CN115201135A - 一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及虾青素抗氧化能力检测技术领域，具体来说评估虾青素对抗光照氧化的的评估方法。通过选择对虾青素合适的光敏剂、活性氧探针、光照时间、反应试剂浓度、以及光谱测量方式和方法，可以实现虾青素抗光照氧化能力的评估。这是首次建立针对虾青素的抗光照氧化能力的实验方案和检测方法。该专利对实验设备要求低，具有简单便捷、易于操作、测量准确可靠、可定量分析的优点。
Description
技术领域
本发明涉及虾青素抗氧化能力检测技术领域，具体来说是一种评估虾青素对抗光照氧化能力的检测和分析方法。
背景技术
虾青素是一种抗氧化性极强的非水溶性抗氧化剂，其结构由分子中间的多烯烃连饱和两个末端的紫罗兰酮环组成，含有羟基和酮基，所以属于叶黄素的一种。近年来，虾青素作为一种非凡的天然抗氧化剂，在食品、化妆等领域受到越来越多的关注。
辐射在我们的生活中无处不在，光辐射作用可以诱导产生多种活性氧和自由基，由此导致光老化和光损伤等消极后果。其中，单线态氧是一种活性氧，具有较高的反应性，易于与生物体内的大分子如DNA、蛋白质和脂质分子等反应，引起细胞损伤。单线态氧对生物分子的氧化作用与关节炎、白内障和皮肤癌等多种疾病有关，选择合适的天然抗氧化剂保护生物抗氧化具有十分重要的意义。
虾青素作为一种抗氧化性能良好的天然抗氧化剂，但目前关于虾青素对抗光氧化的研究较少，尤其是清除光氧化产生的单线态氧还需要发展行之有效的测试方法。这需要解决两个问题：一是要考虑如何方便建立光氧化实验，二是如何有效探测虾青素清除光照产生的活性氧，这里主要是单线态氧。以往对于单线态氧测量方法，包括荧光法、色谱法、化学发光法和电子自旋共振等。比如公开号为CN111233905A的中国发明专利公开了一种选择性检测溶液相中单线态氧的荧光探针及应用，该专利通过制备的荧光探针对单线态氧进行检测，采用的是荧光法，但是该探针的的吸收波段为518/545nm，而虾青素在此处有较大吸收，所以并不能用于虾青素抗氧化的检测。因此，亟需一种虾青素对抗光氧化产生活性氧的检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于如何针对虾青素对抗光氧化，提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，建立虾青素对抗光照氧化的实验方案及评估方法：以亚甲基蓝为光敏剂，利用氙灯辐照，加660nm的滤光片，在光照条件下产生单线态氧；DPBF为探针探测单线态氧，添加不同浓度虾青素，采用紫外-可见光吸收光谱法，检测DPBF在380-440nm吸收峰的变化；
以不含虾青素的样品为对照，并根据以下公式计算虾青素对单线态氧的淬灭常数kr：
S0/S＝1+kr[A]/(kd+kQ[P])
其中，S0表示不含虾青素样品的DPBF探针起始减少速率；
S表示含有虾青素样品的DPBF探针起始减少速率；
[A]表示虾青素的起始浓度，[P]表示DPBF的起始浓度；
kd表示单线态氧自身的衰减速率常数；
kQ表示单线态氧与DPBF反应的速率常数；
通过kr判断虾青素对单线态氧的清除能力。
有益效果：首先，本申请建立光照氧化实验方案，本专利中采用亚甲基蓝(MB)为光敏剂，利用氙灯辐照，加660nm的滤光片，在光照条件下亚甲基蓝可以产生氧化性很强的活性氧-单线态氧；其次，建立合适的探测虾青素清除光照产生活性氧的方法，这里主要是针对单线态氧，采用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)探测单线态氧，采用紫外-可见光吸收光谱法，检测DPBF在380-440nm吸收峰的变化，通过对光谱数据进行处理，并根据虾青素的起始浓度、DPBF的起始浓度、样品中DPBF探针起始减少速率、单线态氧自身的衰减速率常数、单线态氧与DPBF反应的速率常数，计算虾青素对单线态氧的淬灭常数kr，判断虾青素对单线态氧的清除能力。
本申请建立的评估虾青素抗光照氧化的方法，对实验设备要求低，具有简单便捷、可操作性强的优点；且以DPBF和亚甲基蓝为主要检测试剂，价格便宜、容易获取、认可度高，有效地降低了检测成本。
优选的，评估虾青素对抗光照氧化的方法包括以下步骤：
(1)将虾青素用有机溶剂溶解制成母液，然后无水乙醇稀释为虾青素备用液；将DPBF用无水乙醇溶解为DPBF-乙醇溶液，亚甲基蓝用去离子水溶解为亚甲基蓝-水溶液；
(2)将虾青素备用液、DPBF-乙醇溶液、亚甲基蓝-水溶液加入比色皿中，用乙醇-水混合溶液补满后，将比色皿封口；以无水乙醇作为对照；
(3)对上述含有虾青素的样品及对照样品进行光照后，利用紫外-可见分光光度计对样品进行扫描，观察DPBF在380-440nm吸收峰的变化；
(4)根据DPBF吸收峰的变化计算含虾青素样品及对照样品中DPBF探针的起始减少速率，代入公式计算虾青素对单线态氧的淬灭常数kr。
优选的，所述步骤中(1)的有机溶剂选自二甲基亚砜、氯仿、丙酮中的一种或多种组合。
优选的，所述步骤(2)中DPBF和亚甲基蓝的终浓度分别为6μmol/L和6μmol/L。
优选的，所述步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为67％-100％。
有益效果：本申请在反应体系中加入67％-100％的乙醇，能够充分溶解脂溶性抗氧化剂虾青素，避免体系变浑浊。
优选的，所述步骤(2)的比色皿中虾青素的浓度为0.5-2.0μmol/L。
有益效果：当虾青素的浓度为0.5-2.0μmol/L时，通过本申请的检测方法可快速判断溶液中各成分的变化情况，以此实现低浓度虾青素对光氧化产生的活性氧(单线态氧)清除能力的评估，而且低浓度检测还可以节约样品成本。
优选的，所述步骤(2)的比色皿中DPBF的浓度为6～10μmol/L，亚甲基蓝的浓度为6～9μmol/L。
优选的，所述步骤(3)中以氙灯作为诱导亚甲基蓝产生单线态氧的光源，光强度可调。
有益效果：本申请通过氙灯发射的光线，获得适于激发光敏剂亚甲基蓝的波长的光，以此提高单线态氧的产率。
优选的，所述步骤(3)中采用滤光片除去氙灯发射光线中的杂光，透过光波长为660nm。
有益效果：本申请利用滤光片除去氙灯发射光线中的杂光，集中利用660nm波段的单色光，进一步提高了亚甲基蓝的激发效果，进而提高了活性单线态氧的产率。
优选的，所述步骤(3)中样品的光照时间为0～120s。
有益效果：本申请在不同的光照时间下，通过观察DPBF的吸收随时间的变化，衡量反应溶液中单线态氧的产生情况，并取光照120s时的DPBF吸收峰值进行统计分析。
优选的，所述步骤(4)计算虾青素对单线态氧的淬灭常数kr公式中的kd在水中为3×105s-1，在乙醇中为6.7×104s-1；kQ为8x108mol-1s-1。
本发明的优点在于：
1.本专利首次建立评估虾青素对抗光照氧化的实验方案和评估方法，实验中以亚甲基蓝为光敏剂，用660nm光照可有效产生氧化能力很强的活性单线态氧，以此建立光照氧化实验方案；以DPBF为探针，可以探测虾青素与单线态氧发生反应，通过观测在380-440nm吸收光谱的变化，以此建立探测虾青素清除光照产生活性氧的方法，从而推算出虾青素对单线态氧的淬灭常数，从而实现虾青素对抗光氧化的定量评估；
2.本专利建立的虾青素对抗光照氧化的检测方法，对实验设备要求低，具有简单便捷、可操作性强的优点。
附图说明
图1为本申请实施例1的操作流程图；
图2为本申请试验例1中不同照射时间下DPBF的紫外—可见吸收光谱图；
图3为本申请试验例2中不同浓度的虾青素对DPBF的紫外—可见吸收光谱图的影响；
图4为本申请试验例3中不同浓度亚甲基蓝在不同照射时间下的DPBF减少率变化曲线图；
图5为本申请试验例4中不同浓度DPBF在不同照射时间下的DPBF减少率变化曲线图；
图6为本申请试验例5中不同浓度虾青素在不同反应介质中对单线态氧的淬灭率。
附图标记说明：1、氙灯；2、660nm滤光片；3、样品：MB+DPBF+虾青素；4、紫外-可见吸收光谱仪；5、紫外-可见吸收光谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，包括以下步骤：
(1)将虾青素用二甲基亚砜溶解制成浓度为400μmol/L的母液，然后无水乙醇稀释为虾青素备用液，虾青素备用液的浓度为0-6.0μmol/L，其中所用的虾青素、DPBF和亚甲基蓝均可商业购得。
将浓度为0.2mg/mL的DPBF母液，用无水乙醇溶解为DPBF-乙醇溶液。
将浓度为3mg/mL的亚甲基蓝(MB)母液，用去离子水溶解为亚甲基蓝-水溶液。
(2)将1mL虾青素备用液、1mLDPBF-乙醇溶液、50μL亚甲基蓝-水溶液依次加入3mL比色皿中，用乙醇-水混合溶液(V乙醇：V水＝3：0)补足至3mL，对上述比色皿进行吹打混合均匀后，在比色皿上方加盖子，并用封口膜进行封口。其中，虾青素的浓度为2.0μmol/L，DPBF的浓度为6μmol/L，亚甲基蓝的浓度为6μmol/L。
按照同样的操作方式，用无水乙醇代替虾青素备用液作为对照。
(3)如图1所示，在黑暗的环境中，以氙灯1作为光源，经660nm滤光片2除去杂光后，对上述含有虾青素的样品3及对照样品3照射0s、30s、60s、90s、120s，并利用紫外-可见吸收光谱仪4对样品3进行扫描，得到紫外-可见吸收光谱图5，观察不同照射时间下DPBF在380-410nm附近吸收峰的变化。
(4)根据DPBF吸收峰的变化计算含虾青素样品及对照样品中DPBF探针的起始减少速率，代入公式计算虾青素对单线态氧的淬灭常数kr。
虾青素对单线态氧的淬灭常数kr的计算公式如下：
S0/S＝1+kr[A]/(kd+kQ[P])
其中，S0表示不含虾青素样品的DPBF探针起始减少速率；
S表示含有虾青素样品的DPBF探针起始减少速率；
[A]表示虾青素的起始浓度，[P]表示DPBF的起始浓度；
kd表示单线态氧自身的衰减速率常数，在不同的溶剂中，kd不同，在水中为3×105s-1，在乙醇中为6.7×104s-1，当反应溶液为混合溶液时，根据不同溶剂的比例对各自的kd值进行加权求和，以计算出总的衰减速率常数；本实施例的反应溶液为乙醇，kd取6.7×104s-1；
kQ表示单线态氧与DPBF反应的速率常数，为8x108mol-1s-1；
通过kr值判断虾青素对单线态氧的清除能力，kr值越大，表明虾青素对单线态氧的清除能力越强。
实施例2
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中亚甲基蓝的浓度为12μmol/L。
实施例3
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中亚甲基蓝的浓度为9μmol/L。
实施例4
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中亚甲基蓝的浓度为4μmol/L。
实施例5
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中亚甲基蓝的浓度为2μmol/L。
实施例6
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中DPBF的浓度为12μmol/L。
实施例7
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中DPBF的浓度为10μmol/L。
实施例8
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中DPBF的浓度为8μmol/L。
实施例9
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中虾青素的浓度为0μmol/L，并用无水乙醇作为对照样品。
实施例10
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中虾青素的浓度为0.5μmol/L。
实施例11
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中虾青素的浓度为1μmol/L。
实施例12
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中虾青素的浓度为1.5μmol/L。
实施例13
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例9的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为2：1。
实施例14
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例10的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为2：1。
实施例15
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例11的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为2：1。
实施例16
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例12的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为2：1。
实施例17
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为2：1。
实施例18
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例9的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为1：2。
实施例19
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例10的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为1：2。
实施例20
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例11的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为1：2。
实施例21
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例12的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为1：2。
实施例22
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为1：2。
实施例23
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例9的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为0：3。
实施例24
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例10的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为0：3。
实施例25
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例11的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为0：3。
实施例26
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例12的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为0：3。
实施例27
本实施例提供一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其与实施例1的区别在于步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为0：3。
试验例1
实施例9中用无水乙醇作为对照样品，在不加虾青素的条件下得到不同照射时间下DPBF的紫外—可见吸收光谱图如图2所示。
从图2可以看出，DPBF在410nm处的吸光度随着光照时间的增加而降低，这是因为光照使反应溶液中的亚甲基蓝产生单线态氧，DPBF捕获单线态氧，并与单线态氧发生反应，使DPBF在410nm处的吸收降低。
本申请利用紫外-可见光吸收光谱法检测DPBF在410nm处吸光度值的变化，即可反映出溶液中单线态氧含量的变化，以此建立虾青素对单线态氧清除能力的检测方法，对实验设备要求低，简单便捷、可操作性强；且以DPBF和亚甲基蓝为主要检测试剂，价格便宜、容易获取，有效地降低了检测成本。
试验例2
实施例1、实施例9-12中取光照120s时DPBF在380-440nm之间的吸收峰值进行统计分析，得到不同浓度的虾青素对DPBF的紫外—可见吸收光谱图如图3所示。
从图3可以看出，DPBF在380-440nm的吸光度随着虾青素浓度的增加而增加，这是因为虾青素清除了单线态氧，从而使DPBF的降低减少，所以相对于未加虾青素的处理，加入虾青素以后，DPBF的吸收峰明显升高。
试验例3
实施例1-5中用无水乙醇作为对照样品，得到不同浓度的亚甲基蓝在不同照射时间下，DPBF减少率的变化情况如图4所示。
从图4可以看出，DPBF在380-440nm的吸收减少率随着亚甲基蓝浓度的增加而增大，表明较高浓度(6-9μmol/L)的亚甲基蓝在660nm波长的光照下易被激发，从而产生更多的单线态氧，以此为测试体系提供足够单线态氧；当亚甲基蓝的浓度小于6μmol/L时，DPBF的减少率变化较小，说明产生的单线态氧较少，不适合后续检测；而当亚甲基蓝的浓度为12μmol/L时，产生的单线态氧过多，不利于后续虾青素的清除实验。可通过改变亚甲基蓝的浓度控制单线态氧的产生量，便于开展虾青素对不同浓度单线态氧的清除能力的研究。
试验例4
实施例1、实施例6-8中用无水乙醇作为对照样品，得到不同浓度DPBF在不同照射时间下，DPBF减少率的变化情况如图5所示。
从图5可以看出，DPBF在380-440nm的吸收减少率随着DPBF浓度的增加而减小，表明在其他条件相同的情况下，DPBF浓度的增加使得对单线态氧的检测灵敏度降低，在虾青素对单线态氧清除能力的检测中，选择DPBF的浓度为6-10μmol/L，有利于确保检测的灵敏度。
试验例5
实施例1、实施例9-12、实施例13-17、实施例18-22、实施例23-27以不同乙醇和水体积比的混合溶液作为反应介质，得到不同虾青素浓度对单线态氧的淬灭率的关系变化曲线如图6所示。
从图中可以看出，单线态氧的淬灭率随着虾青素浓度的增加而升高，且以乙醇和水的体积比为3：0的乙醇-水混合溶液作为反应介质时，虾青素对单线态氧的淬灭率更高，当乙醇和水的体积比为2：1的乙醇-水混合溶液作为反应介质时，虾青素对单线态氧的淬灭率较高，所以我们优选的反应条件是乙醇和水的体积比为3：0或2：1。
使用原理及优点：本申请以亚甲基蓝为光敏剂，DPBF为探针，在光照条件下使亚甲基蓝产生单线态氧，DPBF捕获单线态氧，并与单线态氧发生反应，使DPBF在380-440nm处的吸收降低，利用紫外-可见光吸收光谱法检测DPBF在380-440nm吸光度值的变化，获得DPBF的浓度变化值，再根据公式计算出虾青素对单线态氧的淬灭常数kr，进而实现虾青素对单线态氧的清除能力的定量评估。
本专利建立的虾青素抗光照氧化能力检测和评估方法，对实验设备要求低，具有简单便捷、可操作性强的优点；且以DPBF和亚甲基蓝为主要检测试剂，价格便宜、容易获取、认可度高，有效地降低了检测成本。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其特征在于：
建立评估虾青素对抗光照氧化的实验方案及评估方法：以亚甲基蓝为光敏剂，利用氙灯辐照，加660nm的滤光片，在光照条件下产生单线态氧；以DPBF为探针探测单线态氧，添加不同浓度虾青素，采用紫外-可见光吸收光谱法，检测DPBF在380-440nm吸收峰的变化，判断虾青素对单线态氧的清除作用；
以不含虾青素的样品为对照，并根据以下公式计算虾青素对单线态氧的淬灭常数kr：
S0/S＝1+kr[A]/(kd+kQ[P])
其中，S0表示不含虾青素样品的DPBF探针起始减少速率；
S表示含有虾青素样品的DPBF探针起始减少速率；
[A]表示虾青素的起始浓度，[P]表示DPBF的起始浓度；
kd表示单线态氧自身的衰减速率常数；
kQ表示单线态氧与DPBF反应的速率常数；
通过kr判断虾青素对单线态氧的清除能力。
2.根据权利要求1所述的一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将虾青素用有机溶剂溶解制成母液，然后无水乙醇稀释为虾青素备用液；将DPBF用无水乙醇溶解为DPBF-乙醇溶液，亚甲基蓝用去离子水溶解为亚甲基蓝-水溶液；
(2)将虾青素备用液、DPBF-乙醇溶液、亚甲基蓝-水溶液加入比色皿中，用乙醇-水混合溶液补满后，将比色皿封口；以无水乙醇作为对照；
(3)对上述含有虾青素的样品及对照样品进行光照后，利用紫外-可见分光光度计对样品进行扫描，观察DPBF在380-440nm吸收峰的变化；
(4)根据DPBF吸收峰的变化计算含虾青素样品及对照样品中DPBF探针的起始减少速率，代入公式计算虾青素对单线态氧的淬灭常数kr。
3.根据权利要求1所述的一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其特征在于：所述步骤(2)中DPBF和亚甲基蓝的终浓度分别为6μmol/L和6μmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其特征在于：所述步骤(2)中乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为67％-100％，具体百分比需根据情况而定，必须有效溶解脂溶性抗氧化剂虾青素，避免溶液变浑浊。
5.根据权利要求1所述的一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其特征在于：所述步骤(2)的比色皿中虾青素的浓度为0.5-2.0μmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其特征在于：所述步骤(2)的比色皿中DPBF的浓度为6～10μmol/L，亚甲基蓝的浓度为6～9μmol/L。
7.根据权利要求1所述的一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其特征在于：所述步骤(3)中以氙灯作为诱导亚甲基蓝产生单线态氧的光源，其光照强度可调。
8.根据权利要求7所述的一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用滤光片除去氙灯发射光线中的杂光，透过光波长为660nm。
9.根据权利要求1所述的一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其特征在于：所述步骤(3)中样品的光照时间为0～120s。
10.根据权利要求1所述的一种评价虾青素抗光照氧化能力的方法，其特征在于：所述步骤(4)计算虾青素对单线态氧的淬灭常数kr公式中的kd在水中为3×105s-1，在乙醇中为6.7×104s-1；kQ为8x108 mol-1s-1。
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