CN110540947B - 一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，由以下方法制备而成：从草炭土溶水搅拌稀释后制得的上清液获得初级菌种，将富含有机物的废水进行固液分离，将初级菌种接种至分离的液体逐级富集发酵培养，将发酵液进行浓缩，即得本发明的联合微生物固氮制剂。本发明的固氮菌剂首次从草炭土中获得氢氧化细菌，并通过与固氮菌以及真菌进行联合培养，获得具有植物促长功能的复合菌种，可以作为高效有机液肥。本发明的固氮制剂原料来源广泛价格低廉，制作成本较低，同时制备该固氮菌剂的方法也较为简单，无需额外提供氢气支持氢氧化细菌的培养，适用于产业化。本发明首次利用高浓度工业有机废水作为微生物的培养基，实现了废物资源利用的高价值转化。

Description

一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂及其制备方法。
背景技术
微生物固氮制剂在农林业领域具有重要且广泛的应用，能够促进植物生物固氮、改善土壤肥力、提高植物矿物元素的吸收利用，增强植物的抗病、抗旱能力、提高产量、改善品质等作用，在发展绿色农业、生态农业方面具有不可替代的作用。根系促长微生物(PGPR)是多种微生物的联合促长机制发挥作用而促进植物生长，也是农业微生物领域研究的重点。微生物制剂研究及应用较多集中在根瘤菌、固氮菌、解磷、钾等领域。
氢氧化细菌(Hydrogen-oxidizing bacteria)，又称氢氧混合气细菌(Knallgasbacteria)，是一些呈革兰氏阴性的好氧或者兼性的化能无机营养菌(lithoautrophs)。细胞膜上有泛醌、维生素K2及细胞色素等呼吸链组分。它们能用氢气和氧气分子做为电子供体和受体，快速固定CO2，通过1,5-二磷酸核酮糖(RuBP-ribulose biphosphate)或者逆三羧酸循环(reverse tricarboxilic cycle)进行细胞合成。更重要的是：它们还能够通过氧化糖、有机酸和氨基酸等有机物来获取能量，因此属于兼性化能的营养模式，在异养模式中，CO2被固定在某种有机酸上，以有机化能方式进行反应。它们能够生存在氧气浓度波动较大的低氧缺氧区，这使得它们能与厌氧产氢细菌共生。
多数氢氧化细菌中有两种与氢的氧化有关的酶，一种是位于壁膜间隙或结合在细胞质膜上的不需要NAD+的颗粒状氧化酶它能够催化以下反应：
H2→2H++2e-
该酶在氧化氢并通过电子传递系统传递电子的过程中，可以驱动质子的跨膜运输，形成跨质子梯度，为ATP的合成提供动力；另一种是可溶性氢化酶，它能催化氢的氧化，而使NAD+还原的反应。所生产的NADH主要用于CO2的还原。根据吉布斯自由能的理论公式计算，这个过程会产生大量的能量和生成ATP，所以能够自发进行以下反应：
(1)H2(g)+1/2O2(g)→H2O(L) △GO＝-237.1kJ/mole
(2)ADP+Pi→ATP △GO＝+30.5kJ/mole
(3)H2(g)+1/2O2(g)+7(ATP+Pi)→H2O+7ATP △GO＝-23.6kJ/mole
氢氧化细菌还能生成微生物单细胞蛋白(Single cell protein-SCP)、供发酵工业用的生物质，它们在新陈代谢机理上超高的灵活性和多功能性——不仅能在异养和自养模式间轻松切换(自养是指细菌以CO2为碳源营养物质，异养是指以有机化合物为碳源营养物质)，也可以实现两种状态同步反应。也就是说在异养模式下反应产生的CO2继续以自养模式进一步反应。并且可以间歇或者连续进行。它依靠NAD+的溶解性氢化酶还原吡啶核苷酸用于生物合成，而颗粒氢化酶则引导电子从氢直接到电子传递链以产生质子动力势。
其自养模式新陈代谢的机理为：
21.36H2+6.21O2+4.09CO2+0.76NH3→C4.09H7.13O1.89N0.75+18.70H2O
其异养模式新陈代谢的机理为：
nH2+nO2+有机酸/nCO2+nNH3→C4.09H7.13O1.89N0.75+nH2O
上述反应机理表明：氢氧化细菌具备优异的合成氨基酸/蛋白质功能。该反应模式是基于氢氧化细菌在单菌种好氧/自养条件下进行，而氢氧化细菌具备好氧/厌氧、自养/异养自由切换的功能优势，但好氧/异养模式需跟其他细菌联合作用才会有高效率的合成反应。目前国内外的学术研究仅做到好氧/自养模式合成氨基酸/多肽/蛋白质的阶段，且仅仅是实验室成果阶段，还未实现工程验证，仅处于展望阶段。而好氧/异养模式还未见与其他细菌联合培养的报导。难点在于实验条件下的联合菌种的选择、组合机理、培养条件和方法等，学术界尚未有成功的、可靠的研究结果。但自然界中却大量存在氢氧化细菌与其他菌种的共生现象，因此，联合培养的研究方向是可行的。
生物固氮是指一些特殊的原核生物能够将分子态氮还原为氨，然后再由氨转化为各种细胞物质，微生物将氮还原为氨的过程称为生物固氮。
总反应式为(图3)：N2+8H++8e-+nATP→2NH3+H2+nADP+nPi
根据生物固氮反应式，固氮菌每固定一个N2，至少释放一个H2，不同的固氮菌释放的H/N比例不同。研究表明：如果固氮菌释放的H2不被其他微生物吸收，则大量聚集的H2会导致植物根圈范围O2、CO2失衡，会抑制固氮菌及其他菌种的呼吸和代谢循环，降低了固氮效果。而氢氧化细菌刚好具备吸收H2并合成氨基酸/蛋白质的功能，可以实现固氮菌的呼吸和代谢平衡。
具有生物固氮作用的微生物近50个属，包括细菌、放线菌和蓝细菌。根据固氮微生物与高等植物以及与其他生物的关系，可分为3大类：自主固氮系、共生固氮系和联合固氮系。好氧自生固氮以固氮菌属(Azotobacter)较为重要，固氮能力较强。共生固氮菌中较为常见的是根瘤菌(Rhizobium)，它与其所共生的豆科植物有严格的种属特异性。此外，弗兰克氏菌(Frankia)能与非豆科植物共生固氮。联合固氮中比较研究普遍的有固氮螺菌属(Azospirillum)、假单孢菌属(Pseudomouas)等。
固氮菌种单独培养方法比较成熟且应用较广，但与其他菌种联合培养的并应用的不多。根据前述分析，氢氧化细菌组合固氮菌进行联合培养的研究方向是可行的。
微生物自身的繁殖除了需要N源，还需要C源，植物生长除了光合作用吸收空气中的CO2以外，也需要从根系中吸收C源。因此研究氢氧化细菌联合固氮菌的同时，还要考虑C源的问题。
真菌是不含叶绿体、化能有机营养的真核微生物，在自然界的C元素循环和N元素循环中起主要作用，典型的异养型生物，它们参与有机含碳化合物的分解、转化并生成CO2，可为植物生物固氮提供无机碳源和有机碳源。其中子囊菌门和担子菌门的一些菌属可以把富含有机物的物质转化成各种酶及有机酸，也可以广泛应用于工业发酵领域；另外，子囊菌门和担子菌门的一些菌属可产生有隔膜的菌丝体、且菌丝体可融合形成网络型菌丝联合体，再结合其他细菌与植物根系形成共生体(VA菌根)，是PGPR的重要组成部分。
根据前述氢氧化细菌的生理及功能特性，氢氧化细菌在微生物固氮、植物促长等领域具有重要、广泛的应用价值，但成熟、高效、低成本、易于产业化的培养方法目前还是研究难点。常见的培养方法如果采用无机自养模式富集培养法，需要人工供应CO2、H2；如采用异养模式限定培养基方法，培养出的菌种丰度比不高，不利于产业化应用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂及其制备方法，该方法适用于产业化。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面本发明提供了一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，由以下方法制备而成：由氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养获得初级菌种后，将富含有机物的废水进行固液分离，将初级菌种接种至分离的液体逐级富集发酵培养，将获得的第五级发酵液进行浓缩，即得基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂。
优选地，所述富含有机物的废水为工业有机废水、禽畜废水、生活污水或汽车涂装水性涂料废水。
优选地，所述富含有机物的废水为汽车涂装水性涂料废水。
优选地，所述联合微生物固氮制剂包含以下菌种：氢氧化细菌、固氮菌、子囊菌门真菌和担子菌门真菌；其中所述复合菌种的总菌含量＞3×108个/ml；氢氧化细菌在所述复合菌种中的总丰度比为55-70％，菌含量＞1.1×108个/ml。
优选地，所述氢氧化细菌为氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T和假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T；所述固氮菌为固氮螺菌Azospirillum rugosum IMMIB AFH-6T和蓝藻固氮菌Elstera cyanobacteriorum TH019T；所述子囊菌门真菌为Varicosporellopsis aquatilis JW75003或/和Atractium crassumCBS180.31T或/和Paracremonium sp.CBS 143277中的一种或几种；所述担子菌门真菌为Uncultured fungus clone(KU534750)或/和Uncultured Basidiomycota clone(KU000527)。
优选地，所述氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T的丰度比为45-55％，菌含量＞9×107个/ml；所述假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T的丰度比为10-15％，菌含量＞2×107个/ml；所述固氮螺菌的丰度比为10-15％，菌含量＞2×107个/ml；所述蓝藻固氮菌的丰度比为3-5％，菌含量＞1×107个/ml；所述Varicosporellopsis aquatilis JW75003的丰度比为18-25％，菌含量＞4×107个/ml；所述Atractium crassum CBS180.31T的丰度比为20-25％，菌含量＞4×107个/ml；所述Paracremonium sp.CBS 143277的丰度比为10-15％，菌含量＞2×107个/ml；所述Uncultured fungus clone(KU534750)的丰度比为28-35％，菌含量＞5×107个/ml；所述Uncultured Basidiomycota clone(KU000527)的丰度比为4-7％，菌含量＞2×107个/ml。
优选地，所述固氮制剂还包含氨基酸，所述氨基酸含量为＞100mg/100g。
第二方面本发明提供了一种基于氢氧化细菌的联合微生物有机水溶菌肥，由以下方法制备而成：由氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养获得初级菌种后，将富含有机物的废水进行固液分离，将初级菌种接种至分离的液体中逐级富集培养，将获得的第五级发酵液进行浓缩，浓缩后剩余的低浓度液体，即得基于氢氧化细菌的联合微生物有机水溶菌肥。
优选地，所述有机水溶菌肥包含以下菌种：氢氧化细菌、固氮菌、子囊菌门真菌和担子菌门真菌；其中所述复合菌种的总菌含量＞3×106个/ml；氢氧化细菌在所述复合菌种中的菌含量＞1.1×106个/ml；所述有机水溶菌肥的总氨基酸含量为＞1.5mg/100g。
第三方面本发明提供了一种基于氢氧化细菌的联合微生物固体有机菌肥，由氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养获得初级菌种后，将富含有机物的废水进行固液分离，将初级菌种接种至分离的液体中逐级富集培养，将逐级富集培养中的三级菌种接种至有机废水固液分离的废渣中进行固态发酵，获得的固态发酵产物与废气吸附饱和的活性炭混合脱水后即为联合微生物固体有机菌肥。
优选地，所述固体有机菌肥包含氢氧化细菌、固氮菌、子囊菌门真菌和担子菌门真菌共同培养的复合菌种，以及氨基酸、发酵固态产物的粗蛋白和活性炭。
第四方面本发明提供了如上所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂在制备植物促长剂中的应用。
本发明的技术方案是根据氢氧化细菌、固氮菌、真菌(子囊菌门、担子菌门)的生理和功能特性(如表1所示)，以及其之间的能量循环原理(如图1所示)，来选择复合菌种的菌种组合方式。本发明的技术原理为：真菌将有机含碳化合物分解为有机酸、CO2提供给氢氧化细菌作为自养/异养模式的碳源；固氮菌把空气中的N2转化成NH3的同时释放出H2。有机酸、CO2、NH3、H2，再加上空气中的O2，一同提供给氢氧化细菌作为代谢元素。因此，如采用富集培养法，只需给微生物提供合适的有机碳源和空气即可，无需另外提供H2。
表1：氢氧化细菌、固氮菌、真菌的生理及功能特性
Figure GDA0002227440130000061
基于联合培养的目标，三种菌种需要在同一培养条件下生存，因此本分发明首先确定了三种菌种生存条件的基础共性：
表2：三种菌种生存条件的基础共性
Figure GDA0002227440130000071
如表2所示，本发明复合菌种选用的菌种应具备的共性生理及功能特性为：革兰氏阴性菌(细菌)、根圈微生物、嗜温微生物(15-45℃)、弱酸环境、化能有机兼性异养(避光)、水活度aw0.8-0.9、兼性好氧。
前述组合菌种均为PGPR微生物，其生理及功能特性均符合表2的生存条件。本发明是依据自然界PGPR微生物的共生机理，利用不同微生物之间的相互作用，以仿生的方法确定的菌种组合方案。
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明将氢噬胞菌(Hydrogenophagalaconesensis HWB-10T)首次与固氮菌、真菌进行联合培养获得具有生物固氮功能制剂的技术方案在此前未见报道。本发明的技术方案还制备了有机水溶菌肥和固体有机菌肥，均具备分解有机质、固氮、促长的作用，并提高植物的抗病能力。本发明的初始菌种来自于自然生态土壤环境，其菌种组成依据自然界PGPR微生物的共生机理，更接近于天然生态环境，不包含有害菌。本发明的固氮制剂具有良好的储存活性。本发明将富含有机物的废水转化成高价值的固氮制剂和有机菌肥，实现了良好的资源利用效益。
本发明的复合菌种原料来源广泛价格低廉，制作成本较低，同时制备该固氮菌剂的方法也较为简单，无需额外提供氢气支持氢氧化细菌的培养，适用于产业化。同时，本发明的固体有机菌肥粗蛋白含量大于30％，是一种高蛋白含量的有机肥，含有较高的营养价值。
附图说明
图1氢氧化细菌、固氮菌、真菌能量循环示意图。
图2为本发明基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂与基于氢氧化细菌的联合微生物固体有机菌肥制备的工艺流程图。
图3为生物固氮反应式示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
本发明基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂与基于氢氧化细菌的联合微生物固体有机水溶菌肥和固体有机菌肥的制备方法，包括以下步骤：
工艺说明：整个液体工艺流程设备采用管路串联，液体采用溢流输送，溢流流量可根据实际制备需求调整，设定为80～100L/h。1～5级菌种制备装置串联连接，菌种制备装置液体容量为0.5m3；各级菌种发酵温度为28-35℃；各级菌种装置中的液体流量为100L/h，并通入压缩空气，气流量为2～3m3/h；废气依次导入各级菌种制备装置，末端5级菌种制备装置中的废气连接活性炭吸附装置。
(1)从中国广东鼎湖山国家级自然保护区原始生态环境(原始生态环境在本发明中的定义为：植被的土壤未受到人工破坏，未经过化学肥、农业肥等肥料的浇灌，保持天然土壤根系微生态环境)的植被下方，取湿度为16％的湿草炭土，溶水搅拌稀释后沉淀，取1L上清液作为原始菌种。
(2)取汽车涂装水性涂料废水以100L/h的流量进入紫外光催化灭菌装置，紫外光催化灭菌时间确保＞15min，灭菌后的涂装废水进入絮凝固液分离装置进行固液分离获得废水液体与含水率为80％的固态废渣；将分离的废水液体以80L/h的流量，溢流进1级菌种制备装置，将原始菌种接入1级菌种制备装置与废水液体混和，启动液体循环系统，通入压缩空气，进行发酵培养。
(3)1级菌种培养7天后获得2级菌种，将2级菌种接种至3级菌种制备装置，培养7天后获得4级菌种，将4级菌种接种至5级菌种制备装置，培养7天，获得5级菌种；其中每级菌种在所属的菌种制备装置进行液态发酵。
(4)将获得的5级发酵液采用絮凝分离的方法，10倍浓缩，制备得到发明的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，发酵液中的总菌含量＞3×108个/ml；氢氧化细菌总丰度比为55-70％，菌含量＞1×108个/ml；总氨基酸＞100mg/100g。
(5)获得固氮制剂后，将步骤(4)絮凝分离提取浓缩液后剩余的液体，制得本发明有机水溶菌肥，总菌含量＞3×106个/ml；其中氢氧化细菌总丰度比为55-70％，菌含量＞1×106个/ml，总氨基酸＞1.5mg/100g。
(6)将步骤(2)获得的固态废渣与步骤(3)获得的经10倍浓缩的3级菌种在混合罐中混合后导入发酵罐进行发酵，温度为28-35℃，两组发酵罐交替进料，通入压缩空气供氧，废气导入活性炭吸附装置。发酵10天后导出发酵产物至混合脱水装置。
(7)活性炭吸附饱和后导出至混合脱水装置，与发酵产物搅拌混合后脱水处理，液体作为菌种回流到发酵罐，固体烘干造粒，制得本发明的基于氢氧化细菌的联合微生物固体有机菌肥，其中发酵固态产物的粗蛋白质含量为＞30％。
实施例2
在实施例1的固氮制剂、有机水溶菌肥和固体有机菌肥的发酵过程中，取样检测，结果如表3所示：
表3：固氮制剂和有机菌肥发酵过程的检测结果
Figure GDA0002227440130000101
Figure GDA0002227440130000111
备注：①代表氢噬胞菌(Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T)②代表假单胞菌(Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T)③代表固氮螺菌(Azospirillum rugosumIMMIB AFH-6T)④代表蓝藻固氮菌(Elstera cyanobacteriorum TH019T)⑤代表Varicosporellopsis aquatilis JW75003⑥代表Atractium crassum CBS180.31T⑦代表Paracremonium sp.CBS 143277⑧代表Uncultured fungus clone(KU534750)⑨Uncultured Basidiomycota clone(KU000527)。
结果如表3所示，pH值由8.85(1级)弱碱性迅速转为弱酸性5.78(1级)～6.42(2级)，说明真菌快速繁殖，把废水中的有机化合物转化成有机酸和CO2，使PH值快速下降，并为氢氧化细菌和固氮菌提供碳源，符合真菌的作用机理。随后PH值开始逐渐回升7.02(3级)～7.13(5级)，趋于中性，说明氢氧化细菌和固氮菌加快繁殖，消耗水中的有机酸并达到平衡。
TKN(氨态氮+有机态氮)指标数据从13mg/L(进料)到600mg/L(4-5级)，说明固氮菌的同步繁殖实现固氮作用(氨态氮)；同时，氨基酸检测报告说明，氢氧化细菌也在同步繁殖并合成了氨基酸(有机态氮)，符合氢氧化细菌的作用机理、也符合两组菌种联合固氮的机理。共检测出14中氨基酸，包括：ASP天冬氨酸、TER苏氨酸、SER丝氨酸、GLU谷氨酸、GLY甘氨酸、ALA丙氨酸、VAL缬氨酸、ILE异亮氨酸、LEU亮氨酸、PHE苯丙氨酸、LYS赖氨酸、HIS组氨酸、ARG精氨酸、PRO脯氨酸。5级菌种发酵后测定的氨基酸含量为14.91mg/100g，将获得的5级发酵液采用絮凝分离的方法，10倍浓缩后制备得到的联合微生物固氮制剂。
真菌总含量从5×107个/ml(1级))到1.7×107个/ml(5级)，是逐步递减的变化规律。结合PH值的变化规律，说明初期是以真菌繁殖作用为主，主要是将有机物转化成有机酸，作为氢氧化细菌的营养物质。
细菌总含量从1.1×106个/ml(1级))到1.8×107个/ml(5级)，是逐步递增的变化规律。后期是以氢氧化细菌和固氮菌繁殖作用为主，消耗有机酸，开始固氮并合成氨基酸。也符合pH值的变化规律。
前述真菌和细菌的菌含量、丰度比的变化规律以及PH值得变化规律符合本项目的工艺机理。
固态发酵过程中发酵产物出现胶状絮凝物，且并不断增加，逐渐形成不规则形状固体物。发酵完成后取出该固体物，洗净表面矿物质杂质，该固体物呈肉色、肠衣状、较高弹性，动物实验验证动物可食用且无不良病理反应。烘干该固体物后进行检测，结果证明粗蛋白质含量为30.41％。
实施例3
本发明采用汽车涂装水性涂料废水为作培养基，在2016年8月1日起施行的《国家危险废物名录》中：
废物类别确定为HW06废有机溶剂与含有机溶剂废物，行业来源为非特定行业，废物代码包括：900-402-06、900-403-06、900-404-06，以及处理前述废物产生的浮渣和污泥，废物代码：900-409-06，900-410-06。
经检测含有如下成分如下表4：
表4：培养基组分及其含量
Figure GDA0002227440130000121
Figure GDA0002227440130000131
上述培养基的参数特征，见表5：
表5：培养基参数
Figure GDA0002227440130000132
Figure GDA0002227440130000141
如表5所示，培养基的初始pH值为8.80-8.90，呈弱碱性，不适于联合菌种的存活条件，但真菌在发酵过程中可以迅速把培养基中的有机化合物分解转化成有机酸和CO2，为复合菌种代谢循环提供碳源的同时，也能够把培养基转化为弱酸状态。
实施例4
取实施例1中的第5级液体发酵液放入于透明容器中，密封、避光，自然环境温度15-35℃，静置14天、21天、28天、60天，观察发现，随着时间的推移，容器内逐渐出现丝状透明悬浮絮凝物，絮凝物缓慢增加并逐渐聚集成无规则团状，约60天左右稳定。过滤分离并检测絮凝物，检测报告显示，该絮凝物为长肽和蛋白质，其中粗蛋白质含量62.3％，说明氢氧化细菌把液体中的氨基酸继续合成长肽/蛋白质，根据絮凝物检测的质量数据结合氨基酸检测报告的氨基酸含量数据计算分析：固氮菌剂几乎把容器中的液态氨基酸全部转化成长肽/蛋白质。这充分说明本发明的固氮菌剂具有良好的储存活性。
实施例6
本实施例采用实施例1的制备方法制备基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂与基于氢氧化细菌的联合微生物固体有机水溶菌肥和固体有机菌肥。本实施例与实施例1的唯一区别在于本实施例的步骤(1)为从中国湖南莽山国家级自然保护区原始生态环境的植被下方，取湿度为30％的湿草炭土，溶水搅拌稀释后沉淀，取1L上清液作为原始菌种(即初级菌种)。
本实施例在制备本发明的固氮制剂、有机水溶菌肥和固体有机菌肥的发酵过程中，取样检测，结果如表6所示：
表6：实施例6固氮制剂和有机菌肥发酵过程的检测结果
Figure GDA0002227440130000151
Figure GDA0002227440130000161
备注：①代表氢噬胞菌(Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T)②代表假单胞菌(Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T)③代表固氮螺菌(Azospirillum rugosumIMMIB AFH-6T)④代表蓝藻固氮菌(Elstera cyanobacteriorum TH019T)⑤代表Varicosporellopsis aquatilis JW75003⑥代表Atractium crassum CBS180.31T⑦代表Paracremonium sp.CBS 143277⑧代表Uncultured fungus clone(KU534750)⑨Uncultured Basidiomycota clone(KU000527)。
实施例7
本实施例采用实施例1的制备方法制备基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂与基于氢氧化细菌的联合微生物固体有机水溶菌肥和固体有机菌肥。本实施例与实施例1的唯一区别在于本实施例的步骤(1)为从中国广东南岭国家级自然保护区原始生态环境的植被下方，取湿度为50％的湿草炭土，溶水搅拌稀释后沉淀，取1L上清液作为原始菌种(即初级菌种)。
本实施例在制备本发明的固氮制剂、有机水溶菌肥和固体有机菌肥的发酵过程中，取样检测，结果如表7所示：
表7：实施例7固氮制剂和有机菌肥发酵过程的检测结果
Figure GDA0002227440130000162
Figure GDA0002227440130000171
备注：①代表氢噬胞菌(Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T)②代表假单胞菌(Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T)③代表固氮螺菌(Azospirillum rugosumIMMIB AFH-6T)④代表蓝藻固氮菌(Elstera cyanobacteriorum TH019T)⑤代表Varicosporellopsis aquatilis JW75003⑥代表Atractium crassum CBS180.31T⑦代表Paracremonium sp.CBS 143277⑧代表Uncultured fungus clone(KU534750)⑨Uncultured Basidiomycota clone(KU000527)。
应用实施例8苦荬菜种植蘸根
将苦荬菜移栽苗分为对照组和实验组(实施例1、6、7)。对照组采用常规方法移栽种植；实验组的苦荬菜采用本发明的复合菌种进行蘸根处理后移栽，约45天后测定两组各项指标，结果见表8。
表8：对照组、实验组各项指标检测结果
Figure GDA0002227440130000181
如表8所示，对照组相比经本发明复合菌种处理后的苦荬菜，显著提高了产量，并提高了质量。
应用实施例9蓖麻浸种实验
将蓖麻种分为对照组和实验组(实施例1、6、7)。对照组采用常规方法种植；实验组的蓖麻种采用本发明的复合菌种进行浸种处理后种植，约20天后测定两组幼苗各项指标，结果见表9。
表9：对照组、实验组各项指标检测结果
Figure GDA0002227440130000191
如表9所示，对照组相比经本发明复合菌种处理后的蓖麻种，发芽出苗良好，长势质量有显著优势。
由应用实施例8、9的结果表明，本发明的固氮菌剂可以广泛的应用于多种植物，具有广谱促长作用；根据不同植物的生长特性，可采用浸种、蘸根或底肥方法使用。
本发明的固氮菌剂在发酵过程中就同步合成了含量较高的氨基酸，在应用于植物根系固氮的同时，也提供了高质量的有机肥料，实现了微生物固氮制剂+有机肥料的组合。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，由以下方法制备而成：由氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养获得初级菌种后，将富含有机物的废水进行固液分离，将初级菌种接种至分离的液体逐级富集发酵培养，将获得的第五级发酵液进行浓缩，即得基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂；
所述氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养通过以下方法实现：通过真菌将富含有机物的废水中的有机含碳化合物分解为有机酸与CO2，提供给氢氧化细菌作为异养模式的碳源；固氮菌将空气中的N2转化成NH3，并同时释放出H2；氢氧化细菌利用有机酸、CO2、NH3、H2以及空气中的O2作为其代谢元素，进行富集培养；
所述氢氧化细菌为氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T和假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T；所述固氮菌为固氮螺菌Azospirillumrugosum IMMIB AFH-6T和蓝藻固氮菌Elstera cyanobacteriorum TH019T；所述真菌为子囊菌门真菌为Varicosporellopsis aquatilis JW75003或/和Atractium crassumCBS180.31T或/和Paracremonium sp.CBS 143277中的一种或几种；所述真菌为担子菌门真菌为Uncultured fungus clone KU534750或/和Uncultured Basidiomycota cloneKU000527。
2.如权利要求1所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，所述富含有机物的废水为工业有机废水、禽畜废水、生活污水或汽车涂装水性涂料废水。
3.如权利要求2所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，所述富含有机物的废水为汽车涂装水性涂料废水。
4.如权利要求1所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，所述联合微生物固氮制剂包含以下菌种：氢氧化细菌、固氮菌、子囊菌门真菌和担子菌门真菌；其中复合菌种的总菌含量＞3×108个/ml；氢氧化细菌在所述复合菌种中的总丰度比为55-70％，菌含量＞1.1×108个/ml。
5.如权利要求1所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，所述氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T的丰度比为45-55％，菌含量＞9×107个/ml；所述假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T的丰度比为10-15％，菌含量＞2×107个/ml；所述固氮螺菌的丰度比为10-15％，菌含量＞2×107个/ml；所述蓝藻固氮菌的丰度比为3-5％，菌含量＞1×107个/ml；所述Varicosporellopsis aquatilis JW75003的丰度比为18-25％，菌含量＞4×107个/ml；所述Atractium crassum CBS180.31T的丰度比为20-25％，菌含量＞4×107个/ml；所述Paracremonium sp.CBS 143277的丰度比为10-15％，菌含量＞2×107个/ml；所述Uncultured fungus clone KU534750的丰度比为28-35％，菌含量＞5×107个/ml；所述Uncultured Basidiomycota clone KU000527的丰度比为4-7％，菌含量＞2×107个/ml。
6.如权利要求1～5中任一项权利要求所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，所述固氮制剂还包含氨基酸，所述氨基酸含量为＞100mg/100g。
7.如权利要求1～6中任一项权利要求所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂在制备植物促长剂中的应用。
8.一种基于氢氧化细菌的联合微生物有机水溶菌肥，其特征在于，由以下方法制备而成：由氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养获得初级菌种后，将富含有机物的废水进行固液分离，将初级菌种接种至分离的液体中逐级富集培养，将获得的第五级发酵液进行浓缩，提取浓缩液后剩余的液体，即得基于氢氧化细菌的联合微生物有机水溶菌肥；所述氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养采用权利要求1中所述的方法，所述氢氧化细菌为氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T和假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensisCCOS 864T；所述固氮菌为固氮螺菌Azospirillum rugosum IMMIB AFH-6T和蓝藻固氮菌Elstera cyanobacteriorum TH019T；所述真菌为子囊菌门真菌为Varicosporellopsisaquatilis JW75003或/和Atractium crassum CBS180.31T或/和Paracremonium sp.CBS143277中的一种或几种；所述真菌为担子菌门真菌为Uncultured fungus clone KU534750或/和Uncultured Basidiomycota clone KU000527。
9.如权利要求8所述的基于氢氧化细菌的联合微生物有机水溶菌肥，其特征在于，所述有机水溶菌肥包含以下菌种：氢氧化细菌、固氮菌、子囊菌门真菌和担子菌门真菌；其中复合菌种的总菌含量＞3×106个/ml；氢氧化细菌在所述复合菌种中的菌含量＞1.1×106个/ml；所述有机水溶菌肥的总氨基酸含量为＞1.5mg/100g。
10.一种基于氢氧化细菌的联合微生物固体有机菌肥，其特征在于，由氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养获得初级菌种后，将富含有机物的废水进行固液分离，将初级菌种接种至分离的液体中逐级富集培养，将逐级富集培养中的三级菌种接种至有机废水固液分离的废渣中进行固态发酵，获得的固态发酵产物与废气吸附饱和的活性炭混合脱水后即为联合微生物固体有机菌肥；所述氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养采用权利要求1中所述的方法，所述氢氧化细菌为氢噬胞菌Hydrogenophaga laconesensis HWB-10T和假单胞菌Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864T；所述固氮菌为固氮螺菌Azospirillumrugosum IMMIB AFH-6T和蓝藻固氮菌Elstera cyanobacteriorum TH019T；所述真菌为子囊菌门真菌为Varicosporellopsis aquatilis JW75003或/和Atractium crassumCBS180.31T或/和Paracremonium sp.CBS 143277中的一种或几种；所述真菌为担子菌门真菌为Uncultured fungus clone KU534750或/和Uncultured Basidiomycota cloneKU000527。
11.如权利要求10所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固体有机菌肥，其特征在于，所述固体有机菌肥包含氢氧化细菌、固氮菌、子囊菌门真菌和担子菌门真菌共同培养的复合菌种，以及氨基酸、发酵固态产物的粗蛋白和活性炭。
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