CN115198005B - 一种基于荧光探针法检测基因突变的方法 - Google Patents

一种基于荧光探针法检测基因突变的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于荧光探针法检测基因突变的方法，包括，步骤S1，将5μLPCR反应液，4μL检测液以及1μL样本配制待反应体系；步骤S2，将待反应体系加入荧光定量PCR仪按照预设参数进行扩增；步骤S3，中控单元获取的待反应体系在扩增第一阶段待反应体系的荧光强度不符合预设标准时，所述中控单元对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距进行调节；步骤S4，所述中控单元根据设置于待反应体系上的阵列透镜的质优度与预设质优度相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距和角度进行调节，以使光学检测单元各机构设置符合标准；步骤S5，中控单元根据待反应体系经过扩增第二阶段后的荧光信号判定其检测结果。

Description

一种基于荧光探针法检测基因突变的方法
技术领域
本发明涉及荧光探针检测领域，尤其涉及一种基于荧光探针法检测基因突变的方法。
背景技术
结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针，是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测，到激发光激发后，从激发态单重态回到基态，在紫外-可见-近红外区有特征发光，称之为荧光。
荧光性质(激发和发射波长、强度、寿命、偏振等)可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子，被称为荧光探针。荧光探针分类很多，可以根据材料属性分为有机和无机探针，可以根据探针尺寸分为分子探针和纳米探针，也可以根据激发光源分为单光子、双光子及多光子荧光探针，还可以根据待测物分类为金属离子荧光单子和生物分子荧光探针等等。荧光探针在各种检测和标记中应用广泛，比如测定金属离子、农药残留、生物分子含量、示踪生物分子，标记大分子及细胞和亚细胞结构等方面。
本发明的目的是为复发或难治性急性髓系白血病(R/RAML)成人患者的治疗指导用药，其中携带IDH1突变的患者推荐使用药物为ivosidenib，携带IDH2突变的患者推荐使用药物为enasidenib。
发明内容
为此，本发明提供一种基于荧光探针法检测基因突变的方法，可以解决无法根据样本荧光强度、阵列透镜的质优度对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节，以使荧光探针法检测基因突变准确度符合标准。
为实现上述目的，本发明提供一种基于荧光探针法检测基因突变的方法，包括：
步骤S1，将5μLPCR反应液，4μL检测液以及1μL样本配制待反应体系；
步骤S2，将待反应体系加入荧光定量PCR仪按照预设参数进行扩增；
步骤S3，中控单元获取的待反应体系在扩增第一阶段待反应体系的荧光强度不符合预设标准时，所述中控单元对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距进行调节；
步骤S4，所述中控单元根据设置于待反应体系上的阵列透镜的质优度与预设质优度相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距和角度进行调节，以使光学检测单元各机构设置符合标准；
步骤S5，中控单元根据待反应体系经过扩增第二阶段后的荧光信号判定其检测结果。
所述步骤S4中，所述中控单元根据阵列透镜的光斑强度和光斑均匀度获取阵列透镜的质优度p，设定p＝(1+(f-f0)/f0)/(1+(y-y0)/y0)，其中，f为阵列透镜的实时光斑强度，f0为中控单元预设阵列透镜光斑强度标准值，y为阵列透镜实时光斑均匀度，y0为中控单元预设阵列透镜光斑均匀度标准值。
进一步地，所述中控单元预设荧光强度差值C，中控单元获取扩增第一阶段待反应体系预设时间内荧光强度差值△c与预设荧光强度差值相比较，判定所述光学检测单元设置是否符合标准,设定△c＝c1-c2，其中，c1为第一预设时间t1时待反应体系的荧光强度,c2为第二预设时间t2时待反应体系的荧光强度，设定，
当△c≤C1，所述中控单元判定所述光学检测单元设置不符合标准；
当C1＜△c＜C2，所述中控单元判定所述光学检测单元设置符合标准；
当△c≥C2，所述中控单元判定所述光学检测单元设置不符合标准；
其中，所述中控单元预设荧光强度差值C，设定第一预设荧光强度差值C1、第二预设荧光强度差值C2。
进一步地，所述中控单元判定所述光学检测单元设置不符合标准时，中控单元将获取的扩增第一阶段待反应体系预设时间内荧光强度差值的绝对值设为荧光强度的变化量，并将其与预设荧光强度差值标准值相比较，对所述第一复眼透镜和所述第二复眼透镜的间距进行调节，其中，
当|△c|≤C0-△a，所述中控单元将所述第一复眼透镜和所述第二复眼透镜的间距d缩短至d1，设定d1＝d×(1-(C0-|△c|)/C0)；
当C0-△a＜|△c|＜C0+△a，所述中控单元根据所述阵列透镜质优度对第一复眼透镜和所述第二复眼透镜的设置位置进行调节；
当|△c|≥C0+△a，所述中控单元将所述第一复眼透镜和所述第二复眼透镜的间距d延长至d2，设定d2＝d×(1+(|△c|-C0)/C0)；
其中，△a为所述中控单元预设荧光强度补偿参数。
进一步地，所述中控单元预设质优度P，中控单元根据获取的阵列透镜质优度p与预设质优度相比较，判定是否对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节，其中，
当p≤P1，所述中控单元选取第一调节参数h1对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节；
当P1＜p＜P2，所述中控单元判定不对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节；
当p≥P2，所述中控单元选取第二调节参数h2对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节；
其中，所述中控单元预设质优度P，设定第一预设质优度P1，第二预设质优度P2，中控单元预设调节参数h，设定第一预设调节参数h1，第二预设调节参数h2。
进一步地，所述中控单元获取的阵列透镜质优度小于等于第一预设质优度，中控单元获取阵列透镜的实时光斑强度f与预设阵列透镜光斑强度F相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距进行调节，其中，
当f≤F1,所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距di延长至di1，设定di1＝di×(1+h1×(F1-f)/F1)；
当F1＜f＜F2,所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距di缩短至di2，设定di2＝di×(1-h1×(f-F1)×(F2-f)/(F1×F2))；
当f≥F2,所述中控单元根据阵列透镜的光斑均匀度对第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行调节；
其中，所述中控单元预设阵列透镜光斑强度F，设定第一预设阵列透镜光斑强度F1，第二预设阵列透镜光斑强度F2，i＝1,2。
进一步地，所述中控单元获取阵列透镜的实时光斑强度在第一预设阵列透镜光斑强度和第二预设阵列透镜光斑强度之间，中控单元根据阵列透镜的光斑均匀度y与预设光斑均匀度标准值相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行调节，其中，
当y≤y0+△y，所述中控单元判定将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度缩小至θ1，设定θ1＝θ×(1-(y0+△y-y)/y0)；
当y＞y0+2×△y，所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度θ缩小至θ2,设定θ2＝θ×(1-(y0+2×△y-y)2/y0)；
其中，△y为所述中控单元预设光斑均匀度补偿参数。
进一步地，所述中控单元获取的阵列透镜质优度大于等于第二预设质优度，中控单元中控单元获取阵列透镜的实时光斑均匀度y与预设阵列透镜光斑均匀度F相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行调节，其中，
当y≤Y1,所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度θ缩小至θ3，设定θ3＝θ×(1-h2×(Y1-y)/Y1)；
当Y1＜y＜Y2，所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度θ缩小至θ4，设定θ3＝θ×(1-h2×(Y2-y)×(y-Y1)/(Y1×Y2))；
当y≥Y2，所述中控单元缩小第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距；
其中，所述中控单元预设阵列透镜光斑均匀度F，设定第一预设阵列透镜光斑均匀度F1、第二预设阵列透镜光斑均匀度F2。
进一步地，所述光学检测单元包括第一调节单元和第二调节单元，其中，第一调节单元与所述第一复眼透镜相连接，所述第二调节单元与所述第二复眼透镜相连接，所述第一调节单元包括第一横向位置调节模块，以及与所述第一横向位置调节模块相连接的第一角度调节模块，所述第二调节单元包括第二横向位置调节模块，以及与所述第二横向位置调节模块相连接的第二角度调节模块，所述中控单元预设间距D,中控单元将获取的第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距与预设间距相比较，对用于控制第一复眼透镜横向位置的第一电机动力参数和用于控制第二复眼透镜横向位置的第四电机动力参数进行调节，其中，
当diq≤D1,所述中控单元提高第一电机动力参数F1至F11，设定F11＝F1×(1+(D1-diq)/D1),将第四电机动力参数F4降低至F41,设定F41＝F4×(1-(D1-diq)/D1)；
当D1＜diq＜D2,所述中控单元提高第一电机动力参数F1至F12，设定F12＝F1×(1+(D2-diq)×(diq-D1)/(D1×D2))；
当diq≥D2,所述中控单元降低第一电机动力参数F1至F13，设定F13＝F1×(1-(diq-D2)/D2),将第四电机动力参数F4提高至F42设定F42＝F4×(1+(diq-D2)/D2)；
其中，所述中控单元预设间距D，设定第一预设间距D1，第二预设间距D2，q＝1,2。
进一步地，所述中控单元预设角度G，中控单元将第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度与预设角度相比较，对用于控制第一复眼透镜角度的第三电机动力参数和用于控制第二复眼透镜角度的第六电机动力参数进行调节，其中，
当θj≤G1，所述中控单元降低第三电机动力参数F3至F31，设定F31＝F3×(1-(G1-θj)/G1)；
当G1＜θj＜G2，所述中控单元降低第三电机动力参数F3至F32，设定F32＝F3×(1-(θj-G1)×(G2-θj)/(G1×G2))，将第六电机动力参数F6提高至F61,设定F61＝F6×(1+(θj-G1)×(G2-θj)/(G1×G2))；
当θj≥G2，所述中控单元降低第三电机动力参数F3至F33,设定F33＝F3×(1-(θj-G2)/G2),将第六电机动力参数F6提高至F62，设定F62＝F6×(1+(θj-G2)/G2)；
其中，所述中控单元预设角度G，设定第一预设角度G1，第二预设角度G2，j＝1,2,3,4。
进一步地，所述检测液分为检测液A和检测液B，其中，检测液A为IDH1-R132H、IDH2-R140Q和内参的引物探针，检测液B为IDH1-R132H、IDH2-R140Q和内参的引物探针。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明通过设置中控单元，当中控单元获取的待反应体系在扩增第一阶段待反应体系的荧光强度不符合预设标准时，所述中控单元对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距进行调节，同时所述中控单元根据设置于待反应体系上的阵列透镜的质优度与预设质优度相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距和角度进行调节，以使光学检测单元各机构设置符合标准；
尤其，本发明中控单元设置有荧光强度差值,中控单元通过将获取的扩增第一阶段待反应体系预设时间内荧光强度差值与预设荧光强度差值相比较，用以判定当前光学检测单元各机构设置是否符合标准，当中控单元获取的预设时间内荧光强度差值小于等于第一预设荧光强度差值，或大于等于第二预设荧光强度差值，说明光学检测单元不稳定造成在扩增第一阶段待反应体系在预设时间内的荧光强度发生一定的波动，因此中控单元将待反应体系预设时间内荧光强度的变化量与预设荧光强度差值的标准值进行比较，对光学检测单元中第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距进行调节，其中，当中控单元获取的荧光强度的变化量小于等于预设荧光强度差值标准值的荧光强度补偿参数的差值时，中控单元通过缩短第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距以提高光学检测单元光路的稳定性，当中控单元获取的荧光强度的变化量大于等于预设荧光强度差值标准值的荧光强度补偿参数的和时，中控单元通过延长第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距以提高光学检测单元光路的稳定性；当中控单元获取的预设时间内荧光强度差值在第一预设荧光强度差值和第二预设荧光强度差值之间，说明光学检测单元对待反应体系在扩增第一阶段在预设时间内的荧光强度未发生波动，中控单元不对光学检测单元的各机构进行调节。
尤其，本发明中控单元将预设质优度划分为明确的两个标准，中控单元根据获取的阵列透镜质优度与预设质优度的两个标准相比较，判定对光学检测单元的第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节，其中，若中控单元获取的阵列透镜质优度小于等于第一预设质优度，说明当前阵列透镜上的光斑效果不佳，中控单元选取较大的调节参数用以对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节，若中控单元获取的阵列透镜质优度大于等于第二预设质优度，说明当前阵列透镜上的光斑效果不佳，中控单元选取较小的调节参数用以对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节，若中控单元获取的阵列透镜质优度在第一预设质优度和第二预设质优度之间，说明当前阵列透镜上的光斑效果符合标准，中控单元不对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节。
尤其，本发明中控单元获取的阵列透镜质优度小于等于第一预设质优度，中控单元选取第一调节参数，同时根据阵列透镜的实时光斑强度与预设值相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距进行调节，其中，若阵列透镜实时光斑强度小于等于第一预设光斑强度，说明当前阵列透镜质优度低的原因在于阵列透镜光斑强度过低，中控单元判定延长第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距以提高阵列透镜的光斑强度；若阵列透镜实时光斑强度在第一预设光斑强度和第二预设光斑强度之间，说明当前阵列透镜质优度低的原因在于光斑强度较低，中控单元判定缩短第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距以提高阵列透镜的光斑强度；若阵列透镜实时光斑强度大于等于第二预设光斑强度，说明当前阵列透镜质优度低的原因在于阵列透镜光斑均匀度值过高，若中控单元获取阵列透镜光斑均匀度小于等于预设光斑均匀度标准值与光斑均匀度误差值的差，中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行略微缩小以小幅度的提高光斑均匀度，若中控单元获取阵列透镜光斑均匀度大于预设光斑均匀度与两倍光斑均匀度误差值的和，中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行大幅度的缩小，以提高光斑均匀度。
尤其，本发明中控单元获取阵列透镜的质优度大于等于第二预设质优度，中控单元根据阵列透镜实时光斑均匀度与预设阵列透镜光斑均匀度相比较，若中控单元获取阵列透镜实时光斑均匀度小于等于第一预设光斑均匀度，中控单元判定大幅度的缩小第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度，以大幅度的提高光斑均匀度；若中控单元获取阵列透镜实时光斑均匀度在第一预设光斑均匀度和第二预设光斑均匀度之间，中控单元判定小幅度的缩小第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度，以小幅度的提高光斑均匀度；若中控单元获取阵列透镜实时光斑均匀度大于等于第二预设光斑均匀度，说明当前阵列透镜质优度高的原因在于光斑强度过高，中控单元判定延长第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距以降低光斑强度。
尤其，本发明通过第一电机和第二电机的动力参数控制第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距，当中控单元获取调节后的第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距小于等于第一预设间距时，中控单元判定提高第一电机的动力参数，同时降低第四电机动力参数，以缩小第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距，当中控单元获取调节后的第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距在第一预设间距和第二预设间距之间时，中控单元判定提高第一电机的动力参数，以缩小第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距，当中控单元获取调节后的第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距大于等于第二预设间距时，中控单元判定降低第一电机的动力参数，同时提高第四电机动力参数，以延长第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距。
尤其，本发明通过调节第三电机和第六电机的动力参数调节第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度，当中控单元获取的调节后的第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度小于等于第一预设角度，中控单元缩小第三电机动力参数，以将第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度调节至该角度，当中控单元获取的调节后的第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度在第一预设角度和第二预设角度之间，中控单元降低第三电机动力参数，同时提高第六电机动力参数，以将第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度调节至该角度，当中控单元获取的调节后的第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度大于等于第二预设角度，中控单元大幅度降低第三电机动力参数，同时大幅度提高第六电机动力参数，以将第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度调节至该角度。
附图说明
图1为发明荧光检测PCR仪结构示意图；
图2为发明实施例光学检测单元结构示意图；
图3为发明实施例第一复眼透镜和第一调节单元侧视图；
图4为发明实施例基于荧光探针法检测基因突变的方法示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步描述；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非在限制本发明的保护范围。
需要说明的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方向或位置关系的术语是基于附图所示的方向或位置关系，这仅仅是为了便于描述，而不是指示或暗示所述装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，还需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域技术人员而言，可根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
请参阅图1所示，其为本发明实施例荧光检测PCR仪结构示意图，其包括待反应体系样本20以及光学检测单元111。
请参阅图2和图3所示，其中图2为本发明实施例光学检测单元结构示意图，图3为本发明实施例第一复眼透镜和第一调节单元侧视图，其包括，
光源1，用于为荧光检测PCR仪荧光检测提供光源，光源发射的光线能够激发被检样品中的荧光基团产生荧光；反光杯2，其用于将光源发出的光线投射于复眼透镜组；复眼透镜组包括第一复眼透镜3和第二复眼透镜10，所述第一复眼透镜与第一调节单元相连接，所述第二复眼透镜与所述第二调节单元相连接，所述第一调节单元包括第一横向位置调节模块、与所述第一横向位置调节模块相连接的第一纵向位置调节模块以及与所述第一纵向位置调节模块相连接的第一角度调节模块，所述第二调节单元包括第二横向位置调节模块、与所述第二横向位置调节模块相连接的第二纵向位置调节模块以及与所述第二纵向位置调节模块相连接的第二角度调节模块，所述第一横向位置调节模块包括第一横向滑杆9，设置于第一横向滑杆上的第一连接件7以及控制第一横向滑杆上第一连接件移动的第一电机6，第一纵向位置调节模块包括第一纵向滑杆21、设置于所述第一纵向滑杆上的第二连接件8以及控制第一纵向滑杆上第二连接件移动的第二电机5，第一角度调节模块包括用于调节第一复眼透镜角度的第三电机4，第三电机与所述第二连接件相连接；所述第二横向位置调节模块包括第二横向滑杆16，设置于第二横向滑杆上的第三连接件14以及控制第二横向滑杆上第三连接件移动的第四电机13，第二纵向位置调节模块包括第二纵向滑杆、设置于所述第二纵向滑杆上的第四连接件158以及控制第二纵向滑杆上第四连接件移动的第五电机12，第二角度调节模块包括用于调节第二复眼透镜角度的第六电机11，第六电机与所述第四连接件相连接。聚光透镜17，其将经过两个复眼透镜后的均匀光斑聚焦到待反应体系样本的表面上；二色镜18，所述二色镜用于分光。阵列透镜19用于通过阵列排布方式形成与所述待反应体系样本完全一致的透镜。
工作过程为光源发出所需可见光线，可见光线经反光杯形成的光路入射第一复眼透镜和第二复眼透镜，实现均匀光斑同时提升光路亮度的作用，提亮后的光路经聚光透镜聚焦到二色镜，经过二色镜的分光，将分光后的光路照射于样本上，样本与二色镜之间设置有阵列透镜，中控单元根据阵列透镜上的光斑检测装置获取光斑强度和均匀度。
具体而言，本发明实施例当中控单元获取预设循环次数后荧光强度符合标准，中控单元根据阵列透镜上的光斑检测装置获取光斑质优度，若当前阵列透镜的质优度符合标准，则中控单元判定当前光学检测单元设置符合标准，若当前阵列透镜的质优度不符合标准，则中控单元判定当前光学检测单元设置不符合标准，中控单元根据获取的阵列透镜光斑强度和均匀度与预设值相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距、第一复眼透镜和第二复眼透镜的角度进行调节，具体而言，本发明实施例通过在扩增第一阶段检测待反应体系的荧光强度是否符合标准，以对光学检测元件各部件进行调节，以保证扩增第二阶段荧光检测的准确度。
请参阅图4所示，其为本发明实施例基于荧光探针法检测基因突变的方法示意图，包括，
步骤S1，将5μLPCR反应液，4μL检测液以及1μL样本配制待反应体系；
步骤S2，将待反应体系加入荧光定量PCR仪按照预设参数进行扩增；
步骤S3，中控单元获取的待反应体系在扩增第一阶段待反应体系的荧光强度不符合预设标准时，所述中控单元对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距进行调节；
步骤S4，所述中控单元根据设置于待反应体系上的阵列透镜的质优度与预设质优度相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距和角度进行调节，以使光学检测单元各机构设置符合标准；
步骤S5，中控单元根据待反应体系经过扩增第二阶段后的荧光信号判定其检测结果。
所述步骤S4中，所述中控单元根据阵列透镜的光斑强度和光斑均匀度获取阵列透镜的质优度p，设定p＝(1+(f-f0)/f0)/(1+(y-y0)/y0)，其中，f为阵列透镜的实时光斑强度，f0为中控单元预设阵列透镜光斑强度标准值，y为阵列透镜实时光斑均匀度，y0为中控单元预设阵列透镜光斑均匀度标准值。
其中，所述中控单元预设荧光强度差值C，中控单元获取扩增第一阶段待反应体系预设时间内荧光强度差值△c与预设荧光强度差值相比较，判定所述光学检测单元设置是否符合标准,设定△c＝c1-c2，其中，c1为第一预设时间t1时待反应体系的荧光强度,c2为第二预设时间t2时待反应体系的荧光强度，设定，
当△c≤C1，所述中控单元判定所述光学检测单元设置不符合标准；
当C1＜△c＜C2，所述中控单元判定所述光学检测单元设置符合标准；
当△c≥C2，所述中控单元判定所述光学检测单元设置不符合标准；
其中，所述中控单元预设荧光强度差值C，设定第一预设荧光强度差值C1、第二预设荧光强度差值C2。
具体而言，所述中控单元判定所述光学检测单元设置不符合标准时，中控单元将获取的扩增第一阶段待反应体系预设时间内荧光强度差值的绝对值设为荧光强度的变化量，并将其与预设荧光强度差值标准值相比较，对所述第一复眼透镜和所述第二复眼透镜的间距进行调节，其中，
当|△c|≤C0-△a，所述中控单元将所述第一复眼透镜和所述第二复眼透镜的间距d缩短至d1，设定d1＝d×(1-(C0-|△c|)/C0)；
当C0-△a＜|△c|＜C0+△a，所述中控单元根据所述阵列透镜质优度对第一复眼透镜和所述第二复眼透镜的设置位置进行调节；
当|△c|≥C0+△a，所述中控单元将所述第一复眼透镜和所述第二复眼透镜的间距d延长至d2，设定d2＝d×(1+(|△c|-C0)/C0)；
其中，△a为所述中控单元预设荧光强度补偿参数。
具体而言，本发明中控单元设置有荧光强度差值,中控单元通过将获取的扩增第一阶段待反应体系预设时间内荧光强度差值与预设荧光强度差值相比较，用以判定当前光学检测单元各机构设置是否符合标准，当中控单元获取的预设时间内荧光强度差值小于等于第一预设荧光强度差值，或大于等于第二预设荧光强度差值，说明光学检测单元不稳定造成在扩增第一阶段待反应体系在预设时间内的荧光强度发生一定的波动，因此中控单元将待反应体系预设时间内荧光强度的变化量与预设荧光强度差值的标准值进行比较，对光学检测单元中第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距进行调节，其中，当中控单元获取的荧光强度的变化量小于等于预设荧光强度差值标准值的荧光强度补偿参数的差值时，中控单元通过缩短第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距以提高光学检测单元光路的稳定性，当中控单元获取的荧光强度的变化量大于等于预设荧光强度差值标准值的荧光强度补偿参数的和时，中控单元通过延长第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距以提高光学检测单元光路的稳定性；当中控单元获取的预设时间内荧光强度差值在第一预设荧光强度差值和第二预设荧光强度差值之间，说明光学检测单元对待反应体系在扩增第一阶段在预设时间内的荧光强度未发生波动，中控单元不对光学检测单元的各机构进行调节。
其中，所述中控单元预设质优度P，中控单元根据获取的阵列透镜质优度p与预设质优度相比较，判定是否对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节，其中，
当p≤P1，所述中控单元选取第一调节参数h1对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节；
当P1＜p＜P2，所述中控单元判定不对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节；
当p≥P2，所述中控单元选取第二调节参数h2对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节；
其中，所述中控单元预设质优度P，设定第一预设质优度P1，第二预设质优度P2，中控单元预设调节参数h，设定第一预设调节参数h1，第二预设调节参数h2。
具体而言，本发明实施例不对第一调节参数和第二调节参数进行限定，本发明提供一种优选地实施方案，其中，第一调节参数为1.3-1.5和第二调节参数1.0-1.2。
具体而言，本发明中控单元将预设质优度划分为明确的两个标准，中控单元根据获取的阵列透镜质优度与预设质优度的两个标准相比较，判定对光学检测单元的第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节，其中，若中控单元获取的阵列透镜质优度小于等于第一预设质优度，说明当前阵列透镜上的光斑效果不佳，中控单元选取较大的调节参数用以对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节，若中控单元获取的阵列透镜质优度大于等于第二预设质优度，说明当前阵列透镜上的光斑效果不佳，中控单元选取较小的调节参数用以对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节，若中控单元获取的阵列透镜质优度在第一预设质优度和第二预设质优度之间，说明当前阵列透镜上的光斑效果符合标准，中控单元不对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节。
其中，所述中控单元获取的阵列透镜质优度小于等于第一预设质优度，中控单元获取阵列透镜的实时光斑强度f与预设阵列透镜光斑强度F相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距进行调节，其中，
当f≤F1,所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距di延长至di1，设定di1＝di×(1+h1×(F1-f)/F1)；
当F1＜f＜F2,所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距di缩短至di2，设定di2＝di×(1-h1×(f-F1)×(F2-f)/(F1×F2))；
当f≥F2,所述中控单元根据阵列透镜的光斑均匀度对第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行调节；
其中，所述中控单元预设阵列透镜光斑强度F，设定第一预设阵列透镜光斑强度F1，第二预设阵列透镜光斑强度F2，i＝1,2。
所述中控单元获取阵列透镜的实时光斑强度在第一预设阵列透镜光斑强度和第二预设阵列透镜光斑强度之间，中控单元根据阵列透镜的光斑均匀度y与预设光斑均匀度标准值相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行调节，其中，
当y≤y0+△y，所述中控单元判定将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度缩小至θ1，设定θ1＝θ×(1-(y0+△y-y)/y0)；
当y＞y0+2×△y，所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度θ缩小至θ2,设定θ2＝θ×(1-(y0+2×△y-y)2/y0)；
其中，△y为所述中控单元预设光斑均匀度补偿参数。
具体而言，本发明中控单元获取的阵列透镜质优度小于等于第一预设质优度，中控单元选取第一调节参数，同时根据阵列透镜的实时光斑强度与预设值相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距进行调节，其中，若阵列透镜实时光斑强度小于等于第一预设光斑强度，说明当前阵列透镜质优度低的原因在于阵列透镜光斑强度过低，中控单元判定延长第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距以提高阵列透镜的光斑强度；若阵列透镜实时光斑强度在第一预设光斑强度和第二预设光斑强度之间，说明当前阵列透镜质优度低的原因在于光斑强度较低，中控单元判定缩短第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距以提高阵列透镜的光斑强度；若阵列透镜实时光斑强度大于等于第二预设光斑强度，说明当前阵列透镜质优度低的原因在于阵列透镜光斑均匀度值过高，若中控单元获取阵列透镜光斑均匀度小于等于预设光斑均匀度标准值与光斑均匀度误差值的差，中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行略微缩小以小幅度的提高光斑均匀度，若中控单元获取阵列透镜光斑均匀度大于预设光斑均匀度与两倍光斑均匀度误差值的和，中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行大幅度的缩小，以提高光斑均匀度。
其中，所述中控单元获取的阵列透镜质优度大于等于第二预设质优度，中控单元中控单元获取阵列透镜的实时光斑均匀度y与预设阵列透镜光斑均匀度F相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行调节，其中，
当y≤Y1,所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度θ缩小至θ3，设定θ3＝θ×(1-h2×(Y1-y)/Y1)；
当Y1＜y＜Y2，所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度θ缩小至θ4，设定θ3＝θ×(1-h2×(Y2-y)×(y-Y1)/(Y1×Y2))；
当y≥Y2，所述中控单元缩小第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距；
其中，所述中控单元预设阵列透镜光斑均匀度F，设定第一预设阵列透镜光斑均匀度F1、第二预设阵列透镜光斑均匀度F2。
具体而言，本发明实施例所述第一复眼透镜和第二复眼透镜相对角度θ为第一复眼透镜与第一横向滑杆所成的角度与第而复眼透镜与第二横向滑杆所成的角度差。
具体而言，本发明中控单元获取阵列透镜的质优度大于等于第二预设质优度，中控单元根据阵列透镜实时光斑均匀度与预设阵列透镜光斑均匀度相比较，若中控单元获取阵列透镜实时光斑均匀度小于等于第一预设光斑均匀度，中控单元判定大幅度的缩小第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度，以大幅度的提高光斑均匀度；若中控单元获取阵列透镜实时光斑均匀度在第一预设光斑均匀度和第二预设光斑均匀度之间，中控单元判定小幅度的缩小第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度，以小幅度的提高光斑均匀度；若中控单元获取阵列透镜实时光斑均匀度大于等于第二预设光斑均匀度，说明当前阵列透镜质优度高的原因在于光斑强度过高，中控单元判定延长第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距以降低光斑强度。
其中，所述光学检测单元包括第一调节单元和第二调节单元，其中，第一调节单元与所述第一复眼透镜相连接，所述第二调节单元与所述第二复眼透镜相连接，所述第一调节单元包括第一横向位置调节模块，以及与所述第一横向位置调节模块相连接的第一角度调节模块，所述第二调节单元包括第二横向位置调节模块，以及与所述第二横向位置调节模块相连接的第二角度调节模块，所述中控单元预设间距D,中控单元将获取的第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距与预设间距相比较，对用于控制第一复眼透镜横向位置的第一电机动力参数和用于控制第二复眼透镜横向位置的第四电机动力参数进行调节，其中，
当diq≤D1,所述中控单元提高第一电机动力参数F1至F11，设定F11＝F1×(1+(D1-diq)/D1),将第四电机动力参数F4降低至F41,设定F41＝F4×(1-(D1-diq)/D1)；
当D1＜diq＜D2,所述中控单元提高第一电机动力参数F1至F12，设定F12＝F1×(1+(D2-diq)×(diq-D1)/(D1×D2))；
当diq≥D2,所述中控单元降低第一电机动力参数F1至F13，设定F13＝F1×(1-(diq-D2)/D2),将第四电机动力参数F4提高至F42设定F42＝F4×(1+(diq-D2)/D2)；
其中，所述中控单元预设间距D，设定第一预设间距D1，第二预设间距D2，q＝1,2。
具体而言，本发明通过第一电机和第二电机的动力参数控制第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距，当中控单元获取调节后的第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距小于等于第一预设间距时，中控单元判定提高第一电机的动力参数，同时降低第四电机动力参数，以缩小第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距，当中控单元获取调节后的第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距在第一预设间距和第二预设间距之间时，中控单元判定提高第一电机的动力参数，以缩小第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距，当中控单元获取调节后的第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距大于等于第二预设间距时，中控单元判定降低第一电机的动力参数，同时提高第四电机动力参数，以延长第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距。
所述中控单元预设角度G，中控单元将第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度与预设角度相比较，对用于控制第一复眼透镜角度的第三电机动力参数和用于控制第二复眼透镜角度的第六电机动力参数进行调节，其中，
当θj≤G1，所述中控单元降低第三电机动力参数F3至F31，设定F31＝F3×(1-(G1-θj)/G1)；
当G1＜θj＜G2，所述中控单元降低第三电机动力参数F3至F32，设定F32＝F3×(1-(θj-G1)×(G2-θj)/(G1×G2))，将第六电机动力参数F6提高至F61,设定F61＝F6×(1+(θj-G1)×(G2-θj)/(G1×G2))；
当θj≥G2，所述中控单元降低第三电机动力参数F3至F33,设定F33＝F3×(1-(θj-G2)/G2),将第六电机动力参数F6提高至F62，设定F62＝F6×(1+(θj-G2)/G2)；
其中，所述中控单元预设角度G，设定第一预设角度G1，第二预设角度G2，j＝1,2,3,4。
具体而言，本发明通过调节第三电机和第六电机的动力参数调节第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度，当中控单元获取的调节后的第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度小于等于第一预设角度，中控单元缩小第三电机动力参数，以将第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度调节至该角度，当中控单元获取的调节后的第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度在第一预设角度和第二预设角度之间，中控单元降低第三电机动力参数，同时提高第六电机动力参数，以将第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度调节至该角度，当中控单元获取的调节后的第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度大于等于第二预设角度，中控单元大幅度降低第三电机动力参数，同时大幅度提高第六电机动力参数，以将第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度调节至该角度。
具体而言，本发明实施例对突变位点IDH1-R132H、IDH1-R132C、IDH2-R140Q、IDH2-R172K进行检测，其与内参基因共同检测组成两组三重qPCR其中，突变碱基设计与MGB探针上，根据荧光信号的有无判定是否存在碱基突变。在携带IDH1突变的复发或难治性急性髓系白血病(R/R AML)成人患者中，IDH1-R132H、IDH1-R132C突变位点的突变频率分别为59％和25％左右，为突变频率最高的两个位点。在携带有IDH2基因突变的复发或难治性急性髓系白血病(R/RAML)成人患者中，IDH2-R140Q、IDH2-R172K突变位点的突变频率分别为75％和20％左右，为突变频率最高的两个位点。
具体而言，本发明实施例中试剂组成包括PCR反应液、检测液A、检测液B、阳性参考品和阴性参考品，其中，PCR反应液包括Taq酶、dNTPs、Buffer，检测液A包括IDH1-R132H、IDH2-R140Q和内参的引物探针，检测液B包括IDH1-R132C、IDH2-R172K和内参的引物探针，阳性参考品为突变型DNA，阴性参考品为野生型DNA；
具体而言，本发明实施例检测工作过程，包括，
步骤S101，选用复发或难治性急性髓系白血病(R/R AML)成人患者的血液或骨髓样本，将血液或骨髓样本采用DNA提取试剂盒提取合格的DNA；
步骤S102，根据样本数量、阳性参考品数量以及阴性参考品数量，计算PCR反应管数量，其中，PCR反应管数量为(样本数量+阳性参考品+阴性参考品)×2；
步骤S103，将5μLPCR反应液，4μL检测液A/B，和1μL样本配制反应体系；
步骤S104，按照第一阶段95℃，2min，循环1次、第二阶段95℃，10s，61℃30s循环45次条件将反应液体系上机。
其中，荧光通道为FAM、VIC、ROX；淬灭基团为MGB。
阳性判断值：Ct值≤30。
试验结果参见表一，
表一，试验结果
其中，内参无扩增则检测结果无效。
至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征做出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种基于非诊断目的的荧光探针法检测基因突变的方法，其特征在于，包括：
步骤S1，将5μLPCR反应液，4μL检测液以及1μL样本配制待反应体系；
步骤S2，将待反应体系加入荧光定量PCR仪按照预设参数进行扩增；
步骤S3，中控单元获取的待反应体系在扩增第一阶段待反应体系的荧光强度不符合预设标准时，所述中控单元对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距进行调节，其中，中控单元预设荧光强度差值C，中控单元获取扩增第一阶段待反应体系预设时间内荧光强度差值△c与预设荧光强度差值相比较，判定光学检测单元的设置是否符合标准,设定△c＝c1-c2，其中，c1为第一预设时间t1时待反应体系的荧光强度,c2为第二预设时间t2时待反应体系的荧光强度，设定，当△c≤C1，中控单元判定所述光学检测单元的设置不符合标准，当C1＜△c＜C2，中控单元判定光学检测单元的设置符合标准，当△c≥C2，中控单元判定光学检测单元的设置不符合标准，中控单元预设荧光强度差值C，设定第一预设荧光强度差值C1、第二预设荧光强度差值C2，其中，中控单元判定所述光学检测单元的设置不符合标准时，中控单元将获取的扩增第一阶段待反应体系预设时间内荧光强度差值的绝对值设为荧光强度的变化量，并将其与预设荧光强度差值标准值C0相比较，对所述第一复眼透镜和所述第二复眼透镜的间距进行调节，其中，
当|△c|≤C0-△a，所述中控单元将所述第一复眼透镜和所述第二复眼透镜的间距d缩短至d1，设定d1＝d×(1-(C0-|△c|)/C0)，
当C0-△a＜|△c|＜C0+△a，所述中控单元根据阵列透镜质优度对第一复眼透镜和所述第二复眼透镜的设置位置进行调节，
当|△c|≥C0+△a，所述中控单元将所述第一复眼透镜和所述第二复眼透镜的间距d延长至d2，设定d2＝d×(1+(|△c|-C0)/C0)，
上式中，△a为所述中控单元预设荧光强度补偿参数；
步骤S4，所述中控单元根据设置于待反应体系上的阵列透镜的质优度与预设质优度相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距和角度进行调节，以使所述光学检测单元各机构设置符合标准，其中，中控单元预设质优度P，中控单元根据获取的阵列透镜质优度p与预设质优度相比较，判定是否对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节，其中，当p≤P1，中控单元选取第一调节参数h1对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节,当P1＜p＜P2，中控单元判定不对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节,当p≥P2，中控单元选取第二调节参数h2对第一复眼透镜和第二复眼透镜的位置进行调节，中控单元预设质优度P，设定第一预设质优度P1，第二预设质优度P2，中控单元预设调节参数h，设定第一预设调节参数h1，第二预设调节参数h2，当中控单元获取的阵列透镜质优度小于等于第一预设质优度时，中控单元获取阵列透镜的实时光斑强度f与预设阵列透镜光斑强度F相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距进行调节，其中，
当f≤F1,所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距di延长至di 1，设定di1＝di×(1+h1×(F1-f)/F1)，
当F1＜f＜F2,所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距di缩短至di2，设定di2＝di×(1-h1×(f-F1)×(F2-f)/(F1×F2))，
当f≥F2,所述中控单元根据阵列透镜的光斑均匀度对第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行调节，
上式中，所述中控单元预设阵列透镜光斑强度F，设定第一预设阵列透镜光斑强度F1，第二预设阵列透镜光斑强度F2，i＝1,2，
所述中控单元获取阵列透镜的实时光斑强度在第一预设阵列透镜光斑强度和第二预设阵列透镜光斑强度之间时，中控单元根据阵列透镜的光斑均匀度y与预设光斑均匀度标准值y0相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行调节，其中，
当y≤y0+△y，所述中控单元判定将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度缩小至θ1，设定θ1＝θ×(1-(y0+△y-y)/y0)，
当y＞y0+2×△y，所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度θ缩小至θ2,设定θ2＝θ×(1-(y0+2×△y-y) 2 /y0)，
上式中，△y为所述中控单元预设光斑均匀度补偿参数，
所述中控单元获取的阵列透镜质优度大于等于第二预设质优度时，中控单元获取阵列透镜的实时光斑均匀度y与预设阵列透镜光斑均匀度F相比较，对第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度进行调节，其中，
当y≤Y1,所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度θ缩小至θ3，设定θ3＝θ×(1-h2×(Y1-y)/Y1)，
当Y1＜y＜Y2，所述中控单元将第一复眼透镜和第二复眼透镜的相对角度θ缩小至θ4，设定θ3＝θ×(1-h2×(Y2-y)×(y-Y1)/(Y1×Y2))，
当y≥Y2，所述中控单元缩小第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距，
上式中，所述中控单元预设阵列透镜光斑均匀度F，设定第一预设阵列透镜光斑均匀度F1、第二预设阵列透镜光斑均匀度F2，
步骤S5，中控单元根据待反应体系经过扩增第二阶段后的荧光信号判定其检测结果；
所述步骤S4中，所述中控单元根据阵列透镜的光斑强度和光斑均匀度获取阵列透镜的质优度p，设定p＝(1+(f-f0)/f0)/(1+(y-y0)/y0)，其中，f为阵列透镜的实时光斑强度，f0为中控单元预设阵列透镜光斑强度标准值，y为阵列透镜实时光斑均匀度，y0为中控单元预设阵列透镜光斑均匀度标准值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光学检测单元包括第一调节单元和第二调节单元，其中，第一调节单元与所述第一复眼透镜相连接，所述第二调节单元与所述第二复眼透镜相连接，所述第一调节单元包括第一横向位置调节模块，以及与所述第一横向位置调节模块相连接的第一角度调节模块，所述第二调节单元包括第二横向位置调节模块，以及与所述第二横向位置调节模块相连接的第二角度调节模块，所述中控单元预设间距D,中控单元将获取的第一复眼透镜和第二复眼透镜的间距与预设间距相比较，对用于控制第一复眼透镜横向位置的第一电机动力参数和用于控制第二复眼透镜横向位置的第四电机动力参数进行调节，其中，
当diq≤D1,所述中控单元提高第一电机动力参数F1至F11，设定F11＝F1×(1+(D1-diq)/D1),将第四电机动力参数F4降低至F41,设定F41＝F4×(1-(D1-diq)/D1)；
当D1＜diq＜D2,所述中控单元提高第一电机动力参数F1至F12，设定F12＝F1×(1+(D2-diq)×(diq-D1)/(D1×D2))；
当diq≥D2,所述中控单元降低第一电机动力参数F1至F13，设定F13＝F1×(1-(diq-D2)/D2),将第四电机动力参数F4提高至F42设定F42＝F4×(1+(diq-D2)/D2)；
其中，所述中控单元预设间距D，设定第一预设间距D1，第二预设间距D2，q＝1,2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述中控单元预设角度G，中控单元将第一复眼透镜与第二复眼透镜的相对角度与预设角度相比较，对用于控制第一复眼透镜角度的第三电机动力参数和用于控制第二复眼透镜角度的第六电机动力参数进行调节，其中，
当θj≤G1，所述中控单元降低第三电机动力参数F3至F31，设定F31＝F3×(1-(G1-θj)/G1)；
当G1＜θj＜G2，所述中控单元降低第三电机动力参数F3至F32，设定F32＝F3×(1-(θj-G1)×(G2-θj)/(G1×G2))，将第六电机动力参数F6提高至F61,设定F61＝F6×(1+(θj-G1)×(G2-θj)/(G1×G2))；
当θj≥G2，所述中控单元降低第三电机动力参数F3至F33,设定F33＝F3×(1-(θj-G2)/G2),将第六电机动力参数F6提高至F62，设定F62＝F6×(1+(θj-G2)/G2)；
其中，所述中控单元预设角度G，设定第一预设角度G1，第二预设角度G2，j＝1,2,3,4。
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