CN115177587A - 一种青蒿素及其衍生物胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种青蒿素及其衍生物胶束及其制备方法和应用。本发明提供的青蒿素及其衍生物胶束，包括胶束载体和负载于所述胶束载体中的活性药物；所述活性药物包括青蒿素和/或青蒿素衍生物；所述胶束载体为果胶‑酪蛋白复合物，所述果胶‑酪蛋白复合物由果胶和酪蛋白经碳二亚胺反应得到。本发明以果胶‑酪蛋白复合物作为药物胶束载体，果胶‑酪蛋白复合物在水中形成亲水端向外，疏水端向内的胶束结构，能够有效进行药物包载，负载青蒿素和/或青蒿琥酯共同作用于机体治疗自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮，能够在一定程度上保障长期口服药物时药物对胃肠道的刺激性伤害，有利于药物对自身免疫疾病的长期治疗。

Description

一种青蒿素及其衍生物胶束及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种青蒿素及其衍生物胶束及其制备方法和应用。

背景技术

青蒿素(ART)及其衍生物青蒿琥酯(AS)是传统抗疟药物，同时也对抗肿瘤、免疫抑制以及自身性免疫系统疾病风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等具有一定作用。但ART和AS具有在水中溶解度差、在胃肠道环境不稳定、生物利用度低和具有一定毒性的缺点，这大幅度降低了二者的药效，使其治疗与应用具有一定局限性。

天然生物大分子具有较高的生物相容性、较小的毒副作用以及较低的成本等优点，是纳米药物载体的可靠来源。选择合适的载体应用于特定疾病的治疗可高效利用载体和药物，有利于药物的吸收和疾病的治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青蒿素及其衍生物胶束及其制备方法和应用，本发明提供的青蒿素及其衍生物胶束口服时能够避免药物对胃肠道的刺激和胃液对药物的破坏，有效保护药物安全通过胃肠道环境运送至小肠的粘液层被吸收，实现青蒿素及其衍生物水溶性和生物利用度的提高，可有效应用于自身免疫性疾病的治疗。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种青蒿素及其衍生物胶束，包括胶束载体和负载于所述胶束载体中的活性药物；所述活性药物包括青蒿素和/或青蒿素衍生物；所述胶束载体为果胶-酪蛋白复合物，所述果胶-酪蛋白复合物由果胶和酪蛋白经碳二亚胺反应得到。

优选的，所述活性药物包括青蒿素时，胶束中青蒿素的质量含量为5～10wt％；

所述活性药物包括青蒿琥酯时，胶束中青蒿琥酯的质量含量为30～50wt％。

优选的，所述青蒿素及其衍生物胶束的粒径为50～240nm。

优选的，所述果胶-酪蛋白复合物的制备方法包括以下步骤：

在保护气体和避光的条件下，将果胶的水溶液、缩合试剂、酪蛋白的缓冲溶液混合进行碳二亚胺反应，得到果胶-酪蛋白复合物；所述碳二亚胺反应的pH值为7±0.5。

优选的，所述果胶和酪蛋白的质量比为1:(0.5～5)。

本发明提供了上述技术方案所述的青蒿素及其衍生物胶束的制备方法，包括以下步骤：

将果胶-酪蛋白复合物的水溶液和活性药物的醇溶液混合进行超声载药，得到所述青蒿素及其衍生物胶束。

优选的，所述果胶-酪蛋白复合物和活性药物的质量比为20:(1～50)。

优选的，所述超声载药的时间为2.5～25min，所述超声载药的超声功率为60～540W。

优选的，所述超声载药后得到载药溶液，还包括将所述载药溶液去除醇溶剂后，离心分离得到上清液，将所述上清液冻干，得到所述青蒿素及其衍生物胶束；所述离心分离的转速为5000～8000r/min，所述离心分离的时间为8～15min。

本发明提供了上述技术方案所述青蒿素及其衍生物胶束或上述技术方案所述的制备方法制备得到的青蒿素及其衍生物胶束在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

本发明提供了一种青蒿素及其衍生物胶束，包括胶束载体和负载于所述胶束载体中的活性药物；所述活性药物包括青蒿素和/或青蒿素衍生物；所述胶束载体为果胶-酪蛋白复合物，所述果胶-酪蛋白复合物由果胶和酪蛋白经碳二亚胺反应得到。本发明以果胶-酪蛋白复合物作为药物胶束载体，所述果胶-酪蛋白复合物由果胶和酪蛋白经碳二亚胺反应得到，由果胶中的羧基基团与酪蛋白的氨基基团发生酰胺反应，使得到的果胶-酪蛋白复合物在水中形成亲水端(果胶碳链)向外，疏水端(酪蛋白单元)向内的胶束结构，能够有效进行药物包载，果胶-酪蛋白复合物具有较强的生物相容性和安全性，作为胶束载体能够有效保护药物不被胃肠液环境破坏，有利于药物运输至小肠，实现生物利用度的提高；而且果胶为天然多糖，酪蛋白为蛋白质，本身生物安全性高且具有一定的免疫调节作用。本发明以果胶-酪蛋白复合物作为药物胶束载体负载青蒿素和/或青蒿琥酯共同作用于机体治疗自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮，能够在一定程度上减轻长期口服药物时药物对胃肠道的刺激性伤害，有利于药物对自身免疫疾病的长期治疗。

本发明提供了上述技术方案所述的青蒿素及其衍生物胶束的制备方法，包括以下步骤：将果胶-酪蛋白复合物的水溶液和活性药物的醇溶液混合进行超声载药，得到所述青蒿素及其衍生物胶束。本发明提供的制备方法在果胶-酪蛋白复合物的水溶液中采用超声载药的方式实现果胶-酪蛋白复合物对活性药物负载，药物载药量高，包封率高，且本发明提供的制备方法简单，反应温和，制备使用的材料和溶剂均无毒，具有较好的环境效益，可应用于工厂化生产。

附图说明

图1为果胶-酪蛋白复合物(PC)冻干粉、青蒿素胶束(PC-ART)冻干粉、青蒿琥酯胶束(PC-AS)冻干粉复溶后的状态和PC、PC-ART、PC-AS透射电镜图；

图2为PC、PC-ART、PC-AS原子力显微镜图；

图3为PC-ART和PC-AS的红外光谱图；

图4为10天内PC-ART和PC-AS的粒径和Zeta电位的变化；

图5为PC-ART和PC-AS在人工胃液和人工肠液中的溶出曲线；

图6为PC-ART和PC-AS在大鼠体内的血药浓度-时间曲线图；

图7为PC-ART和PC-AS对斑马鱼成鱼肝功能的影响；

图8为PC-ART和PC-AS对斑马鱼成鱼肌肉氧化应激的影响；

图9为在不同浓度PC-ART和PC-AS处理下Caco-2细胞的细胞活力；

图10为治疗8周后MRL/lpr小鼠的生理状态；

图11为PC-ART和PC-AS给药期间MRL/lpr小鼠尿液中尿蛋白含量的变化。ART组(50mg/kg/天)，PC-ART低剂量组(12.5mg/kg/天)，PC-ART中剂量组(25mg/kg/天)，PC-ART高剂量组(50mg/kg/天)，AS组(50mg/kg/天)，PC-AS低剂量组(12.5mg/kg/天)，PC-AS中剂量组(25mg/kg/天)，PC-AS高剂量组(50mg/kg/天)，阳性对照组1(PNS，2mg/kg/天)，阳性对照组2(DHA，50mg/kg/天)；

图12为PC-ART和PC-AS治疗对MRL/lpr小鼠血浆中血肌酐(Cre)和血尿素氮(BUN)的影响；

图13为PC-ART和PC-AS治疗对MRL/lpr小鼠血浆中抗核抗体(ANA)和抗双链DNA抗体(dsDNA-Ab)的影响；

图14为PC-ART和PC-AS治疗对MRL/lpr小鼠血浆中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素6(IL-6)的影响；

图15为小鼠肾脏组织HE染色；图15中的A：ART组，图15中的B：PC-ART低剂量组，图15中的C：PC-ART中剂量组，图15中的D：PC-ART高剂量组，图15中的E：AS组，图15中的F：PC-AS低剂量组，图15中的G：PC-AS中剂量组，图15中的H：PC-AS高剂量组，图15中的I：阳性对照组1(PNS)，图15中的J：阳性对照组2(DHA)，图15中的K：模型组，图15中的L：空白对照组，400×；

图16为小鼠肾脏组织PASM染色；图16中的A：ART组，图16中的B：PC-ART低剂量组，图16中的C：PC-ART中剂量组，图16中的D：PC-ART高剂量组，图16中的E：AS组，图16中的F：PC-AS低剂量组，图16中的G：PC-AS中剂量组，图16中的H：PC-AS高剂量组，图16中的I：阳性对照组1(PNS)，图16中的J：阳性对照组2(DHA)，图16中的K：模型组，图16中的L：空白对照组，400×；

图17为小鼠肾脏组织Masson染色；图17中的A：ART组，图17中的B：PC-ART低剂量组，图17中的C：PC-ART中剂量组，图17中的D：PC-ART高剂量组，图17中的E：AS组，图17中的F：PC-AS低剂量组，图17中的G：PC-AS中剂量组，图17中的H：PC-AS高剂量组，图17中的I：阳性对照组1(PNS)，图17中的J：阳性对照组2(DHA)，图17中的K：模型组，图17中的L：空白对照组，400×；

图18为小鼠肾脏组织免疫复合物IgG免疫组化图；图18中的A：ART组，图18中的B：PC-ART低剂量组，图18中的C：PC-ART中剂量组，图18中的D：PC-ART高剂量组，图18中的E：AS组，图18中的F：PC-AS低剂量组，图18中的G：PC-AS中剂量组，图18中的H：PC-AS高剂量组，图18中的I：阳性对照组1(PNS)，图18中的J：阳性对照组2(DHA)，图18中的K：模型组，图18中的L：空白对照组，400×；

图19为PC-ART和PC-AS治疗对MRL/lpr小鼠肾脏中免疫复合物IgG积累的影响；

图20为PC-ART和PC-AS治疗对MRL/lpr小鼠肾脏中抗双链DNA-IgG抗体(dsDNA-IgG)和抗双链DNA-IgM抗体(dsDNA-IgM)的影响；

图21为PC-ART和PC-AS治疗对MRL/lpr小鼠肾脏中白细胞介素21(IL-21)的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种青蒿素及其衍生物胶束，包括胶束载体和负载于所述胶束载体中的活性药物；所述活性药物包括青蒿素和/或青蒿素衍生物；所述胶束载体为果胶-酪蛋白复合物，所述果胶-酪蛋白复合物由果胶和酪蛋白经碳二亚胺反应得到。

在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。

本发明提供的青蒿素及其衍生物胶束包括胶束载体，所述胶束载体为果胶-酪蛋白复合物，所述果胶-酪蛋白复合物由果胶和酪蛋白经碳二亚胺反应得到。

在本发明中，所述果胶-酪蛋白复合物的制备方法优选包括以下步骤：

在保护气体和避光的条件下，将果胶的水溶液、缩合试剂、酪蛋白的缓冲溶液混合进行碳二亚胺反应，得到果胶-酪蛋白复合物；所述碳二亚胺反应的pH值为7±0.5。

在本发明中，所述缩合试剂具体优选为第一交联剂和第二交联剂。

在本发明中，所述第一交联剂具体优选为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。

在本发明中，所述第二交联剂具体优选为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

在本发明中，所述碳二亚胺反应的具体实施方法优选为：

在保护气体中，将果胶的水溶液和第一交联剂混合进行羧基活化，得到活化溶液；

在保护气体中，将所述活化溶液和第二交联剂混合进行反应，得到反应溶液；

在保护气体中，将所述反应溶液和酪蛋白的缓冲溶液混合进行碳二亚胺反应。

在本发明中，所述保护气体具体优选为氮气。

在本本发明中，所述果胶的水溶液的pH值优选为5～6.

在本发明的具体实施例中，所述果胶的质量为1g时，所述第一交联剂的用量为10mmol。

在本发明的具体实施例中，所述果胶的质量为1g时，所述第二交联剂的用量为10mmol。

在本发明中，所述第一交联剂和第二交联剂的摩尔比优选为1:1。

在本发明中，所述羧基活化的时间优选为15min。

在本发明中，所述活化溶液和第二交联剂混合进行反应的时间优选为1h。

在本发明中，将所述反应溶液和酪蛋白的缓冲溶液混合进行碳二亚胺反应的时间优选为24h。

在本发明中，所述果胶和酪蛋白的质量比优选为1:(0.5～5)，更优选为1:(1～4.5)，进一步优选为1:(1.5～4)，最优选为1:2。

在本发明中，所述碳二亚胺反应的pH值优选为7±0.5。

在本发明中，所述碳二亚胺反应优选在超声的条件进行，本发明对所述超声的具体实施过程没有特殊要求。

在本发明中，所述碳二亚胺反应后得到碳二亚胺反应液，本发明优选对所述碳二亚胺反应液进行后处理，得到果胶-酪蛋白复合物。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行加入醇溶剂除去缩合试剂、低温保存过夜、固液分离、取固液分离得到的固体产物加水复溶后除去未反应的果胶和酪蛋白、冷冻干燥。在本发明中，所述醇溶剂优选为乙醇和水的混合溶剂，在本发明中，所述乙醇和水的混合溶液中乙醇的浓度优选为95vol％。在本发明中，所醇溶剂和所述碳二亚胺反应液的体积之比优选为3:1。在本发明中，所述低温保存过夜的温度优选为4℃。在本发明中，所述固液分离优选为离心分离，在本发明中，所述离心分离的转速优选为5000rpm，所述离心分离的时间优选为10min。

本发明提供的青蒿素及其衍生物胶束，包括负载于所述胶束载体中的活性药物；所述活性药物包括青蒿素和/或青蒿素衍生物。

在本发明中，所述青蒿素衍生物具体优选为青蒿琥酯。

在本发明中，所述活性药物优选包封在所述胶束载体的疏水内壳中。

在本发明中，所述活性药物优选包括青蒿素或青蒿琥酯。

在本发明中，所述活性药物优选包括青蒿素时，青蒿素胶束中青蒿素的质量含量优选为5～10wt％，更优选为7～9.5wt％，进一步优选为8～9.2wt％。

在本发明中，所述活性药物优选包括青蒿琥酯时，青蒿琥酯胶束中青蒿琥酯的质量含量优选为30～50wt％，更优选为40～50wt％，进一步优选为41～48wt％。

在本发明中，所述青蒿素及其衍生物胶束的粒径优选为50～240nm，更优选为90～120nm。

本发明提供的青蒿素及其衍生物胶束选择具有免疫调节作用的天然大分子多糖和蛋白质，果胶和酪蛋白，利用碳二亚胺反应合成果胶-酪蛋白胶束载体，负载青蒿素和/或青蒿琥酯。胶束载体作为药物的外壳，其中的果胶可避免药物对胃肠道的刺激和胃液对药物的破坏，有效保护药物安全通过胃肠道环境运送至小肠的粘液层被吸收，实现青蒿素和青蒿琥酯水溶性和生物利用度的提高，有效应用于系统性红斑狼疮的治疗。

本发明提供了上述技术方案所述的青蒿素及其衍生物胶束的制备方法，包括以下步骤：

将果胶-酪蛋白复合物的水溶液和活性药物的醇溶液混合进行超声载药，得到所述青蒿素及其衍生物胶束。

在本发明中，所述果胶-酪蛋白复合物的水溶液具体优选为果胶-酪蛋白复合物的蒸馏水溶液。

在本发明中，所述果胶-酪蛋白复合物和活性药物的质量比优选为20:(1～50)，更优选为20:(2～10)。

在本发明中，所述活性药物的醇溶液优选为活性药物的乙醇溶液。

在本发明中，所述活性药物的乙醇溶液中，所述乙醇的浓度优选为5～80vol％，更优选为10～60vol％。

在本发明中，所述超声载药的时间优选为2.5～25min，更优选为5～20min。

在本发明中，所述超声载药的超声功率优选为60～540W，更优选为180～300W。

在本发明中，所述超声载药具体优选为探头超声法。

在本发明中，所述超声载药后得到载药溶液，本发明优选还包括将所述载药溶液去除醇溶剂后，离心分离得到上清液，将所述上清液冻干，得到所述青蒿素及其衍生物胶束。

在本发明中，所述离心分离的转速为5000～8000r/min，更优选为8000r/min。

在本发明中，所述离心分离的时间优选为8～15min，更优选为10min。

本发明提供的制备方法简单，反应温和，制备使用的材料和溶剂均无毒，具有较好的环境效益，可应用于工厂化生产。

本发明提供了上述技术方案所述青蒿素及其衍生物胶束或上述技术方案所述的制备方法制备得到的青蒿素及其衍生物胶束在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

在本发明中，所述自身免疫性疾病药物具体优选为系统性红斑狼疮(SLE)的药物或风湿性关节炎的药物，更优选为系统性红斑狼疮的药物

本发明采用本方法制备得到的青蒿素口服胶束，载药量优选为8～9.2％，包封率优选为70～90％。

本发明采用本方法制备得到的制备得到的青蒿琥酯口服胶束，载药量优选为40～50％，包封率优选为75～95％。

在本发明中青蒿素和青蒿琥酯的水溶性差，经过载药后的青蒿素和青蒿琥酯包裹在果胶-酪蛋白-胶束中，可提高其在水中的溶解度。

本发明提供了一种药物，所述药物包括药物活性成分和药物辅料，所述药物活性成分为上述技术方案所述青蒿素及其衍生物胶束或上述技术方案所述的制备方法制备得到的青蒿素及其衍生物胶束。

在本发明中，所述药物辅料为药学上可接受的辅料。

本发明对所述药学上可接受的辅料的种类没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的辅料即可。

在本发明中，所述药物为治疗SLE的药物。

在本发明中，所述药物的剂型优选为口服制剂。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将pH＝6的果胶水溶液(果胶为1g)中加入10mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，氮气保护下活化羧基15min，随后加入10mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应1h。在超声条件下加入酪蛋白溶液，果胶和酪蛋白的质量比为1:1，调节pH＝7，在氮气保护和避光条件下进行碳二亚胺反应24h。向碳二亚胺反应后的反应液体中加入三倍反应液体体积的95vol％乙醇-水溶液，4℃条件下冰箱过夜，5000rpm离心10min，除去EDC、NHS和多余的酪蛋白，取离心沉淀复溶于冷水中，冻干，得到果胶-酪蛋白复合物(PC)；

将ART溶解于乙醇中，将冻干得到的PC复溶于蒸馏水中。向PC水溶液中缓慢加入ART乙醇溶液，利用探头超声法使PC负载ART，超声载药时间为5min，超声载药功率为180W，ART乙醇溶液中乙醇浓度为60vol％，PC和药物的质量比为20:10；

超声载药后，将乙醇经旋蒸除去，8000rpm离心10min，取上清液冻干，得到青蒿素口服胶束(PC-ART)。

利用HPLC法检测PC-ART中青蒿素的含量，计算青蒿素的载药量和包封率，PC-ART的载药量和包封率分别为8.53％和79.58％。

实施例2

将pH＝6的果胶水溶液(果胶为1g)中加入10mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，氮气保护下活化羧基15min，随后加入10mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应1h。在超声条件下加入酪蛋白溶液，果胶和酪蛋白的质量比为1:2，调节pH＝7，在氮气保护和避光条件下进行碳二亚胺反应24h。向碳二亚胺反应后的反应液体中加入三倍反应液体体积的95vol％乙醇-水溶液，4℃条件下冰箱过夜，5000rpm离心10min，除去EDC、NHS和多余的酪蛋白，取离心沉淀复溶于冷水中，冻干，得到果胶-酪蛋白复合物(PC)；

将AS溶解于乙醇中，将冻干得到的PC复溶于蒸馏水中。向PC水溶液中缓慢加入AS乙醇溶液，利用探头超声法使PC负载AS，超声载药时间为20min，超声载药功率为300W，AS乙醇溶液中乙醇浓度为10vol％，PC和药物的质量比为20:50；

超声载药后，将乙醇经旋蒸除去，8000rpm离心10min，取上清液冻干，得到青蒿琥酯口服胶束(PC-AS)。

利用HPLC法检测PC-AS中青蒿琥酯的含量，计算青蒿琥酯的载药量和包封率，PC-AS的载药量和包封率分别为47.05％和50.78％。

实施例3

将pH＝5.5的果胶水溶液(果胶为1g)中加入10mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，氮气保护下活化羧基15min，随后加入10mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应1h。在超声条件下加入酪蛋白溶液，果胶和酪蛋白的质量比为1:2，调pH＝7，在氮气保护和避光条件下进行碳二亚胺反应24h。向碳二亚胺反应后的反应液体中加入三倍反应液体体积的95％vol乙醇-水溶液，4℃冰箱过夜。5000rpm离心10min，除去EDC、NHS和多余的酪蛋白，取沉淀复溶于冷水中，冻干，得到果胶-酪蛋白胶束(PC)；

将ART溶解于乙醇中，将冻干得到的PC复溶于蒸馏水中。向PC水溶液中缓慢加入ART乙醇溶液，利用探头超声法使PC负载ART，超声载药时间为10min，超声载药功率为300W，ART乙醇溶液中乙醇浓度为10vol％，PC和药物的质量比为20:10；

超声载药后，将乙醇经旋蒸除去，8000rpm离心10min，取上清液冻干，得到青蒿素口服胶束(PC-ART)。

利用HPLC法检测PC-ART中青蒿素的含量，计算青蒿素的载药量和包封率，PC-ART的载药量和包封率分别为9.05％和83.16％。

实施例4

将pH＝5.5的果胶水溶液(果胶为1g)中加入10mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，氮气保护下活化羧基15min，随后加入10mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应1h。在超声条件下加入酪蛋白溶液，果胶和酪蛋白的质量比为1:3，调pH＝7，在氮气保护和避光条件下进行碳二亚胺反应24h。向碳二亚胺反应后的反应液体中加入三倍反应液体体积的95％vol乙醇-水溶液，4℃冰箱过夜。5000rpm离心10min，除去EDC、NHS和多余的酪蛋白，取沉淀复溶于冷水中，冻干，得到果胶-酪蛋白胶束(PC)；

将AS溶解于乙醇中，将冻干得到的PC复溶于蒸馏水中。向PC水溶液中缓慢加入AS乙醇溶液，利用探头超声法使PC负载AS，超声载药时间为10min，超声载药功率为180W，AS乙醇溶液中乙醇浓度为50vol％，PC和药物的质量比为20:20；

超声载药后，将乙醇经旋蒸除去，8000rpm离心10min，取上清液冻干，得到青蒿琥酯口服胶束(PC-AS)。

利用HPLC法检测PC-AS中青蒿琥酯的含量，计算青蒿琥酯的载药量和包封率，PC-AS的载药量和包封率分别为34.79％和80.78％。

实施例5

将pH＝5.5的果胶水溶液(果胶为1g)中加入10mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，氮气保护下活化羧基15min，随后加入10mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应1h。在超声条件下加入酪蛋白溶液，果胶和酪蛋白的质量比为1:1，调节pH＝7，在氮气保护和避光条件下进行碳二亚胺反应24h。向碳二亚胺反应后的反应液体中加入三倍反应液体体积的95vol％乙醇-水溶液，4℃条件下冰箱过夜，5000rpm离心10min，除去EDC、NHS和多余的酪蛋白，取离心沉淀复溶于冷水中，冻干，得到果胶-酪蛋白复合物(PC)；

将AS溶解于乙醇中，将冻干得到的PC复溶于蒸馏水中。向PC水溶液中缓慢加入AS乙醇溶液，利用探头超声法使PC负载AS，超声载药时间为5min，超声载药功率为540W，AS乙醇溶液中乙醇浓度为20vol％，，PC和药物的质量比为20:4；

超声载药后，将乙醇经旋蒸除去，8000rpm离心10min，取上清液冻干，得到青蒿琥酯口服胶束(PC-AS)。

利用HPLC法检测PC-AS中青蒿琥酯的含量，计算青蒿琥酯的载药量和包封率，PC-AS的载药量和包封率分别为44.914％和85.94％。

实施例6

将pH＝5.5的果胶水溶液(果胶为1g)中加入10mmol 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，氮气保护下活化羧基15min，随后加入10mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应1h。在超声条件下加入酪蛋白溶液，果胶和酪蛋白的质量比为1:2，调节pH＝7，在氮气保护和避光条件下进行碳二亚胺反应24h。向碳二亚胺反应后的反应液体中加入三倍反应液体体积的95vol％乙醇-水溶液，4℃条件下冰箱过夜，5000rpm离心10min，除去EDC、NHS和多余的酪蛋白，取离心沉淀复溶于冷水中，冻干，得到果胶-酪蛋白复合物(PC)；

将AS溶解于乙醇中，将冻干得到的PC复溶于蒸馏水中。向PC水溶液中缓慢加入AS乙醇溶液，利用探头超声法使PC负载AS，超声载药时间为25min，超声载药功率为270W，AS乙醇溶液中乙醇浓度为10vol％，，PC和药物的质量比为20:20；

超声载药后，将乙醇经旋蒸除去，8000rpm离心10min，取上清液冻干，得到青蒿琥酯口服胶束(PC-AS)。

利用HPLC法检测PC-AS中青蒿琥酯的含量，计算青蒿琥酯的载药量和包封率，PC-AS的载药量和包封率分别为42.99％和75.42％。

测试例1

对实施例1和6制备的青蒿素口服胶束(PC-ART)和青蒿琥酯口服胶束(PC-AS)进行性能表征，具体如图1、图2和图3所示：

图1中A中的(a)中的样品1为实施例1制备的PC冻干粉复溶后的状态，图1中A中的(a)中的样品2为实施例1制备的PC-ART冻干粉复溶后的状态；图1中B中的(a)中的样品1为实施例6制备的PC冻干粉复溶后的状态，图1中B中的(a)中的样品2为实施例6制备的PC-AS冻干粉复溶后的状态；图1中A中的(b)为实施例1制备的PC的透射电镜图；图1中A中的(c)为实施例1制备的PC-ART的透射电镜图；图1中B中的(b)为实施例6制备的PC的透射电镜图；图1中B中的(c)为实施例1制备的PC-AS的透射电镜图；图2中A中的(a)、(b)、(c)为实施例1制备的PC的原子力显微镜图；图2中A中的(d)、(e)、(f)为实施例1制备的PC-ART的原子力显微镜图；图2中B中的(a)、(b)、(c)为实施例6制备的PC的原子力显微镜图；图2中B中的(d)、(e)、(f)为实施例6制备的PC-AS的原子力显微镜图；

图1和图2可知，PC-ART和PC-AS在蒸馏水中复溶后，水溶性良好，纳米粒分散均匀，较稳定。由于载药的缘故，纳米粒子水溶液呈现微乳状态，颜色比空白载体水溶液浑浊。在透射电镜图中我们可以观察到，由于胶束的形成，PC-ART和PC-AS呈球状。原子力显微镜图更加直观地显示，纳米粒子具有良好的分散性。

图3中的A为PC-ART的红外光谱图，图3中的B为PC-AS的红外光谱图；图3可知，青蒿素和青蒿琥酯的特征峰强度有所增加，但不明显。这可能与脂溶性药物在PC中被负载的形式有关。当PC以胶束的形式将脂溶性的ART或AS包裹进疏水核，ART或AS在红外中的特征峰不会被检测到。

测试例2

对实施例1和实施例6制备的PC-ART和PC-AS进行性能测试，具体方法为：

1、人工胃液和人工肠液中稳定性评价，具体如下：

为了评价PC-ART和PC-AS的稳定性，首先将PC-ART和PC-AS冻干粉分别溶解于去离子水中，制备浓度为1mg/mL的液体，利用激光粒度仪检测了10天内纳米粒子的粒径和电位变化。分别在第1-10天观察纳米粒子在水溶液中的状态，包括出现沉淀、变质、分散等现象。其次，利用激光粒度仪检测PC-ART和PC-AS的粒径大小和Zeta电位变化。由于酪蛋白容易变质，因此，加入0.02％的叠氮化钠为防腐剂，测试结果如图4所示；

图4中的A为PC-ART 10天内的粒径和Zeta电位的变化曲线，如图4中的A所示，PC-ART的粒径大小(113.51±10.77nm)和Zeta电位(-20.22±1.73mV)在10天内上下浮动，但CV均小于10％(CV分别为9.49％和5.75％)，证明数据之间离散程度较小，趋于稳定。另外，若纳米粒子具有较大的正或负的Zeta电位，那么，它们分子之间的相互排斥的作用力使分子之间不会产生絮凝。相反，较小的Zeta电位使分子之间作用力小而接近并絮凝，导致溶液不稳定。通常情况下Zeta电位大于+30mV或小于-30mV为纳米粒子溶液稳定与不稳定的界限。在本试验中Zeta电位为-30.22±1.73mV，进一步表明PC-ART纳米粒子的稳定性。

图4中的B为PC-AS 10天内的粒径和Zeta电位的变化曲线，如图4中的B所示，PC-AS的粒径大小为109.73±7.94nm，CV＝7.23％(CV<10％)，胶束纳米粒子的粒径离散程度较小，因此，PC-AS纳米载药系统趋于稳定。Zeta电位为-31.48±2.26mV，CV＝7.19％(CV<10％)，证明PC-AS胶束在10天内的变化程度较小，较大的Zeta电位使PC-AS胶束之间产生较大的作用力而在水中保持良好的稳定性。

2、人工胃液和人工肠液中溶出性测试，具体步骤如下：

分别准备4份200mL的人工胃液和人工肠液，分别将ART 5mg，PC-ART(含ART 5mg)、AS 20mg、PC-AS(含AS 20mg)溶解于少量蒸馏水中倒入截留分子量1500的透析袋(经过蒸馏水沸水中煮10min处理)中后放入人工胃液和人工肠液中。将8个烧杯分别放入37℃的水浴锅中，转速50rpm/min。分别在0.083h、0.167h、0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h和24h12个时间点取出1mL溶出液，并向体系中加入1mL空白人工肠液和人工胃液。取出的ART和PC-ART适当稀释后进行衍生化处理，过0.22μm滤膜后进HPLC检测ART含量。AS和PC-AS经过适当稀释后过0.22μm滤膜进行HPLC定量分析。计算累计释放百分率(％)，绘制药物释放曲线。

图5中的A中(a)为PC-ART在人工胃液中的溶出曲线，图5中的A中(b)为PC-ART在人工肠液中的溶出曲线，图5中的B中(a)为PC-AS在人工胃液中的溶出曲线，图5中的B中(b)为PC-AS在人工肠液中的溶出曲线。体内的环境极为复杂，为了考察消化系统中不同的环境中对ART从胶束中释放的影响，在人工胃液和人工肠液中对PC-ART和PC-AS进行了溶出实验。检测纳米药物通过透析袋释放游离药物的速度和累计释放量。结果表明，ART和AS在人工胃液和人工肠液中均比PC-ART和PC-AS的累积释放率高。说明胶束外壳在胃部环境保护了ART和AS不被释放，起到保护作用和缓释作用。类似的结果出现在人工肠液中。这一行为有利于口服药物的应用，缓释的原因主要是由于ART和AS被胶束包裹于内核中。因此，果胶-酪蛋白胶束是疏水性口服药物的良好载体，增加原药的溶解并减少药物的副作用。此时，PC-ART和PC-AS克服胃肠道的生化屏障进入小肠的粘液层，在此处释放并运输至血液循环。

3、生物利用度测试，具体步骤如下：

平均体重为180～200克的雄性SD大鼠在实验前禁食一夜，并自由饮水。将24只大鼠随机分为四组(n＝6)，将ART、PC-ART、AS、PC-AS溶液按照50mg/kg(按照原药计算)的给药剂量对大鼠进行灌胃。并在给药后的0.083h、0.25h、0.5h、0.75h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h和48h对麻醉的大鼠进行眼眶取血(600～800μL)。血样以3000×g离心10min后将上清液(血浆)转移到新的1.5mL离心管中，定量测定血浆中的ART和AS。

图6中的A为PC-ART在大鼠体内的血药浓度-时间曲线图，图6中的B为PC-AS在大鼠体内的血药浓度-时间曲线图。ART和PC-ART均在0.75h达到血药浓度最高值，分别为28.74ng/mL和64.77ng/mL，PC-ART明显提高了原药(ART)在大鼠体内的血药浓度。AS在0.5h达到血药浓度峰值13.67μg/mL，而PC-AS在4h时达到血药浓度峰值59.52μg/mL。PC-AS的最高血药浓度是原药AS的4.35倍，生物利用度大幅度提高，而且，还具有较强的缓释效果。

4、安全性评价，具体步骤如下：

(1)斑马鱼成鱼长期毒性试验：实验共设为9组，分别为：①ART组(2.5mg/L)；②PC-ART高剂量组(含ART 2.5mg/L)；③PC-ART中剂量组(含ART 1.25mg/L)；④PC-ART低剂量组(含ART 0.625mg/L)；⑤AS组(2mg/L)；⑥PC-AS高剂量组(含AS 2mg/L)；⑦PC-AS中剂量组(含AS 1mg/L)；⑧PC-AS低剂量组(含AS 0.5mg/L)；⑨空白对照组。本实验时长28天，每3天更换一次试验药液。实验结束后，取出斑马鱼的肝脏，液氮研磨后用生理盐水制备成10％匀浆液，漩涡10min后3000rpm离心10min，分离上清液并分装为3份，置于-20℃冰箱中备用。利用酶标仪检测10％匀浆液中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)的含量。

(2)细胞毒性试验：实验开始前准备好待试药物，ART和PC-ART的浓度以青蒿素含量为标准用培养基对半稀释为6个浓度梯度：100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL。AS和PC-AS青蒿琥酯含量为标准用培养基对半稀释为6个浓度梯度：100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL。空白对照组加入培养基。每个实验设置10个重复，取平均值。将贴壁的Caco-2细胞用胰酶消化5min，倒出含有胰酶的培养基，加入新鲜培养基后将Caco-2细胞吹散至均匀，加入无菌的96孔板中，封口后放入37℃，5％CO2环境中培养24h。次日，吸去培养基，加入含有培养基的药物。再次培养48h后，吸去上清加入MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，噻唑兰)，培养4h后吸去MTT加入二甲基亚砜(DMSO)，在细胞振荡器上振荡10min后，利用酶标仪在490nm处检测吸光度(OD值)5次，取平均值，计算细胞的增值率。

图7中的A为PC-ART对斑马鱼成鱼肝功能的影响，图7中的B为PC-AS对斑马鱼成鱼肝功能的影响。暴露于ART和AS溶液中的斑马鱼28天后肝组织中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)高于空白对照组，但差异不显著(p>0.05)，证明长期暴露于ART和AS溶液对斑马鱼会造成轻微的药物性肝损伤。而与原药相比，含有相同药物的PC-ART和PC-AS对斑马鱼造成的肝损伤更加微弱，而且随着剂量的减少，ALT和AST含量越来越小，逐渐接近于空白对照组。因此，可以证明PC减轻了原药对斑马鱼的药物性肝损伤。

图8中的A为PC-ART对斑马鱼成鱼肌肉氧化应激的影响，图8中的B为PC-AS对斑马鱼成鱼肌肉氧化应激的影响。给药各组的SOD活力均小于空白对照组(图8中A中的a和图8中的B中的a)，说明此阶段应该是SOD被消耗和抑制的阶段，此时，SOD已经受到过量H₂O₂和O^-的抑制，活力减小。图8中A中的b和图8中的B中的b表明给药各组的CAT活力均高于空白对照组，证明H₂O₂产生较少，刺激CAT活力增加，消耗H₂O₂。图8中A中的c和图8中的B中的c表明给药组的MDA含量均大于空白对照组。综上所述，PC-ART和PC-AS长期接触斑马鱼会对其产生微弱的氧化应激性肝损伤，但其毒性小于原药。

图9中的A为在不同浓度PC-ART处理下Caco-2细胞的细胞活力，图9中的B为在不同浓度PC-AS处理下Caco-2细胞的细胞活力。Caco-2细胞的细胞活力随着ART和AS浓度的增加逐渐减小，细胞活力与PC-ART和PC-AS浓度呈剂量依赖性，但各组之间差异不显著(p>0.05)，细胞表现出良好的生长状态。当原药含量相同时，PC-ART和PC-AS对Caco-2细胞表现出了相对较小的毒性。这在一定程度上保障了长期口服PC-ART时药物对胃肠道的刺激性伤害，有利于药物对风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫疾病的长期治疗。

5、对系统性红斑狼疮的治疗作用，具体步骤如下：

ART及其衍生物对SLE具有一定的治疗效果，但SLE病症机理十分复杂，涉及的细胞因子、免疫细胞十分广泛。对MRL/lpr系统性红斑狼疮小鼠模型的表观、尿液、血液、肾匀浆液、病理切片和免疫组化等方面对PC-ART和PC-AS对SLE的影响进行评价及探索。

图10为治疗8周后MRL/lpr小鼠的生理状态。由图10可以得出：治疗8周后模型组小鼠的毛发粗糙，腋下及扁桃体等处呈现明显的腺体增长，甚至出现了嘴部的皮损现象。而PC-ART、PC-AS和阳性对照组小鼠的病理现象明显好转。与ART组比较，PC-ART各组的毛发较光滑、腺体增生发生较少、腺体体积较小、局部皮损较少，其治疗效果与阳性对照组相当。与AS组比较，PC-AS(25mg/kg/day)和PC-AS(50mg/kg/day)在毛发、腺体和皮损状态出较明显的改善，与阳性对照组相当，而PC-AS(12.5mg/kg/day)的改善不明显。由此可见，PC-ART和PC-AS明显改善了MRL/lpr小鼠的病症，并且其治疗效果优于原药。

图11和图12为PC-ART和PC-AS给药期间MRL/lpr小鼠尿液中尿蛋白含量、血浆中血肌酐(Cre)和血尿素氮(BUN)的影响。这三个指标主要反映小鼠肾功能情况。图11显示，在治疗过程中，PC-ART低剂量组、PC-AS低剂量组和阳性对照组1在第2～4周尿蛋白含量增长缓慢。在第6～8周，PC-ART各组和PC-AS各组的尿蛋白含量明显减少(图11中的b)。而且，在第8周PC-ART高剂量组、PC-AS(25mg/kg/天、50mg/kg/天)的尿蛋白含量总差值与阳性对照组1相当，PC-AS低剂量组的尿蛋白含量总差值与空白对照组相当。综上所述，PC-ART和PC-AS缓解了SLE的肾脏病变，有效恢复了尿蛋白的正常水平，其对SLE的治疗效果优于原药。图12显示，PC-ART和PC-AS各剂量组不同程度的降低了SLE小鼠血液中Cre和BUN的水平，而且，二者的治疗效果由于原药，这间接反映了SLE小鼠肾功能的逐渐恢复。

图13和图14为PC-ART和PC-AS治疗对MRL/lpr小鼠标志性抗体(抗核抗体，ANA；抗双链DNA抗体，dsDNA-Ab)和炎性细胞因子(γ干扰素，IFN-γ；白细胞介素6，IL-6)的影响。结果显示，PC-ART和PC-AS各组均不同程度地降低了MRL/lpr小鼠血浆中ANA和dsDNA-Ab的水平。同时，降低了炎性细胞因子IFN-γ和IL-6的含量，改善了因SLE引起的一系列细胞因子水平的失衡，使血液中的指标逐渐恢复正常状态。

图15～图17为小鼠肾脏组织HE、PASM和Masson染色。经过8周的药物治疗后，PC-ART和PC-AS各组的小鼠肾损伤明显有所好转，周围炎性细胞浸润减少，系膜细胞增生和系膜基质增多现象减轻，无毛细血管腔内透明样血栓产生，肾小球基底膜增厚和肾小球基底膜断裂情况缓解，肾小球毛细血管内细胞增生减少。其中，PC-ART低剂量组、PC-ART中剂量组、PC-AS低剂量组和PC-AS中剂量组治疗效果较好，明显优于原药组，甚至比阳性对照组2(DHA)呈现出较少的肾损伤，与阳性对照组1(PNS)的治疗效果相当。以上结果充分证明了PC-ART和PC-AS对SLE引起的肾损伤具有明显的治疗作用，可有效减少肾脏组织损伤和炎症细胞。

图18和图19为小鼠肾脏组织免疫复合物IgG免疫组化图和半定量统计图。免疫组化结果显示(图18)，与空白对照组相比(L)，模型组小鼠肾组织出现大量IgG免疫复合物沉积于肾小球(K)，其他各治疗组具有不同程度的缓解作用。光密度值结果显示(图19)，与模型组相比，ART组和AS组表现出显著性差异(p<0.05)，其他各组均表现出极显著性差异(p<0.01)，证明了口服药物对SLE的改善。而且，在PC-ART各剂量组的治疗下，小鼠肾脏免疫复合物IgG积累均显著低于ART组(p<0.01)。同样的，PC-AS各剂量组治疗效果也显著优于原药AS(p<0.01)。以上结果显示PC-ART和PC-AS明显减少了MRL/lpr小鼠肾脏IgG免疫复合物的沉积，并且治疗效果优于原药，对SLE具有一定的缓解作用。

图20和图21为PC-ART和PC-AS治疗对MRL/lpr小鼠肾脏标志性抗体(抗双链DNA-IgG抗体，dsDNA-IgG；抗双链DNA-IgM抗体，dsDNA-IgM)和炎性细胞因子(白细胞介素21，IL-21)的影响。PC-ART和PC-AS治疗组均在一定程度上降低了MRL/lpr小鼠肝匀浆液中的dsDNA-IgG和dsDNA-IgM(图20)。而且，PC-ART和PC-AS组MRL/lpr小鼠肾匀浆液IL-21的含量明显低于ART组和AS组(p<0.05)。

总之，PC-ART和PC-AS在一定程度上降低了SLE肾脏中的抗体dsDNA-IgG和dsDNA-IgM的水平，并减少了炎症因子IL-21的含量。其中PC-ART中剂量组和PC-AS低剂量组治疗效果较明显。PC-ART和PC-AS对SLE的积极影响可能与青蒿素和青蒿琥酯特有的过氧基团结构有关。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种青蒿素及其衍生物胶束，其特征在于，包括胶束载体和负载于所述胶束载体中的活性药物；所述活性药物包括青蒿素和/或青蒿素衍生物；所述胶束载体为果胶-酪蛋白复合物，所述果胶-酪蛋白复合物由果胶和酪蛋白经碳二亚胺反应得到。

2.根据权利要求1所述的青蒿素及其衍生物胶束，其特征在于，所述活性药物包括青蒿素时，胶束中青蒿素的质量含量为5～10wt％；

所述活性药物包括青蒿琥酯时，胶束中青蒿琥酯的质量含量为30～50wt％。

3.根据权利要求1所述的青蒿素及其衍生物胶束，其特征在于，所述青蒿素及其衍生物胶束的粒径为50～240nm。

4.根据权利要求1所述的青蒿素及其衍生物胶束，其特征在于，所述果胶-酪蛋白复合物的制备方法包括以下步骤：

在保护气体和避光的条件下，将果胶的水溶液、缩合试剂、酪蛋白的缓冲溶液混合进行碳二亚胺反应，得到果胶-酪蛋白复合物；所述碳二亚胺反应的pH值为7±0.5。

5.根据权利要求4所述的青蒿素及其衍生物胶束，其特征在于，所述果胶和酪蛋白的质量比为1:(0.5～5)。

6.权利要求1～5任一项所述的青蒿素及其衍生物胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将果胶-酪蛋白复合物的水溶液和活性药物的醇溶液混合进行超声载药，得到所述青蒿素及其衍生物胶束。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述果胶-酪蛋白复合物和活性药物的质量比为20:(1～50)。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述超声载药的时间为2.5～25min，所述超声载药的超声功率为60～540W。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述超声载药后得到载药溶液，还包括将所述载药溶液去除醇溶剂后，离心分离得到上清液，将所述上清液冻干，得到所述青蒿素及其衍生物胶束；所述离心分离的转速为5000～8000r/min，所述离心分离的时间为8～15min。

10.权利要求1～5任一项所述青蒿素及其衍生物胶束或权利要求6～9任一项所述的制备方法制备得到的青蒿素及其衍生物胶束在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

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