CN115181672A - 一种培养溶磷藻类的生物炭液体培养基及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培养溶磷藻类的生物炭液体培养基及其应用方法，所述应用方法包括以下步骤：（1）配置培养基：按比例称取原料，并加无菌水混合得到液体培养基，所述培养基中包含生物炭；（2）灭菌：对步骤（1）所得的液体培养基进行高压蒸汽灭菌处理后移至无菌室，冷却到室温后，边搅拌边将培养基分装到培养瓶中；（3）接种：在无菌室内进行接种作业；（4）孵育：将接种后的培养基放入无菌恒温箱内，孵育后即可收获藻液。本发明通过特定培养基的配制，并且依次通过灭菌、接种、孵育和溶磷量检测，可以获得高产量和溶磷功能更强的溶磷藻类。本发明操作简单，成本低、溶磷藻类生长速度快、培养后溶磷效果好，产生良好收益。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种培养溶磷藻类的生物炭液体培养基及其应用方法。
背景技术
磷是植物生长和作物发育所需的主要必需营养素之一，然而，世界上磷的储量有限，正在逐渐耗尽。大多数农业土壤都含有大量无机和有机形式的磷，但植物的有效磷浓度通常非常低。莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是典型的溶磷藻类。
磷（P）是植物生长所必需的营养素，磷的缺乏可能导致植物产量不足和营养不良。目前富磷肥料已广泛应用于农业，以提高作物的生产率。不幸的是，大部分通过磷肥引入的磷立即与土壤中的矿物质结合或沉淀，使其无法被植物吸收。此外，土壤侵蚀是导致土壤磷流失的另一个关键途径，从而导致地下水污染和受纳水体富营养化。土壤微生物在养分转化中起着积极作用，其中溶磷藻类在磷循环中起着关键作用。通过分泌有机酸和/或磷酸酶等，促进不溶性磷源（磷矿物质和有机磷）溶解为可溶性磷。生物炭的施用可以极大地减少化肥的使用，并通过刺激微生物活性、酶的生产和活性促进可持续农业的发展。
但是现有技术中，并没有任何的利用生物炭培养溶磷藻类的方法。
发明内容
本发明提供一种培养溶磷藻类的松木生物炭液体培养基的制备方法及应用，旨在增加溶磷藻类的产量及其溶磷能力。
本发明是这样实现的，所述培养溶磷藻类的生物炭液体培养基的应用方法，包括以下步骤：
（1）配置培养基：按比例称取原料，并加无菌水混合得到液体培养基，所述培养基中包含生物炭；
（2）灭菌：对步骤（1）所得的液体培养基进行高压蒸汽灭菌处理后移至无菌室，冷却到室温后，边搅拌边将培养基分装到培养瓶中，每一个培养瓶中培养基的质量为30g~40g；
（3）接种：在无菌室内进行接种作业，每个培养瓶中取1ml纯菌液进行接种；
（4）孵育：将接种后的培养基放入无菌恒温振荡气候箱内，保持温度25℃，振荡速度为100rpm，光照强度为1000～2000 lx，光暗比12 h:12 h，孵育96h后即可收获藻液。
进一步的，所述应用方法还包括步骤（5）溶磷量测试：根据《农业行业标准NY/T1847-2010（中华人民共和国农业部，2010）》方法，采用钼锑抗比色法测定培养基中可溶性磷含量。
进一步的，所述生物炭的炭化温度为500℃。
进一步的，步骤（1）所述生物炭为松木生物炭，所述松木生物炭液体培养基包含以下质量浓度（mg/L）的组分：20~60松木生物炭、磷酸盐溶液8~9、TAP盐溶液10、醋酸盐溶液10、微量元素溶液1、无菌水1000。
进一步的，所述松木生物炭液体培养基包含以下质量浓度（mg/L）的组分：200松木生物炭、磷酸盐溶液9、TAP盐溶液10、醋酸盐溶液10、微量元素溶液1、无菌水1000。
进一步的，所述松木生物炭液体培养基包含以下质量浓度（mg/L）的组分：400松木生物炭、磷酸盐溶液8.5、TAP盐溶液10、醋酸盐溶液10、微量元素溶液1、无菌水1000。
进一步的，所述松木生物炭液体培养基包含以下质量浓度（mg/L）的组分：600松木生物炭、磷酸盐溶液8、TAP盐溶液10、醋酸盐溶液10、微量元素溶液1、无菌水1000。
进一步的，步骤（2）所述高压蒸汽灭菌为100kPa、121℃，灭菌20分钟。
进一步的，当所述生物炭为松木生物炭时，所述步骤（3）接种菌液为莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii），所述步骤（4）孵育为将接种后的培养基放入无菌恒温振荡气候箱内，保持温度25℃，振荡速度为100rpm，光照强度为1000～2000 lx，光暗比12 h:12h，孵育96h后即可收获藻液。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过特定培养基的配制，并且依次通过灭菌、接种、孵育和溶磷量检测，可以获得高产量和溶磷功能更强的溶磷藻类。
2、本发明操作简单，成本低、溶磷藻类生长速度快、培养后溶磷效果好，产生良好收益。
附图说明
图1为本发明培养基配制及应用流程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种培养溶磷藻类的生物炭液体培养基的制备方法，其特征在于：包含以下质量浓度（mg/L）的组分：20~60松木生物炭、磷酸盐溶液8~9、TAP盐溶液10、醋酸盐溶液10、微量元素溶液1、无菌水1000。
莱茵衣藻的培养应用，其特征在于：包括以下步骤：
（1）配置培养基：优选的，称取适量松木生物炭 20mg，磷酸盐溶液9mg、TAP盐溶液10mg、醋酸盐溶液10mg、微量元素溶液1mg、无菌水1000ml无菌水混合。使用0.1M 的冰醋酸溶液将pH调至7；
其中（1）中的磷酸盐溶液、TAP盐溶液、醋酸盐溶液、微量元素溶液的配制方法如下：
1）磷酸盐溶液：称取87.43 g卵磷脂（C43H83NO8P），在水浴加热条件下溶解于950ml无菌水中，用KOH调节溶液至7.1，定容至1000 mL；
2）TAP盐溶液：分别称取氯化铵（NH4Cl）40g、二水氯化钙（CaCl2·2H2O）5g、七水硫酸锰（MgSO4·7H2O）10g，用300 mL 无菌水溶解CaCl2，用500 mL 无菌水溶解NH4Cl和MgSO4，混合定容至1000ml；
3）醋酸盐溶液：称取Tris base 242g，量取冰醋酸（CH3COOH）100ml，用无菌水溶解并定容至1000ml；
4）微量元素溶液：称取乙二胺四乙酸钠（EDTA-NA2）50g、七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O）22g、硼酸（H3BO3）11.4g、四水氯化锰（MnCl2·4H2O）11.4g、六水氯化钴（CoCl2·6H2O）1.61g、五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.57g、四水钼酸铵 （(NH4)6Mo7O24·4H2O）1.1g、七水硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）4.99g，用无菌水溶解并定容至1000ml。
（2）灭菌：对（1）所得的培养基进行100kPa、121℃，20分钟的高压蒸汽灭菌处理移至无菌室，冷却到室温后，边搅拌边将培养基分装到培养瓶中，每一个培养瓶中培养基的质量为30g~40g；
（3）接种：在无菌室内，分别从中购买于中国科学院水生生物研究所购买的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）取1ml接种到每一个培养瓶中；
（4）孵育：将接种后的培养基放入无菌恒温振荡培养箱内，保持温度25℃，振荡速度为100rpm，光照强度为1000～2000 lx，光暗比12 h:12 h，孵育96h后即可收获藻液；
（5）溶磷量测试：根据《农业行业标准NY/T1847-2010（中华人民共和国农业部，2010）》方法，采用钼锑抗比色法测定培养基中可溶性磷含量。取30ml的（5）中孵育24h后的培养基到离心管中，于4℃，18000rpm离心10min，取上清液25ml于50ml具塞（磨口）刻度管中。在含25ml上清液的50ml具塞（磨口）刻度管中加入1ml抗坏血酸溶液摇匀，30秒后加2ml钼酸盐溶液充分混匀。室温下放置15分钟后，使用光程为30mm比色皿，在700nm波长下，用水作参比，测定吸光度，并换算成磷含量，具体数值在表1中展示。
实施例2
本实施例提供一种培养溶磷藻类的生物炭液体培养基的制备方法，其特征在于：包含以下质量浓度（mg/L）的组分：20~60松木生物炭、磷酸盐溶液8~9、TAP盐溶液10、醋酸盐溶液10、微量元素溶液1、无菌水1000。
莱茵衣藻的培养应用，其特征在于：包括以下步骤：
（1）配置培养基：优选的，称取适量松木生物炭 40mg，磷酸盐溶液8.5mg、TAP盐溶液10mg、醋酸盐溶液10mg、微量元素溶液1mg、无菌水1000ml无菌水混合。使用0.1M 的冰醋酸溶液将pH调至7；
其中（1）中的磷酸盐溶液、TAP盐溶液、醋酸盐溶液、微量元素溶液的配制方法如下：
1）磷酸盐溶液：称取87.43 g卵磷脂（C43H83NO8P），在水浴加热条件下溶解于950ml无菌水中，用KOH调节溶液至7.1，定容至1000 mL；
2）TAP盐溶液：分别称取氯化铵（NH4Cl）40g、二水氯化钙（CaCl2·2H2O）5g、七水硫酸锰（MgSO4·7H2O）10g，用300 mL 无菌水溶解CaCl2，用500 mL 无菌水溶解NH4Cl和MgSO4，混合定容至1000ml；
3）醋酸盐溶液：称取Tris base 242g，量取冰醋酸（CH3COOH）100ml，用无菌水溶解并定容至1000ml；
4）微量元素溶液：称取乙二胺四乙酸钠（EDTA-NA2）50g、七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O）22g、硼酸（H3BO3）11.4g、四水氯化锰（MnCl2·4H2O）11.4g、六水氯化钴（CoCl2·6H2O）1.61g、五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.57g、四水钼酸铵 （(NH4)6Mo7O24·4H2O）1.1g、七水硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）4.99g，用无菌水溶解并定容至1000ml。
（2）灭菌：对（1）所得的培养基进行100kPa、121℃，20分钟的高压蒸汽灭菌处理移至无菌室，冷却到室温后，边搅拌边将培养基分装到培养瓶中，每一个培养瓶中培养基的质量为30g~40g；
（3）接种：在无菌室内，分别从中购买于中国科学院水生生物研究所购买的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）取1ml接种到每一个培养瓶中；
（4）孵育：将接种后的培养基放入无菌恒温振荡培养箱内，保持温度25℃，振荡速度为100rpm，光照强度为1000～2000 lx，光暗比12 h:12 h，孵育96h后即可收获藻液；
（5）溶磷量测试：根据《农业行业标准NY/T1847-2010（中华人民共和国农业部，2010）》方法，采用钼锑抗比色法测定培养基中可溶性磷含量。取30ml的（5）中孵育24h后的培养基到离心管中，于4℃，18000rpm离心10min，取上清液25ml于50ml具塞（磨口）刻度管中。在含25ml上清液的50ml具塞（磨口）刻度管中加入1ml抗坏血酸溶液摇匀，30秒后加2ml钼酸盐溶液充分混匀。室温下放置15分钟后，使用光程为30mm比色皿，在700nm波长下，用水作参比，测定吸光度，并换算成磷含量，具体数值在表1中展示。
实施例3
本实施例提供一种培养溶磷藻类的生物炭液体培养基的制备方法，其特征在于：包含以下质量浓度（mg/L）的组分：20~60松木生物炭、磷酸盐溶液8~9、TAP盐溶液10、醋酸盐溶液10、微量元素溶液1、无菌水1000。
莱茵衣藻的培养应用，其特征在于：包括以下步骤：
（1）配置培养基：优选的，称取适量松木生物炭 60mg，磷酸盐溶液8mg、TAP盐溶液10mg、醋酸盐溶液10mg、微量元素溶液1mg、无菌水1000ml无菌水混合。使用0.1M 的冰醋酸溶液将pH调至7；
其中（1）中的磷酸盐溶液、TAP盐溶液、醋酸盐溶液、微量元素溶液的配制方法如下：
1）磷酸盐溶液：称取87.43 g卵磷脂（C43H83NO8P），在水浴加热条件下溶解于950ml无菌水中，用KOH调节溶液至7.1，定容至1000 mL；
2）TAP盐溶液：分别称取氯化铵（NH4Cl）40g、二水氯化钙（CaCl2·2H2O）5g、七水硫酸锰（MgSO4·7H2O）10g，用300 mL 无菌水溶解CaCl2，用500 mL 无菌水溶解NH4Cl和MgSO4，混合定容至1000ml；
3）醋酸盐溶液：称取Tris base 242g，量取冰醋酸（CH3COOH）100ml，用无菌水溶解并定容至1000ml；
4）微量元素溶液：称取乙二胺四乙酸钠（EDTA-NA2）50g、七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O）22g、硼酸（H3BO3）11.4g、四水氯化锰（MnCl2·4H2O）11.4g、六水氯化钴（CoCl2·6H2O）1.61g、五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.57g、四水钼酸铵 （(NH4)6Mo7O24·4H2O）1.1g、七水硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）4.99g，用无菌水溶解并定容至1000ml。
（2）灭菌：对（1）所得的培养基进行100kPa、121℃，20分钟的高压蒸汽灭菌处理移至无菌室，冷却到室温后，边搅拌边将培养基分装到培养瓶中，每一个培养瓶中培养基的质量为30g~40g；
（3）接种：在无菌室内，分别从中购买于中国科学院水生生物研究所购买的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）取1ml接种到每一个培养瓶中；
（4）孵育：将接种后的培养基放入无菌恒温振荡培养箱内，保持温度25℃，振荡速度为100rpm，光照强度为1000～2000 lx，光暗比12 h:12 h，孵育96h后即可收获藻液；
（5）溶磷量测试：根据《农业行业标准NY/T1847-2010（中华人民共和国农业部，2010）》方法，采用钼锑抗比色法测定培养基中可溶性磷含量。取30ml的（5）中孵育24h后的培养基到离心管中，于4℃，18000rpm离心10min，取上清液25ml于50ml具塞（磨口）刻度管中。在含25ml上清液的50ml具塞（磨口）刻度管中加入1ml抗坏血酸溶液摇匀，30秒后加2ml钼酸盐溶液充分混匀。室温下放置15分钟后，使用光程为30mm比色皿，在700nm波长下，用水作参比，测定吸光度，并换算成磷含量，具体数值在表1中展示。
表1莱茵衣藻经松木生物炭液体培养基与TAP培养基孵育后的溶磷量对比
Claims (6)
1.一种培养溶磷藻类的生物炭液体培养基的应用方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）配置培养基：按比例称取原料，并加无菌水混合得到液体培养基，所述培养基中包含生物炭；
（2）灭菌：对步骤（1）所得的液体培养基进行高压蒸汽灭菌处理后移至无菌室，冷却到室温后，边搅拌边将培养基分装到培养瓶中，每一个培养瓶中培养基的质量为30g~40g；
（3）接种：在无菌室内进行接种作业，每个培养瓶中取1ml纯藻液进行接种；
（4）孵育：将接种后的培养基放入无菌恒温箱内，孵育后即可收获藻液。
2.根据权利要求1所述的培养溶磷藻类的生物炭液体培养基的应用方法，其特征在于还包括步骤（5）溶磷量测试：根据《农业行业标准NY/T1847-2010（中华人民共和国农业部，2010）》方法，采用钼锑抗比色法测定培养基中可溶性磷含量。
3.根据权利要求1所述的培养溶磷藻类的生物炭液体培养基的应用方法，其特征在于所述生物炭的炭化温度为500℃。
4.根据权利要求1所述的培养溶磷藻类的生物炭液体培养基的应用方法，其特征在于步骤（1）所述生物炭为松木生物炭，所述松木生物炭液体培养基包含以下质量浓度（mg/L）的组分：20~60松木生物炭、磷酸盐溶液8~9、TAP盐溶液10、醋酸盐溶液10、微量元素溶液1、无菌水1000。
5.根据权利要求1所述的培养溶磷藻类的生物炭液体培养基的应用方法，其特征在于步骤（2）所述高压蒸汽灭菌为100kPa、121℃，灭菌20分钟。
6.根据权利要求1所述的培养溶磷藻类的生物炭液体培养基的应用方法，其特征在于当所述生物炭为松木生物炭时，所述步骤（3）接种纯藻液为莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii），所述步骤（4）孵育为将接种后的培养基放入无菌恒温振荡气候箱内，保持温度25℃，振荡速度为100rpm，光照强度为1000～2000 lx，光暗比12 h:12 h，孵育96h后即可收获藻液。
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