CN115197288A - 一种山茱萸中环烯醚萜苷化合物a的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,特别是一种山茱萸中环烯醚萜苷化合物neocornuside A的制备方法及其应用。
背景技术
糖尿病(DM)是胰岛素分泌不足导致的终身性内分泌代谢性疾病,主要特征为血糖升高,典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现,即“三多一少”症状。作为最常见的慢性病之一,糖尿病已经成为严重威胁国家经济社会发展的重大公共卫生问题,糖尿病的发生率较高,且发病人群多为中老年人,随着病程的延长可能出现糖尿病肾病、神经周围病变、视网膜病变等严重并发症,威胁患者生命安全。因此,如何预防和治疗糖尿病,成为非常严峻的医学问题。
山茱萸传统上以干燥成熟果肉入药,是我国临床常用中药材。味酸,性微温,具有补益肝肾、收涩固脱之功效,用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等症。化学成分研究表明山茱萸中含环烯醚萜苷类、黄酮类、木脂素类和鞣质类等成分。《长沙药解》载:“男子消渴,小便反多,以其敛精液而止疏泄也。水主藏,木主泄,消渴之证,木能疏泄而水不能蛰藏,精尿俱下,阳根失敛。山茱萸酸涩敛固,助壬癸蛰藏之令,收敛摄精液,以秘阳根”,结合目前中医对糖尿病公认的3种证候类型:阴虚热盛、气阴两虚、阴阳两虚,任何一证型都有“阴虚”的证候,从中我们可以发现山茱萸在糖尿病及并发症方面研究及应用十分的深入,但至今未见有从山茱萸中提取环烯醚萜苷类化合物用于制备抗糖尿病药物的公开报道。
发明内容
针对上述情况,为解决现有技术之缺陷,本发明之目的就是提供一种山茱萸中环烯醚萜苷化合物neocornuside A的制备方法及其应用,可有效解决糖尿病的用药问题。
本发明解决的技术方案是,该环烯醚萜苷化合物neocornuside A化学结构如下所示:
本发明所述的新型环烯醚萜苷化合物neocornuside A制备方法包括以下步骤:
1)将山茱萸(Cornus officinalis)的干燥成熟果肉,以10~15倍量水加热回流提取2~4次,合并提取液,过滤,减压浓缩,得总浸膏;
2)将步骤1)得到的总浸膏用水混悬,然后经大孔吸附树脂层析,依次用水和70%~95%乙醇洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,得到含有环烯醚萜苷单聚体的浓缩液;浓缩液使用适量水分散后,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位;
3)将步骤2)中正丁醇部位经大孔吸附树脂层析,依次以水、20%乙醇、40%乙醇和95%乙醇洗脱,得到流分Fr.1~4;
4)将步骤3)中流分Fr.2经MCI gel柱层析,依次以水、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇和100%甲醇洗脱,得到流分Fr.2.1~5;
5)将步骤4)中流分Fr.2.1经MCI gel柱层析,依次以H2O、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和100%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.1~5;
6)将步骤5)中流分Fr.2.1.4经Toyopearl HW-40凝胶柱层析,依次以40%甲醇、60%甲醇和80%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.1~9;
7)将步骤6)中流分Fr.2.1.4.2经MCI gel柱层析,依次以20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇和100%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.2.1~7;
8)将步骤7)中Fr.2.1.4.2.2经硅胶柱层析,用CH2Cl2:MeOH=20:1和15:1梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.2.2.1~3;
9)将步骤8)中流分Fr.2.1.4.2.2.2流分用C18 ODS RP-HPLC进行分离,得到新型环烯醚萜苷neocornuside A(tR=49.3min)。
所述的步骤9)中C18 ODS RP-HPLC制备的条件为5μm,250×10mm,14%乙腈,3mL/min。
本发明所述的环烯醚萜苷化合物neocornuside A在制备治疗糖尿病药物中的应用。
本发明所述的新型环烯醚萜苷化合物neocornuside A,可对胰岛素诱导的HepG2细胞损伤具有一定的改善作用,可作为治疗糖尿病的药物,其药物组成可以是单体或者其衍生物,是新型环烯醚萜苷neocornuside A及其用途上的创新。
附图说明
图1为本发明新型环烯醚萜苷neocornuside A的1H-NMR图谱。
图2为本发明新型环烯醚萜苷neocornuside A的13C-NMR图谱。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施时,环烯醚萜苷neocornuside A的制备方法包括以下步骤:
1)将山茱萸(Cornus officinalis)的干燥成熟果肉,以10倍量水加热回流提取4次,合并提取液,过滤,减压浓缩,得总浸膏;
2)将步骤1)得到的总浸膏用水混悬,然后经大孔吸附树脂层析,依次用水和95%乙醇洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,得到95%乙醇部位和水部位。95%乙醇部位用适量水分散后,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。
3)将步骤2)中正丁醇部位经大孔吸附树脂层析,依次以水、20%乙醇、40%乙醇和95%乙醇洗脱,得到流分Fr.1~4;
4)将步骤3)中流分Fr.2经MCI gel柱层析,依次以水、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇和100%甲醇洗脱,得到流分Fr.2.1~5;
5)将步骤4)中流分Fr.2.1经MCI gel柱层析,依次以H2O、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和100%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.1~5;
6)将步骤5)中流分Fr.2.1.4经Toyopearl HW-40凝胶柱层析,依次以40%甲醇、60%甲醇和80%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.1~9;
7)将步骤6)中流分Fr.2.1.4.2经MCI gel柱层析,依次以20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇和100%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.2.1~7;
8)将步骤7)中Fr.2.1.4.2.2经硅胶柱层析,用CH2Cl2:MeOH=20:1和15:1梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.2.2.1~3;
9)将步骤8)中流分Fr.2.1.4.2.2.2流分用C18 ODS RP-HPLC进行分离,得到新型环烯醚萜苷neocornuside A(tR=49.3min)。
实施例2
本发明在具体实施时,环烯醚萜苷neocornuside A的制备方法包括以下步骤:
1)将山茱萸(Cornus officinalis)的干燥成熟果肉,以12倍量水加热回流提取4次,合并提取液,过滤,减压浓缩,得总浸膏;
2)将步骤1)得到的总浸膏用水混悬,然后经大孔吸附树脂层析,依次用水和80%乙醇洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,得到80%乙醇部位和水部位。80%乙醇部位用适量水分散后,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。
3)将步骤2)中正丁醇部位经大孔吸附树脂层析,依次以水、20%乙醇、40%乙醇和95%乙醇洗脱,得到流分Fr.1~4;
4)将步骤3)中流分Fr.2经MCI gel柱层析,依次以水、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇和100%甲醇洗脱,得到流分Fr.2.1~5;
5)将步骤4)中流分Fr.2.1经MCI gel柱层析,依次以H2O、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和100%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.1~5;
6)将步骤5)中流分Fr.2.1.4经Toyopearl HW-40凝胶柱层析,依次以40%甲醇、60%甲醇和80%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.1~9;
7)将步骤6)中流分Fr.2.1.4.2经MCI gel柱层析,依次以20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇和100%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.2.1~7;
8)将步骤7)中Fr.2.1.4.2.2经硅胶柱层析,用CH2Cl2:MeOH=20:1和15:1梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.2.2.1~3;
9)将步骤8)中流分Fr.2.1.4.2.2.2流分用C18 ODS RP-HPLC进行分离,得到新型环烯醚萜苷neocornuside A(tR=49.3min)。
实施例3
本发明在具体实施时,环烯醚萜苷neocornuside A的制备方法包括以下步骤:
1)将山茱萸(Cornus officinalis)的干燥成熟果肉,以15倍量水加热回流提取2次,合并提取液,过滤,减压浓缩,得总浸膏;
2)将步骤1)得到的总浸膏用水混悬,然后经大孔吸附树脂层析,依次用水和70%乙醇洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,得到70%乙醇部位和水部位。70%乙醇部位用适量水分散后,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。
3)将步骤2)中正丁醇部位经大孔吸附树脂层析,依次以水、20%乙醇、40%乙醇和95%乙醇洗脱,得到流分Fr.1~4;
4)将步骤3)中流分Fr.2经MCI gel柱层析,依次以水、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇和100%甲醇洗脱,得到流分Fr.2.1~5;
5)将步骤4)中流分Fr.2.1经MCI gel柱层析,依次以H2O、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和100%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.1~5;
6)将步骤5)中流分Fr.2.1.4经Toyopearl HW-40凝胶柱层析,依次以40%甲醇、60%甲醇和80%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.1~9;
7)将步骤6)中流分Fr.2.1.4.2经MCI gel柱层析,依次以20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇和100%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.2.1~7;
8)将步骤7)中Fr.2.1.4.2.2经硅胶柱层析,用CH2Cl2:MeOH=20:1和15:1梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.2.2.1~3;
9)将步骤8)中流分Fr.2.1.4.2.2.2流分用C18 ODS RP-HPLC进行分离,得到新型环烯醚萜苷neocornuside A(tR=49.3min)。
本发明从山茱萸中分离并鉴定1个新的环烯醚萜苷,即neocornuside A,实验结果显示环烯醚萜苷化合物neocornuside A可显著提高胰岛素诱导损伤的HepG2细胞的相对葡萄糖消耗量,具有较好的抗糖尿病效果,相关试验资料如下:
一、本发明化合物的结构鉴定:
neocornuside A的1H-NMR及13C-NMR数据见表1。
表1.neocornuside A的1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)和13C-NMR(125MHZ,DMSO-d6)数据
二、本发明新型环烯醚萜苷neocornuside A的抗糖尿病作用
1)单体化合物的处理
在超净台内将neocornuside A使用DMSO溶液配制成浓度为10mM的母液,过滤除菌。所有配制好的药物均放于-20℃冰箱。
2)细胞培养
将HepG2细胞使用含有10%FBS的高糖培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中培养至对数生长期。待细胞生长至对数生长期,弃去原培养基,用PBS洗2次,加入500μL胰酶,显微镜下观察到细胞间隙变大,细胞变圆时,再加入1mL完全培养基终止消化。将细胞悬液收集于1.5mL EP管中,1000rpm离心5min,弃去上清,用DMEM培养基重悬细胞,按照1:2或1:3比例进行传代。
3)胰岛素诱导HepG2细胞损伤模型的建立
取对数生长期细胞,以1×105/孔的密度将100μL细胞悬液接种于96孔板中,每组设置4个复孔;培养24h后,弃去培养基,加入终浓度为20μM的胰岛素溶液;对照组加入等量的无血清培养基,建立胰岛素诱导HepG2细胞损伤模型。
4)分组和给药
对照组(Con)、模型组(M,胰岛素,20μM)、neocornuside A(10μM)+胰岛素组、阳性药组(罗格列酮,10μM)+胰岛素组。待HepG2细胞贴壁后,将培养基更换为无血清的培养基,饥饿24h后,加入含胰岛素的培养基(20μM),培养24h后,弃去原培养基,PBS洗2次,对照组与模型组加入无血清培养基,给药组加入10μM含neocornuside A的培养基。
5)CCK-8法测定细胞活力
培养24h后,每孔更换100μL无血清培养基,并加入10μL CCK-8,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育1h,在450nm处测量吸光度值(OD),重复三次,计算细胞活力。
6)葡萄糖含量检测试剂盒测定葡萄糖消耗量
培养24h后,收集培养基上清液,使用葡萄糖含量检测试剂盒测定葡萄糖含量。未接种细胞培养液中葡萄糖含量减去各组细胞上清液中葡萄糖含量即可得到葡萄糖消耗量(GC)。相对葡萄糖消耗量(RGC)=GC/OD。
7)实验结果
与对照组相比,模型组中相对葡萄糖消耗量显著降低(P<0.01);与模型组相比,10μM的neocornuside A可显著提高相对葡萄糖消耗量(P<0.05或P<0.01)。实验结果如表2所示。
表2.neocornuside A对胰岛素诱导HepG2细胞相对葡萄糖消耗量的影响
注:与对照组相比:#P<0.05,##P<0.01,与模型组相比:*P<0.05,**P<0.01
本发明采用山茱萸科山茱萸属植物山茱萸的果肉,经过溶剂提取,大孔吸附树脂柱层析、MCI gel、Toyopearl HW-40柱层析、硅胶柱层析、制备高效液相分离等步骤获得一种新型环烯醚萜苷neocornuside A,药理活性结果显示neocornuside A可显著提高胰岛素诱导损伤的HepG2细胞的相对葡萄糖消耗量,可作为治疗糖尿病的药物使用,是新型环烯醚萜苷neocornuside A及其用途上的创新,具有良好的应用和推广价值。
Claims (4)
2.权利要求1所述的山茱萸中环烯醚萜苷化合物A在制备治疗糖尿病药物中的应用。
3.权利要求1所述的山茱萸中环烯醚萜苷化合物A的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将山茱萸的干燥成熟果肉,以10~15倍量水加热回流提取2~4次,合并提取液,过滤,减压浓缩,得总浸膏;
2)将步骤1)得到的总浸膏用水混悬,然后经大孔吸附树脂层析,依次用水和70%~95%乙醇洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,得到含有环烯醚萜苷单聚体的浓缩液;浓缩液使用适量水分散后,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位;
3)将步骤2)中正丁醇部位经大孔吸附树脂层析,依次以水、20%乙醇、40%乙醇和95%乙醇洗脱,得到流分Fr.1~4;
4)将步骤3)中流分Fr.2经MCI gel柱层析,依次以水、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇和100%甲醇洗脱,得到流分Fr.2.1~5;
5)将步骤4)中流分Fr.2.1经MCI gel柱层析,依次以H2O、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和100%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.1~5;
6)将步骤5)中流分Fr.2.1.4经Toyopearl HW-40凝胶柱层析,依次以40%甲醇、60%甲醇和80%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.1~9;
7)将步骤6)中流分Fr.2.1.4.2经MCI gel柱层析,依次以20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇和100%甲醇梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.2.1~7;
8)将步骤7)中Fr.2.1.4.2.2经硅胶柱层析,用CH2Cl2:MeOH=20:1和15:1梯度洗脱,得到流分Fr.2.1.4.2.2.1~3;
9)将步骤8)中流分Fr.2.1.4.2.2.2流分用C18 ODS RP-HPLC进行分离,得到新型环烯醚萜苷neocornuside A。
4.根据权利要求3所述的山茱萸中环烯醚萜苷化合物A的制备方法,其特征在于,所述的步骤9)中C18 ODS RP-HPLC制备的条件为5μm,250×10mm,14%乙腈,3mL/min。
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