CN110200980A - 一种荷载青蒿素的柑橘果胶的口服纳米粒子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荷载青蒿素的柑橘果胶的口服纳米粒子，其制备方法，包括以下步骤：柑橘果胶进行多分子自聚；使柑橘果胶形成纳米粒子并包裹与吸附青蒿素进行；氨基苯硼酸与柑橘果胶纳米粒子连接；外层包裹变性后壳聚糖。本发明首次将柑橘果胶与青蒿素联合使用，使Ⅱ型糖尿病的胰岛素抵抗和胰岛β细胞损伤同时得到改善；将胰岛α细胞转化为胰岛β细胞的方法应用于II型糖尿病的纳米治疗，此方法可以抑制胰高血糖素的分泌，也可以提高胰岛素的分泌；无论是药物和输送材料均采用来源于植物的天然产物，保证在治疗Ⅱ型糖尿病的过程中的无毒性与易代谢性。

Description

一种荷载青蒿素的柑橘果胶的口服纳米粒子
技术领域
本发明涉及医用纳米材料技术领域，更具体地，涉及一种荷载青蒿素的柑橘果胶的口服纳米粒子。
背景技术
糖尿病是一种多病因的代谢性疾病，体现为胰腺胰岛素分泌不足或周围组织对胰岛素敏感性降低，因此肝脏，肌肉等组织不能转化血液中的葡萄糖，从而引起机体代谢混乱，严重时可致死。全世界患糖尿病的人数约为2.8亿，其中5％～10％为I型糖尿病，II型糖尿病占糖尿病新病例的90％～95％。I型糖尿病初次发病时胰岛β细胞已丧失70％～90％，发病后1～2年胰岛β细胞全部死亡，胰岛素分泌量约为零。II型糖尿病一般在35～40岁发病。患者体内胰岛素甚至产生过多，体内的胰岛素受体对胰岛素的敏感性下降，胰岛素的作用效果较差，以及胰腺细胞功能的逐渐衰退，导致胰岛素分泌受损，最终导致高血糖症，因此II型糖尿病患者体内的胰岛素是一种相对缺乏症状。
目前无论是一型糖尿病还是II型糖尿病都没有根治的方法。II型糖尿病是现在糖尿病人群的主要患病人群，而胰岛素抵抗现象是II型糖尿病最显著的特征，其是II型糖尿病的其他症状出现的根本原因，胰岛素的过度分泌使得胰岛β细胞受损，胰岛素无法有效地发挥作用使体内血糖无法下降，从而引发血多并发症，所以近些年对II型糖尿病的治疗，从如何降低血糖逐渐的转变到了改善胰岛素抵抗以及恢复胰岛β细胞的数量，保证胰岛素的分泌。因此改善胰岛素抵抗现象以及补充胰岛素抵抗所引起的胰岛β细胞缺失是一种高效的治疗方式。现在已经有几种药物比如双胍类、噻唑烷二酮类、α-葡萄糖苷酶抑制剂和三萜类天然物质等都可以通过提高胰岛素的敏感性来治疗胰岛素抵抗现象，而以胰岛素增敏性物质为基础与纳米医学相结合的方法还没有出现。
对于II型糖尿病的治疗目前还是以体外注射胰岛素或者药物为主，通过外源性药物维持体内的血糖平衡。注射仍然是将胰岛素输入患者体内的主要方式，但是这种侵入性方式会引起病人疼痛和恐惧，长期注射也会引起皮肤问题、增加感染概率，而且注射会避开肝脏的首过效应，相对增加了外周血管的药物浓度，较快的聚集，并在肾脏排出，无法起到较好的治疗效果。尽管体外输送除皮下注射以外还有肺吸入式、胰岛素泵和口服等方式，因为口服药物能模拟体内代谢途径并能提供一个较稳定的内环境，同时这也能减轻外周高胰岛素血症的发病率以及神经病等并发症，而无论是哪种方式胰岛素在运输过程中损耗都过于大，使胰岛素得不到充分的利用，并且外源性胰岛素对于身体本身来讲属于抗原，体内的免疫系统对外源性胰岛素具有一定的排斥。在过去的几十年中对于克服常规口服输送药物的缺点和限制做了各种不同的尝试。主要集中在在口服药物的研制取得成功将要克服酶的降解、提高上皮细胞的渗透率以及在处理加工中保存药物的生物活性等方面。
对糖尿病进行无毒性治疗已经成为研究的热点，纳米载体介导的药物递送系统为解决口服给药的缺陷提供一种方案。纳米载体能提高药物的胃肠道粘膜附着率、抑制在胃肠道黏膜的药物外排率从而促进药物吸收；通过使用生物粘附聚合物来延长胃肠道滞留时间并促进药物渗透，确保纳米粒子在其吸收部位释放药物；由于纳米输运体系比微米输运体系具有更高的表面体积比，可以显著提高与细胞接触的表面积，从而提高生物利用度。对于药物的载体，有以金属离子为基础的纳米粒子和不含金属离子其他类型的纳米粒子，但是含有金属离子的纳米粒子在体内运送药物时会对体内的正常组织和细胞产生不利影响，甚至会引起正常组织和细胞的异变。在不含金属离子的纳米粒子研究中，有PEG化的脂质体，PEG-PEI等，但是在治疗二型糖尿病方面几乎看不到以天然物质为载体传递对身体无害的天然胰岛素增敏剂。
目前治疗糖尿病的纳米口服运输体系主要集中于提高运输效率方面。主要分为三类：防止消化酶降解，促进肠粘膜附着，促进穿透肠上皮。选择合适的药物运输材料应考虑生物可降解性、生物相容性、通用性和低成本的生产等方面的问题。现有的药物口服输运体系研究通常采取选择天然材料制备输运载体从而达到低毒或无毒的目的。针对体内的环境，对输送体系进行智能化处理，使药物得到更多的释放，可以使药物得到更好的利用，在II型糖尿病患者体内，高血糖是最明显的特征，利用其血糖高的特点促进药物释放是一种有效地释药方式。目前三类主要的葡萄糖反应材料：伴刀豆球蛋白，葡萄糖氧化酶，和苯硼酸(PBA)。其中伴刀豆球蛋白和葡萄糖氧化酶是蛋白质，具有成本高、不稳定、抗原性强等缺点。
因此，虽然口服药物的方式对于糖尿病患者是最佳的选择，但是一直尚未找到一种稳点、毒性小、生物相容性好、载药率和释放率高以及对糖尿病并发症有一定作用的口服药物。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种应用青蒿素、柑橘果胶、氨基苯硼酸以及壳聚糖合成的一种天然低毒的具有促进胰岛α细胞转化为胰岛β细胞和抑制胰岛素抵抗功效的口服纳米粒子。
本发明的第一个目的是提供一种纳米粒子的制备方法。
本发明的第二个目的是提供任一所述制备方法制备得到的纳米粒子。
本发明的第三个目的是提供所述纳米粒子在制备糖尿病药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明针对II型糖尿病的胰岛素抵抗症状，着眼于改善胰岛β细胞减少的问题，在药物运输体系构建上以天然物质的医疗活性为基础，制备以天然降糖物质为物质基础的纳米输运体系；在治疗上，致力于从多方面，多角度针对胰岛素抵抗，加强胰岛β细胞的分化抑制胰岛α细胞的产生；在运输功能上着重于研究更加准确、智能的将药物输送到靶位置的输运体系。在细胞和分子水平上探索对细胞信号通路的影响。首先筛选植物来源的青蒿素(artemisinin)，柑橘果胶(CP)与壳聚糖(TMC)，外加氨基苯硼酸(PBA)合成具有低毒的具有促进胰岛α细胞转化为胰岛β细胞和抑制胰岛素抵抗功效的天然口服纳米输运体系。
具体地，将柑橘果胶溶解在碱性环境的水环境中，并在一定的外部条件和氢氧化钠的作用下使柑橘果胶变性。加入已经溶解的青蒿素溶液，然后在氢氧化钙和碳酸氢钠作用下搅拌过夜，使变性柑橘果胶形成纳米粒子并将青蒿素进行包裹与吸附。在微酸环境下加入氨基苯硼酸与变性柑橘果胶连接，整个粒子合成要保持常温即可，最后在外层包裹一层壳聚糖形成口服纳米输送体系。
其中，苯硼酸的pKa的范围为7.8～8.6，它在水溶液中存在的形式分为两种，一种是未电离的疏水形式，另一种是电离的亲水形式，因此在加入葡萄糖后，PBA从疏水变成亲水，表现出葡萄糖响应性。
柑橘果胶(CP)是一种从柑橘水果中提取出来的水溶性的多糖纤维，其在水中的溶解度有限。在一定的条件下柑橘果胶可以转变为变性柑橘果胶(MCP)，可以有效地增强其在弱酸性水中的溶解性，并且变性柑橘果胶(MCP)也可以有效地抑制炎性分子半乳糖凝集素-3(Gal-3)的存在(炎性分子半乳糖凝集素-3(Gal-3)是一种促进胰岛素抵抗的重要因子之一，研究表明，Gal-3参与炎症反应并且在肥胖个体中以内分泌的方式直接作用于胰岛素三大靶向组织，从而损害胰岛素信号，具体表现为直接绑定胰岛素受体(IR)和抑制下游的红外信号，阻碍下游代谢反应，从而产生胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良等症状)，有效地消除Gal-3可以有效地抑制胰岛素抵抗的发展，促进更多的胰岛素发挥作用。
青蒿素(artemisinin)是一种从中药青蒿中提取出来的倍半萜烯内酯内过氧化物，在抗疟原虫领域发挥着重要的作用，研究表明青蒿素有抵消胰岛α细胞特异性转录因子Arx的功能，可以很好的克服胰岛α细胞分化转移的主要障碍，实现胰岛α细胞向胰岛β细胞的转换。此外，青蒿素还可以通过加强ART信号通路来驱动的胰岛β细胞的体内转化，从而补充糖尿病胰岛β细胞缺失的现象。
多糖是一类天然的复杂碳水化合物，由于它具有经济、可随时利用，可生物降解和高生物相容性等优点被广泛运用在口服药物输送体系中。
随后，对口服纳米输送体系进行表征，红外波谱显示体系成功合成，TEM外观显示药物在增加包裹层的过程中逐渐增大，最终达到100nm左右，并且粒子分散性良好，由此可以认为纳米粒子已依据研究设计合成。在体外实验中，测得口服纳米输运体系具有高载药能力，其释放模式表现出一定的葡萄糖感应性，无论是低葡萄糖条件下还是高葡萄糖条件下青蒿素释放都具有比较高的释放率，而且其释放率随时间变化有一定的浮动；在不同的pH梯度中显示口服纳米输送体系释放不受影响；模拟胃肠液释放结果显示口服纳米输运体系可以在穿过胃到达肠部。最后，在II型糖尿病大鼠体内实验中验证口服纳米输送体系的生物学效用，发现该口服纳米输运体系具有促进胰岛α细胞转化为胰岛β细胞，并且长效的降低血糖，有效抑制II型糖尿病症状的效果。
因此本发明要求保护以下内容：
一种纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
S1.柑橘果胶进行多分子自聚；
S2.使柑橘果胶形成纳米粒子并包裹与吸附青蒿素进行；
S3.氨基苯硼酸与柑橘果胶纳米粒子连接；
S4.外层包裹N-三甲基壳聚糖。
优选地，步骤S1中，柑橘果胶的水溶液，50～60℃下，调节pH至8～10并充分混匀，冷却至室温。
更优选地，步骤S1中，柑橘果胶的水溶液浓度为0.5～3mol/L。
进一步优选地，步骤S1中，柑橘果胶的水溶液浓度为1.5mol/L。
更优选地，步骤S1中，55℃下调节pH并充分混匀，冷却至室温。
更优选地，步骤S1中，使用1～3mol/L氢氧化钠调节pH。
进一步优选地，步骤S1中，使用3mol/L氢氧化钠调节pH。
更优选地，步骤S1中，调节pH至10.0。
更优选地，步骤S1中，搅拌充分混匀。
进一步优选地，步骤S1中，持续搅拌0.5～2小时充分混匀。
进一步优选地，步骤S1中，持续搅拌1小时充分混匀。
优选地，步骤S2中，上一步产物与青蒿素混合，得到混合溶液1，碱环境下充分混匀。
优选地，步骤S2中，包括以下步骤：
S21.调节pH至8～10，以溶解多酚自聚后的柑橘果胶；
S22.与青蒿素溶液混合，得到混合溶液1，在50～60℃充分混匀；
S23.加入氢氧化钙至终浓度0.01～1.0mol/L，在50～60℃充分混匀；
S24.加入碳酸氢钠至终浓度0.01～1.0mol/L，在50～60℃充分混匀。
更优选地，步骤S21中，pH至10.0。
更优选地，步骤S21中，使用1～3mol/L氢氧化钠调节pH。
进一步优选地，步骤S21中，使用3mol/L氢氧化钠调节pH。
更优选地，步骤S22中，混合溶液1中，青蒿素的终浓度为0.5～3mol/L。
进一步优选地，步骤S22中，混合溶液1中，青蒿素的终浓度为1.5mol/L。
进一步优选地，步骤S22中，55℃充分混匀。
更优选地，步骤S22中，300～1000rmp搅拌0.5～3小时以充分混匀。
进一步优选地，步骤S22中，600rmp搅拌2小时以充分混匀。
更优选地，步骤S23中，加入氢氧化钙至终浓度0.01mol/L。
更优选地，步骤S23中，55℃充分混匀。
更优选地，步骤S23中，300～1000rmp搅拌0.5～3小时以充分混匀。
进一步优选地，步骤S23中，600rmp搅拌1小时以充分混匀。
更优选地，步骤S24中，加入碳酸氢钠终浓度0.01mol/L。
更优选地，步骤S24中，55℃充分混匀。
更优选地，步骤S24中，300～1000rmp搅拌0.5～3小时以充分混匀。
进一步优选地，步骤S24中，600rmp搅拌3小时以充分混匀。
优选地，步骤S3中，调节上一步产物至pH＝4～7、氨基苯硼酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液和二环己基碳二亚胺混合得到混合溶液2，混匀，浓缩。
更优选地，步骤S3中，调节上一步产物至pH＝6。
更优选地，步骤S3中，使用1～3mol/L盐酸调节pH。
进一步优选地，步骤S3中，使用2mol/L盐酸调节pH。
更优选地，步骤S3中，混合溶液2中二环己基碳二亚胺的浓度为1.0～3.0mol/L。
进一步优选地，步骤S3中，混合溶液2中二环己基碳二亚胺的浓度为3mol/L。
优选地，步骤S3中，混合溶液2中氨基苯硼酸的质量浓度为0.01～1.0mol/L。
更优选地，混合溶液2中氨基苯硼酸的质量浓度为0.01mol/L。
更优选地，步骤S3中，300～1000rmp搅拌0.5～3小时以充分混匀。
进一步优选地，步骤S3中，300rmp搅拌3小时以充分混匀。
更优选地，步骤S3中，用水做透析液，透析浓缩。
进一步优选地，步骤S3中，透析9～24小时，每3～8个小时换一次透析液。
进一步更优选地，步骤S3中，透析15小时，每5个小时换一次透析液。
优选地，步骤S4中，N-三甲基壳聚糖、步骤S3的产物混合与二环己基碳二亚胺、氨基醇混合得到混合溶液3，充分混匀，浓缩。
更优选地，混合溶液3中二环己基碳二亚胺的浓度为1.0～3.0mol/L。
进一步优选地，混合溶液3中二环己基碳二亚胺的浓度为3mol/L。
更优选地，混合溶液3中N-三甲基壳聚糖的浓度为1.0～3.0mol/L。
进一步优选地，混合溶液3中N-三甲基壳聚糖的浓度为3mol/L。
更优选地，混合溶液3中氨基醇的浓度为1.0～3.0mol/L。
进一步优选地，混合溶液3中氨基醇的浓度为3mol/L。
优选地，所述N-三甲基壳聚糖的制备方法(壳聚糖变性的方法)为：壳聚糖溶于二氯甲烷，调节pH至7～9，50～60℃反应45～120min得N-三甲基壳聚糖。
更优选地，壳聚糖的浓度为1.0～3.0mol/L。
进一步优选地，壳聚糖的浓度为1.5mol/L。
更优选地，使用1～3mol/L氢氧化钠调节pH。
进一步优选地，使用3mol/L氢氧化钠调节pH。
更优选地，调节pH至8。
更优选地，55℃反应90min。
任一所述制备方法制备得到的纳米粒子也属于本发明的保护范围。
所述纳米粒子在制备治疗糖尿病药物中的应用，也属于本发明的保护范围。
优选地，所述治疗糖尿病为促进胰岛α细胞转化为胰岛β细胞和/或抑制胰岛素抵抗。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明将通过具有转化胰岛α细胞为胰岛β细胞功效的青蒿素(ART)和具有抑制Gal-3的变性柑橘果胶(MCP)结合，加上具有葡萄糖响应性的氨基苯硼酸(AAPBA)作为交联剂，外连接一层具有天然降血糖，增加小肠吸收率功能的变性壳聚糖(TMC)，合成天然低毒的口服纳米粒子，成功制备了植物来源的口服输运体系，青蒿素、柑橘果胶、壳聚糖均来源于天然植物的提取物，使此体系具有天然、低毒、可自然代谢降解的优点。并且对纳米粒子无论是体内体外检测都是没有毒性的。
纳米粒子粒径小(100nm左右)能增加被肠上皮吸收的概率，表面带正电荷促进粒子与带负电的肠上皮相吸附，增强粒子稳定性等特性，这些性质都能够帮助口服纳米输送体系从口服途径进入机体血液循环该体系可以穿过小肠上皮进入血液循环。同时该口服纳米粒子具有较高的载药效率(63.79±1.64％)和包封率(85.04±2.1％)，体系具有较明显的感应性，可以显著、迅速并且长效的控制血糖，无论长期服药后T2DM大鼠无论是血糖还是饮水、饮食和体重都具有明显的下降，而且胰岛β细胞和胰岛α细胞数量初步说明明显的促进胰岛α细胞转化为胰岛β细胞，治疗后的II型糖尿病大鼠模型在服药后短时间内便出现血糖下降，血糖波动接近正常大鼠，在治疗II型糖尿病方面具有明显的效果。
本发明首次将柑橘果胶与青蒿素联合使用，使Ⅱ型糖尿病的胰岛素抵抗和胰岛β细胞损伤同时得到改善；将胰岛α细胞转化为胰岛β细胞的方法应用于II型糖尿病的纳米治疗，此方法可以抑制胰高血糖素的分泌，也可以提高胰岛素的分泌；无论是药物和输送材料均采用来源于植物的天然产物，保证在治疗Ⅱ型糖尿病的过程中的无毒性与易代谢性。
附图说明
图1为MCP(ART)-AAPBA-TMC纳米粒子合成示意图。
图2.荷载青蒿素/柑橘果胶粒子红外光谱图。
图3.MCP(ART)-AAPBA-TMC纳米粒子粒径图(A)、纳米粒子透射电镜图(B)、纳米粒子Zeta电位图(C)和纳米粒子热稳定性检测(D)。
图4.青蒿素标准曲线图(A)、MCP(ART)-AAPBA-TMC NPSs输运体系的载药效率与载药量柱状图(B)、不同pH缓冲体系的青蒿素释放曲线(C)、不同浓度葡萄糖缓冲液中的青蒿素释放曲线(D)、模拟胃液缓冲体系的青蒿素释放曲线(E)、模拟肠液缓冲体系的青蒿素释放曲线(F)
图5.纳米粒子对细胞的毒性
图6.体内实验宏观数据检测结果。A.大鼠建立T2D模型时体型、饮食、饮水和体重变化趋势；B.喂药期间T2DM大鼠体型、饮食、饮水和体重变化趋势；C.大鼠建立T2D模型时血糖变化趋势；D.喂药期间T2DM大鼠血糖变化趋势；E.喂药后大鼠葡萄糖耐性；F.喂药后大鼠胰岛素抵抗指数；G.建模后大鼠胰岛素抵抗指数。
图7.四组大鼠的生化指标TG、TC、HDL-C和LDL-C水平。
图8.纳米粒子对器官毒性以及糖原、胰岛素和胰高血糖素免疫组化定量A.糖原染色；B.胰岛素和胰高血糖素免疫组化；C.纳米粒子对大鼠器官毒性；D.糖原染色定量；E.胰岛素免疫组化定量；F.胰高血糖素免疫组化定量。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实验试剂：壳聚糖，青蒿素，柑橘果胶，氨基苯硼酸、STZ链尿佐菌素、胰酶、高糖DMEM培养基、非必需氨基酸均为Gibco公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；96/24孔聚苯乙烯细胞培养板为美国Corning康宁公司产品。高脂饲料、垫料等均为睿迪生物有限公司的产品。
实验仪器：Sigma32184高速冷冻离心机，日本HITACHI 7650透射电子显微镜，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，日本Nikon显微镜，英国Malvern ZEN3600，日本Olympus光学倒置显微镜，法国H.J.Y公司LabRAM Aramis显微拉曼光谱仪，瑞士Mettler,TGA/DSC1同步热分析仪。
实验细胞：肝癌细胞(HepG2细胞)。
实验动物：SD大鼠，购于南方医科大学实验动物中心。
实施例1荷载青蒿素&柑橘果胶的口服纳米体系的制备
荷载青蒿素/柑橘果胶的口服纳米例子的制备流程如图1所示：
第一步：MCP(ART)纳米粒子的制备
首先对柑橘果胶进行变性处理，将柑橘果胶按照1.5mol/L的浓度置于蒸馏水中，并在55℃下用氢氧化钠(3mol/L)将其pH增加到10.0，持续搅拌1小时，然后将溶液冷却至室温，用氢氧化钠(3mol/L)将其pH调节至10.0，对变性后的柑橘果胶进行溶解。
然后在55℃的条件下加入已经溶解在有机溶剂里面的青蒿素，使得青蒿素的终浓度为1.5mol/L 600rmp搅拌2小时，加入氢氧化钙至其终浓度为0.01mol/L，55℃600rmp搅拌1小时，最后加入碳酸氢钠至其终浓度为0.01mol/L，55℃600rmp搅拌3小时。
第二步：MCP(ART)-AAPBA纳米粒子的制备
用3mol/L盐酸调节溶液至微酸环境pH＝6，用有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺将氨基苯硼酸溶解(氨基苯硼酸浓度为1.5mol/L)，在3mol/L二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下将氨基苯硼酸溶液加入到第一步溶液中，使得氨基苯硼酸终浓度为0.01mol/L，搅拌3小时(常温，300rmp)，水溶液透析，透析15小时，期间每5个小时换次水。
第三步：MCP(ART)-AAPBA-TMC纳米粒子的制备
将壳聚糖变性：将壳聚糖溶于二氯甲烷中，使得壳聚糖的浓度为1.5mol/L，用0.01mol/L用氢氧化钠调节溶液至微碱性(pH＝7～9)，在55℃环境下保温90min，即壳聚糖变性完毕，得到N-三甲基壳聚糖。
在缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下，将变性的壳聚糖与第二步的溶液混合，在氨基醇的催化下，室温下搅拌3小时，然后水溶液透析，其中二环己基碳二亚胺、变性的壳聚糖和氨基醇的终浓度均为3mol/L。
实施例2荷载青蒿素&柑橘果胶的口服纳米粒子表征
一、红外光谱检测
将体系合成的原材料MCP、AAPBA、TMC以及实施例1制备得到合成材料MCP(ART)、MCP(ART)-AAPBA、MCP(ART)-AAPBA-TMC做红外光谱检测。
1、实验方法
将待测样品子冷冻干燥，然后放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响，之后放入干燥机中进行干燥处理。在油压机上用10MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，使用德国Bruker VERTEX 33傅里叶变换红外光谱仪测定。
2、实验结果
为了解形成荷载青蒿素/柑橘果胶粒子阶段发生的改变，对荷载青蒿素/柑橘粒子进行了红外光谱实验表征，如图所2示，合成荷载青蒿素/柑橘粒子过程中，物质之间的反应引起了红外图谱中相应特征峰的变化。MCP分别在3282.7cm-1、2952.9cm-1有吸收峰，是MCP上的OH在伸缩波动；分别在1632.7cm-1、1741.7cm-1有吸收峰，是MCP上的C＝O在伸缩波动。AAPBA中在1647.2cm-1、1586.4cm-1、1550.6cm-1、1449.5cm-1、899.9cm-1、798.5cm-1有吸收峰，是AAPBA上的相应特征峰在伸缩波动；在TMC分别在1590.3cm-1、1091.7cm-1有吸收峰，其中1590.3cm-1的吸收峰是TMC上的NH在伸缩波动；1091.7cm-1的吸收峰是TMC上的C-N在振动收缩，说明壳聚糖(CS)已经成功变性为TMC。MCP(ART)分别在1737.8cm-1、1116.7cm-1有吸收峰，分别是青蒿素上的C＝O、C-O-C在伸缩波动，表明核心药物青蒿素已经被包裹在MCP中。MCP(ART)-AAPBA在1737.8cm-1、1453.3cm-1、1139.9cm-1、875.6cm-1、771.5cm-1有吸收峰，其中1737.8cm-1是MCP上的C＝O在伸缩波动，1453.3cm-1、1139.9cm-1、875.6cm-1、771.5cm-1是AAPBA上的相应特征峰在伸缩波动，与单纯的AAPBA上相应特征峰相比普遍低，说明AAPBA的相应特征峰发生蓝移，说明MCP(ART)-AAPBA成功连接。MCP(ART)-AAPBA-TMC在1596.0cm-1有吸收峰，说明TMC已经成功连接在MCP(ART)-AAPBA上。经过红外光谱的一系列检测结果显示，已经初步合成了所需要的纳米粒子MCP(ART)-AAPBA-TMC。
二、粒径和Zeta电位检测
1、实验方法
分别在合成MCP(ART)、MCP(ART)-AAPBA、MCP(ART)-AAPBA-TMC后，取100μl用于电位和粒径的检测。纳米颗粒粒径检测使用Zetasizer纳米分析仪测量。粒径测定中，样本溶解在超纯水中，最少测量180s。仪器将自动测量多次，并将结果依据相关分析得到流体力学粒径结果。
2、实验结果
由动态光散射法测定的MCP(ART)、MCP(ART)-AAPBA、MCP(ART)-AAPBA-TMC三种形态的载纳米颗粒的平均粒径分别为20±4nm，25±5nm，150±4nm(图3A)。
从Zeta电位图(C)结果可以看出MCP、MCP(ART)-AAPBA、MCP(ART)-AAPBA-TMC载药纳米颗粒的Zeta电位分别在-15、+4以及+1左右，粒子团聚较为严重，此结果与透射电镜的图片也相吻合(图3C)。
三、透射电镜观察
1、实验方法
将粒子的悬液滴在覆有碳膜的铜网上，静置5min，用滤纸吸干多余水分，静置30min，待其完全干透。使用HITACHI 7650透射电镜，电子加速电压为300kV，分别于1×104倍、2×104倍的放大倍数下，观察粒子形态。
2、实验结果
通过TEM电镜结果验证可以得出，三种形态的载药纳米颗粒的平均粒径与粒径分析相吻合,而最终得到的MCP(ART)-AAPBA-TMC纳米粒子粒径大小较为适中小于200nm，分散性好，可以更好地穿透肠部，被吸收进入体内(图3B)。
四、热重分析
1、实验方法
将合成的纳米粒子进行干燥处理，使用瑞士Mettler，TGA/DSC1同步热分析仪，在N2氛围下，测量范围为30℃至900℃，升温速度为10℃/min。
2、实验结果
热重分析可以揭示纳米体系的热量交换与质量分解的特征模式。介于25℃到150℃之间，结果显示荷载青蒿素/柑橘果胶粒子的比重下降了20％，这可能与吸附和束缚水的损失有关。壳聚糖包含-NH2和-OH基团，在分子间形成了强烈的氢键。可以推测壳聚糖的-NH2基团与水分子之间形成氢键，可以使粒子结合更多的水分。但总体比重依旧在80％以上，在100℃以上环境时纳米粒子的含量急剧下降，最后直至0％，由此结果我们可以得出在小于100℃的环境里，纳米粒子稳定性良好，而粒子所作用的环境中不会出现极端温度，可以用于口服给药(图3D)。
五、药物包封率测定
1、实验方法
青蒿素最大吸收峰波长205nm，吸收系数小，干扰严重，不能直接用此峰进行定量分析。青蒿素遇稀碱后结构发生定量转化，其产物在291nm处有一强吸收峰，可用紫外分光光度法利用青蒿素这一性质建立定量分析。许多研究也提出，青蒿素在291nm处的吸收峰更适宜于低浓度的样本检测。
分别配置不同浓度的青蒿素标准溶液(10-3mg/ml，2×10-2mg/ml，4×10-2mg/ml，8×10-2mg/ml，1.6×10-1mg/ml，3.2×10-1mg/ml)，使用德国Perkin Elmer Lambda 25紫外分光光度计测定其在291nm的紫外吸收光谱。并依据其吸收峰绘制标准曲线，计算曲线的线性拟合方程与拟合度。
用冷冻干燥机将合成的纳米粒子冻干成粉末。取1mg合成的纳米粒子溶解成悬液，使用高速离心机将最终合成的纳米粒子悬液离心，4000rpm/min，10℃，1h。取上清真空悬蒸浓缩后，应用紫外分光光度计测定其药物吸收光谱，并依据其在绘制标准曲线的波长处的吸光值换算药物含量。药物的包封率与载药率根据以下公式计算37：
2、实验结果
青蒿素在0.2％NaOH溶液中的紫外吸收光谱显示，从10-3mg/ml至4×10-1mg/ml的范围内，青蒿素在291nm处的紫外吸收值呈半抛物线型。由于本研究涉及的样本青蒿素浓度较低，选取10-3mg/ml至4×10-1mg/ml之间的紫外吸收值绘制标准曲线，可见其具有线性关系，线性回归方程为y＝0.0294x，其相关性指数R2＝0.9215(图4 A)。
六、药物包封率测定
1、实验方法
配制pH7.4、0.1M的PBS。分别用PBS溶液配制不同浓度的葡萄糖溶液(1、2、3mg·mL-1)，将粒子置于其中，在室温下放置于摇床上，以50r/min轻轻晃动，分别在20min、40min、60min后取样，使用紫外分光光度计测定其药物在不同葡萄糖溶液中的释放率。
释放率＝上清余药量/总加药量*％
2、实验结果
从MCP(ART)-AAPBA-TMC NPs输运体系的载药效率与载药量柱状图(图4B)结果可以看出，MCP(ART)-AAPBA-TMC NP的青蒿素包封率为85.04±2.1％，载药率为63.79±1.64％。
七、不同pH缓冲体系的药物释放率测定
1、实验方法
按照美国药典的配方配制模拟胃液和模拟肠液。调节模拟胃液的pH至pH＝1.2、pH＝3、pH＝5，调节模拟肠液的pH至pH＝6.8、pH＝7.4，取0.4mg/ml的粒子悬浊液300μl，放入10ml缓冲体系溶液中，在室温下放置于摇床上，以50r/min轻轻晃动，在2小时后取样，每次取样300μl，测量紫外分光光度值前用95％的乙醇碱溶液稀释3倍，即使用紫外分光光度计，测定其吸光度，并依据标准曲线校准换算。每个释放体系重复3次，收集数据用于统计计算。
释放率＝上清余药量/总加药量*％
2、实验结果
从不同pH缓冲体系的青蒿素释放曲线(图4 C)结果可以看出MCP(ART)-AAPBA-TMCNPs分别在模拟胃液的pH至pH＝1.2、3、5和pH＝6.8、7.4的模拟肠液缓冲体系2h后的释放情况。可见纳米粒子在pH＝1.2、3、5的缓冲体系中几乎没有释放，而在pH＝6.8、7.4的缓冲体系中呈现出突释的现象，而且释放率达到20％。在pH＝6.8、7.4两个模拟肠液缓冲体系粒子释放率相差不大。不同pH缓冲体系的药物释放率测定结果表明纳米粒子在不同pH缓冲体系中不呈现pH感应性，粒子在酸性条件下几乎不释放，在中性或偏碱性条件下释放。
八、模拟胃肠液缓冲体系的药物释放率测定
1、实验方法
按照美国药典的配方配制模拟胃液和模拟肠液。调节模拟胃液的pH至pH＝1.2；调节模拟肠液的pH至pH＝7.4。分别取0.4mg/ml的粒子悬浊液300μl，放入10ml模拟胃液和模拟肠液缓冲体系溶液中，在室温下放置于摇床上，以50r/min轻轻晃动，分别在1h、2h、4h、6h后取样，每次取样300μl，测量紫外分光光度值前用95％的乙醇碱溶液稀释3倍，即使用紫外分光光度计，测定其吸光度，并依据标准曲线校准换算。每个释放体系重复3次，收集数据用于统计计算。
释放率＝上清余药量/总加药量*％
2、实验结果
从模拟胃液缓冲体系的青蒿素释放曲线(图4 E)、模拟肠液缓冲体系的青蒿素释放曲线(图4 F)结果可以看出MCP(ART)-AAPBA-TMC NPS分别在模拟胃液和模拟肠液缓冲体系1h、2h、4h、6h后的释放情况。可见纳米粒子在模拟胃液中前4h释放率都不超过0.5％，随着时间的推移，在6h后有少量释放，但总体都不会超过2％，因此可以认为纳米粒子在模拟胃液中几乎不会释放；在模拟肠液中，纳米粒子在0～2h的释放率直线上升，直至达到峰值约为22.5％。峰值过后，在2～4h释放率缓慢下降至12.5％左右。在4～6h释放率逐渐趋于平稳状态，稳定在12.5％左右。模拟胃肠液的测定结果表明口服纳米输运载体在模拟胃液中几乎不会释放，在模拟肠液中会大量释放。因此可以认为纳米口服输运载体可以耐受住胃的极酸环境并且穿过胃到达小肠，在小肠的中性偏碱性的环境中释放药物。
实施例3荷载青蒿素&柑橘果胶的口服纳米粒子的细胞实验
一、实验方法
MCP(ART)-AAPBA-TMC口服纳米输运载体在细胞层面的生物毒性将由MTT法得到评估。
1、细胞培养
HepG-2细胞系由广东药学院提供。细胞在在培养瓶中增殖培养至80％后，以5000/孔的密度接种至96孔板上，培养1，2天，以进行后续实验。其细胞培养条件为：含20％新生牛血清、非必需氨基酸的高糖DMEM培养基，37℃，5.0％CO2。
2、MTT输运体系毒性
分别取不同剂量的输运体系加入正在培养的细胞中，24h后，使用MTT法测量细胞存活率。即在96孔培养板上接种HepG-2细胞，5000个/孔，培养24h后，吸出培养基，加入无血清培养基，及不同浓度的胰岛素输运体系，培养24h后，加入5mg/ml的MTT溶液20ul/孔。继续培养4h，吸出培养基，加入DMSO溶解细胞内形成的甲瓒。在摇床上低速振荡10min，于酶标仪读数，波长510nm。
二、实验结果
如图5所示，在HepG2细胞培养基内加入不同浓度的MCP(ART)-AAPBA-TMC纳米粒子，从MTT测定不同浓度的纳米粒子对细胞活力的影响结果可以看出细胞活力并未受到太大影响，细胞比活力都保持在90％以上。其中，MCP(ART)-AAPBA-TMC纳米体系对细胞活力有促进作用，随着纳米口服输运载体浓度的增大，细胞比活力也逐渐增大。
实施例4荷载青蒿素&柑橘果胶的口服纳米粒子的体内实验
一、II型糖尿病大鼠模型的构建实验
1、实验方法
购进SD大鼠，根据文献所得II型糖尿病的雄性和雌性SD大鼠中的发病率是分别为92％和43％，所以使用STZ(70mg/kg，用柠檬酸缓冲液配置)诱导雄性SD大鼠并进行高脂饲料喂养(喂养四周)，建立II型糖尿病模型，大鼠的空腹血糖值≥200mg/dl被认为是II型糖尿病大鼠(T2DM组大鼠)，可用于后面实验。以未处理的SD大鼠作为Control组。
2、实验结果
图6A为T2DM组与Control组的形态、饮食饮水、体重对比图。从图(图6A1)中我们可以看到，Con组大鼠毛发比较顺滑、光亮，有活力，没有肥胖现象。而T2DM组大鼠毛发脏乱、暗淡呈暗黄色、比较肥大、活力差，眼神黯淡无光。
图6A2、A3、A4为T2DM大鼠和正常大鼠的饮水、饮食和体重对比，从图中我们可以很明显的看出起始阶段无论是饮水、饮食和体重两组大鼠基本持平，而随着建模时间的推进，T2DM组大鼠的饮水、饮食和体重都得到了急剧增加相对与正常组，最终经过30天的时间后，正常组饮水、饮食均为正常组2～3倍，体重接近正常体重的一倍，II型糖尿病症状明显。
二、血糖进行了监测和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)检测
1、实验方法
对正常喂养一个月后的大鼠以及II型糖尿病模型喂养模式的大鼠进行尾静脉取血，分别用血糖测量仪以及胰岛素试剂盒对两组大鼠的空腹血糖(G0)和胰岛素(I0)水平进行检测。根据HOMA-IR＝G0×I0/22.5公式可计算出HOMA-IR。
2、实验结果
结果如图6C所示，Control组大鼠在建模过程中一直保持在5mmol/L左右，而T2DM组大鼠的血糖从在建模过程中一直持续上升，从第5天开始达到7.8mmol/L，处于高血糖状态。建模第25～30天，T2DM大鼠血糖急剧上升，到了第30天达到了20mmol/L，达到了II型糖尿病高血糖标准。从胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)检测结果上看(图6G)，为建模时期的Control组和T2DM组的对照，Control组HOMA-IR指数约为2左右，而T2DM组HOMA-IR指数则达到了8，胰岛素抵抗症状严重。综上所述，认为T2DM组大鼠建模成功。
三、T2DM大鼠长期喂药体征检测
1、实验方法
挑选正常SD雄性大鼠8只作为阳性对照组，T2DM大鼠构建成功后，分为三组，每组8只T2DM大鼠，三组分别为阴性对照组、药物对照组和纳米粒子治疗组，总计四组大鼠。
阳性对照组(Control组)：正常大鼠+PBS；
阴性对照组(T2DM+PBS组)：T2DM大鼠+PBS；
青蒿素药物组(T2DM+ART)：T2DM大鼠+青蒿素，浓度为40mg/kg；
纳米粒子治疗组(T2DM+NPs)：T2DM大鼠+纳米粒子(实施例1制备的MCP(ART)-AAPBA-TMC)，浓度为40mg/kg。每组小鼠进行灌胃30天，每5天都对每只大鼠血糖检测记录，每天对小鼠的体重和食物、水的消耗量进行统计。
2、实验结果
糖尿病大鼠治疗与未治疗体貌进行对比，未治疗糖尿病大鼠依旧体型肥硕，毛发暗淡无光，脏乱，眼神暗淡无光。而经过治疗的糖尿病大鼠则体型明显出现了改善，毛发逐渐干净，光亮，眼神明亮(图6B1)。四组大鼠的饮水和饮食进行对比(图6B2、B3)，T2DM+PBS组、T2DM+ART组基本没有出现变化，依旧处于多饮多食阶段，而T2DM+NPs组的饮食和饮水量是缓慢而持续下降的，并且在后期与正常大鼠+PBS组相接近。而且T2DM+NPs组大鼠的体重在服药后经过缓慢增加后一直维持在平稳状态的(400g左右)，T2DM+PBS组、T2DM+ART组大鼠的体重一直居高不下，处于不断增长的状态(图6 B4)。T2DM+NPs组大鼠的血糖经过30天的治疗也出现了明显降低，更加趋近于Control组的血糖值(图6D)。并且四组大鼠中T2DM组和T2DM+ART组的HOMA-IR指数约都在12.5左右，T2DM+NPs组的HOMA-IR指数下降至5以下，虽未达到正常范围，但是却逐渐接近正常值，因此可以认为纳米粒子对治疗胰岛素抵抗有一定的效果(图6F)。综上所述，我们认为纳米粒子对II型糖尿病的胰岛素抵抗症状有明显的改善作用。
四、葡萄糖耐性实验
1、实验方法
对于葡萄糖耐量试验(GTT)，将四组(分组如上)大鼠禁食过夜，然后用D-葡萄糖以2.5克/千克(体重)剂量进行注射，然后用血糖测量仪对每只大鼠进行0、20、40、60、80、120、180、240、360、480和600min时间点进行血糖检测。
2、实验结果
Control、T2DM+NPs、T2DM+ART、T2DM+PBS四组大鼠葡萄糖耐性实验(GTT)结果分析(图6 E)。四组大鼠中T2DM+ART组和T2DM+PBS组血糖快速上升，在30min左右达到最高水平，约为25mmol/ml，接着波动下降，T2DM+ART组400min左右血糖恢复到正常水平，而T2DM+PBS直至600min仍旧恢复不到正常水平，说明其体内平衡已经被打破。而T2DM+NPs组在30min左右也到达最高水平，约为15mmol/ml。峰值过后缓慢平稳下降，在200min左右就恢复到正常血糖水平。整个过程更加趋向于Control组应激过程，而且其整个过程属于正常体内应激反应。
五、T2DM大鼠血清生化指标的检测
1、实验方法
对Control、T2DM+NPs、T2DM+ART、T2DM+PBS四组大鼠进行血清生化指标的检测。
从尾静脉收集血液样本，在4℃下无抗凝离心3000转10分钟，血清储存在-20℃的环境里。血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)用标准试剂盒分光光度法测。具体检测方法根据试剂盒说明书进行操作。
2、实验结果
图7为Control组、T2DM+PBS组、T2DM+ART组和T2DM+NPs组大鼠在长期喂药后甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)的含量。从图中可以看出四组大鼠的甘油三脂含量相差不大，T2DM+NPs组最接近正常值，说明这一组肝脏损伤恢复最好；T2DM+ART组和T2DM+NPs组的血清总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的含量都高于正常值，其中血清总胆固醇和低密度脂蛋白都维持在高水平状态，T2DM+NPs组的含量有所下降。结果表明经过药物治疗后大鼠的肝功能有所改善。
六、T2DM大鼠相关器官的糖原染色
1、实验方法
四组大鼠在长期口服喂药结束后对每组的大鼠进行处死处理，取大鼠的肝脏、肾脏和心脏器官放于生理盐水中，洗净，称量器官的净重，然后对器官进行石蜡包埋切片观察，并对四组大鼠的组织切片进行PAS染色，使用激光共聚焦显微镜观察。
2、实验结果
图8A、D为Control组(Con)、T2DM+PBS组(PBS)、T2DM+ART组(ART)和T2DM+NPs(NPs)组四组大鼠在长期喂药后心脏、肝脏以及肾脏切片糖原染色(PAS染色)定量结果。定量分析可以比较直观表明，与Control组、T2DM+PBS组、T2DM+ART组相比较，T2DM+NPs组糖原积累较多，可以直观反映我们合成的纳米粒子增加糖原在心脏、肝脏以及肾脏中的积累。
七、器官毒性检测
1、实验方法
四组大鼠在长期口服喂药结束后对每组的大鼠进行处死处理，取大鼠的脾腺、肝脏、肾脏和心脏器官放于生理盐水中，洗净，称量器官的净重，然后对器官进行石蜡包埋切片观察，并对四组大鼠的组织切片进行HE染色观察。
2、实验结果
图8C为Control组、T2DM+PBS组、T2DM+ART组和T2DM+NPs组四组大鼠在长期喂药后心脏、肝脏、脾脏以及肾脏切片HE染色。心脏切片方面，四组特征变化不大。肝脏切片方面，T2DM+PBS组、T2DM+ART组肝细胞出现轻微水肿，细胞板遭到破坏，排列不规律，并且出现脂肪细胞浸润现象，T2DM+NPs组与Control组相比症状得以缓解，但是肝细胞还是处于病态，而T2DM+NPs组则细胞板完整，细胞排列整齐，肝细胞水肿现象和脂肪细胞浸润现象消失。肾脏组织切片方面，T2DM+PBS组、T2DM+ART组的细胞遭到了炎细胞的侵蚀，肾小球出现了不同程度的损伤，而T2DM+NPs组可以看出在炎细胞侵蚀方面得到了缓解，肾小球比较完整。在脾脏切片方面，三组切片的细胞都出现了细胞水肿现象，T2DM+PBS组较为严重，而T2DM+NPs组症状得到缓解。组织学评估结果表明，NPs对器官组织无明显的损伤和毒副作用，这也进一步说明该纳米口服输运载体的毒性极低。
八、免疫组化实验
1、实验方法
四组大鼠在长期口服喂药结束后对每组的大鼠进行处死处理，取大鼠的胰腺器官放于生理盐水中，洗净，称量器官的净重，然后对胰腺进行石蜡包埋切片观察，并对四组大鼠的组织切片，用胰岛素和胰高血糖素抗体对胰腺进行染色，观察。
2、实验结果
为了确定在NPs治疗的胰腺中观察到的增生性内分泌细胞的来源，我们进行了进一步的免疫组织化学分析。通过标记胰岛素和胰高血糖素来判断Control组、T2DM+PBS组、T2DM+ART组和T2DM+NPs组胰岛α细胞和胰岛β细胞的转化情况(图8B、E、F)。T2DM+NPs组四组大鼠在长期喂药后心脏、肝脏以及肾脏免疫组化实验结果。从图8可以看出T2DM+PBS组胰岛素分泌量明显少于Control组，胰高血糖素分泌量相对Control组变化不明显，说明T2DM+PBS组大鼠的胰岛β细胞破坏严重，体内的稳态失衡。T2DM+ART组的胰岛素分泌量有所上升，T2DM+NPs组的胰岛素分泌量上升最为明显，初步估计接近Control组，同时二者的胰高血糖素分泌量相对Control组来看有所下降。因此可以推测青蒿素可以将胰岛α细胞转化为胰岛β细胞。

Claims (10)

1.一种纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.柑橘果胶进行多分子自聚；
S2.使柑橘果胶形成纳米粒子并包裹与吸附青蒿素进行；
S3.氨基苯硼酸与柑橘果胶纳米粒子连接；
S4.外层包裹N-三甲基壳聚糖。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，柑橘果胶的水溶液，50～60℃下，调节pH至8～10并充分混匀，冷却至室温。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，上一步产物与青蒿素混合，得到混合溶液1，碱环境下充分混匀。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，包括以下步骤：
S21.调节pH至8～10，以溶解多分子自聚后的柑橘果胶；
S22.与青蒿素溶液混合，在50～60℃充分混匀；
S23.加入氢氧化钙至0.01～1.0mol/L，在50～60℃充分混匀；
S24.加入碳酸氢钠至0.01～1.0mol/L，在50～60℃充分混匀。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S22中，混合溶液1中，青蒿素的终浓度为0.5～3mol/L。
6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S3中，调节上一步产物至pH＝4～7，与氨基苯硼酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液和二环己基碳二亚胺混合得到混合溶液2，混匀，浓缩。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤S3中，混合溶液2中氨基苯硼酸的质量浓度为0.01～1.0mol/L。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，步骤S4中，N-三甲基壳聚糖、步骤S3的产物混合与二环己基碳二亚胺、氨基醇混合得到混合溶液3，充分混匀，浓缩。
9.权利要求1到8任一所述制备方法制备得到的纳米粒子。
10.权利要求9所述纳米粒子在制备糖尿病药物中的应用。
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