催化的单分子荧光生物 传感器及其应用
技术领域
本发明属于单分子荧光检测技术领域，具体涉及一种基于无酶toehold介导的链置换反应催化的单分子荧光生物传感器及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
维持基因组完整性对于生物体至关重要，但基因组DNA不断受到各种内源性和外源性因子的破坏，导致细胞内出现多种类型的DNA损伤(例如，碱基对错配、氧化碱基、DNA烷基化、DNA脱氨和DNA链断裂)。尿嘧啶是最常见的DNA损伤形式之一，它是由于DNA复制过程中dUTP的错误掺入或胞嘧啶的自发水解脱氨导致的。尿嘧啶在基因组中的存在可能导致G：C碱基对在随后的DNA复制中替换为A：U碱基对，而A：U碱基对可能阻碍DNA结合蛋白的识别，从而导致错误的密码信息，甚至致癌。尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase,UDG)是细胞碱基切除修复途径的启动酶，它可以通过催化裂解尿嘧啶和脱氧核糖之间的N-糖基键，生成AP位点，从而切除DNA中尿嘧啶。UDG的失调可能导致尿嘧啶切除修复功能障碍，从而导致各种疾病，如布鲁姆综合征、人类免疫缺陷、淋巴瘤、神经衰弱和癌症。因此，对UDG活性的灵敏检测对了解DNA损伤修复过程和提高早期临床诊断的准确性非常重要。
传统的UDG检测方法包括凝胶电泳结合放射性标记和质谱法。然而，这些方法通常耗时耗力，灵敏度低，而且往往涉及危险的辐射、复杂的仪器和复杂的程序。为了提高检测灵敏度，人们开发了各种酶介导的等温信号扩增方法用于UDG检测，包括滚环扩增(rollingcircle amplification,RCA)、链置换扩增(strand displacement amplification,SDA)、指数扩增反应(exponential amplification reaction,EXPAR)，以及核酸外切酶辅助的信号扩增。然而，酶介导的信号扩增方法的引入不可避免地增加了实验成本，使检测设计复杂化，并且不适合于内源性UDG活性的体内成像。特别地，单细胞水平的细胞内UDG的可视化对于理解DNA修复系统和研究突变相关疾病具有重要意义。
单分子荧光检测已经成为最先进的分析技术之一，具有超高的灵敏度、低样品消耗、高信噪比等优点。尽管单分子检测在生物传感应用中取得了辉煌的成就，但它仍然难以检测浓度极低的稀有目标(如临床样品中的生物标志物)。为了解决这个问题，人们引入了多种核酸扩增方法，以开发出灵敏度更高的新型单分子检测方法，然而发明人发现，在实施扩增反应时总是需要不同的酶，包括聚合酶、核酸酶和连接酶，因此不能排除上述引入的基于酶的检测方法的限制。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供一种基于无酶toehold介导的链置换反应催化的单分子荧光生物传感器及其应用。本发明构建了一个基于无酶toehold介导的链置换反应催化的单个分子福斯特共振能量转移(
Figure BDA0003643481570000021
resonance energy transfer，FRET)生物传感器，用于UDG活性的体外检测和体内成像。目标UDG信号通过无酶催化反应被放大，整个反应可以一步完成，无需费力的洗涤和分离步骤，可以极大地简化实验过程，节省实验时间，降低检测成本，具有极佳的灵敏度和特异性，为基于UDG的生物医学基础研究、临床诊断和治疗提供了一个有价值的平台，因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种基于无酶toehold介导的链置换反应催化的单分子荧光生物传感器，所述荧光生物传感器至少包括一个检测探针和两个发夹探针；
其中，所述检测探针为发夹检测探针，其至少含有一个尿嘧啶位点，当存在UDG时，其特异性识别并去除检测探针上的尿嘧啶，导致所述检测探针断裂并暴露出一个toehold结构域；
所述发夹探针均在序列末端修饰有荧光基团，当检测探针暴露所述toehold结构域时，通过toehold介导的链置换反应启动两个修饰有荧光基团的发夹探针的催化自组装，从而产生具有放大的FRET信号的大量DNA双链体。
所述荧光生物传感器还可以包含缓冲液等其他成分，本领域技术人员可根据实际情况进行选择使用，在此不再做具体限定。当然，上述荧光生物传感器可作为UDG检测试剂盒进行生产销售。
因此，本发明的第二个方面，提供一种UDG检测试剂盒，所述检测试剂盒包含上述荧光生物传感器。
本发明的第三个方面，提供一种检测尿嘧啶DNA糖基化酶的方法，所述方法包括采用上述荧光生物传感器或检测试剂盒进行检测。
本发明的第四个方面，提供上述荧光生物传感器、检测试剂盒和/或检测方法在尿嘧啶DNA糖基化酶相关药物筛选和/或样品尿嘧啶DNA糖基化酶分析中的应用。
此外，需要说明的，本发明虽然以检测尿嘧啶DNA糖基化酶为例，提供相关荧光生物传感器、检测试剂盒以及检测方法，但是基于本发明的构思，如将检测探针中的特异性识别位点进行替换进而用于检测其他DNA修复酶显然也是容易获得的，因此同样也在本发明的保护范围之内。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
1.上述技术方案构建了一个基于无酶toehold介导的链置换反应催化的单个分子荧光共振能量转移生物传感器，用于UDG活性的体外检测和体内成像。
当UDG存在时，它会特异性地识别并去除检测探针上的尿嘧啶，导致检测探针断裂并暴露出一个toehold域。暴露的toehold将激活链置换反应，诱导两个荧光团(Cy3和Cy5)分别标记的发夹探针自组装成Cy3和Cy5双标记的DNA双链，其中Cy3到Cy5之间发生高效的FRET。
2.灵敏度高、特异性好：由于toehold介导的链置换反应的高效率和单分子检测技术的高信噪比，该方法具有较高的灵敏度，检测限为0.00029单位每毫升。单分子检测的应用进一步提高了灵敏度，减少了样品的消耗。
3.应用范围广：该技术方案可用于筛选潜在的抑制剂和分析动力学参数，在分子诊断和即时检测方面具有潜在的应用价值。重要的是，通过设计合适的DNA底物，它可以成为一个通用的平台。
4.可用于活细胞内源性UDG活性的成像。
5.操作简单：在本技术方案中，目标UDG信号通过无酶催化反应被放大，整个实验可以一步完成，无需费力的洗涤和分离步骤，可以极大地简化实验过程，节省实验时间，降低实验成本，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明催化单分子FRET用于UDG检测的原理示意图；其中，(A)一步单分子UDG检测概述。(B)UDG通过toehold介导的链置换反应诱导FRET复合物催化组装的原理。数字表示功能域，域x与域x*互补。碱基切除修复反应期间的分子结构变化如虚线框所示。
图2为本发明实施例中催化单分子FRET用于UDG检测的原理性验证相关图，其中，(A)以SYBR Gold为指示剂的PAGE分析。泳道M：DNA标记(DNA marker)；泳道1：100纳摩尔每升检测探针；泳道2：200纳摩尔每升Cy5标记的发夹探针1；泳道3：200纳摩尔每升Cy3标记的发夹探针2；泳道4：100纳摩尔每升检测探针+200纳摩尔每升Cy5标记的发夹探针1+200纳摩尔每升Cy3标记的发夹探针2+2单位APE1；泳道5：100纳摩尔每升检测探针+200纳摩尔每升Cy5标记的发夹探针1+200纳摩尔每升Cy3标记的发夹探针2+2单位APE1+1单位每毫升UDG。(B)直接激发Cy3荧光基团的PAGE分析。Cy3的信号显示为绿色，Cy5的信号显示为红色，Cy3和Cy5的共定位用黄色表示。(C)不存在(对照)和存在UDG的情况下Cy3和Cy5的荧光发射光谱。UDG的浓度为1单位每毫升。(D)在存在或不存在UDG的情况下，Cy5荧光强度随反应时间的变化曲线。
图3为本发明实施例中基于全内反射荧光(TIRF)成像的单分子检测来检测UDG活性相关图，其中，Cy3和Cy5在不存在UDG(A-C)和存在(D-F)时的单分子荧光图像。Cy3的信号显示为绿色(A和D)，Cy5的信号显示为红色(B和E)，而Cy3和Cy5的共定位信号显示为黄色(C和F)。UDG的浓度为1单位每毫升。比例尺为5微米。
图4为本发明实施例中Cy3(A)和Cy5(B)荧光点的单分子逐步光漂白轨迹。光漂白过程之前的单分子荧光图像显示在左侧面板上。比例尺为5微米。
图5为本发明实施例中对反应条件的筛选优化相关图，其中，(A)F–F0值随反应温度的变化。(B)F–F0值与APE1用量的关系。UDG的浓度为1单位每毫升。误差棒显示为三个独立实验的标准偏差。
图6为本发明实施例中灵敏度检测相关图，其中，(A)荧光发射光谱随UDG浓度的变化。(B)Cy5荧光强度与UDG浓度对数在0.005至0.5单位每毫升范围内呈线性关系。(C)Cy5计数随UDG浓度的变化。(D)Cy5计数与UDG浓度的对数在0.0005到0.5单位每毫升范围内呈线性关系。误差棒显示为三个独立实验的标准偏差。
图7为本发明实施例中分别在反应缓冲液(对照)、0.1毫克每毫升BSA、0.1毫克每毫升IgG、1单位每毫升Fpg、1单位每毫升hAAG、1单位每毫升UDG、以及含有1单位每毫升UDG+上述所有干扰的混合物存在下测定的Cy5单分子计数。误差棒显示为三个独立实验的标准偏差。
图8为本发明实施例中动力学和抑制剂相关实验图，其中，(A)初始速度(V)随检测探针浓度的变化。UDG的浓度为1单位每毫升。(B)不同浓度的UGI对UDG的相对活性的抑制效果。UDG的浓度为0.2单位每毫升。误差棒显示为三个独立实验的标准偏差。
图9为本发明实施例中细胞UDG的检测相关图，(A)分别在裂解缓冲液、裂解缓冲液+UGI、细胞提取物+UGI和细胞提取物存在时测量Cy5计数。(B)不同HeLa细胞数诱导的Cy5计数变化。插图显示为Cy5计数与HeLa细胞数的对数之间的线性关系。误差棒显示为三个独立实验的标准偏差。
图10为本发明实施例中细胞内UDG的成像相关图，分别用(A)Cy5标记的发夹探针1+Cy3标记的发夹探针2，(B)检测探针(T)+Cy5标记的发夹探针1+Cy3标记的发夹探针2，(C)检测探针+Cy5标记的发夹探针1+Cy3标记的发夹探针2转染的HeLa细胞中UDG活性成像。(D)响应于不同条件下的FRET信号。a组，Cy5标记的发夹探针1+Cy3标记的发夹探针2；b组，检测探针(T)+Cy5标记的发夹探针1+Cy3标记的发夹探针2；c组，检测探针+Cy5标记的发夹探针1+Cy3标记的发夹探针2。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，传统的UDG检测方法包括凝胶电泳结合放射性标记和质谱法。然而，这些方法通常耗时耗力，灵敏度低，而且往往涉及危险的辐射、复杂的仪器和复杂的程序。为了提高检测灵敏度，人们开发了各种酶介导的等温信号扩增方法用于UDG检测，以及核酸外切酶辅助的信号扩增。然而，酶介导的信号扩增方法的引入不可避免地增加了实验成本，使检测设计复杂化，并且不适合于内源性UDG活性的体内成像。
有鉴于此，本发明构建了一个基于无酶toehold-介导的链置换反应催化的单个分子福斯特共振能量转移生物传感器，用于UDG活性的体外检测和体内成像。靶UDG可以去除检测探针上的尿嘧啶碱基，在APE1的辅助下导致检测探针断裂。裂解的检测探针暴露其toehold结构域，并通过toehold-介导的链置换反应启动两个荧光基团标记的发夹探针的催化自组装，以产生具有放大的FRET信号的大量DNA双链体。由于toehold介导的链置换反应的高效率和单分子检测技术的高信噪比，该方法具有较高的灵敏度。FRET方法的自校准特性确保了所提出的生物传感器即使在复杂的细胞内环境中也具有高精度，为活细胞中UDG活性的特异、灵敏检测和成像提供了一个新的平台。
其实验原理(如图1)：为了阐明整个反应过程，每条DNA链被分解成几个功能域，用不同的数字表示。该实验涉及两个荧光标记的发夹探针——Cy5标记的发夹探针1(Cy5-HP1)和Cy3标记的发夹探针2(Cy3-HP2)，以及一个在结构域1*和2*之间用一个尿嘧啶碱基(U)修饰的发夹检测探针。在UDG的存在下，UDG特异性地识别检测探针中的尿嘧啶碱基，并水解尿嘧啶和脱氧核糖之间的N-糖苷键，释放出尿嘧啶碱基，形成一个脱嘌呤/嘧啶(AP)位点。AP位点随后被APE1裂解，生成一个单核苷酸间隙，导致检测探针的茎域1*自动解离。裂解的检测探针暴露出toehold结构域1，它可以与Cy5标记的发夹探针1的结构域1*结合，启动分支迁移反应，形成稳定的启动子/Cy5标记的发夹探针1双链，随后Cy5标记的发夹探针1的结构域3暴露。暴露的结构域3将作为另一个toehold，启动下一个分支迁移反应，生成Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链，并释放裂解的检测探针。游离的裂解检测探针可以与另一个Cy5标记的发夹探针1结合，催化循环的toehold介导的链置换反应，产生大量的Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链。由此产生的双链体可以使Cy3供体和Cy5受体相互靠近，诱发Cy3到Cy5的显著FRET，并且FRET信号可以通过全内反射荧光显微镜(TIRF)简单、灵敏地进行量化。相反，在没有UDG的情况下，尿嘧啶碱基不能被切除，toehold结构域1在检测探针的茎部区域被阻断，不能发生链置换反应，也不能检测到FRET信号。
因此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种基于无酶toehold介导的链置换反应催化的单分子荧光生物传感器，所述荧光生物传感器至少包括一个检测探针和两个发夹探针；
其中，所述检测探针为发夹检测探针，其至少含有一个尿嘧啶位点，当存在UDG时，其特异性识别并去除检测探针上的尿嘧啶，导致所述检测探针断裂并暴露出一个toehold结构域；
所述发夹探针均在序列末端修饰有荧光基团，当检测探针暴露所述toehold结构域时，通过toehold-介导的链置换反应启动两个修饰有荧光基团的发夹探针的催化自组装，从而产生具有放大的FRET信号的大量DNA双链体。
具体的，所述发夹探针1标记有Cy5，所述发夹探针2标记为Cy3；
所述检测探针为发夹检测探针，具有茎环结构，其中，近5'端的茎部结构中含有一个尿嘧啶位点，从而将该结构区域划分为结构域1*和结构域2*，其互补区域对应划分为结构域1和结构域2，发夹检测探针环部命名为结构域3；当存在UDG时，UDG特异性地识别检测探针中的尿嘧啶碱基，并水解尿嘧啶和脱氧核糖之间的N-糖苷键，释放出尿嘧啶碱基，形成一个脱嘌呤/嘧啶(AP)位点；AP位点随后被人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(humanapurinic/apyrimidinic endonuclease1，APE1)裂解，生成一个单核苷酸间隙，导致检测探针的结构域1*自动解离；
裂解的检测探针暴露出toehold结构域1，其与Cy5标记的发夹探针1的结构域1*结合，启动分支迁移反应，形成稳定的启动子/Cy5标记的发夹探针1双链，随后Cy5标记的发夹探针1的结构域3暴露；暴露的结构域3作为另一个toehold，启动下一个分支迁移反应，生成Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链，并释放裂解的检测探针；游离的裂解检测探针与另一个Cy5标记的发夹探针1结合，催化循环的toehold介导的链置换反应，产生大量的Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链；由此产生的双链体可以使Cy3供体和Cy5受体相互靠近，诱发Cy3到Cy5的显著FRET。
因此，所述荧光生物传感器还包括人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1即APE1。
本发明的又一具体实施方式中，
所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述发夹探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述发夹探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的又一具体实施方式中，所述荧光生物传感器还可以包含缓冲液等其他成分，本领域技术人员可根据实际情况进行选择使用，在此不再做具体限定。当然，上述荧光生物传感器可作为UDG检测试剂盒进行生产销售。
因此，本发明的又一具体实施方式中，提供一种UDG检测试剂盒，所述检测试剂盒包含上述荧光生物传感器。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测UDG的方法，所述方法包括采用上述荧光生物传感器或检测试剂盒进行检测。
具体的，所述检测方法包括：
将检测探针、两个发夹探针、APE1与待测样品进行孵育即得。由上述具体检测方法可知，本发明可在同质模式下进行，不需要费力的洗涤和分离步骤，从而极大节约人力物力资源。
所述孵育条件为：在30-40℃(优选为37℃)孵育50-100分钟(优选为80分钟)。
上述孵育反应在溶液环境下进行，所述溶液可以为反应缓冲液，如标准Taq反应缓冲液(10毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐(Tris-HCl)，50毫摩尔每升的氯化钾(KCl)，1.5毫摩尔每升的氯化镁(MgCl2)，pH 8.3)。
本发明的又一具体实施方式中，所述方法还包括对上述孵育反应产物进行荧光检测分析。
所述荧光检测分析可以是基于荧光分光光度计在532纳米的激发波长下测量荧光光谱，并记录波长在550到750纳米之间荧光光谱；还可以是基于全内反射荧光显微镜(TIRF)成像进行单分子检测分析。
其中，所述待测样品可以是环境样品或生物样品，所述生物样品包括离体的血液、体液、组织和细胞，特别的，经试验证明，本发明荧光生物传感器能够用于活细胞内源性UDG活性的成像，从而在细胞水平灵敏检测细胞内的UDG。
本发明又一具体实施方式中，提供上述生物传感器、检测试剂盒和/或检测方法在UDG相关药物筛选和/或样品UDG分析中的应用。
所述药物可以是UDG抑制剂或激活剂。
所述样品可以是环境样品或生物样品，所述生物样品包括离体的血液、体液、组织和细胞，经试验证明，本发明荧光生物传感器能够用于活细胞内源性UDG活性的成像，从而在细胞水平灵敏检测细胞内的UDG，为活细胞中DNA修复相关的酶和相关途径的可视化提供了一个简单而强大的工具，在生物学研究、临床诊断和药物发现方面具有巨大的潜力。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。下述实施例中，使用相关探针等核苷酸序列如下所示：
Figure BDA0003643481570000081
“*”代表硫代修饰。
实施例
实验方法
发夹探针的制备：所有发夹探针在1×标准Taq反应缓冲液(10毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐(Tris-HCl)，50毫摩尔每升的氯化钾(KCl)，1.5毫摩尔每升的氯化镁(MgCl2)，pH 8.3)中95摄氏度孵育5分钟，然后慢慢冷却到室温，使探针折叠成发夹结构。得到的发夹探针在4摄氏度下保存，以便进一步使用。
UDG活性检测：整个反应是在含有不同浓度的UDG，100纳摩尔每升的检测探针，200纳摩尔每升的Cy5标记的发夹探针1，200纳摩尔每升的Cy3标记的发夹探针2，2个单位的APE1，1×标准Taq反应缓冲液(10毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐(Tris-HCl)，50毫摩尔每升的氯化钾(KCl)，1.5毫摩尔每升的氯化镁(MgCl2)，pH 8.3)的10微升反应混合物中37摄氏度下孵育80分钟。
凝胶电泳和荧光光谱测量：为了验证Cy5标记的发夹探针1-Cy3标记的发夹探针2双链的组装以及Cy3和Cy5之间的FRET，在室温120伏的恒定电压下，采用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在1×TBE缓冲液(9纳摩尔每升Tris-HCl，9毫摩尔每升硼酸，0.2毫摩尔每升乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 7.9)中分析反应产物，电泳时间为50分钟。电泳后的凝胶用ChemiDocTMMP成像系统(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行成像分析。用1×标准Taq反应缓冲液(10毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐(Tris-HCl)，50毫摩尔每升的氯化钾(KCl)，1.5毫摩尔每升的氯化镁(MgCl2)，pH 8.3)将10微升的反应产物稀释至50微升，然后用Hitachi F-7000荧光分光光度计在532纳米的激发波长下测量荧光光谱，并记录波长在550到750纳米之间荧光光谱。荧光发射光谱由配有氙灯作为激发源的日立F-7000荧光分光光度计(Tokyo，日本)测量。Cy3染料的激发波长为532纳米。发射光谱在550到750纳米之间被记录。
单分子检测与数据分析：反应产物在成像缓冲液(10毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐(Tris-HCl)，50毫摩尔每升的氯化钾(KCl)，1.5毫摩尔每升的氯化镁(MgCl2)，1毫摩尔每升的水溶性维生素E，pH 8.0)中稀释10000倍。用移液枪吸取10微升稀释后的反应产物直接滴到盖玻片上用于全内反射荧光显微镜(TIRF)成像。使用561纳米的激光器激发Cy3荧光分子。Cy3和Cy5的光子被一个油浸100倍物镜(Olympus，日本)收集，然后分离并引导到Andor Ixon DU897 EMCCD的两半上，曝光时间为500毫秒。使用Image J软件选择一个800×800像素的感兴趣区域(ROI)进行Cy5分子计数，并用10帧Cy5的总计数进行数据分析。单分子光漂白实验如上所述进行，稀释的反应混合物被561纳米的激光或640纳米的激光连续激发，并以400毫秒的曝光时间高频记录实时图像。
抑制分析：将不同浓度的尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)与检测探针在37摄氏度下孵育15分钟，然后向溶液中添加其他底物和UDG，并在37摄氏度下孵育80分钟。UDG的相对活性(RA)根据下列等式计算：
RA(％)＝Ci/Ct×100％＝10(Ni-Nt)/578.06×100％
其中Nt是存在0.2单位每毫升UDG时的Cy5计数，Ni是存在0.2单位每毫升UDG和不同浓度UGI时的Cy5计数通过绘制RA值与UGI浓度的关系图，计算IC50值。
细胞培养和细胞提取物的制备：将人肝细胞(HL-7702细胞)、人宫颈癌细胞(HeLa细胞)和人肺腺癌细胞(A549细胞)分别用含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素双抗的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)在37摄氏度、含5％二氧化碳培养箱中进行培养并用于实际样品分析。待细胞生长到对数生长期时，利用胰蛋白酶收集细胞，并使用Countstar生物技术有限公司的自动细胞计数器IC1000进行计数。使用核提取物试剂盒(Active Motif,Carlsbad,CA,USA)制备细胞提取物。
人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素双抗的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)在37摄氏度、含5％二氧化碳培养箱中进行培养。待细胞生长到对数生长期时，利用胰蛋白酶收集细胞，并使用Countstar生物技术有限公司的自动细胞计数器IC1000进行计数。根据制造商的说明，使用核提取试剂盒(Active Motif,Carlsbad,CA,USA)收集核提取物。对于细胞抑制实验，在加入HeLa细胞提取物或裂解缓冲液之前，将1单位每毫升UGI与检测探针在37摄氏度下孵育15分钟，然后进行上述相同的程序。
癌细胞中UDG的光学成像：将HeLa细胞接种在玻璃底的细胞培养皿中，并在37摄氏度、含5％二氧化碳培养箱中培养过夜。然后去除原始培养基，并用磷酸缓冲液(PBS)清洗贴壁细胞一次。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 3000试剂进行转染试验。将500微升含有7.5微升Lipofectamine-3000、20微升检测探针或其对照探针(5微摩尔每升)、20微升Cy5标记的发夹探针1(5微摩尔每升)、20微升Cy3标记的发夹探针2(5微摩尔每升)和10微升P300的Opti-MEM(Invitrogen)混合物加入每个培养皿中，在37摄氏度、含5％二氧化碳培养箱中培养2小时。然后用PBS清洗细胞数次以去除多余的样品。最后，在倒置的奥林巴斯IX71荧光显微镜(Olympus，日本)上用10倍物镜获得细胞的荧光图像。
实验结果
1.原理的实验验证
首先用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，以SYBR Gold作为荧光指示剂，监测UDG催化的检测探针的裂解和随后的链置换反应(图2A)。在UDG的存在下，被裂解的检测探针和Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链的特征带同时出现(图2A，泳道5)，同时伴随着Cy5标记的发夹探针1(图2A，泳道2)和Cy3标记的发夹探针2(图2A，泳道3)的消失，表明UDG可以催化检测探针的裂解来启动后续的链置换反应。相反，在没有UDG的情况下，既没有观察到裂解的检测探针，也没有观察到Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链的特征带(图2A，泳道4)，表明没有发生反应。
理论上，基于双链DNA中相邻碱基之间的距离约为0.34纳米的假设，合成的Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链中从Cy3到Cy5的距离约为2.72纳米，在FRET的有效距离内(对于Cy3/Cy5对，2R0＝11.4纳米)。我们进一步使用PAGE通过直接激发Cy3荧光团来验证Cy3和Cy5之间的FRET(图2B)。在没有UDG的情况下，在Cy3通道中只观察到Cy3标记的发夹探针2条带，而在Cy5通道中没有任何条带，这表明在没有UDG的情况下没有发生从Cy3到Cy5的FRET。加入UDG后，Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链体的特征带出现在Cy3通道中，同时Cy3标记的发夹探针2特征带强度下降，Cy5通道中出现Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链体的特征带，与Cy3通道中的特征带完全共定位，证明了高效的FRET是UDG诱导的Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链体组装的结果。
我们还使用系综荧光测量来研究Cy3和Cy5之间的FRET(图2C)。在没有UDG的对照实验中(图2C)，没有检测到显著的Cy5荧光信号，表明在没有UDG的情况下，Cy3与Cy5之间没有发生FRET。而在UDG存在的情况下，可以同时检测到Cy3荧光信号的降低和Cy5荧光信号的升高(图2C)，表明目标UDG诱导的Cy3到Cy5的有效FRET。时间过程实验表明，Cy5荧光信号在5到80分钟内随反应时间增加而增加，并在80分钟时达到平台(图2D)，而在没有UDG的对照组中未观察到明显的信号增加(图2D)。这些结果清楚地证明了目标UDG诱导的催化组装。
我们进一步采用基于全内反射荧光(TIRF)成像的单分子检测来检测UDG活性(图3)。在没有UDG的情况下，只观察到Cy3信号(图3A)，没有观察到Cy5信号(图3B)，表明没有形成Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链结构，也没有发生FRET。相反，当UDG存在时，Cy3(图3D)和Cy5(图3E)的信号可以同时检测到，Cy3和Cy5(图3F)信号完全共定位，表明从Cy3到Cy5发生有效FRET。值得注意的是，UDG的存在导致Cy3荧光信号显著价降低(图3D)，这是由于从Cy3到Cy5发生有效FRET的结果，与凝胶电泳(图2B)和荧光测量(图2C)的结果一致。由于单个分子是一步不可逆转地被光漂白的，因此轨迹中的每一步代表一个漂白染料分子。我们追踪了光漂白步骤，发现Cy3和Cy5荧光点均显示单步光漂白(图4)，表明观察到的点代表单个分子。这些结果清楚地表明，Cy5计数可用于UDG活性的精确测量。
2.灵敏度实验
在最佳实验条件下(图5)，研究了UDG检测方法的检测灵敏度。如图6所示，当UDG浓度从0.001增加到0.5单位每毫升时，产生逐渐降低的Cy3信号和增强的Cy5信号。当UDG浓度超过0.5单位每毫升时，信号达到平台。此外，Cy5荧光强度与UDG浓度的对数在0.005到0.5单位每毫升之间呈线性相关(图6B)，回归方程为F＝39.54log10C+130.13(R2＝0.9950)，其中F为Cy5荧光强度，C为UDG浓度(单位每毫升)。通过评估对照组的平均Cy5荧光强度加上三倍标准偏差，计算出检测限为0.00367单位每毫升。我们通过单分子检测进一步监测了不同浓度UDG对Cy5计数的影响。如图6C所示，Cy5计数随着UDG浓度的增加而增加，并在0.0005至0.5单位每毫升范围内与UDG浓度的对数呈线性相关(图6D)。回归方程为N＝578.06log10C+2200.41(R2＝0.9984)，其中N为Cy5计数，C为UDG浓度(单位每毫升)。经计算，检测限为0.00029单位每毫升，比系综荧光测量(图6B)得到的检测限低10倍。这种高灵敏度可归因于以下三个因素：(1)通过靶诱导检测探针的特异性切割，将UDG活性信号有效地转导为可扩增的DNA信号；(2)toehold介导的链置换反应的高信号放大效率；(3)单分子检测技术固有的高灵敏度和高信噪比。
3.特异性实验
以牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白G(IgG)、甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg)和人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)为阴性对照，研究了本技术方案的选择性。BSA和IgG均是不相关的蛋白质，它们不能从DNA底物中去除尿嘧啶。Fpg作为一种双功能的DNA糖基化酶，可以特异性地从8-oxoG：C碱基对中去除受损的8-氧代-7，8-二氢鸟嘌呤(8-oxoG)碱基，并水解AP位点的3'-磷酸二酯键。TDG是一种单功能的DNA糖基化酶，能够从G：T错配中去除T。如图7所示，在相同条件下，仅在UDG(图7)存在时检测到明显的Cy5信号，而在反应缓冲液(图7)、BSA(图7)、IgG(图7)、Fpg(图7)以及hAAG(图7)存在时未观察到明显的Cy5信号。此外，当UDG存在时，即使存在上述所有干扰，也可以观察到显著的Cy5信号(图7)。这些结果表明，所提出的方法对靶UDG具有良好的特异性。
4.动力学实验
为了量化UDG的酶动力学参数，我们将1单位每毫升的UDG和不同浓度的检测探针(0-120纳摩尔每升)在37摄氏度条件下孵育20分钟，测量了UDG的初始速度。如图8A所示，UDG的初始速度随着检测探针浓度的增加而增强。UDG的动力学参数是通过将实验数据拟合到下列米氏方程来计算的：
V＝Vmax[S]/(Km+[S])
其中Vmax代表最大初始速度，[S]代表检测探针的浓度，米氏常数(Km)表示最大反应速率一半时的底物浓度。经计算，Vmax值为3.04±0.36每分钟，Km值为59.50±13.51纳摩尔每升。获得的Km值与基于内切酶IV(Endo IV)辅助信号放大的荧光方法获得的值(52.75纳摩尔每升)一致，表明本技术方案可用于分析UDG的米氏动力学参数。
5.抑制剂实验
为了证明所提出的技术方案用于UDG抑制分析的能力，我们使用尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)作为模型抑制剂。UGI与UDG以1:1的化学计量比特异性结合，形成不可逆的蛋白质复合物。如图8B所示，UDG的相对活性随着UGI浓度的增加而逐渐降低。测得的半抑制浓度(IC50)为0.07单位每毫升。这些结果表明，所提出的技术方案可用于UDG抑制剂的筛选，因此在UDG相关疾病诊断和药物发现方面具有巨大的应用潜力。
6.细胞UDG的检测
准确定量细胞内UDG活性对临床诊断和治疗具有重要意义。为了证明本技术方案在复杂生物样本中的潜在应用，我们测量了人宫颈癌细胞(HeLa细胞)提取物中的UDG活性。如图9A所示，在对照组中未观察到明显的Cy5信号(图9A)，而添加细胞核提取物(图9A)可观察到显著增强的Cy5信号。为了进一步验证Cy5信号增强是由细胞内源性的UDG诱导的，而不是由细胞核提取物的其他成分导致的，使用UGI来抑制细胞核提取物中的UDG活性。添加1单位每毫升UGI后，与未添加UGI的Cy5信号(图9A)相比，Cy5信号降低了73.88％(图9A)，这表明UGI对UDG活性具有抑制作用。我们进一步监测了Cy5计数与HeLa细胞数量的变化。如图9B所示，Cy5计数随着HeLa细胞数量的增加而增加，并且Cy5计数与细胞数量的对数在3到10000个细胞范围内呈线性相关。回归方程为N＝467.88log10X–67.47(R2＝0.9899)，其中N代表Cy5计数，X代表HeLa细胞个数。经计算，检测限低至2.7个细胞，与基于酶介导的三环级联信号放大的生物发光分析(3个细胞)相当。这些结果表明，本技术方案可以用于测量复杂体系中UDG的活性，从而为利用本技术方案对活细胞内源性UDG进行成像铺平了广阔的道路。
7.细胞内UDG的成像
我们进一步使用本技术方案来监测HeLa活细胞中的内源性UDG活性。对于细胞成像，我们将检测探针中的尿嘧啶替换为胸腺嘧啶作为对照探针，称为检测探针(T)。如图10A所示，当仅将Cy5标记的发夹探针1和Cy3标记的发夹探针2转染到HeLa细胞时，可以观察到明亮的Cy3荧光，但Cy5荧光相对较弱，表明没有FRET信号。当检测探针(T)、Cy5标记的发夹探针1和Cy3标记的发夹探针2一起转染HeLa细胞时，也检测到类似的结果(图10B)。相反，当检测探针、Cy5标记的发夹探针1和Cy3标记的发夹探针2转染到HeLa细胞中时，可以同时观察到Cy3荧光信号降低和Cy5荧光信号显著增加，并具有完美的共定位(图10C)，表明产生了FRET信号。此外，我们还量化了活细胞成像的荧光信号。考虑到细胞内微环境的复杂性，选用FRET信号(FA/FD，Cy5受体与Cy3供体的荧光强度比)而不仅仅是Cy5荧光信号来评估细胞内的UDG活性。如图10D所示，FRET信号的平均值按c组>b组>a组的顺序降低，表明本技术方案可用于活体细胞内源性UDG活性的监测和成像。
由上述实施例可知，本申请技术方案至少具有如下优点：
1.由尿嘧啶切除修复反应产生的裂解检测探针作为有效的催化剂，可以在没有任何酶参与的情况下放大信号。
2.该技术方案可以在同质模式下进行，不需要费力的洗涤和分离步骤。
3.由于UDG诱导的碱基切除修复反应与toehold介导的链置换反应具有良好的兼容性，该方法可以在恒温下一步完成，极大地简化了检测程序，确保所提出的方法的分析时间短于或与已报道的UDG检测方法相当。单分子检测方法的引入也大大降低了数据处理难度，提高了数据呈现的直观性和数据处理效率，实现了对UDG活性的高效简单测定。
4.检测性能出色，应用潜力巨大。
将信号放大的FRET与单分子检测相结合，使该检测方法具有较高的准确性和灵敏度，即使在复杂的细胞内环境中也能直接准确地检测低丰度的UDG。所提出的生物传感器已经成功地应用于UDG的动力学分析、抑制剂筛选和活细胞中UDG活性的实时成像。重要的是，通过合理设计适当的DNA底物，它可以很容易地扩展到检测其他DNA修复相关的酶，为活细胞中DNA修复相关的酶和相关途径的可视化提供了一个简单而强大的工具，在生物学研究、临床诊断和药物发现方面具有巨大的潜力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛科技大学
<120> 基于无酶toehold介导的链置换反应催化的单分子荧光生物传感器及其应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agaggcauca atgggagatc ccattcccat tgatgcctct 40
<210> 2
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agaggcatca atgggaatgg gatcatgcct ctaacctagc gatcccattc ccattg 56
<210> 3
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgggatcgc taggttagag gcatgatccc attcccatac atgcctctaa cctagc 56
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agaggcatca atgggagatc ccattcccat tgatgcctct 40

Claims (10)

1.一种基于无酶toehold介导的链置换反应催化的单分子荧光生物传感器，其特征在于，所述荧光生物传感器至少包括一个检测探针和两个发夹探针；
其中，所述检测探针为发夹检测探针，其至少含有一个尿嘧啶位点，当存在UDG时，其特异性识别并去除检测探针上的尿嘧啶，导致所述检测探针断裂并暴露出一个toehold结构域；
所述发夹探针均在序列末端修饰有荧光基团，当检测探针暴露所述toehold结构域时，通过toehold-介导的链置换反应启动两个修饰有荧光基团的发夹探针的催化自组装，从而产生具有放大的FRET信号的大量DNA双链体。
2.如权利要求1所述的单分子荧光生物传感器，其特征在于，所述检测探针为发夹检测探针，具有茎环结构；其中，近5'端的茎部结构中含有一个尿嘧啶位点，从而将该结构区域划分为结构域1*和结构域2*，其互补区域对应划分为结构域1和结构域2，发夹检测探针环部命名为结构域3；当存在UDG时，UDG特异性识别检测探针中的尿嘧啶碱基，并水解尿嘧啶和脱氧核糖之间的N-糖苷键，释放出尿嘧啶碱基，形成一个脱嘌呤/嘧啶位点；脱嘌呤/嘧啶位点随后被人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1裂解，生成一个单核苷酸间隙，导致检测探针的结构域1*自动解离。
3.如权利要求2所述的单分子荧光生物传感器，其特征在于，裂解的检测探针暴露出toehold结构域1，其与Cy5标记的发夹探针1的结构域1*结合，启动分支迁移反应，形成启动子/Cy5标记的发夹探针1双链，随后Cy5标记的发夹探针1的结构域3暴露；暴露的结构域3作为另一个toehold，启动下一个分支迁移反应，生成Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链，并释放裂解的检测探针；游离的裂解检测探针与另一个Cy5标记的发夹探针1结合，催化循环的toehold介导的链置换反应，产生大量Cy5标记的发夹探针1/Cy3标记的发夹探针2双链；由此产生的双链体使Cy3供体和Cy5受体相互靠近，诱发Cy3到Cy5的显著FRET。
4.如权利要求1所述的单分子荧光生物传感器，其特征在于，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
发夹探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
发夹探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.如权利要求1所述的单分子荧光生物传感器，其特征在于，所述荧光生物传感器还包含缓冲液。
6.一种UDG检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1-5任一项所述荧光生物传感器。
7.一种检测UDG的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1-5任一项所述荧光生物传感器或权利要求6所述检测试剂盒对待测样品进行检测。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，检测方法包括：
将检测探针、两个发夹探针、APE1与待测样品进行孵育即得；
优选的，所述孵育条件为：在30-40℃(优选为37℃)孵育50-100分钟(优选为80分钟)；
优选的，上述孵育反应在溶液环境下进行，所述溶液为反应缓冲液，优选为标准Taq反应缓冲液。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对上述孵育反应产物进行荧光检测分析；
优选的，所述待测样品为环境样品或生物样品，所述生物样品包括离体的血液、体液、组织和细胞。
10.权利要求1-5任一项所述荧光生物传感器、权利要求6所述检测试剂盒和/或权利要求7-9任一项所述检测方法在UDG相关药物筛选和/或样品UDG分析中的应用。
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