CN110540948B - 一种基于氢氧化细菌的复合菌种及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于氢氧化细菌的复合菌种，所述复合菌种是一类呼吸类型均为兼性好氧，适宜pH值为4.5‑8，适宜水活度为0.8‑0.9，且营养类型为化能有机/无机兼性异养的根圈嗜温微生物。本发明还提供了所述复合菌种的培养方法，在提供所述复合菌种的共性存活条件下，真菌将有机含碳化合物分解为有机酸与CO2提供给氢氧化细菌作为异养模式的碳源；固氮菌将空气中的N2转化成NH3，并同时释放出H2；氢氧化细菌利用有机酸、CO2、NH3、H2以及空气中的O2作为其代谢元素，实现能量传递和平衡，通过富集培养，获得基于氢氧化细菌的复合菌种。本发明将氢氧化细菌与固氮菌以及真菌进行联合培养，获得具有植物促长功能的复合菌种，其可作为高效有机菌肥。

Description

一种基于氢氧化细菌的复合菌种及其培养方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种基于氢氧化细菌的复合菌种及其培养方法。
背景技术
微生物制剂在农林业领域具有重要且广泛的应用，能够促进植物生物固氮、改善土壤肥力、提高植物矿物元素的吸收利用，增强植物的抗病、抗旱能力、提高产量、改善品质等作用，在发展绿色农业、生态农业方面具有不可替代的作用。根系促长微生物(PGPR)是多种微生物的联合促长机制发挥作用而促进植物生长，也是农业微生物领域研究的重点。微生物制剂研究及应用较多集中在根瘤菌、固氮菌、解磷、钾等领域。
氢氧化细菌(Hydrogen-oxidizing bacteria)，又称氢氧混合气细菌(Knallgasbacteria)，是一些呈革兰氏阴性的好氧或者兼性的化能无机营养菌(lithoautrophs)。细胞膜上有泛醌、维生素K2及细胞色素等呼吸链组分。它们能用氢气和氧气分子做为电子供体和受体，快速固定CO2，通过1,5-二磷酸核酮糖(RuBP-ribulose biphosphate)或者逆三羧酸循环(reverse tricarboxilic cycle)进行细胞合成。更重要的是：它们还能够通过氧化糖、有机酸和氨基酸等有机物来获取能量，因此属于兼性化能的营养模式，在异养模式中，CO2被固定在某种有机酸上，以有机化能方式进行反应。它们能够生存在氧气浓度波动较大的低氧缺氧区，这使得它们能与厌氧产氢细菌共生。
多数氢氧化细菌中有两种与氢的氧化有关的酶，一种是位于壁膜间隙或结合在细胞质膜上的不需要NAD+的颗粒状氧化酶它能够催化以下反应：
H2→2H++2e-
该酶在氧化氢并通过电子传递系统传递电子的过程中，可以驱动质子的跨膜运输，形成跨质子梯度，为ATP的合成提供动力；另一种是可溶性氢化酶，它能催化氢的氧化，而使NAD+还原的反应。所生产的NADH主要用于CO2的还原。根据吉布斯自由能的理论公式计算，这个过程会产生大量的能量和生成ATP，所以能够自发进行以下反应：
(1)H2(g)+1/2O2(g)→H2O(L) △GO＝-237.1kJ/mole
(2)ADP+Pi→ATP △GO＝+30.5kJ/mole
(3)H2(g)+1/2O2(g)+7(ATP+Pi)→H2O+7ATP △GO＝-23.6kJ/mole
氢氧化细菌还能生成微生物单细胞蛋白(Single cell protein-SCP)、供发酵工业用的生物质，它们在新陈代谢机理上超高的灵活性和多功能性——不仅能在异养和自养模式间轻松切换(自养是指细菌以CO2为碳源营养物质，异养是指以有机化合物为碳源营养物质)，也可以实现两种状态同步反应。也就是说在异养模式下反应产生的CO2继续以自养模式进一步反应。并且可以间歇或者连续进行。它依靠NAD+的溶解性氢化酶还原吡啶核苷酸用于生物合成，而颗粒氢化酶则引导电子从氢直接到电子传递链以产生质子动力势。
其自养模式新陈代谢的机理为：
21.36H2+6.21O2+4.09CO2+0.76NH3→C4.09H7.13O1.89N0.75+18.70H2O
其异养模式新陈代谢的机理为：
nH2+nO2+有机酸/nCO2+nNH3→C4.09H7.13O1.89N0.75+nH2O
上述反应机理表明：氢氧化细菌具备优异的合成氨基酸/蛋白质功能。该反应模式是基于氢氧化细菌在单菌种好氧/自养条件下进行，而氢氧化细菌具备好氧/厌氧、自养/异养自由切换的功能优势，但好氧/异养模式需跟其他细菌联合作用才会有高效率的合成反应。目前国内外的学术研究仅做到好氧/自养模式合成氨基酸/多肽/蛋白质的阶段，且仅仅是实验室成果阶段，还未实现工程验证，仅处于展望阶段。而好氧/异养模式还未见与其他细菌联合培养的报导。难点在于实验条件下的联合菌种的选择、组合机理、培养条件和方法等，学术界尚未有成功的、可靠的研究成果。但自然界中却大量存在氢氧化细菌与其他菌种的共生现象，因此，联合培养的研究方向是可行的。
生物固氮是指一些特殊的原核生物能够将分子态氮还原为氨，然后再由氨转化为各种细胞物质，微生物将氮还原为氨的过程称为生物固氮。
总反应式为(图2)：N2+8H++8e-+nATP→2NH3+H2+nADP+nPi
根据生物固氮反应式，固氮菌每固定一个N2，至少释放一个H2，不同的固氮菌释放的H/N比例不同。研究表明：如果固氮菌释放的H2不被其他微生物吸收，则大量聚集的H2会导致植物根圈范围O2、CO2失衡，会抑制固氮菌及其他菌种的呼吸和代谢循环，降低了固氮效果。而氢氧化细菌刚好具备吸收H2并合成氨基酸 /蛋白质的功能，可以实现固氮菌的呼吸和代谢平衡。
具有生物固氮作用的微生物近50个属，包括细菌、放线菌和蓝细菌。根据固氮微生物与高等植物以及与其他生物的关系，可分为3大类：自主固氮系、共生固氮系和联合固氮系。好氧自生固氮以固氮菌属(Azotobacter)较为重要，固氮能力较强。共生固氮菌中较为常见的是根瘤菌(Rhizobium)，它与其所共生的豆科植物有严格的种属特异性。此外，弗兰克氏菌(Frankia)能与非豆科植物共生固氮。联合固氮中比较研究普遍的有固氮螺菌属(Azospirillum)、假单孢菌属 (Pseudomouas)等。
固氮菌种单独培养方法比较成熟且应用较广，但与其他菌种联合培养的并应用的不多。根据前述分析，氢氧化细菌组合固氮菌进行联合培养的研究方向是可行的。
微生物自身的繁殖除了需要N源，还需要C源，植物生长除了光合作用吸收空气中的CO2以外，也需要从根系中吸收C源。因此研究氢氧化细菌联合固氮菌的同时，还要考虑C源的问题。
真菌是不含叶绿体、化能有机营养的真核微生物，在自然界的C元素循环和 N元素循环中起主要作用，典型的异养型生物，它们参与有机含碳化合物的分解、转化并生成CO2，可为植物生物固氮提供无机碳源和有机碳源。其中子囊菌门和担子菌门的一些菌属可以把富含有机物的物质转化成各种酶及有机酸，也可以广泛应用于工业发酵领域；另外，子囊菌门和担子菌门的一些菌属可产生有隔膜的菌丝体、且菌丝体可融合形成网络型菌丝联合体，再结合其他细菌与植物根系形成共生体(VA菌根)，是PGPR的重要组成部分。
根据前述氢氧化细菌的生理及功能特性，氢氧化细菌在微生物固氮、植物促长等领域具有重要、广泛的应用价值，但成熟、高效、低成本、易于产业化的培养方法目前还是研究难点。常见的培养方法如果采用无机自养模式富集培养法，需要人工供应CO2、H2；如采用异养模式限定培养基方法，培养出的菌种丰度比不高，不利于产业化应用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于氢氧化细菌的复合菌种及其培养方法，该方法适用于产业化。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面本发明提供了一种基于氢氧化细菌的复合菌种，所述复合菌种是一类呼吸类型均为兼性好氧，适宜pH值为4.5-8，适宜水活度为0.8-0.9，且营养类型为化能有机/无机兼性异养的根圈嗜温微生物。
优选地，所述复合菌种包括以下组分：细菌和真菌，所述细菌均为革兰氏阴性菌，所述细菌包括氢氧化细菌和固氮菌；所述真菌包括子囊菌门和担子菌门。
优选地，所述总菌含量＞2.8×107个/ml；氢氧化细菌总丰度比为＞60％，其菌含量＞1.1×107个/ml。
优选地，所述氢氧化细菌包括氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T和假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T；所述固氮菌为固氮螺菌Azospirillum rugosum IMMIB AFH-6T；所述子囊菌门为Varicosporellopsis aquatilisJW75003、Atractium crassum CBS180.31T或Paracremonium sp.CBS 143277中的一种或一种以上；所述担子菌门为Uncultured fungus clone(KU534750)。
优选地，所述复合菌种中的固氮螺菌Azospirillum rugosum IMMIB AFH-6T丰度比为＞10.5％；氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T丰度比为＞ 48.5％；假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T丰度比为＞12％；Varicosporellopsis aquatilis JW75003丰度比为＞19.5％；Atractium crassumCBS180.31T丰度比为＞20.5％；Paracremonium sp.CBS 143277丰度比为＞11％；Uncultured fungus clone(KU534750)丰度比为＞29％；
优选地，所述复合菌种中的固氮螺菌Azospirillum rugosum IMMIB AFH-6T丰度比为5％～11％；氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T丰度比为 11％～54％；假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T丰度比为 7.5～12.5％；Varicosporellopsis aquatilis JW75003丰度比为19％～21.5％；Atractium crassumCBS180.31T丰度比为20％～21％；Paracremonium sp.CBS 143277丰度比为 10.5～11.5％；Uncultured fungus clone(KU534750)丰度比为29％～30％。
优选地，所述复合菌种中氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T的菌含量为＞9×106个/ml；假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T的菌含量为＞2×106个/ml；固氮螺菌Azospirillum rugosum IMMIB AFH-6T的菌含量＞2 ×106个/ml；Varicosporellopsis aquatilis JW75003的菌含量为＞4×106个/ml； Atractiumcrassum CBS180.31T的菌含量为＞4×106个/ml；Paracremonium sp.CBS 143277的菌含量为＞2×106个/ml；Uncultured fungus clone(KU534750)的菌含量为＞5×106个/ml。
优选地，所述复合菌种中氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T的菌含量为5.2×105～1×107个/ml；假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T的菌含量为9×105～2.7×106个/ml；固氮螺菌Azospirillum rugosum IMMIB AFH-6T的菌含量1.2×106～2.6×106个/ml；Varicosporellopsis aquatilis JW75003的菌含量为 4.1×106～4.3×106个/ml；Atractium crassum CBS180.31T的菌含量为3.8×106～4.7× 106个/ml；Paracremonium sp.CBS 143277的菌含量为2.3×106～2.6×106个/ml； Unculturedfungus clone(KU534750)的菌含量为5.3×106～6.1×106个/ml。
第二方面本发明提供了一种如上所述基于氢氧化细菌复合菌种的培养方法，通过以下方法实现：在提供所述复合菌种的共性存活条件下，真菌将有机含碳化合物分解为有机酸与CO2提供给氢氧化细菌作为异养模式的碳源；固氮菌将空气中的N2转化成NH3，并同时释放出H2；氢氧化细菌利用有机酸、CO2、NH3、H2以及空气中的O2作为其代谢元素，实现能量传递和平衡，通过富集培养，获得基于氢氧化细菌的复合菌种。
优选地，所述共性存活条件包括：营养类型、生存空间、温度、pH值、水活度以及呼吸类型；其中所述氢氧化细菌和固氮菌的营养类型为化能无机兼性，真菌为化能有机异养型；所述生存空间为氢氧化细菌、固氮菌和真菌均来源于植物根圈微生物，在同一植被的土壤中生存；所述温度为15-45℃；所述pH值为4.5-7，所述水活度为0.8-0.9；所述氢氧化细菌、固氮菌和真菌的呼吸类型均为兼性好氧。
优选地，本发明其中一个实施例中中国广东鼎湖山国家级自然保护区原始生态环境(原始生态环境在本发明中的定义为：植被的土壤未受到人工破坏，未经过化学肥、农业肥等肥料的浇灌，保持天然土壤根系微生态环境)的植被下方，取湿度为15-50％的湿草炭土溶于水搅拌稀释后制得的上清液获得初级菌种后，将初级菌种接种到液体培养基中进行富集，逐级富集培养至五级菌种。在富集培养过程中，并分别于培养时间点0h、24h、48h、72h、96h、7天、14天、21天取样检测。发现在0h～72h时，pH值从初始的8.85下降至6.12，为弱酸，说明真菌快速繁殖，将培养基中的有机化合物转化成有机酸和CO2，使pH值快速下降，为氢氧化细菌和固氮菌提供碳源；在7天～21天时pH值开始逐渐回升至6.88，趋于中性，说明氢氧化细菌和固氮菌加快繁殖，消耗培养基中的有机酸，使发酵液中的pH值并达到平衡。在0h～7天时，TKN(氨态氮+有机态氮)的数据逐渐升高，从13(0h)升至600(7天)mg/L，说明固氮菌实现固氮作用，将空气中的N2转化为NH3(氨态氮)；在7天～21天，TKN指标数据缓增并趋稳，说明氢氧化细菌利用真菌提供的CO2和有机酸以及固氮菌提供的NH3作为其自养/异养模式的碳源、氮源和其他代谢所需元素在持续合成氨基酸。
第三方面本发明提供了培养复合菌种所需的液体合成培养基，包括以下重量份的组分：有机化合物2-3份、矿物质0.2-0.3份，水余量。
优选地，所述有机化合物包括以下重量份的组分：水性丙烯酸3-6份，水性聚氨酯3-6份，2-丁氧基乙醇5-10份，二甘醇一丁醚3-6份，石油精0.5-1份，聚丙二醇2-4份，四甲基葵二醇3-5份，2-丙醇5-10份，1-甲基-2-吡咯烷酮0.5-1份，正丁醇5-10份，5-氯-2-甲基-3(2H)异噻唑酮1-3份，乙二醇单丁醚5-10份，二甲氨基乙醇3-6份，二甘醇单丁醚4-8份，N.N-二甲基乙醇胺0.5-1份，1.2-乙二醇 3-6份，2-氨基乙醇3-6份，一缩二丙二醇一甲醚3-6份。
优选地，所述矿物质包括以下重量份的组分：钛白粉1-5份、滑石粉10-30份、珠光粉5-10份、硫酸钡10-30份、碳酸钙10-30份、氧化铁红1-5份、酞青蓝1-5 份、氧化铁黄1-5份。
优选地，所述合成培养基参数为：有机化合物浓度2-3％、无机盐浓度0.2-0.3％、凯氏氮(TKN)12-15mg/L、总磷(TP)8-10mg/L、悬浮物(SS)231mg/L、浊度(TU)1700-2100度、pH值8-9、水温28-32℃。
第四方面，本发明还提供了上述培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)将有机化合物按前述比例配置混合液，搅拌分散均匀；
(2)将矿物质按前述比例配置，加入到有机化合物混合液中，搅拌分散均匀；
(3)加水稀释后得到液体培养基；
(4)将液体培养基通过紫外光装置进行循环灭菌处理，灭菌时间＞30min。
第五方面本发明提供了如上所述的复合菌种在制备植物促长剂中的应用。
本发明根据氢氧化细菌、固氮菌、真菌(子囊菌门、担子菌门)的生理和功能特性(如表1所示)，以及其之间的代谢元素和能量循环原理(如图1所示)，来选择复合菌种的菌种组合方式。本发明的技术方案为：真菌将有机含碳化合物分解为有机酸、CO2提供给氢氧化细菌作为自养/异养模式的碳源；固氮菌把空气中的N2转化成NH3的同时释放出H2。有机酸、CO2、NH3、H2，再加上空气中的 O2，一同提供给氢氧化细菌作为代谢元素及能量传递和平衡(如图1所示)。因此，如采用富集培养法，只需给微生物提供合适的有机碳源和空气即可，无需另外提供H2。
表1：氢氧化细菌、固氮菌、真菌的生理及功能特性
Figure RE-GDA0002227439120000081
本发明提供了基于氢氧化细菌的复合菌种的组合机理，基于联合培养的目标，三种菌种需要在同一培养条件下生存，因此本分发明首先确定了三种菌种生存条件的基础共性：
表2：三种菌种生存条件的基础共性
Figure RE-GDA0002227439120000082
如表2所示，本发明复合菌种选用的菌种应具备的共性生理及功能特性为：革兰氏阴性菌(细菌)、根圈微生物(PGPR)、嗜温微生物(15-45℃)、弱酸环境、化能有机兼性异养(避光)、水活度aw0.8-0.9、兼性好氧。
前述组合菌种均为PGPR微生物，其生理及功能特性均符合表2的生存条件。本发明是依据自然界PGPR微生物的共生机理，利用不同微生物之间的相互作用，以仿生的方法确定的菌种组合方案。
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明的复合菌种是通过利用真菌、固氮菌与氢氧化细菌之间的元素代谢和能量循环进行联合培养制备而成；对于氢氧化细菌的生长无需额外提供H2，直接利用固氮菌生理功能特性释放的NH3和 H2，以及真菌前期代谢的有机酸和CO2，即可作为其生长的氮源和碳源。本发明的复合菌种具有植物促长功能，可以制备高效的有机菌肥。本发明的复合菌种具有良好的储存活性。本发明的复合菌种原料来源广泛价格低廉，制作成本较低，同时培养该复合菌种的方法也较为简单，无需额外提供氢气支持氢氧化细菌的培养，适用于产业化。
附图说明
图1氢氧化细菌、固氮菌、真菌代谢元素及能量循环示意图。
图2生物固氮反应式示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细描述。
本发明培养基配方如下表3：
表3：培养基配方
Figure RE-GDA0002227439120000091
Figure RE-GDA0002227439120000101
实施例5
本实施例提供一种本发明合成培养基的制备方法，具体步骤如下：
(1)将有机化合物按实施例1的比例配置混合液，搅拌分散均匀。
(2)将矿物质按实施例1的比例配置，加入到有机化合物的混合液中，搅拌分散均匀，矿物质在有机化合物混合液中形成悬浮分散状态，目测浊度较高，不透光。
(3)加入纯水稀释，使其总重为100kg，继续搅拌分散，稀释后得到液体合成培养基。
(4)将液体合成培养基通过紫外光装置进行循环灭菌处理，灭菌时间＞ 30min。将灭菌后的培养基放入培养容器内。
将实施例1～4制备的培养基进行检测，获得其参数特征，见表4：
表4：实施例1～4的培养基参数
Figure RE-GDA0002227439120000111
如表4所示，培养基的初始pH值为8.80-8.90，呈弱碱性，不适于联合菌种的存活条件，但真菌在发酵过程中可以迅速把培养基中的有机化合物分解转化成有机酸和CO2，为复合菌种代谢循环提供碳源的同时，也能够把培养基转化为弱酸状态。
实施例6复合菌种的培养方法
步骤一：从中国广东鼎湖山国家级自然保护区原始生态环境的植被下方，取湿度为16％的湿度较高的草炭土，溶水搅拌稀释后沉淀，取1L上清液作为初级菌种；
步骤二：将初级菌种接种到实施例1的液体培养基中进行培养，通入压缩空气，液体与气流量的体积比例关系为1m3:5-15m3/h，优选地，气流量为0.8-1m3/h，温度控制为28-32℃，优选地，30-32℃。富集培养7天后停止供气，静置沉淀24h，待矿物质沉淀至容器底部后分离上清液，得到二级菌种。
步骤三：取二级菌种放入相同反应容器中；通入压缩空气，气流为0.9-1.1m3/h，温度控制为29-31℃，富集培养7天后得到三级菌种；
步骤四：同步骤三，将气流为1-1.2m3/h，温度控制为28-30℃，富集培养7天后得到四级菌种；
步骤五：同步骤四，气流为1.2-1.4m3/h，温度控制为28-29℃，富集培养7天后得到五级菌种；整个培养过程持续21天，并分别于培养时间点0h、24h、36h、 72h、96h、7天、14天、21天取样检测，检测结果见表5。
表5：实施例6培养过程不同时间点的检测结果
Figure RE-GDA0002227439120000121
Figure RE-GDA0002227439120000131
备注：①代表氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T②代表假单胞菌(Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T)③代表固氮螺菌(Azospirillum rugosumIMMIB AFH-6T)④代表 Varicosporellopsis aquatilis JW75003⑤代表Atractiumcrassum CBS180.31T⑥代表Paracremonium sp.CBS 143277⑦代表Uncultured fungusclone(KU534750)。
由表5所示，初始pH值由8.85(0h)弱碱迅速转为弱酸6.12(36h)～5.98 (72h)，说明真菌快速繁殖，把培养基中的有机化合物转化成有机酸和CO2，使 pH值快速下降，并为氢氧化细菌和固氮菌提供碳源，符合真菌的作用机理。随后 pH值开始逐渐回升6.88(7天)～7.02(21天)，趋于中性，说明氢氧化细菌和固氮菌加快繁殖，消耗培养基中的有机酸，使发酵液中的pH值并达到平衡。
表5中TKN(氨态氮+有机态氮)的数据随培养时间逐渐升高：13(0h)～600 (7天)mg/L，说明固氮菌的同步繁殖实现固氮作用(氨态氮)；同时也说明，氢氧化细菌也在同步繁殖并合成了氨基酸(有机态氮)，符合氢氧化细菌的作用机理、也符合两组菌种联合固氮的机理。在7天～21天后，TKN指标数据缓增并趋稳，说明氢氧化细菌在持续合成氨基酸。
表5中细菌和真菌丰度比和菌含量指标数据(0h～7天)直接说明了组合菌种联合培养繁殖的变化规律，7天～21天数据缓增趋稳，是因为随着培养基的不断消耗下降，C源的供应与微生物的繁殖逐渐平衡，因此，7天以后的三、四、五及菌种均为本发明的目标培养复合菌种，其中氢氧化细菌(①+②)总的丰度比＞ 60.5％，氢氧化细菌总菌含量＞1×107个/ml。
实施例7
本实例采用实施例6复合菌种的培养方法，本实施例采用实施例2制备的培养基，本实施例与实施例6的唯一区别在于本实施例的步骤一为从中国湖南莽山国家级自然保护区原始生态环境的植被下方，取湿度为30％的湿度较高的草炭土，溶水搅拌稀释后沉淀，取1L上清液作为初级菌种。
本实施例并分别于培养时间点0h、24h、36h、72h、96h、7天、14天、21天取样检测，检测结果见表6。
表6：实施例7培养过程不同时间点的检测结果
Figure RE-GDA0002227439120000141
备注：①代表氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T②代表假单胞菌(Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T)③代表固氮螺菌(Azospirillum rugosumIMMIB AFH-6T)④代表Varicosporellopsis aquatilis JW75003⑤代表Atractiumcrassum CBS180.31T⑥代表Paracremonium sp.CBS 143277⑦代表Uncultured fungusclone(KU534750)。
实施例8
本实例采用实施例6复合菌种的培养方法，本实施例采用实施例3制备的培养基，本实施例与实施例6的唯一区别在于本实施例的步骤一为从中国广东南岭国家级自然保护区原始生态环境的植被下方，取湿度为50％的湿度较高的草炭土，溶水搅拌稀释后沉淀，取1L上清液作为初级菌种。
本实施例并分别于培养时间点0h、24h、36h、72h、96h、7天、14天、21天取样检测，检测结果见表7。
表7：实施例8培养过程不同时间点的检测结果
Figure RE-GDA0002227439120000151
Figure RE-GDA0002227439120000161
备注：①代表氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T②代表假单胞菌(Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T)③代表固氮螺菌(Azospirillum rugosumIMMIB AFH-6T)④代表 Varicosporellopsis aquatilis JW75003⑤代表Atractiumcrassum CBS180.31T⑥代表Paracremonium sp.CBS 143277⑦代表Uncultured fungusclone(KU534750)。
实施例9
实施例6～8的联合菌种所组合的菌种均为兼性好氧，因此联合菌种具备良好的储存活性，验证试验如下：
分别取实施例6～8的三级菌种(上清液、无任何悬浮絮凝杂质)放入于透明容器中，密封、避光，环境温度15-35℃，分别于静置的第14天、21天、28天、 60天观察，结果发现，随着时间的推移，容器内逐渐出现丝状透明悬浮絮凝物，絮凝物缓慢增加并逐渐聚集成无规则团状，约60天左右稳定。过滤分离并检测絮凝物，检测报告显示，该絮凝物为长肽和蛋白质，说明氢氧化细菌把液体中的氨基酸继续合成长肽/蛋白质，根据絮凝物检测的质量数据结合氨基酸检测报告的氨基酸含量数据计算分析：联合菌种几乎把容器中的液态氨基酸全部转化成长肽/蛋白质。这充分说明本发明的联合菌种具有良好的储存活性。
应用实施例10苦荬菜种植蘸根
将苦荬菜移栽苗分为对照组和实验组(实施例6、7、8)。对照组采用常规方法移栽种植；实验组的苦荬菜采用本发明的复合菌种进行蘸根处理后移栽，约45 天后测定两组各项指标，结果见表8。
表8：对照组、实验组各项指标检测结果
Figure RE-GDA0002227439120000162
Figure RE-GDA0002227439120000171
如表8所示，对照组相比经本发明复合菌种处理后的苦荬菜，显著提高了产量，并提高了质量。
应用实施例11蓖麻浸种实验
将蓖麻种分为对照组和实验组(实施例6、7、8)。对照组采用常规方法种植；实验组的蓖麻种采用本发明的复合菌种进行浸种处理后种植，约20天后测定两组幼苗各项指标，结果见表9。
表9：对照组、实验组各项指标检测结果
Figure RE-GDA0002227439120000172
Figure RE-GDA0002227439120000181
如表9所示，对照组相比经本发明复合菌种处理后的蓖麻种，发芽出苗良好，长势质量有显著优势。
由应用实施例10、11的结果表明，本发明的复合菌种可以广泛的应用于多种植物，具有广谱促长作用；根据不同植物的生长特性，可采用浸种、蘸根或底肥方法使用。
本发明的联合菌种在培养过程中就同步合成了含量较高的氨基酸，在应用于植物根系固氮的同时，也提供了高质量的有机肥料，实现了微生物固氮制剂+有机肥料的组合。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种基于氢氧化细菌复合菌种的培养方法，其特征在于，通过以下方法实现：在提供所述复合菌种的共性存活条件下，真菌将有机含碳化合物分解为有机酸与CO2提供给氢氧化细菌作为异养模式的碳源；固氮菌将空气中的N2转化成NH3，并同时释放出H2；氢氧化细菌利用有机酸、CO2、NH3、H2以及空气中的O2作为其代谢元素，实现能量传递和平衡，进行富集培养；所述富集培养采用的是合成培养基，其包括以下重量份的组分：有机化合物2-3份、矿物质0.2-0.3份、水余量；所述合成培养基参数为：有机化合物浓度2-3%、无机盐浓度0.2-0.3%、凯氏氮12-15mg/L、总磷8-10 mg/L、悬浮物231 mg/L、浊度1700-2100度、pH值8-9、水温28-32℃；
所述真菌包括子囊菌门和担子菌门，所述子囊菌门为Varicosporellopsis aquatilisJW75003、Atractium crassum CBS180.31T或Paracremonium sp.CBS 143277中的一种或一种以上；所述担子菌门为Uncultured fungus clone；
所述固氮菌为固氮螺菌Azospirillum rugosum IMMIB AFH-6T；所述氢氧化细菌为氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T 或假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensisCCOS 864T。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，具体通过以下方法实现：由氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养获得初级菌种后，将初级菌种接种到液体培养基中进行富集，通入压缩空气，温度为28-32℃，经过逐级富集培养至五级菌种，即得所述复合菌种。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述固氮螺菌Azospirillum rugosumIMMIB AFH-6T丰度比为＞10.5%；氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T丰度比为＞48.5%；假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T丰度比为＞12%；Varicosporellopsis aquatilis JW75003丰度比为＞19.5%；Atractium crassumCBS180.31T丰度比为＞20.5%；Paracremonium sp.CBS 143277丰度比为＞11%；Unculturedfungus clone丰度比为＞29%；所述复合菌种中所述氢噬胞菌的含量为＞9×106个/ml；所述假单胞菌的含量为＞2×106个/ml；所述固氮螺菌的含量＞2×106个/ml；Varicosporellopsis aquatilis JW75003的菌含量为＞4×106个/ml；Atractium crassumCBS180.31T的菌含量为＞4×106个/ml；Paracremonium sp.CBS 143277的菌含量为＞2×106个/ml；Uncultured fungus clone的菌含量为＞5×106个/ml。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述有机化合物包括以下重量份的组分：水性丙烯酸3-6份，水性聚氨酯3-6份，2-丁氧基乙醇5-10份，二甘醇一丁醚3-6份，石油精0.5-1份，聚丙二醇2-4份，四甲基葵二醇3-5份，2-丙醇5-10份，1-甲基-2-吡咯烷酮0.5-1份，正丁醇5-10份，5-氯-2-甲基-3（2H）异噻唑酮1-3份，乙二醇单丁醚5-10份，二甲氨基乙醇3-6份，二甘醇单丁醚4-8份，N.N-二甲基乙醇胺0.5-1份，1.2-乙二醇3-6份，2-氨基乙醇3-6份，一缩二丙二醇一甲醚3-6份；所述矿物质包括以下重量份的组分：钛白粉1-5份、滑石粉10-30份、珠光粉5-10份、硫酸钡10-30份、碳酸钙10-30份、氧化铁红1-5份、酞青蓝1-5份、氧化铁黄1-5份。
5.由权利要求1~4任一项所述的基于氢氧化细菌复合菌种的培养方法制备的复合菌种在制备植物促长剂中的应用。
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CN105295928B (zh) * 2015-11-27 2019-04-19 上海师范大学 一种适用于退化草场的土壤改良剂及制备方法
CN107418919A (zh) * 2017-08-31 2017-12-01 南通大学 光合细菌高效培养方法
CN109020058B (zh) * 2018-08-01 2019-05-28 清新丽豪化工有限公司 一种设备涂装水性面漆工艺有机废水处理系统和方法
CN108996667B (zh) * 2018-08-01 2019-05-03 清新丽豪化工有限公司 一种集约式好氧生化降解系统和方法
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