CN1191467C - 单态氧和超氧阴离子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及测试技术，更详细地是单态氧和超氧阴离子的检测方法，主要是在浓度为1-100um/L的化学发光探针溶液中加入浓度为1-100um/L的白蛋白；该方法具有所需样品少，操作简便，不需用到贵重仪器及药品，灵敏度高，可以做到低浓度检测等特点。
Description
(一)技术领域
本发明涉及测试技术，更详细地是单态氧和超氧阴离子的检测方法。
(二)背景技术
自由基对维持机体正常生理功能是必需的，例如，它们可以参与生物细胞的信号转导，扩张血管，杀灭入侵的微生物及攻击病变的肿瘤细胞等正常生理功能；但是，过量的自由基又会对机体产生严重的伤害，生物体的衰老和许多种疾病的发生发展都与自由基有密不可分的联系。因此，探测生物体中自由基的产生，对基础研究及医学临床应用都具有十分重要的意义。
目前常用的自由基研究方法主要有以下几种：
1、电子自旋共振(ESR)：利用自由基具有顺磁性的物理特性，即顺磁物质在固定微波和一定磁场作用下可吸收微波能量，使未成对电子产生共振，因此可获得自由基吸收微波能量程度随磁场变化的ESR波谱。
2、脉冲射解法：即用一个脉冲式电离辐射源照射待研究的化合物溶液，可产生自由基，因为许多自由基的吸收光谱与原化合物不同，所以可以利用吸收光谱进行检测。
3、分光光度法：利用自由基的反应活性，使其和特定的底物反应生成具有颜色的复合物，通过比色可以计算复合物产量的多少，从而对溶液中的自由基进行定量。
4、化学发光法：利用具有高反应活性的自由基与特定的化学发光试剂反应，生成激发态的反应产物，用光电倍增管或CCD记录发光的强度、时间过程及空间分布，用以间接反映活性自由基产生情况及其随时间的变化。
上述方法不同程度的存在如下缺点：要用到高档仪器，一般试验室难以达到；灵敏度低，难以做到单态氧和超氧阴离子的低浓度检测；操作复杂，要用到多种仪器及药品等。
(三)发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺点，提供一种单态氧和超氧阴离子的检测方法，该方法具有所需样品少，操作简便，不需用到贵重仪器及药品，灵敏度高，可以做到低浓度检测等特点。
本发明中所提出的单态氧和超氧阴离子的检测方法是在浓度为1-100um/L的化学发光探针溶液中加入浓度为1-100um/L的白蛋白。
最适的反应浓度为化学发光探针10um/L，白蛋白5um/L。
所述白蛋白可以是人血清白蛋白、牛血清白蛋白、或蛋清蛋白。
所述化学发光探针主要采用海萤荧光素类似物，例如FCLA(全称：3，7-二氢-6-[4-[2-[N’-(5-荧光素)硫脲基]-乙氧基]苯基]-2-甲基咪唑[1，2-a]吡嗪-3-钠盐)或MCLA(全称：2-甲基-6-(4-对甲氧苯基)-3，7-二氢咪唑[1，2-a]吡嗪-3-氢氯化物)。二者是用海萤的荧光物质人工合成的海萤荧光物质衍生物，购自日本东京化成工业株式会社。
所述化学发光探针可与单态氧或超氧阴离子反应产生化学发光。若用超微弱发光探测系统单独检测FCLA的水溶液，只能看到有极微弱的光子产生；但若向其中加入白蛋白，则可观察到有强烈的发光，发光的峰值位于525nm，当通过通氮气的方法除尽体系中的氧后，发光也随之消失。因此，加入的蛋白催化了FCLA与单态氧或超氧阴离子之间的反应，降低了FCLA检测单态氧和超氧的阈值，使其灵敏度大大增加，因此能够检测到FCLA水溶液中由于氧气自氧化和环境中弱的电离辐射所产生的单态氧分子和超氧阴离子。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、本发明对单态氧和超氧阴离子检测灵敏度高，可检测的到自然状态下由于分子氧自氧化和弱的电离辐射所产生的微量的单态氧分子和超氧阴离子，比常规方法的灵敏度要高出约20倍。
2、本发明中所使用的白蛋白是一种生物体内普遍存在的化学组分，所以在活体使用时，不会对生物体产生毒害作用，具有安全、无损伤的特点。
3、本发明所采用的测量装置简单，投资少，容易实现，操作简便。
附图说明
图1是用生物超微弱发光探测系统测量得到的FCLA溶液和FCLA-HSA体系化学发光强度的示意图。
图2是FCLA-HSA体系化学发光光谱的测量结果。
图3是在不同生物组织溶液中，FCLA化学发光强度的比较图。
图4是利用通氮气的方法除去FCLA-HSA体系中的溶解氧后，该体系化学发光的衰减图。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明作进一步说明。
浓度为10um的FCLA溶液100ul，浓度为5um的HSA溶液100ul，三蒸水100ul，混和放在测量皿中，用溶解氧分析仪测量其氧浓度为5.4mg/L，再用生物超微弱发光探测系统测量该体系的化学发光，得到图1中曲线B的测量结果。通过通氮气来除去FCLA-HSA体系中的溶解氧，分别通氮气15sec，30sec，1min，2min，4min和6min后，体系中剩余的氧浓度分别为2.9mg/L，2.2mg/L，1.6mg/L，0.8mg/L，0.4mg/L，0.1mg/L。随着体系中氧浓度的降低，发光强度也随之下降，发光衰减趋势见图4。
如图所示，图1是用生物超微弱发光探测系统测量得到的FCLA溶液(A)和FCLA-HSA体系(B)化学发光的结果图。由图可看出，混和体系的化学发光与单纯的FCLA溶液相比，强度要增加几十倍，充分体现了本发明方法检测单态氧和超氧阴离子的高灵敏性。
图2是用RF-540型荧光仪所测量的FCLA-HSA体系的化学发光光谱。测量时，关闭激发光源，接收一侧的狭缝宽度为30nm。测量得到的光谱其峰值在525nm。
图3是在不同白蛋白溶液中，FCLA化学发光的比较图。其中，bk为FCLA溶液的发光计数，作为背景；A为FCLA溶液中加入牛血清白蛋白后的发光计数，B为FCLA溶液中加入牛血清后的发光计数，C为FCLA溶液中加入人血清后的发光计数，D为FCLA溶液中加入人血清白蛋白后的发光计数。从图中可以看出，HSA可以最佳的催化FCLA与单态氧或超氧阴离子之间的反应。
图4是利用通氮气的方法除去FCLA-HSA体系中的溶解氧后，该体系化学发光的衰减图。实验中，共测量了20个点，并对所得到的结果进行多项式拟和。从图中可以看出，随着体系中溶解氧浓度的降低，单态氧的含量也相应减少，整个体系的发光强度也随之衰减；当体系中的氧浓度接近于零，即切断了单态氧或超氧阴离子的转化来源时，体系的发光也随之消失。
Claims (4)
1、一种单态氧和超氧阴离子的检测方法，其特征在于是在浓度为1-100um/L的海萤荧光素类似物溶液中加入浓度为1-100um/L的白蛋白。
2、根据权利要求1所述的单态氧和超氧阴离子的检测方法，其特征在于反应浓度为化学发光探针10um/L，白蛋白5um/L。
3、根据权利要求1或2所述的单态氧和超氧阴离子的检测方法，其特征在于所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白、或蛋清蛋白。
4、根据权利要求1所述的单态氧和超氧阴离子的检测方法，其特征在于所述海萤荧光素类似物是3，7-二氢-6-[4-[2-[N’-(5-荧光素)硫脲基]-乙氧基]苯基]-2-甲基咪唑[1，2-a]吡嗪-3-一钠盐或2-甲基-6-(4-对甲氧苯基)-3，7-二氢咪唑[1，2-a]吡嗪-3-氢氯化物。
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