CN115197961A - 一种非洲猪瘟病毒b602l重组蛋白稳定表达细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒b602l重组蛋白稳定表达细胞系及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系及其构建方法和应用，在将B602L重组蛋白完成序列改造后，将其克隆至真核表达载体，进行真核表达，经过筛选能得到稳定表达B602L重组蛋白的CHO细胞株。利用本发明的构建方法能在1个月内筛选获得表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白的CHO细胞株，并在没有G418筛选压力下，细胞系传至20代，仍可检测到外源重组蛋白，具有试验周期短、成功率高和表达成本低的优点。

Description

一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系及其构建 方法和应用
技术领域
本发明涉及重组蛋白表达的技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒B602L 重组蛋白稳定表达细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus,ASFV)引起的一种急性、出血性、烈性猪传染病。世界动物卫生组织(OIE) 将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病和重点防范的外来动 物疫病之一。自2018年8月首次在我国报道以来，已经迅速蔓延至全国各地， 造成巨大经济损失和严重影响社会稳定。目前ASF尚无有效疫苗，针对该病的 预防和控制措施主要靠对感染猪及与其密切接触的猪进行快速诊断和扑杀。
B602L蛋白是一种在ASFV感染晚期表达的非结构蛋白，被认为是帮助衣 壳蛋白p72正确折叠的分子伴侣。研究显示抑制B602L蛋白的表达能够导致p72 蛋白水平下降和衣壳蛋白pE120R的移位，改变病毒的组装过程，使其出现异常 的“拉链状”结构。B602L蛋白已被证实具有良好的抗原性，能刺激机体产生 较高水平的抗体，它在感染后的后期可被家猪和丛林猪的高免抗血清识别，提 示针对其的ELISA可能是区分持续感染病毒动物与免疫动物的有效诊断方法。
目前常见的重组蛋白表达系统主要有大肠杆菌原核表达系统和真核表达系 统，如酵母表达系统、昆虫细胞和哺乳动物细胞系统。原核表达系统具有遗传 背景清楚、培养操作简单、成本低廉，且可以快速大规模地生产目的蛋白等优 点而被广泛应用，但是原核表达的重组蛋白可能出现错误折叠、失活等情况。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种非洲猪瘟病毒 B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，利用基因工程技术通过真核表达 系统构建稳定表达B602L重组蛋白的CHO细胞系以及得到纯度较高的B602L 重组蛋白；本发明的目的之二在于提供一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定 表达细胞系，高产量、免疫原性良好；本发明的目的之三在于提供一种非洲猪 瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的应用，可用于ASFV血清学诊断用抗 原的研究，对于ASFV的诊断和疫苗生产具有重要的意义。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，包括以下 步骤：
1)构建载体：分析非洲猪瘟B602L重组蛋白的基因序列的信号肽和酶切位 点信息，B602L重组蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：1所示；在起始密码子 ATG之前添加如SEQ.ID NO:2所示Kozac序列，在序列N端连接如SEQ.ID NO:3 所示的小鼠IgGκ链信号肽序列；再在肽链C端连接组氨酸标签体以融合蛋白 与目的蛋白相连接，完成序列改造后的目的蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：4 所示，将目的蛋白序列克隆至真核表达载体；
2)真核表达：将步骤1)的克隆完成后的真核表达载体以脂质体方式转染 到经过培养的CHO细胞，进行培养，收集的上清和细胞，选取一半上清和细胞 进行蛋白检测，另一半进行筛选；
蛋白检测：将上清和细胞采用蛋白质印迹法进行蛋白检测，第一抗体为抗 His标签鼠单克隆抗体，第二抗体为山羊抗小鼠的辣根过氧化物酶酶标抗体，最 后用显色液避光显色，在凝胶成像仪上拍照，观察着色情况；
筛选：将上清和细胞进行润洗，换新培养基进行培养，再加入抗性筛选试 剂进行筛选培养，以有限稀释法筛选出若干个单克隆细胞株，经观察及鉴定正 确后，扩大培养并冻存CHO细胞；将冻存的细胞复苏，连续传代，检测重组蛋 白B602L能否表达；
进一步，步骤1)中，所述组氨酸标签体是由6个组氨酸成串的肽段；所述 融合蛋白为含有4个四联体的柔性Linker；所述真核表达载体为pCMV-EGFP。 再进一步，步骤2)中，所述CHO细胞的培养步骤为：使用含10％胎牛血清的 Ham’s F12-K培养基在细胞瓶中复苏CHO细胞，按照1：3的比例进行传代，直 到细胞量(0.2～7)×108个细胞；待CHO细胞汇合度达70～90％时，弃去培养 基，使用PBS润洗1～2次，加入0.5～2mL质量浓度为0.25％的EDTA胰酶消化， 以(0.5～2)×106个细胞的密度接种6孔细胞培养板，置于37℃二氧化碳培养 箱培养18～24h。
进一步，步骤2)中，将克隆完成后的真核表达载体以脂质体方式转染到经 过培养的CHO细胞，每孔转染DNA量为2～2.5μg，转染前半小时弃去原培养 基，换成Opti-MEM无血清培养基，每孔1～2mL，得到脂质体混合物；将培养 混合液缓慢加入六孔板中，十字交叉法混匀使脂质体复合物尽量接触到细胞单 层，在35～38℃和体积含量为5％的CO2氛围下孵育6～8h后换成含5％新生 胎牛血清的Ham’s F-12K培养，24h后在荧光显微镜下观察；其中，培养混合 液是由A液和B液混合而成的；A液是由
Figure BDA0003702967100000031
LTX Reagent 9μL加入150μL Opti-MEM无血清培养基混合而成，B液是质粒DNA 2.5μg，PLUS TMReagent 3.5μL和175μLOpti-MEM无血清培养基混合而成。G418筛选培养 14～21天后，以有限稀释法筛选单克隆细胞株5～10个，经荧光显微镜观察并进 行蛋白免疫印迹检测B602L重组蛋白可表达后，扩繁冻存CHO细胞；将冻存的 CHO细胞复苏，连续传至15～20代，通过蛋白质印迹法检测B602L重组蛋白是 否丢失，若没有丢失，得到非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系，由上述的非洲猪瘟病 毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法制备而成。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的应用，上述的B602L 重组蛋白稳定表达细胞系以及B602L重组蛋白可用于ASFV血清学诊断用抗原。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明的细胞系构建方法中，在将B602L重组蛋白完成序列改造后， 将其克隆至真核表达载体，进行真核表达，真核表达系统能弥补原核表达系统 中可能出现的错误折叠、失活的情况，表达的重组蛋白能够引入适当的蛋白折 叠、翻译后修饰及产物组装，重组蛋白B602L可获得完整的生物学活性，通过 G418加压筛选能得到稳定表达B602L重组蛋白的CHO细胞株。利用本发明的 构建方法能在1个月内筛选获得表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白的CHO细胞 株，并在没有G418筛选压力下，细胞系传至20代，仍可检测到外源重组蛋白， 成功率为90％，与现有技术相比，具有试验周期短、成功率高和表达成本低的 优点。
(2)利用本发明的构建方法所得到的稳定表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋 白CHO细胞系，在连续传15～20代后仍能表达B602L重组蛋白。
(3)表达系统所产生的B602L重组蛋白能用于ASFV血清学诊断用抗原的 研究，对于ASFV的诊断和疫苗生产具有非常重要的意义。
附图说明
图1为真核表达载体的表达情况图；
图2为经过G418筛选的单克隆细胞株荧光显微镜观察图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的 是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任 意组合形成新的实施例。
一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，包括以下 步骤：
1)构建载体：分析非洲猪瘟B602L重组蛋白的基因序列的信号肽和酶切位 点信息，B602L重组蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：1所示；在起始密码子 ATG之前添加如SEQ.ID NO:2所示Kozac序列，在序列N端连接如SEQ.ID NO:3 所示的小鼠IgGκ链信号肽序列；再在肽链C端连接6个组氨酸，并以含有4 个四联体的柔性Linker(融合蛋白)与目的蛋白相连接，完成序列改造后的目的 蛋白(B602L重组蛋白)的核苷酸序列如SEQ.ID NO：4所示，将目的蛋白序列 克隆至真核表达载体pCMV-EGFP；
2)真核表达：将B602L重组蛋白的的基因克隆至pCMV-EGFP载体上并合 成序列，得到pCMV-EGFP-B602L的真核表达载体，pCMV-EGFP-B602L以脂质 体方式转染到经过培养的CHO细胞，每孔转染DNA量为2.5μg，转染前半小 时弃去原培养基，换成Opti-MEM无血清培养基，每孔1～2mL，得到脂质体混 合物；将培养混合液缓慢加入六孔板中，十字交叉法混匀使脂质体复合物尽量 接触到细胞单层，在37℃和体积含量为5％的CO2氛围下孵育6h后换成含 5％新生胎牛血清的Ham’s F-12K培养，24h后在荧光显微镜下观察；同时转染 两个复孔48h，一个用做蛋白检测，一个用做筛选；其中，培养混合液是由A 液和B液混合而成的；A液是由
Figure BDA0003702967100000061
LTX Reagent 9μL加入150μL Opti-MEM无血清培养基混合而成，B液是质粒DNA 2.5μg，PLUSTMReagent 3.5μL和175μLOpti-MEM无血清培养基混合而成；
蛋白检测：将转染48h后的一个孔分别收集上清和细胞，将上清和细胞采 用蛋白质印迹法进行蛋白检测，第一抗体为抗His标签鼠单克隆抗体(1：10000 倍稀释)，第二抗体为山羊抗小鼠的辣根过氧化物酶酶标抗体(1：10000倍稀释)， 最后用ECL显色液避光显色2min，在凝胶成像仪上拍照，观察着色情况；
筛选：转染48h后的另一个孔弃去原培养基，用PBS润洗2次，换5％新生 胎牛血清的Ham’s F-12K培养基进行培养，加入G418至终浓度为600μg/mL， 进行筛选培养14天，以有限稀释法筛选出5个单克隆细胞株，经Western blot 鉴定正确后，扩繁冻存细胞。将冻存的细胞复苏，由图2可知，连续传代20代， 通过Western blot仍能检测到外源蛋白B602L；
3)应用：以ASFV重组B602L蛋白作为检测抗原检测非洲猪瘟阳性血清， 结果如表1所示，根据结果显示使用该方法表达的重组B602L蛋白具有良好的 反应原性。
表1
Figure BDA0003702967100000071
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的 范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换 均属于本发明所要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心
<120> 一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系及其构建方法和应用
<130> 1
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1590
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggcagaat ttaatattga tgagcttctc aaaaacgtat tggaggatcc ctctactgaa 60
atatccgaag aaacgcttaa acagctttac caaaggacga acccttacaa acagttcaaa 120
aatgatagca gggtggcctt ttgctctttt acaaatttgc gggagcagta tattcgacgt 180
cttataatga ctagctttat tggatatgtc ttcaaagctc tgcaggaatg gatgccttcc 240
tattcaaaac ctacccacac gaccaaaact cttctcagtg agctaataac gttagttgat 300
actttgaaac aggaaactaa tgatgttccc tctgaatcgg tagtaaatac aattttatct 360
atagcagata gctgcaaaac ccagacgcag aaaagcaagg aagctaaaac aacgatcgat 420
agctttttac gagaacattt tgtgtttgat cctaatcttc atgctcaaag tgcgtatact 480
tgtgcagata ccaatgtaga cacttgtgca agcatgtgtg cagataccaa tgtagacacc 540
tgtgcaagca tgtgtgcaga taccaatgta gatacctgtg caagcacttg tacaagcaca 600
gaatacaccg atttagcaga tcctgagcgc atccctttac acatcatgca aaaaacatta 660
aatgtgccta atgagcttca ggccgatatt gatgcaatca cccaaacccc acagggctat 720
agggcagcag cccacatatt acaaaatata gaacttcacc aaagcattaa acatatgctt 780
gaaaatccga gggcgtttaa acccattctc tttaacacaa aaattactag atatctttcg 840
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ggaggcggtt caggcggagg cggatctcac caccaccacc accactaacc cggg 1854

Claims (6)

1.一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建载体：分析非洲猪瘟B602L重组蛋白的基因序列的信号肽和酶切位点信息，B602L重组蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：1所示；在起始密码子ATG之前添加如SEQ.IDNO:2所示Kozac序列，在序列N端连接如SEQ.ID NO:3所示的小鼠IgGκ链信号肽序列；再在肽链C端连接组氨酸标签体以融合蛋白与目的蛋白相连接，完成序列改造后的目的蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：4所示，将目的蛋白分别克隆至真核表达载体；
2)将步骤1)的克隆完成后的真核表达载体以脂质体方式转染到经过培养的CHO细胞，进行培养，收集的上清和细胞，选取一半上清和细胞进行蛋白检测，另一半进行筛选；
蛋白检测：将上清和细胞采用蛋白质印迹法进行蛋白检测，第一抗体为抗His标签鼠单克隆抗体，第二抗体为山羊抗小鼠的辣根过氧化物酶酶标抗体，最后用显色液避光显色，在凝胶成像仪上拍照，观察着色情况；
筛选：将上清和细胞进行润洗，换新培养基进行培养，再加入抗性筛选试剂进行筛选培养，以有限稀释法筛选出若干个单克隆细胞株，经观察及鉴定正确后，扩大培养并冻存CHO细胞；将冻存的细胞复苏，连续传代，检测重组蛋白B602L能否表达。
2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1)中，所述组氨酸标签体是由6个组氨酸成串的肽段；所述融合蛋白为含有4个四联体的柔性Linker；所述真核表达载体为pCMV-EGFP。
3.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，其特征在于，步骤2)中，所述CHO细胞的培养步骤为：使用含10％胎牛血清的Ham’s F12-K培养基在细胞瓶中复苏CHO细胞，按照1：3的比例进行传代，直到细胞量(0.2～7)×108个细胞；待CHO细胞汇合度达70～90％时，弃去培养基，使用PBS润洗1～2次，加入0.5～2mL质量浓度为0.25％的EDTA胰酶消化，以(0.5～2)×106个细胞的密度接种6孔细胞培养板，置于37℃二氧化碳培养箱培养18～24h。
4.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，其特征在于，步骤2)中，将克隆完成后的真核表达载体以脂质体方式转染到经过培养的CHO细胞，每孔转染DNA量为2～2.5μg，转染前半小时弃去原培养基，换成Opti-MEM无血清培养基，每孔1～2mL，得到脂质体混合物；将培养混合液缓慢加入六孔板中，十字交叉法混匀使脂质体复合物尽量接触到细胞单层，在35～38℃和体积含量为5％的CO2氛围下孵育6～8h后换成含5％新生胎牛血清的Ham’s F-12K培养，24h后在荧光显微镜下观察；其中，培养混合液是由A液和B液混合而成的；A液是由
Figure FDA0003702967090000021
LTX Reagent 9μL加入150μL Opti-MEM无血清培养基混合而成，B液是质粒DNA 2.5μg，PLUSTMReagent 3.5μL和175μLOpti-MEM无血清培养基混合而成。
5.一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系，其特征在于，由权利要求1～4任一项所述的非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法制备而成。
6.一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的应用，其特征在于，权利要求5所述的B602L重组蛋白稳定表达细胞系用于ASFV血清学诊断用抗原。
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