CN115197879A - 一种慢生根瘤菌w052及其应用 - Google Patents

一种慢生根瘤菌w052及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115197879A
CN115197879A CN202210752929.4A CN202210752929A CN115197879A CN 115197879 A CN115197879 A CN 115197879A CN 202210752929 A CN202210752929 A CN 202210752929A CN 115197879 A CN115197879 A CN 115197879A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bradyrhizobium
plants
plant
growth
soybean
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210752929.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115197879B (zh
Inventor
梁翠月
赵谦
管子迪
周慧颖
田江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN202210752929.4A priority Critical patent/CN115197879B/zh
Publication of CN115197879A publication Critical patent/CN115197879A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115197879B publication Critical patent/CN115197879B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01GHORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00Botany in general
    • A01G7/06Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01PBIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P21/00Plant growth regulators
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C05FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05FORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00Other organic fertilisers
    • C05F11/08Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Forests & Forestry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)W052及其应用。该菌株从大豆根瘤中分离纯化得到,于2022年06月01日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,其保藏编号GDMCC No:62201。本发明的慢生根瘤菌W052具有优异的耐锰能力,在低浓度的Mn2+条件下,菌株生长不受影响,其最高耐受浓度可达50‑60mM;其生化特征测定结果为溶磷反应、柠檬酸盐反应、淀粉水解反应、泌氢反应呈阴性,无明胶液化能力。接种慢生根瘤菌W052能显著促进植株生长,提升植株鲜重,增加叶片叶绿素含量和植株氮含量,提升固氮酶活性,与不接种慢生根瘤菌W052的对照植株相比具有显著性差异。

Description

一种慢生根瘤菌W052及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种慢生根瘤菌W052及其应用。
背景技术
大豆是重要的粮食作物和油料作物,其对氮素的吸收量较高,生产100kg大豆约吸收6.5~8.5kg氮素。在中国,大豆种植过程中,绝大多数都是通过施加氮肥来满足大豆对氮素的需求。但是生产化工合成氮肥将消耗大量的、不可再生的石化原料,如天然气、石油和煤炭等。生产化肥还会造成环境污染,产生温室气体;化肥在施入田间后会造成土壤板结,降低土地生产潜力;植物对化肥的吸收利用率只有30%,这意味着有大量的氮肥进入地下水源和空气中,造成环境污染。
实际上,与大豆共生的根瘤菌可以提供大豆生长所需的部分氮素。除了与大豆自然共生的根瘤菌可以为大豆提供氮肥,还可将根瘤菌制备成微生物肥料,通过接种根瘤菌也可以为大豆提供氮肥。目前国际上,如美国、巴西和阿根廷等大豆出口大国,大豆氮肥主要依靠接种大豆根瘤菌形成根瘤来提供,但是在中国通过接种大豆根瘤菌提供氮肥的种植面积仅占全部种植面积的3%左右。目前中国的根瘤菌微生物肥料大约只有20种,只占微生物肥料的极少一部分,但是有越来越多的具有优异性状的根瘤菌被发现,比如现有技术中的适合黄淮区的耐药抗逆固氮的慢生根瘤菌,新发现的根瘤菌可以为根瘤菌微生物肥料的制造提供更优质的原材料。制约根瘤菌微生物肥料应用的其中一个因素就是接种的根瘤菌的固氮能力不够优异。
另外,锰污染也会影响固氮菌的固氮效率,同时也影响大豆的生长。因此,寻找一种固氮能力优异且耐锰的根瘤菌对大豆种植产业的发展具有相当必要性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,旨在提供一种慢生根瘤菌W052及其应用,为农业上生物固氮的实施提供固氮效率更高的根瘤菌。
本发明的首要目的在于提供一种慢生根瘤菌W052。
本发明的另一目的在于提供慢生根瘤菌W052在促进植物生长或制备能够促进植物生长的产品中的应用。
本发明的又一目的在于提供慢生根瘤菌W052在促进植物固氮或制备能够促进植物固氮的产品。
本发明的又一目的在于提供慢生根瘤菌W052在促进植物叶片光合作用或制备能够促进植物叶片光合作用的产品中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种促进植物生长的产品。
本发明通过以下技术手段实现上述发明目的:
本发明提供了一种慢生根瘤菌W052,于2022年06月01日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,其保藏编号GDMCC No:62201。
本发明提供的慢生根瘤菌W052 16srDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的慢生根瘤菌W052由采集于广东省广州市朱村的大豆根瘤分离纯化得到。其属于慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.);在NCBI中进行比对,与Bradyrhizobiumpachyrhizi strain PAC48相似度最高,为98.30%。
本发明提供的慢生根瘤菌W052经鉴定其属于革兰氏阴性菌,细胞形状呈杆状,长1-3μm、宽0.5μm。
本发明提供的慢生根瘤菌W052在YMA平板上培养菌落呈圆形,颜色为白色,表面湿润粘稠而具有光泽。
本发明提供的慢生根瘤菌W052具有优异的耐锰能力,在低浓度的Mn2+条件下,菌株生长不受影响,其最高耐受浓度可达50-60mM。其生化指标测定结果为:溶磷反应呈阴性,柠檬酸盐反应呈阴性,淀粉水解反应呈阴性,泌氢反应呈阴性,无明胶液化能力。
根据NCBI中慢生根瘤菌W052 16s rDNA的比对结果以及16srDNA系统发育进化树系谱图能够发现,慢生根瘤菌W052与NCBI中相似度最高的10株菌株均无聚为一枝,可见,慢生根瘤菌W052为慢生根瘤菌属的新菌株。
慢生根瘤菌W052能显著促进植株生长,提升植株鲜重,与不接种慢生根瘤菌W052的对照植株相比具有显著性差异,因此,慢生根瘤菌W052在促进植物生长或制备能够促进植物生长的产品中的应用也属于本申请的保护范围之内。
慢生根瘤菌W052能显著提高植株固氮酶活性,提高植株氮含量,与不接种慢生根瘤菌W052的对照植株相比具有显著性差异,因此,慢生根瘤菌W052在促进植物固氮或制备能够促进植物固氮的产品中的应用也属于本申请的保护范围之内。
慢生根瘤菌W052能显著提高植株叶片中叶绿素的含量,与不接种慢生根瘤菌W052的对照植株相比具有显著性差异,因此,慢生根瘤菌W052在促进植物叶片光合作用或制备能够促进植物叶片光合作用的产品中的应用也属于本申请的保护范围之内。
优选地,所述植物为大豆。
优选地,所述产品为菌剂或肥料。
本发明还提供了一种促进植物生长的产品,其特征在于,含有慢生根瘤菌W052,和/或其菌悬液,和/或其发酵产物。
优选地,所述产品为肥料。
优选地,所述产品为菌剂。
优选地,所述植物为大豆。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
本发明提供的慢生根瘤菌W052能显著促进植株生长,提升植株鲜重,增加叶片叶绿素含量和植株氮含量,提升固氮酶活性。
附图说明
图1为低浓度(10mM)Mn2+条件下慢生根瘤菌W052菌落生长情况。
图2为不同浓度条件下,慢生根瘤菌W052细菌培养液中细菌浓度的变化情况。
图3为慢生根瘤菌W052 16srDNA系统发育进化树系谱图。
图4为慢生根瘤菌W052菌落生长图。
图5为慢生根瘤菌W052革兰氏染色结果。
图6为慢生根瘤菌W052溶磷反应结果。
图7为慢生根瘤菌W052柠檬酸盐反应结果。
图8为慢生根瘤菌W052泌氢反应结果。
图9为慢生根瘤菌W052淀粉水解反应结果。
图10为慢生根瘤菌W052明胶液化反应结果。
图11为植株新叶、老叶SPAD值测定结果图。
图12为植株生长情况。
图13为植株新叶、老叶生长情况。
图14为接种慢生根瘤菌W052后整株植株的生长情况。
图15为接种慢生根瘤菌W052后植株根系上的根瘤的生长情况。
图16为植株地上部、叶片、根鲜重测定结果,其中A图为地上部、根系的鲜重测定结果,B图为叶片鲜重测定结果。
图17为植株老叶、新叶叶绿素含量测定结果。
图18为植株根瘤数量和鲜重测定结果。
图19为固氮酶活测定结果。
图20植株氮含量测定结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1慢生根瘤菌W052的分离与鉴定
于2020年8月在广东省广州市朱村采集大豆根瘤,通过下述步骤分离纯化得慢生根瘤菌W052,具体步骤如下所述:
1、收集大豆新鲜根瘤,对根瘤表面进行消毒处理,将大豆根瘤用无菌水浸泡清洗,经75%酒精浸泡3min并轻微摇晃,再采用3.5%的NaClO处理8min,最后使用无菌水冲洗5~8次;在无菌条件下,以灭菌玻璃棒碾碎根瘤,挤压获得根瘤汁液并对根瘤汁液进行稀释,得到10-3、10-4、10-5倍浓度梯度的悬浊液样品;将各浓度样品依次取0.1mL涂抹在YMA-刚果红固体培养基平板上进行培养,于28℃红固恒温培养5天,挑选生长良好、呈现白色或淡粉色的单克隆菌落,接种于新的YMA-刚果红固体培养基中平板划线纯化培养,获得目标菌株活体培养物,并转接于50%的甘油中-80℃保藏。
2、将上述挑选得到的单菌落培养物进行16srDNA测序,挑选根瘤菌。
3、将得到的根瘤菌进行耐锰实验
(1)实验方法
将1L YMA培养基进行高温灭菌后加入10mL经0.22μm滤膜过滤的1M氯化锰溶液,混匀后制成10mM的YMA-锰培养基并接种不同菌株,5天后观察菌株生长状况,挑选出其中生长良好的菌株进一步实验。
取数个100mL三角烧瓶,灭菌后分别加入经0.22μm滤膜过滤的1M氯化锰溶液0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3mL,并使用灭菌后的YMB培养基定容至50mL,制得浓度分别为5、10、15、20、30、40、50、60mM的YMB-锰培养基。
初步筛选得到的菌株在离心管中培养至OD600值达到0.5后,取0.5mL加入上述装有YMB-锰培养基的三角烧瓶,每个菌株同一浓度设置三个重复。培养3d后测定培养基OD600值,得到菌株的具体耐锰能力。
(2)根据耐锰实验结果,选择耐锰能力最优的一株菌,记为菌株W052。
菌株W052的耐锰实验结果展示如图1、2所示。
图1为低浓度(10mM)Mn2+条件下慢生根瘤菌W052菌落生长情况,可见,在低浓度Mn2 +条件下,菌落的生长不受影响;
图2为不同浓度条件下,慢生根瘤菌W052细菌培养液中细菌浓度的变化情况,从图可得,慢生根瘤菌W052最高可耐受50-60mM的Mn2+,需要在Mn2+浓度达到60mM后,细菌才停止生长,所以慢生根瘤菌W052具有优异的耐锰能力。
菌株W052的16srDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。根据16srDNA的测序结果,构建慢生根瘤菌W05216srDNA系统发育进化树系谱图,如图3所示。在NCBI中进行比对,菌株W052与Bradyrhizobium pachyrhizi strain PAC48相似度最高,为98.30%。
4、菌株W052形态
(1)细胞形状
将慢生根瘤菌W052培养至混浊,在显微镜400×油镜下进行观察,其形状为杆状,与系统比例尺对比,单个菌体长1-3μm、宽0.5μm。
(2)菌落形状如图4所示,可见,慢生根瘤菌W052菌落在YMA平板上呈圆形,颜色为白色,表面湿润粘稠而具有光泽。
根据形态鉴定和16srDNA测序鉴定,综合判断为菌株W052属于慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.),并于2022年06月01日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,其保藏编号GDMCC No:62201,保藏单位地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2慢生根瘤菌W052生理生化指标
1、革兰氏染色
取慢生根瘤菌W052菌液100μL于干净载玻片上涂抹均匀,以烘片机40℃均匀烘干固定涂片,取100μL草酸铵结晶紫滴于涂片上,染色一分钟后以无菌水冲洗至无有紫色液体流下;之后加碘液覆盖涂片染色一分钟,无菌水冲洗;此时取95%酒精数滴于涂片上进行脱色20秒,不时摇动,之后无菌水冲洗;最后加入番红染色液复染一分钟,冲洗干净后干燥,在显微镜下进行观察。
结果如图5所示,慢生根瘤菌W052染色结果为阴性,呈现红色,属于革兰氏阴性菌。
2、溶磷反应
按照下述成分配制无机磷培养基(PKO):葡萄糖,10g/L;硫酸铵,0.5g/L;氯化钾,0.3g/L;七水硫酸锰,0.3g/L;磷酸三钙,5g/L;七水硫酸亚铁,30mg/L;四水硫酸锰,30mg/L;琼脂,15g/L;调节pH至7.0~7.5,115℃下灭菌30min。
挑取所得的慢生根瘤菌W052单克隆进行划线培养,28℃恒温培养箱培养5d,观察培养基与菌株生长的状况。
结果如图6所示,慢生根瘤菌W052菌落四周没有透明溶磷圈,表明慢生根瘤菌W052溶磷能力弱或没有溶磷能力。
3、柠檬酸盐反应
按照下述成分配制柠檬酸盐反应培养基:柠檬酸钠,5.0g/L;磷酸氢铵,1.0g/L;氯化钠,5.0g/L;七水合硫酸镁,0.2g/L;磷酸氢二钾,1.0g/L;溴百里酚兰1%水溶液8mL;琼脂,20g/L,蒸馏水990mL;调节pH至7.0-7.2,121℃灭菌15min。
挑取所得的慢生根瘤菌W052单克隆进行划线培养,28℃恒温培养箱培养5天,观察菌株生长状况。
结果如图7所示,慢生根瘤菌W052在柠檬酸盐培养基上培养5天后培养基没有转为蓝色,表明慢生根瘤菌W052没有利用柠檬酸盐的能力。
4、泌氢反应
按照下述成分配制无机磷(PVK)改良培养基如下:葡萄糖10g,酵母膏0.5g,磷酸二氢钾4.4g,硫酸铵5g,七水硫酸镁1g,氯化钾2g,一水硫酸锰0.02g,七水硫酸亚铁0.02g,蒸馏水1L,琼脂15g,pH8.0~8.5,115℃条件下灭菌30min,冷却后加入10mL溴甲酚紫指示剂(过滤灭菌)。
挑取所得的慢生根瘤菌W052单克隆进行划线培养,28℃恒温培养箱培养5天,观察菌株生长状况。
结果如图8所示,慢生根瘤菌W052在培养5天后菌落四周仍呈现紫色,即菌株无法泌氢,改变菌落四周培养基的pH值,表明慢生根瘤菌W052没有泌氢能力。
5、淀粉水解反应
按照下述成分配制淀粉培养基如下:可溶性淀粉,20g/L;蛋白胨,10g/L;牛肉膏,5g/L;氯化钠,5g/L;琼脂,15g/L;121℃灭菌15min。
挑取所得的慢生根瘤菌W052单克隆进行划线培养,28℃恒温培养箱培养5天后,加入碘液,观察培养基状况。
结果如图9所示,淀粉培养基在接种慢生根瘤菌W052 5天后加入碘液,淀粉没有被菌株水解形成白色区域,即淀粉水解反应呈阴性,表明慢生根瘤菌W052没有水解淀粉的能力。
6、明胶液化反应
按照下述成分配制明胶培养基如下:蛋白胨,5g/L;明胶,150g/L;调节pH至7.2~7.4,121℃灭菌20min。
挑取所得的慢生根瘤菌W052单克隆进行划线培养,28℃恒温培养箱培养5d后,放入4℃冷库,观察培养基状况。
结果如图10所示,液态明胶在低温下凝固,表明慢生根瘤菌W052没有明胶液化能力。
实施例3慢生根瘤菌W052回接实验
一、实验分组
1、实验组:回接慢生根瘤菌W052,设置8个重复实验,在接种后35天收取样品。
2、对照组:不接种慢生根瘤菌W052,加入低氮营养液,设置8个重复实验,在加入低氮营养液后35天收取样品。
二、实验方法
(1)大豆种子灭菌:挑选种皮无破损、饱满、大小一致的大豆种子,采用氯气消毒法(100mL次氯酸钠加4.8mL盐酸)对种子表皮消毒10h后,将大豆种子取出备用。
(2)菌体培养:配制1L YMA液体培养基,分装于2个三角瓶中,于121℃灭菌20min;吸取100μL已纯化并达到对数生长期的慢生根瘤菌W052菌液于装有YMA培养基的三角瓶中,在摇床中以28℃、180r/min的条件培养菌液至OD600值达到0.5±0.05后,分装于灭过菌的50mL离心管中,在离心机中以5000rpm离心10min后取出,倒掉上清液,用低氮营养液重悬得到菌悬液备用。
其中,低氮营养液成分包括:
1)大量元素:56.676g/L Ca(NO3)2·4H2O,13.24g/L(NH4)2SO4,38.418g/L KNO3,147.89g/L MgSO4·7H2O,34.025g/L KH2 PO4,106.54g/L CaCl2·2H2O,264.88g/L K2SO4
2)微量元素:0.254g/L MnSO4·7H2O,0.431g/L ZnSO4·7H2O,0.125g/L CuSO4·5H2O,0.2g/L(NH4)6MO7O24·4H2O,14.68g/L Na2EDTA,0.95g/L NaB4O7·4H2O。
(3)砂培及接种:将细砂、粗砂按照1:1比例混合制得培养砂,充分混合均匀后装入小盆中,每个盆中放入三颗经步骤(1)灭菌后的大豆种子并置于温室大棚中培养;待种子萌发、子叶变绿张开后,实验组的植株接种100mL步骤(2)制得的菌悬液,对照组的植株加入100mL低氮营养液。
二、结果测定方法
将上述实验组和对照组回接实验得到的植株进行以下实验,探究慢生根瘤菌W052对植株生长状况的影响。
收取样品前两周测定新叶、老叶SPAD值;收取样品时观察植株、叶片和根瘤生长情况。
(一)新叶、老叶SPAD值的测定
1、实验方法
在种植大豆种子三周后,每两天使用手持SPAD仪对大豆植株老叶及新叶SPAD值进行测定,记录下结果。
2、实验结果
实验结果如图11所示,回接慢生根瘤菌W052的植株新叶、老叶SPAD值均明显高于不接种慢生根瘤菌W052的植株,并且回接慢生根瘤菌W052能促使叶片SPAD值的升高,逆转老叶SPAD值的下降。
(二)观察植株、叶片和根瘤生长情况
结果如图12、13、14、15所示,其中,图12为植株生长情况,相较而言,大豆在接种慢生根瘤菌W052后植株地上部生物量有明显提升;图13(右)为植株新叶、老叶生长情况,可见,回接慢生根瘤菌W052的植株叶色明显转绿,并且新叶叶片面积明显高于低氮对照组;图14为接种慢生根瘤菌W052后整株植株的生长情况;图15为接种慢生根瘤菌W052后植株根系上的根瘤的生长情况。
收取样品后测定植株地上部、叶片、根鲜重,叶绿素含量(乙醇丙酮法),根瘤数量、重量,固氮酶活(乙炔还原法),植株氮含量。
(三)植株地上部、叶片、根鲜重测定
1、实验方法
在收取样品时,从大豆基部骤然变细处剪开,分为地上部与根部,分别称重后进行记录,之后取下大豆第一片三出复叶作为老叶,最后一片已经完全展开的三出复叶作为新叶分别称重后记录。
2、实验结果
实验结果如图16所示,其中A图为地上部、根系的鲜重,B图为叶片鲜重。可见,回接慢生根瘤菌W052的植株地上部的鲜重显著高于对照组,根部鲜重与对照组基本一致,说明回接慢生根瘤菌W052能促进植株生长发育。
(四)叶绿素含量测定
1、实验方法
叶绿素含量测定使用乙醇丙酮法,具体过程如下所示:
取0.2g叶片样品放入10mL离心管中,加入体积比为1:1的乙醇、丙酮混合液4mL,置于黑暗条件下24h,待叶片发白后取出,将溶液摇晃均匀后在663nm和645nm波长下分别测定吸光度a以及吸光度b,按以下公式计算叶绿素含量。
Figure BDA0003721609250000091
Figure BDA0003721609250000092
叶绿素总含量=叶绿素a含量+叶绿素b含量
2、实验结果
实验结果如图17所示,可见,回接慢生根瘤菌W052的植株老叶和新叶中叶绿素含量均显著高于对照组,说明回接慢生根瘤菌W052能显著提升新叶和老叶中叶绿素的含量。
(五)根瘤数量、重量测定
1、实验方法
根瘤鲜重及数目测定:将收获的大豆植株根系上的根瘤全部剥离后,用纸巾吸取表面水分后,过2mm筛子区分大小根瘤,分别称重及计数。
2、实验结果
实验结果如图18所示,可见,接种慢生根瘤菌W052使得大豆所产生的根瘤基本为大于2mm的大根瘤,平均单株结瘤45个左右,质量0.6克左右,平均大根瘤单颗质量为0.0167。
(六)固氮酶活测定
1、实验方法
固氮酶活的测定采用乙炔还原法,具体过程如下所述:
S1.选取根瘤样品,将根瘤带周围小段根系剪下,洗净,称重。
S2.将根瘤置于8mL青霉素小瓶中,塞上胶塞,以封口膜封好,放入冰盒。
S3.从小瓶中抽出1mL空气,并注入1mL乙炔,封口膜封好,反应3小时,加入1mL0.5M的NaOH终止反应,使用气象色谱仪测定乙烯峰面积。
按下述公式计算固氮酶活:
Figure BDA0003721609250000101
2、实验结果
实验结果如图19所示,可见,慢生根瘤菌W052与大豆共生后形成的根瘤中固氮酶活大约在3mol/h/g。
(七)植株氮含量测定
1、实验方法
消煮:烘干样品,用磨样机磨碎,称取0.2g粉末,放入5mL消煮管中加水湿润后,再加入5mL浓硫酸,静置12h。将5mL消煮管放在消煮炉上180℃低温消煮0.5h,然后350℃消煮1h。分三次滴加少量过氧化氢至棕褐色的消煮液中,直至样品呈无色。静置样品,待冷却后加水定容至50mL。
氮含量测定:将样品稀释4倍,使用连续流动分析仪(SAN++,美国)测定氮磷含量。铵态氮显色剂为水杨酸钠和次氯酸钠,于660nm波长处测定其吸光值。比色信号在输入电脑后,用Flow Access软件计算结果。
2、实验结果
实验结果如图20所示,可见,回接慢生根瘤菌W052的植株地上部和根系的氮含量均显著高于对照组,说明回接慢生根瘤菌W052能促进植株氮吸收,提升植株氮含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种慢生根瘤菌W052及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1387
<212> DNA
<213> 慢生根瘤菌W052的16srDNA序列
<400> 1
ggctgaccta ccgtggccgg ctgccccctt tcggttagcg caccgtcttc aggtaaaacc 60
aactcccatg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgtggcgtg 120
ctgatccacg attactagcg attccaactt catgggctcg agttgcagag cccaatccga 180
actgagacgg ctttttgaga tttgcgaagg gtcgcccctt agcatcccat tgtcaccgcc 240
attgtagcac gtgtgtagcc cagcccgtaa gggccatgag gacttgacgt catccccacc 300
ttcctcgcgg cttatcaccg gcagtctcct tagagtgctc aactaaatgg tagcaactaa 360
ggacgggggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac 420
agccatgcag cacctgtctc cggtccagcc gaactgaaga actccgtctc tggagtccgc 480
gaccgggatg tcaagggctg gtaaggttct gcgcgttgcg tcgaattaaa ccacatgctc 540
caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttta atcttgcgac cgtactcccc 600
aggcggaatg cttaaagcgt tagctgcgcc actagtgagt aaacccacta acggctggca 660
ttcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg 720
tgcctcagcg tcagtatcgg gccagtgagc cgccttcgcc actggtgttc ttgcgaatat 780
ctacgaattt cacctctaca ctcgcagttc cactcacctc tcccgaactc aagatcttca 840
gtatcaaagg cagttctgga gttgagctcc aggatttcac ccctgactta aagacccgcc 900
tacgcaccct ttacgcccag tgattccgag caacgctagc ccccttcgta ttaccgcggc 960
tgctggcacg aagttagccg gggcttattc ttgcggtacc gtcattatct tcccgcacaa 1020
aagagcttta caaccctagg gccttcatca ctcacgcggc atggctggat caggcttgcg 1080
cccattgtcc aatattcccc actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt gtctcagtcc 1140
caatgtggct gatcatcctc tcagaccagc tactgatcgt cgccttggtg agccatcacc 1200
tcaccaacta gctaatcaga cgcgggccgc tctttgggcg ataaatcttt ccccgtcagc 1260
ggctatccgc taataggcgc agtttccctc agatgttccg acccaaaagc tacgttgccc 1320
cgagttacca cccgtgagcc gatgccatat caatacgacc gccagactct cacgagagca 1380
gacgtcg 1387

Claims (10)

1.一种慢生根瘤菌W052(Bradyrhizobium sp.W052),其特征在于,于2022年06月01日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,其保藏编号GDMCC No:62201。
2.权利要求1所述的慢生根瘤菌W052在促进植物生长或制备能够促进植物生长的产品中的应用。
3.权利要求1所述的慢生根瘤菌W052在促进植物固氮或制备能够促进植物固氮的产品中的应用。
4.权利要求1所述的慢生根瘤菌W052在促进植物叶片光合作用或制备能够促进植物叶片光合作用的产品中的应用。
5.根据权利要求2-4任一所述的应用,其特征在于,所述植物为大豆。
6.根据权利要求2-4任一所述的应用,其特征在于,所述产品为菌剂或肥料。
7.一种促进植物生长的产品,其特征在于,含有权利要求1所述的慢生根瘤菌W052,和/或其菌悬液,和/或其发酵产物。
8.根据权利要求7所述产品,其特征在于,所述产品为肥料。
9.根据权利要求7所述产品,其特征在于,所述植物为大豆。
10.根据权利要求7所述产品,其特征在于,所述产品为菌剂。
CN202210752929.4A 2022-06-29 2022-06-29 一种慢生根瘤菌w052及其应用 Active CN115197879B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210752929.4A CN115197879B (zh) 2022-06-29 2022-06-29 一种慢生根瘤菌w052及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210752929.4A CN115197879B (zh) 2022-06-29 2022-06-29 一种慢生根瘤菌w052及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115197879A true CN115197879A (zh) 2022-10-18
CN115197879B CN115197879B (zh) 2023-08-22

Family

ID=83578393

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210752929.4A Active CN115197879B (zh) 2022-06-29 2022-06-29 一种慢生根瘤菌w052及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115197879B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116376755A (zh) * 2023-03-08 2023-07-04 华南农业大学 一株玛瑙斯慢生根瘤菌hp25菌株及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103627662A (zh) * 2013-12-03 2014-03-12 领先生物农业股份有限公司 一种花生慢生根瘤菌及其用途
CN103952343A (zh) * 2014-04-16 2014-07-30 四川农业大学 一株大豆慢生根瘤菌SCAUs36及其应用
CN110468073A (zh) * 2019-08-20 2019-11-19 中国农业大学 一株适合东北地区的抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用
WO2020163251A1 (en) * 2019-02-05 2020-08-13 Pivot Bio, Inc. Improved consistency of crop yield through biological nitrogen fixation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103627662A (zh) * 2013-12-03 2014-03-12 领先生物农业股份有限公司 一种花生慢生根瘤菌及其用途
CN103952343A (zh) * 2014-04-16 2014-07-30 四川农业大学 一株大豆慢生根瘤菌SCAUs36及其应用
WO2020163251A1 (en) * 2019-02-05 2020-08-13 Pivot Bio, Inc. Improved consistency of crop yield through biological nitrogen fixation
CN110468073A (zh) * 2019-08-20 2019-11-19 中国农业大学 一株适合东北地区的抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116376755A (zh) * 2023-03-08 2023-07-04 华南农业大学 一株玛瑙斯慢生根瘤菌hp25菌株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115197879B (zh) 2023-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112266881B (zh) 一株解淀粉芽胞杆菌及其在防治苹果重茬障碍中的应用
CN106011005B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌t600及其菌剂制备方法和应用
CN113755382B (zh) 一株阿氏芽孢杆菌ndfy-1及其应用
CN113215037B (zh) 一株高效固氮慢生根瘤菌菌株及其应用
CN110591957B (zh) 一株耐盐苜蓿根瘤菌及其应用
CN114875016B (zh) 一种适合荧光假单胞菌的制剂化载体及其菌剂
CN111304126B (zh) 一种自生固氮菌株及其用途
CN116144529B (zh) 一株水稻科萨克氏菌oor3-1菌株及其应用
CN113980846A (zh) 一种拮抗尖孢镰刀菌的高效抗逆贝莱斯芽孢杆菌
CN114908025A (zh) 一株胶质类芽孢杆菌hb-02菌株及其促作物生长的应用
CN110396485B (zh) 产生生长素的类短短芽孢杆菌及其应用
CN115197879B (zh) 一种慢生根瘤菌w052及其应用
CN115029278A (zh) 一株巨大芽孢杆菌及其促作物生长的应用
CN117264838B (zh) 一种对植物铅胁迫具有促生功能的假单胞菌及其应用
CN117106614B (zh) 一株根际细菌青岛假单胞菌yim b08402和其微生物菌剂及应用
CN116751701B (zh) 一株解磷菌及其应用
CN103773709A (zh) 一种具有高效解磷作用的枯草芽孢杆菌及其应用
CN114958683B (zh) 一株芽孢杆菌及其应用
CN114561324B (zh) 一株番茄青枯病拮抗菌株及其在防治番茄青枯病方面的应用
CN113151076B (zh) 一种伯克霍尔德菌及其应用
CN104805018A (zh) 一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯的壤霉菌(Agromyces sp.)MT-E
CN114350559A (zh) 一株耐盐促生的辽宁慢生根瘤菌ry6菌株及其应用
CN117645954B (zh) 一株胶冻样类芽孢杆菌mssw03及其应用
CN116676227B (zh) 白色伯克霍尔德氏菌、菌剂及其应用以及促进植物生长的方法
CN117089491A (zh) 一株双鱼假单胞菌csm-129及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant