CN115184339B - 一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的方法，它涉及病毒的检测方法。它是要解决现有的小型拉曼光谱仪用于病毒检测时灵敏度低的技术问题。本方法：一、制备纳米银溶胶：二、用碘化钾和氯化钾修饰；三、将待测试样与修饰后的纳米银胶混合得待测溶液A；四、调节氯化钙溶液的pH=4与待测溶液A混合得待测溶液B；五、将待测溶液B滴入到载片的镀银凹槽中，用便携式拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱检测，通过病毒特征峰的比对，判断待测试样中是否含有病毒，完成病毒的检测。本方法可检测病毒浓度低至1ppb的试样，可用于病毒检测领域。

Description

一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的方法
技术领域
本发明涉及病毒的检测方法，具体涉及采用便携式拉曼光谱仪测定生物大分子，如新冠病毒、H5N1病毒的方法。
背景技术
表面增强拉曼散射(SERS)是一种操作简单、无损、快速、成本低、灵敏度极高的检测技术，已经应用于生命科学领域，用其取代操作复杂、检测周期长、成本高、灵敏度低的聚合酶链反应(PCR)及其衍生技术检测新冠病毒势在必行。
常用的拉曼光谱仪多为价格昂贵，体型庞大笨重的大型拉曼光谱仪，使用成本也比较高，很难在大规模新型冠状病毒筛查时用于采集现场、即时检测。因此，小型拉曼光谱仪便携的优势在此展现出来，但小型拉曼光谱仪灵敏度相对较低，不能满足检验要求。
发明内容
本发明是要解决现有的小型拉曼光谱仪用于新型冠状病毒检测时灵敏度低的技术问题，而提供一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的方法。利用纳米银溶胶基底，结合便携式拉曼光谱仪和表面增强技术对新型冠状病毒进行快速检测，并进一步提供试剂盒。本方法操作简单、成本低、灵敏度和准确率高、耗时短，可用于大规模现场筛查新冠病毒。
本发明的基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的方法，按以下步骤进行：
一、制备纳米银溶胶：
在搅拌条件下，将500~1000目的锌粉加入到柠檬酸钠水溶液中，再滴加稀硝酸，使溶液的pH值为4~4.5；然后加热使溶液的温度升高至28℃~35℃，在搅拌条件下滴加硝酸银水溶液；硝酸银水溶液滴加完毕后，再滴加硼氢化钠水溶液；滴加硼氢化钠水溶液过程中，当溶液颜色由浅黄变为深黄色，再变为灰绿色时，停止滴加硼氢化钠水溶液；继续搅拌5~10分钟，得到悬浊液；将悬浊液离心处理，弃去上清液，得到纳米银溶胶；纳米银溶胶放在4 ~6℃的低温条件下密封保存；
二、用碘化钾和氯化钾修饰：
将碘化钾(KI)和氯化钾(KCl)加入水中，配制成混合溶液；其中混合溶液中碘化钾的浓度为0.01~0.05mol/L，氯化钾的浓度为0.01~0.05mol/L；将步骤一得到的纳米银溶胶加入到混合溶液中，混合均匀，得到修饰后的纳米银溶胶；其中纳米银溶胶与混合溶液的体积比为1.0:0.5~2.0；
三、将待测试样与修饰后的纳米银溶胶按体积比为0.1~1.0: 1.0 混合均匀，得到待测溶液A ；
四、用盐酸将浓度为0.01~0.05 mol/L 的氯化钙溶液的pH值调节至4，得到酸性氯化钙溶液；再按待测溶液A与酸性氯化钙溶液的体积比为1.0:10~15的比例，将待测溶液A与酸性氯化钙溶液混合均匀，得到待测溶液B；
五、将待测溶液B滴入到载片的镀银的凹槽中，用便携式拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱检测，通过病毒特征峰的比对，判断待测试样中是否含有病毒，完成病毒的检测。
更进一步地，步骤一中，锌粉的物质的量为硝酸银物质的量的40%~50%；
更进一步地，步骤一中，锌粉与硼氢化钠的物质的量之和是硝酸银的物质的量的102%~110%。
更进一步地，步骤一中，硝酸银水溶液的浓度为0.001~0.005mol/L；
更进一步地，步骤一中，硼氢化钠水溶液的浓度为0.01~0.1mol/L；
更进一步地，步骤一中，柠檬酸钠水溶液的浓度为0.001~0.005mol/L；
更进一步地，步骤一中纳米银溶胶中，纳米银的浓度为0.2 ~1.0mol/L；纳米银浓度需要根据被检测物质的种类进行调整，纳米银的浓度为0.4mol/L的条件下，病毒表现出最佳SERS信号增强效果。
更进一步地，步骤五中所述的病毒为新型冠状病毒或H5N1病毒。
更进一步地，步骤五中所述的表面增强拉曼光谱检测的测试条件为：激光波长为633nm，功率为0.8~1mW，积分时间为10~12s。
更进一步地，步骤五中所述的载片的制备方法为：在载片表面用电钻钻出直径为1.5~2.5mm、深度为0.8~1.5mm的球面凹槽；再将纳米银溶胶滴在凹槽中或者将纳米银溶胶涂刷在凹槽表面，然后干燥；得到带有镀银凹槽的载片。
更进一步地，载片为厚度为铝片、铜片或塑料片；载片的厚度为2.0mm。
本发明以纳米锌粉、硼氢化钠为复合还原剂，以柠檬酸钠作为还原保护剂来防止纳米银溶胶中的纳米银沉淀；纳米银溶胶再用碘化钾和氯化钾修饰后，与待检测样品混匀，然后加入酸化的氯化钙来防止纳米银团聚，再利用金属凹槽的形状的载片对样品所散射的激光进行聚焦，通过以上手段，达到增强便携式拉曼光谱检测的病毒生物大分子信号的目的。可检测病毒浓度低至1ppb的试样，灵敏度高。
本发明的方法可用于病毒检测领域。
附图说明
图1是实施例1中经步骤一制备的纳米银溶胶的透射电镜照片；
图2是实施例1中经步骤五在铝板表面制备的不镀银凹槽和带有镀银的凹槽的照片；
图3是实施例1和对比实施例1中测试的表面增强拉曼光谱图；
图4是对比实施例3中得到的对比纳米银溶胶的透射电镜照片；
图5是对比实施例3中，利用对比纳米银溶胶测试得到的表面增强拉曼光谱图；
图6是实施例2中测试的表面增强拉曼光谱图；
图7是实施例3中测试的表面增强拉曼光谱图；
图8是实施例4中测试的表面增强拉曼光谱图；
图9是实施例5中测试的表面增强拉曼光谱图。
具体实施方式
用下面的实施例验证本发明的有益效果。
实施例1：本实施例的基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的方法，按以下步骤进行：
一、制备纳米银溶胶：
取200mL浓度为0.001mol/L柠檬酸钠水溶液置放于烧杯中，搅拌条件下加入0.026g (0.40mmol)细度为1000目的锌粉，再滴加稀硝酸，使溶液的pH值达到4；然后加热使溶液的温度升高至30℃±1℃，在搅拌条件下滴加200mL浓度为0.001mol/L的硝酸银水溶液；硝酸银水溶液滴加完毕后，再滴加浓度为0.01mol/L的硼氢化钠水溶液；滴加硼氢化钠水溶液过程中，当溶液颜色由浅黄快速变为深黄色，再变为灰绿色时，停止滴加硼氢化钠水溶液，此时锌粉与硼氢化钠的物质的量之和略大于硝酸银的物质的量，即硝酸银还原完全；继续搅拌5~10分钟，得到悬浊液；将悬浊液离心处理，弃去上清液，得到1mL纳米银溶胶；纳米银溶胶放在5℃的低温条件下密封保存；（取弃去的上清液1mL，滴加NaCl溶液进行测试，发现无AgCl沉淀生成，也证明了硝酸银还原完全）；本步骤中得到的纳米银溶胶的透射电镜照片如图1所示，从图1可以看出，溶胶中纳米粒子的形状类似球形，颗粒直径为40~60纳米；
二、用碘化钾和氯化钾修饰：
将碘化钾(KI)和氯化钾(KCl)加入水中，配制成混合溶液；其中混合溶液中碘化钾的浓度为0.01mol/L，氯化钾的浓度为0.01mol/L；将步骤一得到的纳米银溶胶加入到混合溶液中，混合均匀，得到修饰后的纳米银溶胶；其中纳米银溶胶与混合溶液的体积比为1.0:1.0；利用碘化钾(KI)和氯化钾(KCl)进行增强；
三、以浓度为100ppb的新型冠状病毒溶液作为待测试样，将待测试样与修饰后的纳米银溶胶按体积比为0.5: 1.0 混合均匀，得到待测溶液A ；
四、用盐酸将浓度为0.01 mol/L氯化钙溶液的pH值调节至4，得到酸性氯化钙溶液；再按待测溶液A与酸性氯化钙溶液的体积比为1.0:10的比例，将待测溶液A与酸性氯化钙溶液混合均匀，得到待测溶液B；
五、制备带有镀银凹槽的铝载片，制备方法如下：在厚度为2mm的铝板表面，用电钻钻出直径为1.5mm、深度为1.5mm的半球面凹坑；再将纳米银溶胶滴在凹坑中，然后干燥，得到带有镀银凹槽的铝载片；其中带有镀银凹槽的铝载片和带有不镀银凹槽的铝载片的照片如图2所示；其中左侧为带有不镀银凹槽的铝载片，右侧为带有镀银凹槽的铝载片；
将待测溶液B滴入到载片的镀银的凹槽中，用型号为Portman532的便携式拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱检测，测试条件为：激光波长为633nm，功率为0.8mW，积分时间为10s，得到表面增强拉曼光谱图如图3中的曲线a所示，空白对照（即未加待测试样的）的谱图如图3中的曲线b所示，从图3的曲线a可以看出，表面增强拉曼光谱图在拉曼位移为1624cm-1 处存在新型冠状病毒的特征峰，特征峰相对峰高为5410，峰形尖锐，证明该方法可以灵敏地检测出待测试样中含有新型冠状病毒，完成病毒的检测。而空白对照在拉曼位移为1624 cm-1 处没有特征峰。
对比实施例1：将实施例1中的带有镀银凹槽的铝载片依次替换为凹槽不镀银铝载片、无凹槽的铝平板、普通玻璃板，按实施例1的方法进行表面增强拉曼光谱检测，得到的谱图依次如图3的曲线c、d、e所示。通过与曲线a相比，可以看出，利用普通玻璃板没有检出新型冠状病毒的特征峰，在无凹槽的铝平板上测出的谱图在拉曼位移为1624 cm-1 处存在新型冠状病毒的特征峰，但特征峰相对峰高仅为466，强度仅为曲线a对应峰的强度的8.6%，在凹槽不镀银铝载片上测出的谱图在拉曼位移为1624 cm-1 处存在新型冠状病毒的特征峰，但特征峰相对峰高为1656，比在无凹槽的铝平板上检测的效果好，但其强度也仅为曲线a对应峰的强度的30.6%。从对比可以看出，载片的凹槽的结构设计，大大提高了检测的灵敏度，而凹槽中的镀银处理进一步提高了检测的灵敏度，而实施例1的方案用便携式拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱检测，通过病毒特征峰的比对，就能检测出样品中是否含有病毒，是一种低成本、高效、灵敏的方法。
对比实施例2：本实施例与实施例1不同的是步骤四中不用盐酸调节pH值，即不酸化，其它与实施例1相同。此方案中，待测溶液B中纳米银粒子发生了团聚，以致于表面增强拉曼光谱检测无法进行。
对比实施例3：本实施例与实施例1不同的是步骤一中纳米银溶胶的方法用下面的操作替代：
将200mL浓度为0.001mol/L的硝酸银水溶液加入到烧杯中，加热至30℃±1℃，在搅拌条件下加入200mL浓度为0.001mol/L的柠檬酸钠水溶液，再滴加浓度为0.01mol/L的硼氢化钠水溶液；滴加过程中溶液会由无色变为黄色、瞬间颜色变深，搅拌均匀后溶液在烧杯中呈灰绿色、在试管中先呈亮黄色。当烧杯中的溶液变为灰绿色时停止滴加硼氢化钠水溶液，此时溶液中硝酸银与硼氢化钠的摩尔数相等；再继续缓慢搅拌10分钟，得到混合溶液；将混合溶液离心处理，弃去上清液（取1ml上清液滴加NaCl无沉淀），得到作为对比的纳米银溶胶，将对比纳米银溶胶放在5℃的低温条件下密封保存。
其它步骤与参数与实施例1相同。
本对比实施例中得到的对比纳米银溶胶的透射电镜照片如图4所示。从图4可以看出，纳米银粒子的粒径为20~30纳米，比实施例1得到的粒子的粒径稍小。利用此对比纳米银溶胶测试得到的表面增强拉曼光谱图如图5中的曲线a所示，图5中的曲线b为空白对照，c为实施例1的表面增强拉曼光谱，d为实施例1的空白对照。通过与曲线a与c相比较，可知，本实施例制备的对比纳米银溶胶中银粒子的表面增强拉曼光谱响应比实施例1的纳米银粒子的响应差。这是由于实施例1的纳米银溶胶是以纳米锌粉、硼氢化钠和柠檬酸钠作为复合还原剂制备的，锌粉与银离子反应Zn+2Ag+ = Zn2++2Ag 的平衡常数K=1052.9, 热力学驱动力非常大。但从动力学角度观察，其反应速率并不是很快，这是因为二相反应只在其界面上发生，限制了反应速率。向体系中再加入NaBH4使情况又变得稍微复杂。本实施例1中首先是Zn+2Ag+ = Zn2++2Ag，反应发生后，单质锌会减少，同时生成的部分单质纳米银会包覆在未反应的锌的表面，形成银包锌，又减少了可发生反应的界面，减缓了Ag+与Zn进一步反应的速率。另一方面，在Zn+2Ag+ = Zn2++2Ag反应1~2分钟后，滴加硼氢化钠(NaBH4)，使Ag+迅速被还原完全，产生的部分纳米银也会包覆在未反应的锌微粒表面，形成银包锌，因此实施例1的纳米银溶胶是纳米银和银包锌粒子的混合体系，而对比实施例3的纳米银溶胶中仅含纯纳米银粒子，纳米银溶胶中的成分不同，造成拉曼光谱响应的区别。
实施例2：本实施例的基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的方法，按以下步骤进行：
一、制备纳米银溶胶：本步骤与实施例1相同；
二、用碘化钾和氯化钾修饰：本步骤与实施例1相同；
三、以浓度为1ppb的新型冠状病毒溶液作为待测试样，将待测试样与修饰后的纳米银溶胶按体积比为0.5: 1.0 混合均匀，得到待测溶液A ；
四、用盐酸将浓度为0.01 mol/L氯化钙溶液的pH值调节至4，得到酸性氯化钙溶液；再按待测溶液A与酸性氯化钙溶液的体积比为1.0:10的比例，将待测溶液A与酸性氯化钙溶液混合均匀，得到待测溶液B；
五、先制备带有镀银凹槽的载片，其制备方法与实施例1相同；将待测溶液B滴入到载片的镀银的凹槽中，用便携式拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱检测，测试条件为：激光波长为633nm，功率为0.8mW，积分时间为10s，得到表面增强拉曼光谱图如图6中的曲线a所示，空白对照（即未加待测试样的）的谱图如图6中的曲线b所示，实施例1的谱图如曲线c所示，从图6的曲线a可以看出，表面增强拉曼光谱图在拉曼位移为1624 cm-1 处存在新型冠状病毒的特征峰，特征峰相对峰高为1043，峰形尖锐，证明该方法对于浓度为低至1ppb的新型冠状病毒溶液依然可以灵敏地检测出待测试样中含有新型冠状病毒，灵敏度高。
实施例3：本实施例的基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的方法，按以下步骤进行：
一、制备纳米银溶胶：本步骤与实施例1的步骤一相同；
二、用碘化钾和氯化钾修饰：本步骤与实施例1的步骤二相同；
三、以浓度为100ppb的H5N1病毒溶液作为待测试样，将待测试样与修饰后的纳米银溶胶按体积比为0.5: 1.0 混合均匀，得到待测溶液A ；
四、用盐酸将浓度为0.01 mol/L氯化钙溶液的pH值调节至4，得到酸性氯化钙溶液；再按待测溶液A与酸性氯化钙溶液的体积比为1.0:10的比例，将待测溶液A与酸性氯化钙溶液混合均匀，得到待测溶液B；
五、制备带有镀银凹槽的铝载片和带有不镀银凹槽的铝载片，制备方法与实施例1的步骤五相同；并备好无凹槽的铝制平板、普通玻璃；分别用带有镀银凹槽的铝载片、带有不镀银凹槽的铝载片、无凹槽的铝制平板和普通玻璃作衬底进行下面的表面增强拉曼光谱检测；
将待测溶液B滴入到衬底中，用型号为Portman532的便携式拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱检测，测试条件为：激光波长为633nm，功率为0.8mW，积分时间为10s，得到表面增强拉曼光谱图如图7所示，其中用带有镀银凹槽的铝载片作衬底得到的谱线为a 曲线，用带有不镀银凹槽的铝载片作衬底得到的谱线为b 曲线，用无凹槽的铝制平板衬底得到的谱线为 c曲线，用普通玻璃作衬底得到的谱线为 d曲线，用带有镀银凹槽的铝载片作衬底的空白对照谱线为e 曲线。从图7的曲线a可以看出，表面增强拉曼光谱图在拉曼位移为1005.9 cm-1 处存在H5N1病毒的特征峰，特征峰相对峰高为2278.5，峰形尖锐，证明该方法可以灵敏地检测出待测试样中的H5N1病毒，完成病毒的检测。而空白对照在拉曼位移为1005.9 cm-1处没有特征峰。从曲线d可以看出，利用普通玻璃作衬底没有检出H5N1病毒，从曲线c可以看出，在无凹槽的铝制平板上测出的谱图在拉曼位移为1005.9cm-1 处存在H5N1病毒的特征峰，但特征峰相对峰高仅为332，强度仅为曲线a对应峰的强度的14.5%；从曲线b可以看出，用带有不镀银凹槽的铝载片作衬底测出的谱图在拉曼位移为1005.9cm-1处存在H5N1病毒的特征峰，但特征峰相对峰高为709.5，比在无凹槽的铝制平板上检测的效果好，但其强度也仅为曲线a对应峰的强度的31.1%。从对比可以看出，载片的凹槽的结构设计，大大提高了检测的灵敏度，而凹槽中的镀银处理进一步提高了检测的灵敏度，而实施例3的方案用便携式拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱检测，通过H5N1病毒病毒特征峰的比对，就能检测出样品中是否含有H5N1病毒病毒，本方法的成本低，高效且灵敏。
实施例4：本实施例与实施例3不同的是：将实施例3中的步骤三中的H5N1病毒溶液的浓度替换为1ppb，其他与实施例3相同，进行表面增强拉曼光谱检测，得到的光谱图如图8所示。图8中曲线b是用带有镀银凹槽的铝载片作衬底得到测试浓度为1ppb的H5N1病毒溶液的谱图，曲线a是用带有镀银凹槽的铝载片作衬底得到测试浓度为100ppb的H5N1病毒溶液的谱图，从曲线b可以看出对于浓度低至1ppb的H5N1病毒溶液也可以灵敏地检出。
实施例5：本实施例与实施例3不同的是：将实施例3中的步骤一中纳米银溶胶制备方法用对比实施例3中纳米银溶胶的制备方法替换，其他与实施例3相同，进行表面增强拉曼光谱检测，得到的光谱图如图9中的b所示。本实施例5中得到的纳米银溶胶的制备过程中没有加入锌粉，得到的纳米银溶胶体系中为纯纳米银粒子。从利用此纳米银溶胶测试得到的表面增强拉曼光谱图中可以看出，在拉曼位移为1005.9cm-1处存在H5N1病毒的特征峰，但特征峰相对峰高为985.9，相对于以纳米锌粉、硼氢化钠和柠檬酸钠作为复合还原剂制备的银胶，测试灵敏度稍差。

Claims (7)

1.一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括用碘化钾和氯化钾修饰的纳米银溶胶、酸性氯化钙溶液和带有镀银凹槽的载片；
其中用碘化钾和氯化钾修饰的纳米银溶胶的制备方法如下：
一、制备纳米银溶胶：在搅拌条件下，将500~1000目的锌粉加入到柠檬酸钠水溶液中，再滴加稀硝酸，使溶液的pH值为4~4.5；然后加热使溶液的温度升高至28℃~35℃，在搅拌条件下滴加硝酸银水溶液；硝酸银水溶液滴加完毕后，再滴加硼氢化钠水溶液；滴加硼氢化钠水溶液过程中，当溶液颜色由浅黄变为深黄色，再变为灰绿色时，停止滴加硼氢化钠水溶液；继续搅拌5~10分钟，得到悬浊液；将悬浊液离心处理，弃去上清液，得到纳米银溶胶；该纳米银溶胶是纳米银和银包锌粒子的混合体系；纳米银溶胶放在4 ~ 6℃的低温条件下密封保存；所述的锌粉的物质的量为硝酸银物质的量的40%~50%；
二、用碘化钾和氯化钾修饰：将碘化钾和氯化钾加入水中，配制成混合溶液；其中混合溶液中碘化钾的浓度为0.01~0.05mol/L，氯化钾的浓度为0.01~0.05mol/L；将步骤一得到的纳米银溶胶加入到混合溶液中，混合均匀，得到修饰后的纳米银溶胶；其中纳米银溶胶与混合溶液的体积比为1.0:0.5~2.0；
所述的酸性氯化钙溶液是用盐酸将浓度为0.01~0.05 mol/L 的氯化钙溶液的pH值调节至4后得到的；
所述的带有镀银凹槽的载片的制备方法为：在载片表面用电钻钻出直径为1.5~2.5mm、深度为0.8~1.5mm的球面凹槽；再将纳米银溶胶滴在凹槽中或者将纳米银溶胶涂刷在凹槽表面，然后干燥；得到带有镀银凹槽的载片。
2.根据权利要求1所述的一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的试剂盒，其特征在于，步骤一中，硝酸银水溶液的浓度为0.001~0.005mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的试剂盒，其特征在于，步骤一中，硼氢化钠水溶液的浓度为0.01~0.1mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的试剂盒，其特征在于，步骤一中，柠檬酸钠水溶液的浓度为0.001~0.005mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的试剂盒，其特征在于所述的病毒为新型冠状病毒或H5N1病毒。
6.根据权利要求1所述的一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的试剂盒，其特征在于便携式拉曼光谱仪参数为：激光波长为633nm，功率为0.8~1mW，积分时间为10~12s。
7.根据权利要求1所述的一种基于便携式拉曼光谱仪的快速检测病毒的试剂盒，其特征在于所述的载片为铝片、铜片或塑料片；载片的厚度为2.0mm。
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