CN102230895B - 一种利用荧光蛋白作为荧光探针测量电离辐射下细胞氧化胁迫损伤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用荧光蛋白作为荧光探针测量电离辐射下细胞氧化胁迫损伤的方法，利用荧光蛋白选择定位表达在对电离辐射敏感的亚细胞结构上，对电离辐射产生自由基含量进行定量化的测量，从而通过直接观测蛋白荧光强度变化推测电离辐射对细胞具体部位的损伤，本发明发射的荧光易于检测，灵敏度高，荧光性质稳定，在较大的pH范围内也能正常发光，对高温、去垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶具有较强抗性，对细胞无毒害，不受假阳性干扰，构建载体方便，表达没有种属、组织和位置特异性。
Description
技术领域
本发明属于生物和生化检测领域，涉及对电离辐射引起细胞生化反应及损伤的定量测量和评价，提出荧光蛋白作为定量测量细胞在辐射反应中氧化胁迫产生自由基作用的内源性荧光探针。
背景技术
由于核技术在工农业、医学生物学等领域应用的迅速发展，相关的核安全以及电离辐射对生物及人类健康的影响日益受到关注，因此，人们迫切需要了解电离辐射对细胞损伤的机理并进行辐射防护，这就要求对辐射作用生物(细胞)过程能够进行准确定量的探测，目前还是一个正在尝试解决的难题。一般地，电离辐射除了通过能量传递的直接作用外，主要通过对含水物质的辐解反应生成的各种自由基的间接作用对机体的损伤。在水辐射分解生成的各种一级自由基中，ROS(Reactive Oxygen Species)是最为重要的一种，包括：O2 -、·OH和H2O2，并且生成的ROS含量与细胞的辐射损伤程度存在一定的正相关性。因此，准确和定量测量辐射反应中ROS作用是解决问题的关键技术之一。利用荧光探针可能成为一种有效的手段，因为它可以实时、高灵敏、定性和定量检测ROS的含量；比如，美国Invitrogen公司就可以提供各种在体外(inVitro)鉴别自由基的荧光探针。进一步，利用荧光探针检测活体组织或细胞在电离辐射过程中生成的ROS这方面现在也有一些有益的尝试；比如，朱茂祥等利用荧光探针的方法探测了60Coγ射线照射诱发BEP2D细胞内ROS水平提高，得到初步的剂量效应关系。但是，目前测量细胞内ROS的各种光谱探针还存在许多不足，如易被光萃灭，易发生自氧化或被氧化，非特异性定位标记及自身参与生物体反应生成ROS等。如何避免上述缺点，从而在细胞中实现对辐射引发的ROS产生和变化的检测，特别是对细胞中各个细胞器进行特异性定位标记、甚至能确定和识别DNA或蛋白质具体位点，即寻求一种荧光性质高效、灵敏、稳定、准确追踪细胞辐射氧化胁迫产生ROS的荧光探针，并建立其荧光强度和ROS的定量化的关系，正是本发明的意义和目的所在。
发明内容
本发明提供了一种利用荧光蛋白作为荧光探针测量电离辐射下细胞氧化胁迫损伤的方法。
本发明的内容即是利用具有荧光性质的天然或增强型的荧光蛋白作为活的组织或细胞在电离辐射过程中ROS(Reactive Oxygen Species)生成量的内标物或内源性荧光探针，基于依据是荧光蛋白在分子生物学和细胞生物学研究中的成功应用和其荧光性质的特殊优点，并且发现荧光蛋胁迫下与自由胁迫下与自由基作用而改变其荧光性质，从而其荧光强度可作为辐射生化反应中ROS含量的定量化指标。
为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：
利用荧光蛋白作为荧光探针测量电离辐射下细胞氧化胁迫损伤的方法，包括下列步骤：
(1)利用一般分子生物学融合蛋白表达的方法或商业化的试剂对细胞中的电离辐射产生氧化胁迫敏感的细胞器进行荧光蛋白靶向定位标记；
(2)对特异性表达荧光蛋白的细胞的电离辐照处理；
(3)利用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光光谱仪对线粒体内荧光蛋白的荧光强度进行实时、定量分析。
所述的利用荧光蛋白作为荧光探针测量电离辐射下细胞氧化胁迫损伤的方法，所述的荧光蛋白选择定位表达在对电离辐射敏感的亚细胞结构上，对电离辐射产生自由基含量进行定量化的测量，从而通过直接观测蛋白荧光强度变化推测电离辐射对细胞具体部位的损伤。
虽然荧光蛋白的荧光性质较为稳定，但因为它是一种蛋白质，其发光特性由蛋白构象和其组成氨基酸性质决定，而构象和氨基酸又受ROS的作用和影响，所以，我们提出利用荧光蛋白作为定量化测量电离辐射损伤细胞的内源性荧光探针的方案。依据原理如下：
(1)在ROS(主要为·OH)作用下蛋白质构象发生改变并导致其荧光强度减弱。A.A.Alnuami等证实绿色荧光蛋白GFP在·OH作用下其自发荧光强度减弱，荧光减弱程度与暴露时间呈线性关系。进一步，我们利用超声作为ROS(主要为·OH)产生源，证实了生成的ROS可引起GFP荧光强度的减弱(见附图1)，并得到荧光强度随ROS含量变化的规律。这就证明GFP荧光强度确实可作为ROS含量的定量化指标。
(2)电离辐射对生物体作用可以通过直接和间接作用两种途径，其中通过自由基反应的间接作用是主要作用方式；这是因为电离辐射作用于水，可以产生反应活性强的活性氧自由基和水合电子等：
这些水的辐解反应物进一步作用于生物体(细胞)中的蛋白质、核酸和细胞膜等物质从而产生各种生物学效应。
(3)利用一般分子生物学方法或商业化的试剂对细胞内多种亚细胞结构如线粒体、细胞膜等进行荧光蛋白靶向定位标记；对特异性表达GFP的细胞的辐照处理后产生ROS；然后利用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光光谱仪等可以对细胞中辐射导致ROS改变GFP的荧光强度变化进行实时观测和定量分析。
本发明的有益效果：
与其它荧光探针相比，此荧光反应不需外加的底物和辅助因子，只需紫外光或蓝光激发，发射的荧光易于检测，灵敏度高；荧光性质稳定，能耐受长时间光照，从而延长了可探测时间；在较大的pH范围内(pH 7-12)也能正常发光，对高温、去垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶具有较强抗性；对细胞无毒害；不受假阳性干扰；构建载体方便；表达没有种属、组织和位置特异性。
附图说明
图1超声处理对绿色荧光蛋白GFP荧光强度的影响示意图。
其中功率＝26W，荧光测定激发波长＝488nm，狭缝宽度＝2.5nm。
具体实施方式
1、利用GFP靶向定位线粒体测量细胞在电离辐射早期ROS生成过程
线粒体是细胞氧化磷酸化的场所，通过合成ATP为细胞的生命活动提供能量，在维持生物体正常生理功能方面起着非常重要的作用。作为唯一具有核外遗传物质的细胞器，其～直是辐射生物学研究的重点和热点。线粒体是细胞内源性ROS主要来源，呼吸链中约1％的氧经旁路反应生成氧自由基。当细胞受到辐射损伤时，呼吸链受到抑制，电子传递链中漏出的电子增多并与氧生成更多的氧自由基。自由基的增加又可加重损伤线粒体内各种生物大分子，降低氧化磷酸化功能，从而进一步加剧线粒体内自由基的生成。J.K.Leach等证实线粒体呼吸链是辐射所致细胞内ROS生成的场所，呼吸链缺陷型细胞在辐射过程中生成的ROS含量与正常细胞相比明显降低。所以实时、定量研究辐射早期线粒体中ROS生成量具有重要意义。其具体测量步骤如下：
(1)利用商业化试剂对细胞线粒体进行GFP靶向标记，方法见产品说明书。也可用一般分子生物学融合蛋白表达的方法对线粒体进行靶向表达和标记。
(2)线粒体特异性表达GFP的细胞的电离辐照(γ射线辐照、荷能离子束辐照等)处理。
(3)最后利用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光光谱仪等对线粒体内GFP荧光强度进行实时观测和定量分析。
2、利用GFP靶向定位细胞膜测量细胞在电离辐射过程中ROS对细胞膜的损伤
辐射生物学研究表明，细胞膜是仅次于DNA的辐射损伤的靶，对辐射非常敏感。水辐解生成的氧自由基可引起膜脂质过氧化损伤，蛋白质交联与断裂，膜流动性改变等。膜结构的破坏将严重干扰代谢的方向性、有序性和协调性，进而导致细胞死亡。我们提出利用GFP靶向定位于细胞膜可定点分析电离辐射过程中细胞膜ROS含量的变化及其对膜组分的损伤。
Claims (2)
1.一种利用荧光蛋白作为细胞内源荧光探针探测细胞在电离辐射下受到氧化胁迫导致电离辐射损伤的方法，包括下列步骤：
(1)首先，利用一般分子生物学融合蛋白表达的方法或商业化的试剂对细胞中的电离辐射产生氧化胁迫敏感的线粒体、细胞膜进行荧光蛋白GFP靶向定位标记；
(2)其次，对特异性表达荧光蛋白靶向标记的细胞进行电离辐照处理；
(3)然后，利用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光光谱仪，通过对细胞线粒体、细胞膜表达的荧光蛋白的荧光强度进行实时测量、定量分析，由其荧光蛋白在电离辐射条件下的荧光强度减弱程度而定量评估电离辐射引起细胞的氧化胁迫损伤。
2.根据权利要求1所述的利用荧光蛋白作为细胞内源荧光探针探测细胞在电离辐射下受到氧化胁迫导致电离辐射损伤的方法，其特征在于：所述的荧光蛋白选择定位表达在对电离辐射敏感的线粒体、细胞膜上，从而通过直接观测蛋白荧光强度变化推测电离辐射通过氧化性自由基对细胞及具体部位的辐射损伤。
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