CN115175987A - 基因编辑的免疫细胞和治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了基因编辑的免疫细胞、产生基因编辑的免疫细胞的方法和治疗方法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括使多个哺乳动物细胞与包含由同源臂侧接的插入序列的多核酸构建体接触，其中所述同源臂包含与邻近所述多个哺乳动物细胞的基因组中的靶位点的序列的至多400个连续核苷酸同源的序列。

Description

基因编辑的免疫细胞和治疗方法
交叉参考
本申请要求于2019年9月23日提交的美国临时申请号62/904,299和2019年10月15日提交的美国临时申请号62/915,436的权益，所述申请中的每一个出于所有目的均以引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请含有已以电子方式以ASCII格式提交并以引用的方式整体并入本文的序列表。所述ASCII副本创建于2020年9月23日，名为47533748601_SL.txt并且大小为5,341,564字节。
背景技术
基因编辑的免疫细胞有望成为一系列病症的潜在疗法，所述病症包括癌症、自身免疫性病症、炎性病症和传染病。为了实现这一潜力，需要将所需的修饰有效地引入免疫细胞基因组中，同时保持细胞生存力的技术。
以引用的方式并入
本申请中引用的每个专利、公开和非专利文献在此以引用的方式整体并入，就好像每个都以引用的方式单独并入一样。
发明内容
一方面，本文提供了产生工程化哺乳动物细胞群的方法，其包括：(a)使多个哺乳动物细胞与包含由同源臂侧接的插入序列的多核酸构建体接触，其中所述同源臂中的每一个包含与邻近所述多个哺乳动物细胞的基因组中的靶位点的序列的至多400个连续核苷酸同源的序列；(b)裂解所述多核酸构建体；以及(c)将所述插入序列插入所述靶位点，从而产生工程化哺乳动物细胞群。
在一些实施方案中，所述方法还包括扩增所述基因工程化哺乳动物细胞群。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多个哺乳动物细胞与DNA酶接触。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶(Benzonase)、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶是DNA酶I。在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多个哺乳动物细胞与外源免疫刺激剂接触。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，所述外源免疫刺激剂是B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7或截短CD19。
在一些实施方案中，所述外源免疫刺激剂被配置来刺激所述多个哺乳动物细胞中的至少一部分的扩增。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂的浓度为约50IU/ml至约1000IU/ml。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多个哺乳动物细胞与调节DNA双链断裂修复的外源剂接触。在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中活细胞的百分比增加。在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，所述剂包括NAC或抗IFNAR2抗体。在一些实施方案中，所述剂包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的所述蛋白质选自由以下组成的组：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K和Scr7。
在一些实施方案中，所述多个哺乳动物细胞在培养基中体外或离体培养，其中所述培养基基本上不含抗生素。
在一些实施方案中，使用质粒、小环载体、线性化双链DNA构建体或病毒载体将所述插入序列引入所述多个哺乳动物细胞中。
在一些实施方案中，所述插入序列包括编码外源受体的序列。在一些实施方案中，所述外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、B细胞受体(BCR)、自然杀伤细胞(NK细胞)受体、细胞因子受体或趋化因子受体。在一些实施方案中，所述外源受体是对疾病相关抗原具有特异性的免疫受体。在一些实施方案中，所述外源受体是特异性结合至癌抗原的免疫受体。在一些实施方案中，所述外源受体是特异性结合自身免疫性抗原的免疫受体。
在一些实施方案中，所述插入序列包括启动子序列、增强子序列或启动子序列和增强子序列两者。
在一些实施方案中，所述方法还包括裂解所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述靶位点。在一些实施方案中，所述裂解所述靶位点包括用内切核酸酶裂解。在一些实施方案中，所述裂解所述多核酸构建体包括用内切核酸酶裂解。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是CRISPR相关内切核酸酶。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是Cas9。在一些实施方案中，(a)还包括将第一指导RNA(gRNA)或编码所述第一gRNA的多核酸引入所述多个哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，(a)还包括将第二指导RNA(gRNA)或编码所述第二gRNA的多核酸引入所述多个哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生至少一个双链断裂。在一些实施方案中，所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在多核酸构建体中产生至少一个双链断裂。
在一些方面，第一gRNA和第二指导RNA包含包括与SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:82中的至少一部分至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性的序列。在一些情况下，第一gRNA能够结合至内源基因(诸如选自表1、免疫检查点和/或安全港基因的基因)，而第二gRNA能够结合异种序列或合成序列(诸如本文提供的通用gRNA的靶向序列)。
在一些实施方案中，所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生至少一个双链断裂并在所述多核酸构建体中产生至少一个双链断裂。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入安全港基因座中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入免疫调节基因基因座中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入免疫检查点基因基因座中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入编码受体的基因中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入编码T细胞受体组分的基因中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入TRAC或TCRB基因座中。
在一些实施方案中，由所述TRAC或TCRB基因座编码的所述内源蛋白的表达被破坏。
在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述多个哺乳动物细胞包括人T细胞、NK细胞、NKT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述多个哺乳动物细胞包括人T细胞。
在一些实施方案中，(c)包括在所述多核酸构建体中产生两个双链断裂。
在一些实施方案中，(b)包括在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生两个双链断裂，其中将所述插入序列插入所述多个哺乳动物细胞的基因组中并桥接所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述两个双链断裂。
在一些实施方案中，将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸从哺乳动物细胞基因组中缺失。
在一些实施方案中，所述同源臂包含是三或四的倍数的多个核苷酸。在一些实施方案中，所述同源臂包含至多5-100个碱基对。在一些实施方案中，所述同源臂包含至多50个碱基对。在一些实施方案中，所述同源臂侧接用于插入的序列。在一些实施方案中，所述同源臂由指导RNA靶向的序列侧接。在一些实施方案中，所述同源臂不同或相同。在一些情况下，同源臂是不同的。在一些情况下，同源臂是相同的。在一些情况下，所述同源臂中的至少一个由指导RNA靶向的序列侧接。在一些情况下，两个同源臂均由指导RNA靶向的序列侧接。在一些实施方案中，所述同源臂侧接用于插入的序列。在一些实施方案中，同源臂包含与TRAC或TCRB基因座中的序列同源的序列。
在一些情况下，同源臂可包含与30-70、35-65、40-60、45-55、45-50、60-80、60-100、50-200、100-400、200-600或500-1000个碱基长度同源的序列。在一些情况下，同源臂包含与48个碱基长度同源的序列。在一些情况下，所述序列是例如表1中的内源基因序列、免疫检查点序列和/或安全港序列。
在一些实施方案中，所述方法还包括破坏哺乳动物细胞基因组中的一个或多个额外基因。
在一些实施方案中，所述方法还包括在(a)中引入包含用于插入的序列的一个或多个额外多核酸构建体，在(b)中在哺乳动物细胞基因组中的额外位点处产生双链断裂，在(c)中在一个或多个额外多核酸构建体中产生双链断裂，以及将一个或多个用于插入的额外序列插入哺乳动物细胞基因组中的额外位点中。
一方面，本文提供了产生工程化哺乳动物细胞群的方法，其包括：(a)使多个哺乳动物细胞与包含由同源臂侧接的插入序列的多核酸构建体接触，其中所述同源臂包含与邻近所述多个哺乳动物细胞的基因组中的靶位点的序列同源的序列；(b)裂解所述多核酸构建体；以及(c)将所述插入序列插入所述靶位点，其中所述插入的效率比不包括(b)的方法高至少10％，从而产生工程化哺乳动物细胞群。
在一些实施方案中，所述方法还包括扩增所述基因工程化哺乳动物细胞群。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多个哺乳动物细胞与DNA酶接触。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测所述转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％、65％、70％、75％、80％或90％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶是DNA酶I。在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多个哺乳动物细胞与外源免疫刺激剂接触。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，所述外源免疫刺激剂是B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7或截短CD19。
在一些实施方案中，所述外源免疫刺激剂被配置来刺激所述多个哺乳动物细胞中的至少一部分的扩增。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂的浓度为约50IU/ml至约1000IU/ml。
在一些实施方案中，多个哺乳动物细胞与包含由同源臂侧接的插入序列的多核酸构建体的接触在与所述外源免疫刺激剂的所述接触后30小时-36小时发生。在一些实施方案中，多个哺乳动物细胞与包含由同源臂侧接的插入序列的多核酸构建体的接触在与所述外源免疫刺激剂的所述接触后36小时发生。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多个哺乳动物细胞与调节DNA双链断裂修复的外源剂接触。在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中活细胞的百分比增加。在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，所述剂包括NAC或抗IFNAR2抗体。在一些实施方案中，所述剂包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的所述蛋白质选自由以下组成的组：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K和Scr7。
在一些实施方案中，所述多个哺乳动物细胞在培养基中体外或离体培养，其中所述培养基基本上不含抗生素。
在一些实施方案中，使用质粒、小环载体、线性化双链DNA构建体或病毒载体将所述插入序列引入所述多个哺乳动物细胞中。
在一些实施方案中，所述插入序列或转基因包括编码外源受体的序列。在一些实施方案中，所述外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、B细胞受体(BCR)、自然杀伤细胞(NK细胞)受体、细胞因子受体或趋化因子受体。在一些实施方案中，所述外源受体是对疾病相关抗原具有特异性的免疫受体。在一些实施方案中，所述外源受体是特异性结合至癌抗原的免疫受体。在一些实施方案中，所述外源受体是特异性结合自身免疫性抗原的免疫受体。
在一些情况下，外源受体可为TCR。在其他情况下，外源受体可为CAR。CAR可由包括与SEQ ID NO:91的多肽至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同一性的多肽序列编码。在一些情况下，多核酸构建体包括与SEQ ID NO:90的至少一部分至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性。在一些情况下，多核酸构建体包含SEQID NO:90，或其修饰型式。
在一些实施方案中，所述插入序列包括启动子序列、增强子序列或启动子序列和增强子序列两者。
在一些实施方案中，所述方法还包括裂解所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述靶位点。在一些实施方案中，所述裂解所述靶位点包括用内切核酸酶裂解。在一些实施方案中，所述裂解所述多核酸构建体包括用内切核酸酶裂解。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是CRISPR相关内切核酸酶。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是Cas9。在一些实施方案中，(a)还包括将第一指导RNA(gRNA)或编码所述第一gRNA的多核酸引入所述多个哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，(a)还包括将第二指导RNA(gRNA)或编码所述第二gRNA的多核酸引入所述多个哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生至少一个双链断裂。在一些实施方案中，所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在多核酸构建体中产生至少一个双链断裂。
在一些实施方案中，所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生至少一个双链断裂并在所述多核酸构建体中产生至少一个双链断裂。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入安全港基因座中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入免疫调节基因基因座中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入免疫检查点基因基因座中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入编码受体的基因中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入编码T细胞受体组分的基因中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入TRAC或TCRB基因座中。
在一些实施方案中，由所述TRAC或TCRB基因座编码的所述内源蛋白的表达被破坏。在一些情况下，将多个哺乳动物细胞的基因组中的双链断裂引入TRAC基因座中。在一些情况下，将多个哺乳动物细胞的基因组中的双链断裂引入TRAC基因座的外显子1中。在一些情况下，将多个哺乳动物细胞的基因组中的双链断裂引入TRAC的外显子1中，并且所述双链断裂包含SEQ ID NO:80的至少一部分或SEQ ID NO:80的5’或3’的任一侧上的至少约1000个碱基的序列。
在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述多个哺乳动物细胞包括人T细胞、NK细胞、NKT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述多个哺乳动物细胞包括人T细胞。
在一些实施方案中，(c)包括在所述多核酸构建体中产生两个双链断裂。
在一些实施方案中，(b)包括在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生两个双链断裂，其中将所述插入序列插入所述多个哺乳动物细胞的基因组中并桥接所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述两个双链断裂。
在一些实施方案中，将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸从哺乳动物细胞基因组中缺失。
在一些实施方案中，所述同源臂包含是三或四的倍数的多个核苷酸。在一些实施方案中，所述同源臂包含至多5-100个碱基对。在一些实施方案中，所述同源臂包含至多50个碱基对。在一些实施方案中，所述同源臂包含至多75个碱基对。在一些实施方案中，所述同源臂侧接用于插入的序列。在一些实施方案中，所述同源臂由指导RNA靶向的序列侧接。在一些实施方案中，所述多核酸构建体包含相同或不同的同源臂。在一些实施方案中，所述同源臂侧接用于插入的序列。在一些实施方案中，同源臂包含与TRAC或TCRB基因座中的序列同源的序列。
在一些实施方案中，所述方法还包括破坏哺乳动物细胞基因组中的一个或多个额外基因。
在一些实施方案中，所述方法还包括在(a)中引入包含用于插入的序列的一个或多个额外多核酸构建体，在(b)中在哺乳动物细胞基因组中的额外位点处产生双链断裂，在(c)中在一个或多个额外多核酸构建体中产生双链断裂，以及将一个或多个用于插入的额外序列插入哺乳动物细胞基因组中的额外位点中。
一方面，本文提供了产生工程化哺乳动物细胞群的方法，其包括：(a)使多个哺乳动物细胞与包含由同源臂侧接的至少1000个碱基对的插入序列的多核酸构建体接触，其中所述同源臂包含与邻近所述多个哺乳动物细胞的基因组中的靶位点的序列的至多400个连续核苷酸同源的序列；(b)裂解所述多核酸构建体；以及(c)将所述插入序列插入所述靶位点，其中所述插入的效率比其中同源臂包含与邻近所述靶位点的所述序列的至少500个连续核苷酸同源的序列的方法高至少10％，从而产生工程化哺乳动物细胞群。
在一些实施方案中，所述方法还包括扩增所述基因工程化哺乳动物细胞群。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多个哺乳动物细胞与DNA酶接触。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶是DNA酶I。在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多个哺乳动物细胞与外源免疫刺激剂接触。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，所述外源免疫刺激剂是B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7或截短CD19。
在一些实施方案中，所述外源免疫刺激剂被配置来刺激所述多个哺乳动物细胞中的至少一部分的扩增。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂的浓度为约50IU/ml至约1000IU/ml。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多个哺乳动物细胞与调节DNA双链断裂修复的外源剂接触。在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中活细胞的百分比增加。在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，所述剂包括NAC或抗IFNAR2抗体。在一些实施方案中，所述剂包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的所述蛋白质选自由以下组成的组：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K和Scr7。
在一些实施方案中，所述多个哺乳动物细胞在培养基中体外或离体培养，其中所述培养基基本上不含抗生素。
在一些实施方案中，使用质粒、小环载体、线性化双链DNA构建体或病毒载体将所述插入序列引入所述多个哺乳动物细胞中。
在一些实施方案中，所述插入序列包括编码外源受体的序列。在一些实施方案中，所述外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、B细胞受体(BCR)、自然杀伤细胞(NK细胞)受体、细胞因子受体或趋化因子受体。在一些实施方案中，所述外源受体是对疾病相关抗原具有特异性的免疫受体。在一些实施方案中，所述外源受体是特异性结合至癌抗原的免疫受体。在一些实施方案中，所述外源受体是特异性结合自身免疫性抗原的免疫受体。
在一些实施方案中，所述插入序列包括启动子序列、增强子序列或启动子序列和增强子序列两者。
在一些实施方案中，所述方法还包括裂解所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述靶位点。在一些实施方案中，所述裂解所述靶位点包括用内切核酸酶裂解。在一些实施方案中，所述裂解所述多核酸构建体包括用内切核酸酶裂解。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是CRISPR相关内切核酸酶。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是Cas9。在一些实施方案中，(a)还包括将第一指导RNA(gRNA)或编码所述第一gRNA的多核酸引入所述多个哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，(a)还包括将第二指导RNA(gRNA)或编码所述第二gRNA的多核酸引入所述多个哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生至少一个双链断裂。在一些实施方案中，所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在多核酸构建体中产生至少一个双链断裂。
在一些实施方案中，所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生至少一个双链断裂并在所述多核酸构建体中产生至少一个双链断裂。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入安全港基因座中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入免疫调节基因基因座中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入免疫检查点基因基因座中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入编码受体的基因中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入编码T细胞受体组分的基因中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入TRAC或TCRB基因座中。
在一些实施方案中，由所述TRAC或TCRB基因座编码的所述内源蛋白的表达被破坏。
在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述多个哺乳动物细胞包括人T细胞、NK细胞、NKT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述多个哺乳动物细胞包括人T细胞。
在一些实施方案中，(c)包括在所述多核酸构建体中产生两个双链断裂。
在一些实施方案中，(b)包括在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生两个双链断裂，其中将所述插入序列插入所述多个哺乳动物细胞的基因组中并桥接所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述两个双链断裂。
在一些实施方案中，将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸从哺乳动物细胞基因组中缺失。
在一些实施方案中，所述同源臂包含是三或四的倍数的多个核苷酸。在一些实施方案中，所述同源臂包含至多5-100个碱基对。在一些实施方案中，所述同源臂包含至多50个碱基对。在一些实施方案中，所述同源臂包含至多75个碱基对。在一些实施方案中，所述同源臂侧接用于插入的序列。在一些实施方案中，所述同源臂由指导RNA靶向的序列侧接。在一些实施方案中，所述多核酸构建体包含相同或不同的同源臂。在一些实施方案中，所述同源臂侧接用于插入的序列。在一些实施方案中，同源臂包含与TRAC或TCRB基因座中的序列同源的序列。
在一些实施方案中，所述方法还包括破坏哺乳动物细胞基因组中的一个或多个额外基因。
在一些实施方案中，所述方法还包括在(a)中引入包含用于插入的序列的一个或多个额外多核酸构建体，在(b)中在哺乳动物细胞基因组中的额外位点处产生双链断裂，在(c)中在一个或多个额外多核酸构建体中产生双链断裂，以及将一个或多个用于插入的额外序列插入哺乳动物细胞基因组中的额外位点中。
一方面，本文提供了产生工程化哺乳动物细胞群的方法，其包括：(a)使多个哺乳动物细胞与包含由同源臂侧接的插入序列的多核酸构建体接触，其中所述同源臂包含与邻近所述多个哺乳动物细胞的基因组中的靶位点的序列的至多400个连续核苷酸同源的序列；(b)裂解所述多核酸构建体；(c)在所述多个哺乳动物细胞的基因组中在所述靶位点处产生第一双链断裂，并在所述多个哺乳动物细胞的基因组中在第二位点处产生第二双链断裂；以及(d)将所述插入序列插入所述靶位点，从而产生工程化哺乳动物细胞群。
在一些实施方案中，所述方法还包括扩增所述基因工程化哺乳动物细胞群。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多个哺乳动物细胞与DNA酶接触。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶是DNA酶I。在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多个哺乳动物细胞与外源免疫刺激剂接触。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，所述外源免疫刺激剂是B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7或截短CD19。
在一些实施方案中，所述外源免疫刺激剂被配置来刺激所述多个哺乳动物细胞中的至少一部分的扩增。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂的浓度为约50IU/ml至约1000IU/ml。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述多个哺乳动物细胞与调节DNA双链断裂修复的外源剂接触。在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中活细胞的百分比增加。在一些实施方案中，与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。在一些实施方案中，如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
在一些实施方案中，所述剂包括NAC或抗IFNAR2抗体。在一些实施方案中，所述剂包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的所述蛋白质选自由以下组成的组：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K和Scr7。
在一些实施方案中，所述多个哺乳动物细胞在培养基中体外或离体培养，其中所述培养基基本上不含抗生素。
在一些实施方案中，使用质粒、小环载体、线性化双链DNA构建体或病毒载体将所述插入序列引入所述多个哺乳动物细胞中。
在一些实施方案中，所述插入序列包括编码外源受体的序列。在一些实施方案中，所述外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、B细胞受体(BCR)、自然杀伤细胞(NK细胞)受体、细胞因子受体或趋化因子受体。在一些实施方案中，所述外源受体是对疾病相关抗原具有特异性的免疫受体。在一些实施方案中，所述外源受体是特异性结合至癌抗原的免疫受体。在一些实施方案中，所述外源受体是特异性结合自身免疫性抗原的免疫受体。
在一些实施方案中，所述插入序列包括启动子序列、增强子序列或启动子序列和增强子序列两者。
在一些实施方案中，所述方法还包括裂解所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述靶位点。在一些实施方案中，所述裂解所述靶位点包括用内切核酸酶裂解。在一些实施方案中，所述裂解所述多核酸构建体包括用内切核酸酶裂解。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是CRISPR相关内切核酸酶。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是Cas9。在一些实施方案中，(a)还包括将第一指导RNA(gRNA)或编码所述第一gRNA的多核酸引入所述多个哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，(a)还包括将第二指导RNA(gRNA)或编码所述第二gRNA的多核酸引入所述多个哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生至少一个双链断裂。在一些实施方案中，所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在所述多核酸构建体中产生至少一个双链断裂。
在一些实施方案中，所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生至少一个双链断裂并在所述多核酸构建体中产生至少一个双链断裂。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入安全港基因座中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入免疫调节基因基因座中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入免疫检查点基因基因座中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入编码受体的基因中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入编码T细胞受体组分的基因中。在一些实施方案中，将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入TRAC或TCRB基因座中。
在一些实施方案中，由所述TRAC或TCRB基因座编码的所述内源蛋白的表达被破坏。
在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述多个哺乳动物细胞包括人T细胞、NK细胞、NKT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述多个哺乳动物细胞包括人T细胞。
在一些实施方案中，(c)包括在所述多核酸构建体中产生两个双链断裂。
在一些实施方案中，(b)包括在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生两个双链断裂，其中将所述插入序列插入所述多个哺乳动物细胞的基因组中并桥接所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述两个双链断裂。
在一些实施方案中，将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸从哺乳动物细胞基因组中缺失。
在一些实施方案中，所述同源臂包含是三或四的倍数的多个核苷酸。在一些实施方案中，所述同源臂包含至多5-100个碱基对。在一些实施方案中，所述同源臂包含至多50个碱基对。在一些实施方案中，所述同源臂包含至多75个碱基对。在一些实施方案中，所述同源臂侧接用于插入的序列。在一些实施方案中，所述同源臂由指导RNA靶向的序列侧接。在一些实施方案中，所述多核酸构建体包含相同或不同的同源臂。在一些实施方案中，所述同源臂侧接用于插入的序列。在一些实施方案中，同源臂包含与TRAC或TCRB基因座中的序列同源的序列。
在一些实施方案中，所述方法还包括破坏哺乳动物细胞基因组中的一个或多个额外基因。
在一些实施方案中，所述方法还包括在(a)中引入包含用于插入的序列的一个或多个额外多核酸构建体，在(b)中在哺乳动物细胞基因组中的额外位点处产生双链断裂，在(c)中在一个或多个额外多核酸构建体中产生双链断裂，以及将一个或多个用于插入的额外序列插入哺乳动物细胞基因组中的额外位点中。
一方面，本文提供了制造工程化T细胞的方法，其包括：(a)提供来自人类受试者的原代T细胞；(b)将以下离体引入原代T细胞中：(i)核酸酶或编码核酸酶的多核酸，其中核酸酶是CRISPR相关核酸酶；(ii)第一指导RNA或编码第一指导RNA的多核酸，其中第一指导RNA靶向原代T细胞的TRAC或TCRB基因座中的序列；(iii)第二指导RNA或编码第二指导RNA的多核酸；以及(iv)包含用于插入的序列的多核酸构建体，其中用于插入的序列包括编码外源T细胞受体或嵌合抗原受体的序列，其中多核酸构建体包含侧接用于插入的序列的第一短同源臂和第二短同源臂，其中第一短同源臂和第二短同源臂包含与原代T细胞的TRAC或TCRB基因座中的序列同源的序列，其中第一短同源臂少于50个碱基对并且第二短同源臂少于50个碱基对，其中第一短同源臂和第二短同源臂由第二指导RNA靶向的序列侧接；(c)在原代T细胞的基因组的TRAC或TCRB基因座中产生双链断裂，其中TRAC或TCRB基因座中双链断裂是由CRISPR相关核酸酶和第一指导RNA产生，其中双链断裂介于与第一短同源臂同源的第一序列与和第二短同源臂同源的第二序列之间；以及(d)在多核酸构建体中产生两个双链断裂，从而产生裂解的多核酸构建体，其中裂解的多核酸构建体在第一末端包含第一短同源臂并在第二末端包含第二短同源臂，其中两个双链断裂由CRISPR相关核酸酶和第二指导RNA产生；(e)通过同源性介导的末端连接将编码外源T细胞受体的序列插入TRAC或TCRB基因座中的双链断裂位点处的原代T细胞基因组中。
在一些情况下，(b)的引入在与外源免疫刺激剂的接触之后30小时至36小时发生。在一些情况下，(b)的引入在与外源免疫刺激剂的接触之后36小时发生。在一些情况下，外源免疫刺激剂是B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7或截短CD19。
一方面，本文提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的组合物。在一些实施方案中，所述癌症为膀胱癌、上皮癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、食管癌、胃肠道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、肺泡状横纹肌肉瘤、肛管癌、直肠癌、眼癌、颈部癌、胆囊癌、胸膜癌、口腔癌、外阴癌、结肠癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、腹膜癌、肾脏癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。在一些实施方案中，所述癌症为胃肠道癌、乳腺癌、淋巴瘤或前列腺癌。在一些实施方案中，所述工程化哺乳动物细胞群对于所述受试者是同种异体的或自体的。
一方面，本文提供了哺乳动物细胞，其包含：(a)多核酸构建体，其包含由同源臂侧接的外源序列，其中同源臂中的每一个包含与邻近哺乳动物细胞的基因组中的靶位点的序列的至多400个连续核苷酸同源的序列，其中多核酸已经裂解并包含切除末端；以及(b)哺乳动物细胞的基因组中的双链断裂，其中由双链断裂暴露的至少一个末端被切除。
在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。
一方面，本文提供了哺乳动物细胞，其包含：(a)多核酸构建体，其包含由同源臂侧接的至少1000个碱基对的插入序列，其中同源臂中的每一个包含与邻近所述哺乳动物细胞的基因组中的靶位点的序列的至多400个连续核苷酸同源的序列；以及(b)哺乳动物细胞的基因组中的双链断裂，其中由双链断裂暴露的至少一个末端被切除。在一些情况下，同源臂包含与30-70、35-65、40-60、45-55或45-50个碱基长度同源的序列，在一些情况下，同源臂包含与48个碱基长度同源的序列。
在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。
一方面，本文提供了通过本文所述的方法制备的哺乳动物细胞。
一方面，本文提供了通过本文所述的方法制备的哺乳动物细胞群。
一方面，本文提供了包含通过本文所述的方法制备的哺乳动物细胞的药物组合物。
一方面，本文提供了包含通过本文所述的方法制备的哺乳动物细胞群的药物组合物。
一方面，本文提供了组合物，其包含：已与编码转基因的多核酸接触的细胞群；和浓度为约5μg/ml至约15μg/ml的DNA酶；其中在所述DNA酶的存在下，如通过在使所述细胞群与所述多核酸接触之后7天通过流式细胞术检测所述转基因所测量的，所述细胞群的至少60％表达所述转基因。
在一些实施方案中，所述细胞群的至少一部分的细胞核包含至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述细胞群包括原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞群包括原代免疫细胞。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种外源添加的免疫刺激剂。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans cell)、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物还包含抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个基因组位点的破坏。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个内源基因的修饰或缺失。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包含CISH、PD-1或两者。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含转基因。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的细胞受体：T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
一方面，本文提供了包含基因修饰的细胞群的组合物，其中所述细胞群包含以下细胞，其细胞核包含：编码转基因的多核酸；和至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。
在一些实施方案中，所述组合物还包含DNA酶。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述细胞群的至少一部分的细胞核包含至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。
在一些实施方案中，所述细胞群包括原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞群包括原代免疫细胞。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种外源添加的免疫刺激剂。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物还包含抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个基因组位点的破坏。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个内源基因的修饰或缺失。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包含CISH、PD-1或两者。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含转基因。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的细胞受体：T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
一方面，本文提供了组合物，其包含：基因修饰的细胞；DNA酶；以及基本不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述细胞群包括原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞群包括原代免疫细胞。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种外源添加的免疫刺激剂。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物还包含抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个基因组位点的破坏。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个内源基因的修饰或缺失。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包含CISH、PD-1或两者。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含转基因。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的细胞受体：T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
一方面，本文提供了组合物，其包含：基因修饰的原代免疫细胞；DNA酶；以及至少一种外源添加的免疫刺激剂。
在一些实施方案中，所述细胞群的至少一部分的细胞核包含至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述细胞群包括原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞群包括原代免疫细胞。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种外源添加的免疫刺激剂。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物还包含抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个基因组位点的破坏。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个内源基因的修饰或缺失。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包含CISH、PD-1或两者。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含转基因。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的细胞受体：T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
一方面，本文提供了组合物，其包含：基因修饰的原代免疫细胞；DNA酶；以及至少一种浓度为约50IU/ml至约1000IU/ml的外源添加的免疫刺激剂。
在一些实施方案中，所述细胞群的至少一部分的细胞核包含至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述细胞群包括原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞群包括原代免疫细胞。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种外源添加的免疫刺激剂。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物还包含抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个基因组位点的破坏。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个内源基因的修饰或缺失。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包含CISH、PD-1或两者。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含转基因。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的细胞受体：T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
一方面，本文提供了增加工程化细胞的转基因表达的方法，其包括：将编码转基因的外源多核酸引入原代免疫细胞群，从而产生修饰的原代免疫细胞群；以及使所述修饰的原代免疫细胞群与DNA酶和免疫刺激剂接触；其中与仅接触所述DNA酶或所述免疫刺激剂中的一种的类似修饰的原代免疫细胞群相比，所述接触使得表达由所述外源多核酸编码的所述转基因的细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，所述细胞群的至少一部分的细胞核包含至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度加入。在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物还包含抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个基因组位点的破坏。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个内源基因的修饰或缺失。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包含CISH、PD-1或两者。在一些实施方案中，所述内源基因包括T细胞受体基因。在一些实施方案中，所述内源基因包括TRAC、TCRB或两者。在一些实施方案中，所述内源基因包括T细胞受体和免疫检查点基因。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含转基因。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的细胞受体：T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
一方面，本文提供了增加工程化细胞的生存力的方法，其包括：将编码转基因的外源多核酸引入原代免疫细胞群，从而产生修饰的原代免疫细胞群；以及使所述修饰的原代免疫细胞群与DNA酶和免疫刺激剂接触；其中与仅接触所述DNA酶或所述免疫刺激剂中的一种的类似修饰的原代免疫细胞群相比，所述接触使得表达由所述外源多核酸编码的所述转基因的活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，与所述DNA酶和与所述免疫刺激剂的接触同时发生。
在一些实施方案中，所述细胞群的至少一部分的细胞核包含至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度加入。在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物还包含抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个基因组位点的破坏。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个内源基因的修饰或缺失。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包括CISH、PD-1、TRAC、TCRB或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含转基因。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的细胞受体：T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
一方面，本文提供了增加工程化细胞的细胞生存力的方法，其包括：将编码转基因的外源多核酸引入原代免疫细胞群，从而产生修饰的原代免疫细胞群；以及使所述修饰的原代免疫细胞群与DNA酶接触；其中与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的原代免疫细胞群相比，所述接触使得表达如由所述群中的所述外源多核酸编码的所述转基因的活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，所述细胞群的至少一部分的细胞核包含至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度加入。在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物还包含抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个基因组位点的破坏。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个内源基因的修饰或缺失。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包括CISH、PD-1、TRAC、TCRB或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含转基因。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的细胞受体：T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
一方面，本文提供了增加工程化细胞的转基因表达的方法，其包括：将编码转基因的外源多核酸引入原代免疫细胞群，从而产生修饰的原代免疫细胞群；以及使所述原代免疫细胞群与DNA酶接触；其中与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的原代免疫细胞群相比，所述接触使得表达由所述外源多核酸编码的所述转基因的细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，所述细胞群的至少一部分的细胞核包含至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度加入。在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物还包含抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个基因组位点的破坏。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个内源基因的修饰或缺失。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包含CISH、PD-1或两者。在一些实施方案中，所述内源基因包括CISH、PD-1、TRAC、TCRB或其组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含转基因。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的细胞受体：T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
一方面，本文提供了增加工程化细胞的细胞生存力的方法，其包括：将编码转基因的小环载体或线性化双链DNA构建体引入细胞群，从而产生修饰的细胞群；以及使所述修饰的细胞群与DNA酶接触；其中与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的细胞群相比，所述接触使得所述修饰的细胞群中活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，所述细胞群的至少一部分的细胞核包含至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度加入。在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物还包含抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个基因组位点的破坏。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个内源基因的修饰或缺失。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包含CISH、PD-1或两者。在一些实施方案中，所述内源基因包括CISH、PD-1、TRAC、TCRB或其组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含转基因。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的细胞受体：T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
一方面，本文提供了增加工程化细胞的整合效率的方法，其包括：将编码转基因的小环载体或线性化双链DNA构建体引入细胞群，从而产生修饰的细胞群；以及使所述修饰的细胞群与DNA酶接触；其中与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的细胞群相比，所述接触使得表达由所述小环载体或所述线性化双链DNA构建体编码的所述转基因的细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，所述引入包括用所述外源多核酸或所述小环载体或所述线性化双链DNA构建体对所述细胞群进行电穿孔。
在一些实施方案中，所述细胞群的至少一部分的细胞核包含至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度加入。在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物还包含抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个基因组位点的破坏。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个内源基因的修饰或缺失。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包含CISH、PD-1或两者。在一些实施方案中，所述内源基因包括CISH、PD-1、TRAC、TCRB或其组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含转基因。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的细胞受体：T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
一方面，本文提供了对原代细胞群进行基因组编辑的方法，其包括：将外源多核酸引入所述原代细胞群，所述外源多核酸将转基因编码至双链断裂中，从而产生修饰的原代细胞群；以及将DNA双链断裂修复调节子引入所述修饰的原代细胞群；其中与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的原代细胞群相比，所述接触增加所述修饰的原代细胞群中的以下中的至少一个：生存力百分比；或由所述外源多核酸编码的所述转基因的表达百分比。在一些实施方案中，所述细胞群包括原代免疫细胞。
在一些实施方案中，所述细胞群的至少一部分的细胞核包含至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子。在一些实施方案中，所述组合物是基本上不含抗生素的培养基。
在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度加入。在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的参与DNA双链断裂修复的蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种外源添加的免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。
在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物还包含抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个基因组位点的破坏。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞包含一个或多个内源基因的修饰或缺失。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包括CISH、PD-1、TRAC、TCRB或其组合。
在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞的细胞核包含转基因。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的细胞受体：T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
一方面，本文提供了对原代免疫细胞群进行基因组编辑的方法，其包括：对所述原代免疫细胞群进行电穿孔以引入：指导多核酸；指导核酸酶；以及编码转基因的小环载体或线性化双链DNA构建体，从而产生修饰的原代免疫细胞群；使所述修饰的原代免疫细胞群与DNA酶和免疫刺激剂接触；其中与进行所述电穿孔但不进行所述接触的类似修饰的原代免疫细胞群相比，所述接触使得所述修饰的原代免疫细胞群中表达所述转基因的活细胞的百分比增加。
在一些实施方案中，所述电穿孔包括使所述细胞与编码所述指导核酸酶的多核酸接触。在一些实施方案中，所述多核酸包括DNA。在一些实施方案中，所述多核酸包括mRNA。在一些实施方案中，所述电穿孔包括使所述细胞与所述指导核酸酶接触。在一些实施方案中，所述指导核酸酶包括Cas蛋白、锌指核酸酶、TALEN、兆核酸酶、其同源物、或其修饰型式或其任何组合。
在一些实施方案中，所述指导核酸酶包括Cas蛋白。
Cas蛋白可来自任何合适的生物体。非限制性实例包括酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinae spiralis)、绿产色链霉菌(Streptomyces viridoc hromo genes)、绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、粉红链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、粉红链孢囊菌、酸热脂环酸芽孢杆菌(AlicyclobacHlus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克氏菌目(Burkholderiales)细菌、萘降解极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝杆藻属物种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、铜绿假单胞菌(Pseudomon asaeruginosa)、聚球藻属物种(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobiumarabaticum)、德氏制氨菌(Ammonifex degensii)、贝氏热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、暂定脱硫细杆菌(Candi datus Desulforudis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、热丙酸暗色厌氧香肠状菌(Pelotoma culum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus)、氧化亚铁嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色闪杆菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、调查甲烷喜盐菌(Methanohalobium evestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属物种(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospiramaxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、节旋藻属物种(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属物种(Lyngbya sp.)、喜泥微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属物种(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)、海洋蓝藻菌(Acaryochloris marina)、莎希纤毛菌(Leptotrichia shahii)和新弗朗西丝菌(Francisella novicida)。在一些方面，生物体是酿脓链球菌(S.pyogenes)。在一些方面，生物体是金黄色葡萄球菌(S.aureus)。在一些方面，生物体是嗜热链球菌(S.thermophilus)。
Cas蛋白可来源于多个细菌物种，包括但不限于非典型韦荣氏球菌(Veillonellaatypical)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、龈沟产线菌(Filifactor alocis)、莫雷单细菌(Solobacterium moorei)、灵巧粪球菌(Coprococcus catus)、齿密螺旋体(Treponema denticola)、杜氏裂孔菌(Peptoniphilus duerdenii)、光冈氏链状杆菌(Catenibacterium mits uokai)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、假中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)、肠氨基酸球菌(Acidaminococcus intestine)、齿龈欧氏菌(Olsenella uli)、北原酒球菌(Oenococcuskitaharae)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、戈氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、大芬戈尔德菌、运动支原体(Mycoplasma mobile)、鸡支原体(Mycoplasma gallisepticum)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovip neumoniae)、犬支原体(Mycoplasma canis)、关节液支原体(Mycoplasma synoviae)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、嗜热链球菌、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、棒状乳杆菌扭转亚种(Lactobacillus coryniformissubsp.Torquens)、多营养泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansi a muciniphila)、解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)、微小迷踪菌(Elusimicrobiumminutum)、卤水硝酸盐裂解菌(Nitratifractor salsuginis)、球形球毛壳菌(Sphaerochaeta globus)、产琥珀酸丝状杆菌产琥珀酸亚种(Fibrobacter succinogenessubsp.Succinogenes)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、彩虹普雷沃菌(Prevotella micans)、反刍瘤胃普雷沃菌(Prevotella ruminicola)、柱状黄杆菌(Flav obacterium columnare)、少食氨基单胞菌(Aminomonas paucivorans)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、海洋候选谱尼螺杆菌(Candidat us Puniceispirillummarinum)、艾森氏蠕形杆菌(Verminephrobacter eiseniae)、丁香罗尔斯顿菌(Ralstoniasyzygii)、芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobacter shibae)、固氮螺菌属(Azospirillum)、汉堡硝化杆菌(Nitrobacter hamburgensis)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、空肠弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacter jejunisubsp.Jejuni)、鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、犹太嗜酸菌(Acidovorax ebreus)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavame ntivorans)、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburiaintestinalis)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、多杀性巴氏杆菌多杀性亚种(Pasteurella multocida subsp.Multocida)、华德萨特菌(Sutterellawadsworthensis)、变形菌属(proteobacterium)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、排泄物副沙门氏菌(Parasutterella excrementihominis)、产琥珀酸沃廉菌和新凶手弗郎西斯菌(Francisella novicida)。
如本文所用的Cas蛋白可以是Cas蛋白的野生型或修饰形式。Cas蛋白可以是野生型或修饰的Cas蛋白的活性变体、非活性变体或片段。Cas蛋白可包含氨基酸变化，诸如相对于Cas蛋白的野生型型式的缺失、插入、取代、变体、突变、融合、嵌合或其任何组合。Cas蛋白可为与野生型示例性Cas蛋白具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性或序列相似性的多肽。Cas蛋白可为与野生型示例性Cas蛋白具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。变体或片段可包括与野生型或修饰的Cas蛋白或其一部分至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性或序列相似性。变体或片段可以靶向与指导核酸复合的核酸基因座，同时缺乏核酸裂解活性。
在一些实施方案中，所述Cas蛋白包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰型式。
在一些实施方案中，所述指导多核酸包括编码指导RNA的DNA。在一些实施方案中，所述指导多核酸包括指导RNA。
在一些实施方案中，所述电穿孔包括使所述原代人细胞群与包含所述指导多核酸和所述指导核酸酶的指导核糖核蛋白复合物接触。
在一些实施方案中，所述指导RNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述接触还包括使所述修饰的原代细胞群与免疫刺激剂接触。在一些实施方案中，与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的原代细胞群相比，与所述免疫刺激剂的所述接触增加所述修饰的原代细胞群中的以下中的至少一个：生存力百分比；或由所述外源多核酸编码的所述转基因的表达百分比。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。在一些实施方案中，所述接触还包括将DNA双链断裂修复调节子引入所述修饰的细胞群。
在一些实施方案中，与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的原代细胞群相比，所述DNA双链断裂修复调节子的所述引入增加所述修饰的原代细胞群中的以下中的至少一个：生存力百分比；或由所述外源多核酸编码的所述转基因的表达百分比。在一些实施方案中，所述DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的所述蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，参与DNA的所述蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述接触包括在基本上不含抗生素的培养基中接触所述修饰的原代细胞群。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述接触包括在共培养APC存在下接触所述TIL。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。在一些实施方案中，所述引入包括破坏所述原代细胞群的至少一部分的一个或多个基因组位点，从而产生所述修饰的原代细胞群。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
在一些实施方案中，所述引入包括修饰或缺失所述原代细胞群的至少一部分的一个或多个内源基因，从而产生所述修饰的原代细胞群。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包括PD-1。
一方面，本文提供了对原代免疫细胞群进行基因组编辑的方法，其包括：a)对所述原代人细胞群进行电穿孔以引入：指导多核酸；指导核酸酶；以及编码转基因的小环载体或线性化双链DNA构建体，从而产生修饰的原代免疫细胞群；以及使所述修饰的原代免疫细胞群与DNA酶和免疫刺激剂接触；其中与进行所述电穿孔但不进行所述接触的类似修饰的原代免疫细胞群相比，所述接触使得表达由所述小环载体或所述线性化双链DNA构建体编码的所述转基因的细胞得百分比增加。
在一些实施方案中，所述电穿孔包括使所述细胞与编码所述指导核酸酶的多核酸接触。在一些实施方案中，所述多核酸包括DNA。在一些实施方案中，所述多核酸包括mRNA。在一些实施方案中，所述电穿孔包括使所述细胞与所述指导核酸酶接触。在一些实施方案中，所述指导核酸酶包括Cas蛋白、锌指核酸酶、TALEN、兆核酸酶、其同源物、或其修饰型式或其任何组合。
在一些实施方案中，所述指导核酸酶包括Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰型式。
在一些实施方案中，所述指导多核酸包括编码指导RNA的DNA。在一些实施方案中，所述指导多核酸包括指导RNA。
在一些实施方案中，所述电穿孔包括使所述原代人细胞群与包含所述指导多核酸和所述指导核酸酶的指导核糖核蛋白复合物接触。
在一些实施方案中，所述指导RNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述接触还包括使所述修饰的原代细胞群与免疫刺激剂接触。在一些实施方案中，与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的原代细胞群相比，与所述免疫刺激剂的所述接触增加所述修饰的原代细胞群中的以下中的至少一个：生存力百分比；或由所述外源多核酸编码的所述转基因的表达百分比。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。在一些实施方案中，所述接触还包括将DNA双链断裂修复调节子引入所述修饰的细胞群。
在一些实施方案中，与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的原代细胞群相比，所述DNA双链断裂修复调节子的所述引入增加所述修饰的原代细胞群中的以下中的至少一个：生存力百分比；或由所述外源多核酸编码的所述转基因的表达百分比。在一些实施方案中，所述DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的所述蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，参与DNA的所述蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述接触包括在基本上不含抗生素的培养基中接触所述修饰的原代细胞群。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述接触包括在共培养APC存在下接触所述TIL。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。在一些实施方案中，所述引入包括破坏所述原代细胞群的至少一部分的一个或多个基因组位点，从而产生所述修饰的原代细胞群。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
在一些实施方案中，所述引入包括修饰或缺失所述原代细胞群的至少一部分的一个或多个内源基因，从而产生所述修饰的原代细胞群。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包括PD-1。
一方面，本文提供了对细胞进行电穿孔的方法，其包括：将指导核酸酶引入所述细胞的第一电穿孔步骤；以及包括引入以下的第二电穿孔步骤：包含与基因的至少一部分互补的区域的指导多核酸；以及包含细胞受体序列的外源多核酸，从而产生修饰的细胞；其中与包含由a)和b)组成的单一电穿孔的类似细胞相比，所述修饰的细胞具有以下中的至少一项：包含细胞受体序列的所述外源多核酸的整合百分比增加；或生存力百分比增加。
在一些实施方案中，所述第一电穿孔步骤包括使所述细胞与编码所述指导核酸酶的多核酸接触。在一些实施方案中，所述多核酸包括DNA。在一些实施方案中，所述多核酸包括mRNA。在一些实施方案中，所述第一电穿孔步骤包括使所述细胞与所述指导核酸酶接触。
在一些实施方案中，所述电穿孔包括使所述细胞与编码所述指导核酸酶的多核酸接触。在一些实施方案中，所述多核酸包括DNA。在一些实施方案中，所述多核酸包括mRNA。在一些实施方案中，所述电穿孔包括使所述细胞与所述指导核酸酶接触。在一些实施方案中，所述指导核酸酶包括Cas蛋白、锌指核酸酶、TALEN、兆核酸酶、其同源物、或其修饰型式或其任何组合。
在一些实施方案中，所述指导核酸酶包括Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰型式。
在一些实施方案中，所述指导多核酸包括编码指导RNA的DNA。在一些实施方案中，所述指导多核酸包括指导RNA。
在一些实施方案中，所述电穿孔包括使所述原代人细胞群与包含所述指导多核酸和所述指导核酸酶的指导核糖核蛋白复合物接触。
在一些实施方案中，所述指导RNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述接触还包括使所述修饰的原代细胞群与免疫刺激剂接触。在一些实施方案中，与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的原代细胞群相比，与所述免疫刺激剂的所述接触增加所述修饰的原代细胞群中的以下中的至少一个：生存力百分比；或由所述外源多核酸编码的所述转基因的表达百分比。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。在一些实施方案中，所述接触还包括将DNA双链断裂修复调节子引入所述修饰的细胞群。
在一些实施方案中，与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的原代细胞群相比，所述DNA双链断裂修复调节子的所述引入增加所述修饰的原代细胞群中的以下中的至少一个：生存力百分比；或由所述外源多核酸编码的所述转基因的表达百分比。在一些实施方案中，所述DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的所述蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，参与DNA的所述蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述接触包括在基本上不含抗生素的培养基中接触所述修饰的原代细胞群。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述接触包括在共培养APC存在下接触所述TIL。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。在一些实施方案中，所述引入包括破坏所述原代细胞群的至少一部分的一个或多个基因组位点，从而产生所述修饰的原代细胞群。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
在一些实施方案中，所述引入包括修饰或缺失所述原代细胞群的至少一部分的一个或多个内源基因，从而产生所述修饰的原代细胞群。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包括PD-1。
一方面，本文提供了对细胞进行电穿孔的方法，其包括：将指导核糖核蛋白复合物引入所述细胞的第一电穿孔步骤；以及包括引入外源多核酸的第二电穿孔步骤，从而产生修饰的细胞；其中与包含由a)和b)组成的单一电穿孔的类似细胞相比，所述修饰的细胞具有以下中的至少一项：包含细胞受体序列的所述外源多核酸的整合百分比增加；或生存力百分比增加。
在一些实施方案中，所述外源多核酸包含线性化双链DNA。在一些实施方案中，所述电穿孔包括使所述细胞与编码所述指导核酸酶的多核酸接触。在一些实施方案中，所述多核酸包括DNA。在一些实施方案中，所述多核酸包括mRNA。在一些实施方案中，所述电穿孔包括使所述细胞与所述指导核酸酶接触。在一些实施方案中，所述指导核酸酶包括Cas蛋白、锌指核酸酶、TALEN、兆核酸酶、其同源物、或其修饰型式或其任何组合。
在一些实施方案中，所述指导核酸酶包括Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰型式。
在一些实施方案中，所述指导多核酸包括编码指导RNA的DNA。在一些实施方案中，所述指导多核酸包括指导RNA。
在一些实施方案中，所述电穿孔包括使所述原代人细胞群与包含所述指导多核酸和所述指导核酸酶的指导核糖核蛋白复合物接触。
在一些实施方案中，所述指导RNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。
在一些实施方案中，所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。在一些实施方案中，所述DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，所述接触还包括使所述修饰的原代细胞群与免疫刺激剂接触。在一些实施方案中，与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的原代细胞群相比，与所述免疫刺激剂的所述接触增加所述修饰的原代细胞群中的以下中的至少一个：生存力百分比；或由所述外源多核酸编码的所述转基因的表达百分比。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂包括B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7、截短CD19、其衍生物或任何组合。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂包括IL-2、IL-7、IL-15或其任何组合。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂以约50IU/ml至约1000IU/ml的浓度存在。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂被配置来刺激所述细胞群或所述细胞的至少一部分的扩增。在一些实施方案中，所述接触还包括将DNA双链断裂修复调节子引入所述修饰的细胞群。
在一些实施方案中，与进行所述引入但不进行所述接触的类似修饰的原代细胞群相比，所述DNA双链断裂修复调节子的所述引入增加所述修饰的原代细胞群中的以下中的至少一个：生存力百分比；或由所述外源多核酸编码的所述转基因的表达百分比。在一些实施方案中，所述DNA双链断裂修复调节子包括NAC、抗IFNAR2抗体或两者。在一些实施方案中，所述DNA双链断裂修复调节子包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些实施方案中，参与DNA双链断裂修复的所述蛋白质包括选自由以下组成的组的蛋白质：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些实施方案中，参与DNA的所述蛋白质包括RS-1、RAD51或两者。
在一些实施方案中，所述接触包括在基本上不含抗生素的培养基中接触所述修饰的原代细胞群。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括选自由以下组成的组的细胞：B细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴样细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、髓样细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、前体细胞、浆细胞、祖细胞、调节性T细胞、T细胞、胸腺细胞、其任何分化或去分化细胞、或其任何细胞的混合物或组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括原代T细胞。在一些实施方案中，所述原代T细胞是从受试者的血液样品中分离的。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述血液样品是全血样品或分级血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品包含分离的外周血液单核细胞。在一些实施方案中，所述原代T细胞包括γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任何组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括CD3+细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，TIL包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、其分化或去分化细胞、或其任何组合。
在一些实施方案中，所述接触包括在共培养APC存在下接触所述TIL。在一些实施方案中，所述APC被配置来刺激所述TIL的扩增。在一些实施方案中，所述APC表达B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。在一些实施方案中，所述引入包括破坏所述原代细胞群的至少一部分的一个或多个基因组位点，从而产生所述修饰的原代细胞群。
在一些实施方案中，所述转基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：细胞受体、免疫检查点蛋白、细胞因子及其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码T细胞受体。
在一些实施方案中，所述引入包括修饰或缺失所述原代细胞群的至少一部分的一个或多个内源基因，从而产生所述修饰的原代细胞群。在一些实施方案中，所述内源基因包括免疫检查点基因。在一些实施方案中，所述内源基因包括PD-1。
一方面，本文提供了治疗癌症的方法，其包括将本文所述的组合物或通过本文所述的方法产生的修饰细胞群施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，所述受试者需要所述治疗。在一些实施方案中，所述受试者已被诊断为患有癌症或肿瘤。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述施用包括将所述组合物或所述修饰的细胞群输注到所述受试者的血管中。
本文提供了一种工程化多核苷酸，其包含包括如通过BLAST所确定的与SEQ IDNO:81或SEQ ID NO:84的至少一部分至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性的序列。
本文还提供了一种工程化多核苷酸，其包括如通过BLAST所确定的与SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:82的至少一部分至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性。
本文提供了包含工程化多核苷酸的核糖核蛋白(RNP)。RNP还可以包含内切核酸酶。在一些方面，内切核酸酶包括CRISPR内切核酸酶。
本文提供了一种包含工程化多核苷酸和/或RNP的细胞。
本文提供了包含工程化细胞的细胞群。
本文还提供了试剂盒，所述试剂盒包含在容器中的工程化多核苷酸和/或核糖核蛋白。
附图说明
图1A-图1C提供了将插入序列引入免疫细胞基因组中的示意图。图1A示出了多核苷酸构建体。C1和C2代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，例如被指导RNA靶向用于由CRISPR相关核酸酶裂解的序列。C1和C2可以是相同的序列或者不同的序列。H1和H2代表同源臂序列。“插入物”代表待插入基因组中的序列。构建体被设计用于在图1B中所示出的基因组中的靶位点处插入。C3代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，其可以是与C1和/或C2相同的序列或不同的序列。图1B中的H1和H2代表基因组中与多核苷酸构建体中的H1和H2同源的序列。图1C示出了在通过本公开的方法引入插入序列之后的基因组。
图2提供了表明在没有核酸酶或指导RNA的实验条件下插入TCR序列没有整合到基因组中或由细胞表达的实验结果。每列代表一种条件。每行代表来源于不同供体的样品。y轴代表由CD3染色产生的荧光，而X轴代表由插入TCR的染色产生的荧光。数字代表落入象限内的活细胞的百分比。条件一是模拟处理的细胞。条件2是接受具有1000bp同源臂的DNA小环载体的细胞。条件3是接受具有48bp同源臂的DNA小环载体的细胞。
图3示出了与具有1000个碱基对同源臂(条件4和条件5)的实验条件相比，在具有48个碱基对同源臂和小环靶向指导RNA(条件6和条件7)的实验条件下，更高比例和更多数目的细胞表达插入TCR。每列代表一种条件。每行代表来源于不同供体的样品。y轴代表由CD3染色产生的荧光，而X轴代表由插入TCR的染色产生的荧光。数字代表落入象限内的活细胞的百分比。
图4提供了来自各种实验条件的表达插入TCR的活细胞的百分比。呈现了来自两个供体的处理的样品的数据，其中每个供体两次技术复制。结果示出了与具有1000个碱基对同源臂(条件4和条件5)的实验条件相比，在具有48个碱基对同源臂和小环靶向指导RNA(条件6和条件7)的实验条件下，更高比例和更多数目的细胞表达插入TCR。条件1是模拟处理的细胞。条件2是接受具有1000bp同源臂的DNA小环载体，但不接受指导RNA或核酸酶的细胞。条件3是接受具有48bp同源臂的DNA小环载体，但不接受指导RNA或核酸酶的细胞。
图5提供了来自各种实验条件的表达GFP报告基因的活细胞的百分比。呈现了来自两个供体的处理的样品的数据，其中每个供体三次技术复制。条件1是模拟处理的细胞。条件2是接受具有1000bp同源臂的DNA小环载体，但不接受指导RNA或核酸酶的细胞。条件3是接受具有48bp同源臂的DNA小环载体，但不接受指导RNA或核酸酶的细胞。条件4和条件5是接受具有1000bp同源臂的DNA小环载体、靶向小环的指导RNA和核酸酶的细胞。条件6和条件7是接受具有48bp同源臂的DNA小环载体、靶向小环的指导RNA和核酸酶的细胞。结果示出了使用包括单链退火的方法进行的有效免疫细胞基因组编辑。
图6A-图6E提供了用本公开的方法编辑免疫细胞基因组的示意图，所述方法包括具有两个同源臂和两个裂解位点的多核苷酸构建体。图6A示出了多核苷酸构建体。C1和C2代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，例如被指导RNA靶向用于由CRISPR相关核酸酶裂解的序列。C1和C2可以是相同的序列或者不同的序列。H1和H2代表同源臂序列。“(插入物)”代表两个同源臂之间的间插序列，所述间插序列可以存在或不存在。构建体被设计用于在图6B中所示出的基因组中的靶位点处插入。图6B示出了免疫细胞基因组中的靶位点。C3代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，其可以是与C1和/或C2相同的序列或不同的序列。图6B中的H1和H2代表基因组中与多核苷酸构建体中的H1和H2同源的序列。图6C代表图6A的多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体已在C1和C2处裂解并从双链断裂位点进行5'切除，从而暴露H1和H2同源臂的单链序列。图6D代表来自图6A的免疫细胞基因组中已在C3处裂解的位点。由双链断裂暴露的每个末端均进行5'切除，从而暴露与H1和H2同源臂中的序列同源的单链序列。图6E代表使用多核酸构建体或其一部分作为修复模板进行基因组修复后的基因组(例如，通过包括单链退火、同源性介导的末端连接、微同源性介导的末端连接、替代末端连接、同源性定向修复、同源重组或其组合的途径进行修复)。
图7A-图7E提供了用本公开的方法编辑免疫细胞基因组的示意图，所述方法包括具有一个同源臂和一个裂解位点的多核苷酸构建体。图7A示出了多核苷酸构建体。C1代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，例如被指导RNA靶向用于由CRISPR相关核酸酶裂解的序列。H1代表同源臂序列。“(插入物)”代表两个同源臂之间的间插序列，所述间插序列可以存在或不存在。构建体被设计用于在图7B中所示出的基因组中的靶位点处插入。图7B示出了免疫细胞基因组中的靶位点。C2代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，其可以是与C1相同的序列或不同的序列。图7B中的H1代表基因组中与多核苷酸构建体中的H1同源的序列。图7C代表图7A的多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体已在C1处裂解并从双链断裂位点进行5'切除，从而暴露H1同源臂的单链序列。图7D代表来自图7A的免疫细胞基因组中已在C2处裂解的位点。由双链断裂暴露的末端已进行5'切除，从而暴露与H1同源臂中的序列同源的单链序列。图7E代表使用多核酸构建体或其一部分作为修复模板进行基因组修复后的基因组(例如，通过包括单链退火、同源性介导的末端连接、微同源性介导的末端连接、替代末端连接、同源性定向修复、同源重组或其组合的途径进行修复)。
图8A-图8E提供了用本公开的方法编辑免疫细胞基因组的示意图，所述方法包括具有两个同源臂和两个裂解位点的多核苷酸构建体以及在免疫细胞基因组中引入两个双链断裂(例如以促进大的缺失)。图8A示出了多核苷酸构建体。C1和C2代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，例如被指导RNA靶向用于由CRISPR相关核酸酶裂解的序列。C1和C2可以是相同的序列或者不同的序列。H1和H2代表同源臂序列。“(i)”代表两个同源臂之间的间插序列，所述间插序列可以存在或不存在。构建体是在插入时桥接免疫细胞中的两个靶位点，从而在免疫细胞基因组中产生缺失，无论是否具有插入。图8B示出了免疫细胞基因组中的两个靶位点。C3和C3代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，它们中的每一个可以是与C1和/或C2相同的序列或不同的序列。图8B中的H1和H2代表基因组中与多核苷酸构建体中的H1和H2同源的序列。图8C代表图8A的多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体已在C1和C2处裂解并从双链断裂位点进行5'切除，从而暴露H1和H2同源臂的单链序列。图8D代表来自图8A的免疫细胞基因组中已在C3和C4处裂解的位点。由双链断裂暴露的每个末端均进行5'切除，从而暴露与H1和H2同源臂中的序列同源的单链序列。图8E代表使用多核酸构建体或其一部分作为修复模板进行基因组修复后的基因组(例如，通过包括单链退火、同源性介导的末端连接、微同源性介导的末端连接、替代末端连接、同源性定向修复、同源重组或其组合的途径进行修复)。
图9A-图9C提供了使用包含一个同源臂和一个裂解位点的多核苷酸构建体将插入序列引入免疫细胞基因组中的示意图。图9A示出了多核苷酸构建体。C1代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，例如被指导RNA靶向用于由CRISPR相关核酸酶裂解的序列。H1代表同源臂序列。“插入物”代表待插入基因组中的序列。构建体被设计用于在图9B中所示出的基因组中的靶位点处插入。C2代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，其可以是与C1相同的序列或不同的序列。图9B中的H1代表基因组中与多核苷酸构建体中的H1同源的序列。图9C示出了通在过本公开的方法引入插入序列之后的基因组。
图10A-图10C提供了用于编辑本公开的免疫细胞基因组(例如，引入小INDEL)的示意图。图10A示出了多核苷酸构建体。C1和C2代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，例如被指导RNA靶向用于由CRISPR相关核酸酶裂解的序列。C1和C2可以是相同的序列或者不同的序列。H1和H2代表同源臂序列。构建体被设计成充当图10B中所示出的基因组中的靶位点的修复模板。C3代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，其可以是与C1和/或C2相同的序列或不同的序列。图10B中的H1和H2代表基因组中与多核苷酸构建体中的H1和H2同源的序列。图10C示出了在通过本公开的方法引入插入序列之后的基因组。
图11A-图11C提供了使用包含一个同源臂和一个裂解位点的多核苷酸构建体编辑本公开的免疫细胞基因组(例如引入小INDEL)的示意图。图11A示出了多核苷酸构建体。C1代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，例如被指导RNA靶向用于由CRISPR相关核酸酶裂解的序列。H1代表同源臂序列。构建体被设计成充当图11B中所示出的免疫细胞基因组中的靶位点的修复模板。C2代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，其可以是与C1相同的序列或不同的序列。图11B中的H1代表基因组中与多核苷酸构建体中的H1同源的序列。图11C示出了通过本公开的方法引入插入序列之后的基因组。
图12A-图12C提供了用本公开的方法将插入序列引入免疫细胞基因组中的示意图，所述方法包括具有两个同源臂和两个裂解位点的多核苷酸构建体以及在免疫细胞基因组中引入两个双链断裂(例如以促进大的缺失)。图12A示出了多核苷酸构建体。C1和C2代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，例如被指导RNA靶向用于由CRISPR相关核酸酶裂解的序列。C1和C2可以是相同的序列或者不同的序列。H1和H2代表同源臂序列。“插入物”代表待插入基因组中的序列。构建体被设计用于在图12B中所示出的基因组中的靶位点处插入。C3和C4代表靶向用于由核酸酶裂解的序列，它们中的每一个可以是与C1和/或C2相同的序列或不同的序列。图12B中的H1和H2代表基因组中与多核苷酸构建体中的H1和H2同源的序列。图12C展示了通过本公开的方法引入插入序列并删除跨越H1和H2的序列之后的基因组。
图13A-图13C提供了用本公开的方法产生免疫细胞基因组中的缺失的示意图，所述方法包括具有两个同源臂和两个裂解位点的多核苷酸构建体以及在免疫细胞基因组中引入两个双链断裂(例如以促进缺失)。图13A示出了多核苷酸构建体。C1和C2代表被靶向用于由核酸酶裂解的序列，例如被指导RNA靶向用于由CRISPR相关核酸酶裂解的序列。C1和C2可以是相同的序列或者不同的序列。H1和H2代表同源臂序列。构建体被设计用于在图13B中所示出的免疫细胞中的靶位点充当修复模板。C3和C4代表靶向用于由核酸酶裂解的序列，它们中的每一个可以是与C1和/或C2相同的序列或不同的序列。图13B中的H1和H2代表基因组中与多核苷酸构建体中的H1和H2同源的序列。图13C示出了在通过本公开的方法使用多核苷酸构建体作为修复模板以在免疫细胞基因组中产生跨越H1和H2的序列缺失之后的基因组。
图14示出了在培养基中存在或不存在DNA酶的情况下，在6孔培养皿中用质粒供体载体对活化的T细胞培养物进行电穿孔后24小时拍摄的图像。图清楚地显示了在不存在DNA酶的情况下细胞团聚，而在具有DNA酶的培养物中没有可见的细胞团块。
图15A示出了在培养基中存在或不存在DNA酶的情况下，质粒电穿孔后24小时转染的细胞的恢复百分比。图2B是量化每种条件下的恢复百分比的图表。两幅图均表明与不具有DNA酶的培养物相比，转染后的淋巴细胞存活在具有DNA酶的培养物中增加。图15B示出了在用或不用DNA酶处理的情况下，在第0天或第1天质粒供体电穿孔后第14天GFP+细胞的表达百分比。图15C示出了在用或不用DNA酶处理的情况下，在第0天或第1天质粒供体电穿孔后第14天GFP+细胞的表达百分比。图15D示出了在用或不用DNA酶处理的情况下，在第0天或第1天质粒供体电穿孔后第14天mTCR+细胞的表达百分比。图15B和图15D均表明，与不具有DNA酶的培养物相比，转基因整合在具有DNA酶的培养物中增加。
图16A示出了在第0天或第1天质粒供体、Cas9、gRNA(在存在或不存在RS1、DNA酶或RS1的情况下)和DNA酶电穿孔后第14天GFP+细胞的表达百分比。图16B示出了在第0天或第1天质粒供体、Cas9、gRNA(在存在或不存在RS1、DNA酶或RS1的情况下)和DNA酶电穿孔后第14天mTCR+细胞的表达百分比。结果示出了用RS1和/或DNA酶处理增加了转基因表达。
图17A示出了在用脉冲(对照)、Cas9和gRNA、供体(GFP)、供体和DNA酶或供体、DNA酶和RS-1刺激后第0天电穿孔的T细胞的第7天GFP表达百分比。图17B示出了在用脉冲(对照)、Cas9和gRNA、供体(GFP)、供体和DNA酶或供体、DNA酶和RS-1刺激后(仅转染后)第0天电穿孔的T细胞的第7天mTCR表达百分比。图17C示出了在用脉冲(对照)、Cas9和gRNA、供体(GFP)、供体和DNA酶或供体、DNA酶和RS-1刺激后(转染后或转染前和转染后两者)第1天电穿孔的T细胞的第7天GFP表达百分比。图17D示出了在用脉冲(对照)、Cas9和gRNA、供体(GFP)、供体和DNA酶或供体、DNA酶和RS-1刺激后(转染后或转染前和转染后两者)第1天电穿孔的T细胞的第7天mTCR表达百分比。结果示出了用RS1和/或DNA酶处理增加了转基因表达。
图18A示出了在用脉冲(对照)、Cas9和gRNA、供体(GFP或mTCR)、供体和DNA酶或供体、DNA酶和RS-1刺激后(仅转染后)第0天电穿孔的T细胞的第14天GFP或mTCR表达百分比。图18B示出了在用脉冲(对照)、Cas9和gRNA、供体(GFP或mTCR)、供体和DNA酶或供体、DNA酶和RS-1刺激后(转染后或转染前和转染后两者)第1天电穿孔的T细胞的第14天GFP或mTCR表达百分比。结果示出了用RS1和/或DNA酶处理转染后14天稳定的转基因表达增加。
图19示出了在刺激后36小时或在刺激后36小时以及初始电穿孔后6小时处对用或不用RS-1或DNA酶电穿孔的供体055330的电穿孔效率和mTCR的FACs分析。结果示出在两个时间点用RS1和/或DNA酶处理转基因表达均增加，这表明了处理的持久效果。
图20示出了在刺激后36小时或在刺激后36小时以及初始电穿孔后6小时处对用或不用RS-1或DNA酶电穿孔的供体119866的电穿孔效率和mTCR的FACs分析。结果示出在两个时间点用RS1和/或DNA酶处理转基因表达均增加，这表明了处理的持久效果。
图21A示出了在刺激后36小时和初始电穿孔后24小时处对用或不用RS-1或DNA酶电穿孔的供体055330和119866的电穿孔效率以及mTCR的FACs分析。图21B示出了在刺激后36小时或刺激后36小时以及初始电穿孔后6小时处对用或不用RS-1或DNA酶电穿孔的供体120534的电穿孔效率和mTCR的FACs分析。结果示出在两个时间点用RS1和/或DNA酶处理转基因表达均增加，这表明了处理的持久效果
图22A示出了用或不用N-乙酰-半胱氨酸(NAC)、Akt VIII抑制剂(Akt Inh)或抗IFNAR2抗体(IFN Ab)电穿孔后第2天活细胞计数(活细胞的数目)的图。图22B示出了用或不用N-乙酰-半胱氨酸(NAC)、Akt VIII抑制剂(Akt Inh)或抗IFNAR2抗体(IFN Ab)电穿孔后第5天活细胞计数(活细胞的数目)的图。图22C示出了用或不用N-乙酰-半胱氨酸(NAC)、AktVIII抑制剂(Akt Inh)或抗IFNAR2抗体(IFN Ab)电穿孔后第7天活细胞计数(活细胞的数目)的图。
图23A示出了用或不用N-乙酰-半胱氨酸(NAC)、Akt VIII抑制剂(Akt Inh)或抗IFNAR2抗体(IFN Ab)电穿孔后第2天活细胞计数(活细胞的百分比)的图。图23B示出了用或不用N-乙酰-半胱氨酸(NAC)、Akt VIII抑制剂(Akt Inh)或抗IFNAR2抗体(IFN Ab)电穿孔后第5天活细胞计数(活细胞的百分比)的图。图23C示出了用或不用N-乙酰-半胱氨酸(NAC)、Akt VIII抑制剂(Akt Inh)或抗IFNAR2抗体(IFN Ab)电穿孔后第7天活细胞计数(活细胞的百分比)的图。
图24示出了用或不用N-乙酰-半胱氨酸(NAC)、Akt VIII抑制剂(Akt Inh)或抗IFNAR2抗体(IFN Ab)电穿孔后第7天mTCR阳性细胞的百分比的图。图表明当使用30μg或50μg外源供体DNA时，与对照培养物相比，转基因表达在含有IFN Ab的培养物中增加。
图25A示出了使用包含靶向AAVS1的同源臂(HR)或单链退火(SSA)的AAVS1-GFP供体电穿孔后经历第二刺激的总活细胞的cytoflex结果。图25B示出了在电穿孔以及用AAVS1-GFP供体进行电穿孔的相同细胞的第二刺激之后的GFP百分比。在电穿孔后第7天测量GFP。在电穿孔后约30分钟加入第二刺激。
图26A示出了包含RAD52、Exo1、RAD54B、Lig3、BRD或PolQ敲除的HCT1116细胞的流式细胞术图。用AAVS1 SA-GFP供体通过SSA或HR对敲除的HCT1116细胞进行电穿孔，在电穿孔后第10天获得结果并将结果相对于对照进行归一化。图26B示出了相对于野生型(WT)进行归一化的HR供体模板的GFP表达的变化百分比。图26C示出了相对于野生型(WT)进行归一化的SSA供体模板的GFP表达的变化百分比。
图27是在表1中提供的示例性基因(诸如免疫检查点和/或TCR)中敲入转基因(诸如包含细胞受体(诸如CAR或TCR)的转基因)的示例性策略的示意图。
图28A示出了在用对照(仅脉冲)或HR转基因供体电穿孔后24小时、36小时、48小时或72小时处细胞周期的S期中的T细胞的百分比。图28B示出了用对照(仅脉冲)、HR SA-GFP供体或SSA SA GFP小环(MC)电穿孔后第7天的GFP百分比。图28C示出了用对照(仅脉冲)或SSA抗间皮素CAR小环(MC)电穿孔后第7天的CAR(CD34+)百分比。将GFP和CAR百分比与在24小时、36小时、48小时或72小时处电穿孔的细胞进行比较。
图29A示出了36小时后的DNA传感器、其时序和表达的高于基线的倍数变化。所述倍数变化与X轴上映射的细胞周期一致。大约36小时的转染区示为阴影框。图29B示出了刺激后24、36、48和72小时处两种T细胞供体的S期中的T细胞的百分比。图29C示出了使用抗CD3和抗CD28包覆的珠子(包括抗CD3和抗CD28)刺激并在刺激后24小时、36小时、48小时或72小时处用单独SA-GFP质粒(质粒对照)或用SA-供体与Cas9和AAVS1 gRNA(HR)组合电穿孔的T细胞中的GFP百分比。
图30A示出了用抗CD3和抗CD28包覆的珠子刺激36小时并用供体质粒单独或与CRISPR Cas9试剂组合电穿孔的T细胞中的完美GFP表达。HR和HMEJ负载物均为在AAVS1处整合的SA-GFP构建体。质粒单独递送或与Cas9 mRNA和AAVS1 gRNA(HR)组合递送，或用于HMEJCas9 mRNA和AAVS1 gRNA以及通用gRNA。构建体含有一个1kb的插入负载物。图30B示出了与质粒对照相比，通过HR-mTCR或SSA-mTCR(HMEJ)转染的鼠TCR(KRAS G12D TCR)插入物的表达百分比。简而言之，将T细胞用抗CD3和抗CD28包覆的珠子刺激36小时并用供体质粒单独或与CRISPR Cas9剂组合电穿孔。HR和HMEJ负载物均为具有1kb同源性(对于HR)和48bp同源性(HMEJ)的MND-抗KRAS TCR。质粒单独递送或与Cas9mRNA和AAVS1 gRNA(HR)组合递送，或用于HMEJ Cas9 mRNA、AAVS1 gRNA和通用gRNA。
图31A示出了非病毒细胞制造的示例性工作流程。(1)分离并纯化T细胞；(2)通过添加珠子和/或合适的刺激性抗体来活化T细胞；(3)去除活化珠子；(4)对活化的T细胞进行电穿孔以及(5)扩增修饰的细胞。图31B示出了使用图31A的示例性工作流程制造并用质粒对照、HR或HMEJ构建体电穿孔的细胞的扩增倍数。图31C示出了包括额外刺激的示例性任选的工作流程，如由电穿孔后第二珠子添加所表示的。
图32A示出了与质粒对照相比，用通过HR-mTCR或SSA-mTCR(HMEJ)转基因递送的鼠TCR(KRAS G12D TCR)插入物电穿孔的T细胞的扩增倍数。还示出了再刺激的SSA-mTCR(HMEJ)细胞。图32B示出了与对照(仅脉冲)相比，用SSA-mTCR(HMEJ)转基因或SSA-mTCR(HMEJ)转基因转染并且还再刺激的细胞的抗间皮素CAR表达(CD34表达)百分比。图32C示出了相同细胞的发光数据。
图33示出了用仅质粒；质粒、Cas9 mRNA和AAVS1 gRNA(HR)；或用于HMEJ的质粒、cas9 mRNA、AAVS1 gRNA和通用gRNA电穿孔的CD4和CD8细胞的GFP表达。
图34A示出了用仅供体(对照)、SA-eGFP-pA(HR)或SA-eGFP-pA(HMEJ)构建体电穿孔的T细胞的敲入百分比，所述构建体包含来自48、100、250、500、750或1000个碱基对长度的同源臂。图34B示出了显示使用如图34A中所述的具有增加的同源臂长度的SA-eGFP-pA(HR)或SA-eGFP-pA(HMEJ)构建体的靶向整合率的条形图。
图35A示出了在具有或不具有额外刺激的情况下，在使用仅供体(对照)、SA-eGFP-pA(HR)或SA-eGFP-pA(HMEJ)构建体进行靶向整合后的细胞扩增，所述构建体包含递增的同源臂长度。图35B示出了与图35A中所述的相同数据的条形图。
图36示出了示例性临床工作流程。可以修改所提供的工作流程以包括如本文所述的T细胞的额外刺激。
具体实施方式
简介
基因编辑的免疫细胞有望成为一系列病症的潜在疗法，所述病症包括癌症、自身免疫性病症、炎性病症和传染病。为了实现这一潜力，需要将所需的修饰有效地引入免疫细胞基因组中，同时保持细胞生存力的技术。在一些实施方案中，本文公开了基因编辑的免疫细胞、改进的基因编辑免疫细胞的方法和治疗方法。可以引入免疫细胞基因组中的修饰包括例如插入、缺失、序列替换(例如，取代)及其组合。
许多现有的基因编辑免疫细胞的方法依赖于同源重组途径。举例来说，可以将双链断裂引入基因组中，并提供修复模板以通过同源重组直接修复双链断裂。为了通过同源重组直接修复，修复模板可能需要长同源臂(例如，约500-1500个碱基对同源臂)。依赖于通过同源重组进行修复的方法可具有局限性，例如由于所需的同源臂的大小、由于修复的效率或其组合。在本文公开的方法中，可以在修复模板以及基因组中的靶位点中引入双链断裂。这可允许通过替代或额外的修复途径整合修复模板，例如包括末端切除的途径、在修复模板中仅需要短同源臂的途径或其组合。可使用的替代或额外修复途径的非限制性实例包括包含单链退火、同源性介导的末端连接、微同源性介导的末端连接、替代末端连接及其组合的途径。
本文公开的方法可比现有的编辑免疫细胞的方法具有优势，例如，更高的编辑效率、更高的编辑细胞生存力、产生更大的编辑细胞群的能力、产生具有增强的增殖能力和/或效应功能的编辑细胞的能力、使用更小的修复模板构建体(例如，包含更短的同源臂)的能力、将更大的序列引入免疫细胞基因组中的能力(例如，以更高的效率)、将多种修饰(例如，插入、缺失、取代和/或其他修饰)引入免疫细胞基因组中的能力及其组合。
基因修饰的细胞
在一些实施方案中，本文公开了基因编辑的细胞和编辑细胞的方法。在一些实施方案中，细胞包括肾细胞、肝细胞、胰腺细胞、血细胞、免疫细胞、淋巴细胞、心脏细胞、肺细胞、干细胞、卵巢细胞、前列腺细胞、肌肉细胞、肌腱细胞、韧带细胞、心肌细胞、骨细胞、骨髓细胞、角膜细胞、视网膜细胞、软骨细胞、内皮细胞、宫颈细胞、乳腺细胞、神经系统细胞、脊髓细胞、脑细胞、神经元、皮肤细胞、上皮细胞、胃肠细胞、激素分泌细胞、胰腺β细胞、甲状腺细胞、胸腺细胞、外分泌细胞和甲状旁腺细胞。
在一些实施方案中，本文公开了基因编辑的免疫细胞和编辑免疫细胞的方法。在一些实施方案中，免疫细胞包括淋巴细胞、T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、调节性T细胞(Treg)、细胞毒性T淋巴细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Th9细胞、初始T细胞、记忆T细胞、效应T细胞、效应-记忆T细胞(TEM)、中央记忆T细胞(TCM)、常驻记忆T细胞(TRM)、自然杀伤T细胞(NKT)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤细胞(NK)、固有淋巴细胞(ILC)、B细胞、B1细胞、B1a细胞、B1b细胞、B2细胞、浆细胞、调节性B细胞、抗原呈递细胞(APC)、单核细胞、巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞或其组合。
在一些实施方案中，免疫细胞是细胞系。举例来说，细胞系可为已经历突变并获得在培养物中广泛增殖的能力的细胞群。
本公开的免疫细胞可为人哺乳动物细胞。本公开的免疫细胞可为人免疫细胞。本公开的免疫细胞可为小鼠免疫细胞。本公开的免疫细胞可为大鼠免疫细胞。本公开的免疫细胞可为兔免疫细胞。本公开的免疫细胞可为山羊免疫细胞。本公开的免疫细胞可为非人灵长类动物免疫细胞。本公开的免疫细胞可为猪免疫细胞。本公开的免疫细胞可为美洲驼免疫细胞。本公开的免疫细胞可为山羊免疫细胞。本公开的免疫细胞可为来自基因修饰的动物的免疫细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是原代细胞。在一些实施方案中，免疫细胞的基因编辑可离体或体外进行。举例来说，可从供体生物体中获取原代细胞，对其进行基因编辑，并将其注入受体生物体中或回输至供体生物体中。在一些实施方案中，原代细胞的基因编辑可在生物体内(例如，体内)进行。
多核酸构建体
在一些实施方案中，本文公开了基因编辑免疫细胞的方法，例如在免疫细胞中引入插入、缺失、序列替换及其组合。多核酸构建体可用于本公开的方法中，例如用于提供修复模板以指导免疫细胞基因组中双链断裂的修复。修复模板可有利于修复过程的特定结果，例如包含插入、缺失、替换序列或其任何组合的修复的基因组。
多核酸构建体可包含例如一个或多个同源臂和一个或多个可被靶向用于由核酸酶裂解的裂解位点(例如，被指导RNA和Cas9靶向)。在一些实施方案中，多核酸构建体包含插入序列。
在本文公开的方法中，可以在修复模板以及基因组中的靶位点中引入双链断裂。这可允许通过替代或额外的修复途径整合修复模板，例如包括末端切除的途径、在修复模板中仅需要短同源臂的途径或其组合。可使用的替代或额外修复途径的非限制性实例包括包含单链退火、同源性介导的末端连接、微同源性介导的末端连接、替代末端连接及其组合的途径。
多核酸构建体可包含DNA、RNA、化学修饰的核苷酸或其组合。在一些实施方案中，多核酸构建体包含DNA。在一些实施方案中，多核酸包括RNA。在一些实施方案中，多核酸包括RNA并且可以被逆转录成互补DNA。在一些实施方案中，多核酸包括DNA小环。在一些实施方案中，多核酸构建体包含质粒。在一些实施方案中，多核酸包括线性DNA(例如PCR产物)、从DNA小环或质粒释放的线性DNA，或合成产生的DNA。在一些实施方案中，多核酸构建体包含环状RNA。在一些实施方案中，多核酸构建体包含化学修饰(例如，如本文所公开的)。
在一些实施方案中，多核酸构建体被包含在病毒载体中。示例性病毒载体包括但不限于慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、α病毒载体、黄病毒载体、弹状病毒载体、麻疹病毒载体、新城疫病毒载体、痘病毒载体和小核糖核酸病毒载体。在一些实施方案中，多核酸构建体被包含在AAV病毒载体中。
在一些实施方案中，本文公开了在免疫细胞基因组中引入多个修饰(例如，一个插入和一个缺失、多个插入、多个缺失、一个插入和多个缺失、多个插入和一个缺失或多个插入和多个缺失)的方法。
插入序列
在一些实施方案中，本文公开的方法允许或包括将插入序列插入免疫细胞的基因组中。在一些实施方案中，插入序列是多核酸，例如DNA序列。在一些实施方案中，多核酸构建体包含插入序列。
在一些实施方案中，插入序列为至少10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、20kb、50kb、100kb、200kb、300kb、400kb、500kb、600kb、700kb、800kb、900kb、1000kb或更多。在一些实施方案中，插入序列大于0.5kb、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、20kb、50kb、100kb、200kb、300kb、400kb、500kb、600kb、700kb、800kb、900kb或1000kb。
在一些实施方案中，插入序列为约500bp至500kb、500bp至400kb、500bp至300kb、500bp至200kb、500bp至100kb、500bp至50kb、500bp至40kb、500bp至30kb、500bp至20kb、500bp至10kb、500bp至9kb、500bp至8kb、500bp至7kb、500bp至6kb、500bp至5kb、500bp至4kb、500bp至3kb、500bp至2kb或500bp至1kb。在一些实施方案中，插入序列为约1kb至500kb、1kb至400kb、1kb至300kb、1kb至200kb、1kb至200kb、1kb至100kb、1kb至90kb、1kb至80kb、1kb至70kb、1kb至60kb、1kb至50kb、1kb至40kb、1kb至30kb、1kb至20kb、1kb至10kb、1kb至9kb、1kb至8kb、1kb至7kb、1kb至6kb、1kb至5kb、1kb至4kb、1kb至3kb或1kb至2kb。在一些实施方案中，插入序列为约2kb至500kb、2kb至400kb、2kb至300kb、2kb至200kb、2kb至200kb、2kb至100kb、2kb至90kb、2kb至80kb、2kb至70kb、2kb至60kb、2kb至50kb、2kb至40kb、2kb至30kb、2kb至20kb、1kb至10kb、2kb至9kb、2kb至8kb、2kb至7kb、2kb至6kb、2kb至5kb、2kb至4kb或2kb至3kb。在一些实施方案中，插入序列为约3kb至500kb、3kb至400kb、3kb至300kb、3kb至200kb、3kb至200kb、3kb至100kb、3kb至90kb、3kb至80kb、3kb至70kb、3kb至60kb、3kb至50kb、3kb至40kb、3kb至30kb、3kb至20kb、1kb至10kb、3kb至9kb、3kb至8kb、3kb至7kb、3kb至6kb、3kb至5kb或3kb至4kb。在一些实施方案中，插入序列为约4kb至500kb、4kb至400kb、4kb至300kb、4kb至200kb、4kb至200kb、4kb至100kb、4kb至90kb、4kb至80kb、4kb至70kb、4kb至60kb、4kb至50kb、4kb至40kb、4kb至30kb、4kb至20kb、1kb至10kb、4kb至9kb、4kb至8kb、4kb至7kb、4kb至6kb或4kb至5kb。在一些实施方案中，插入序列为约5kb至500kb、5kb至400kb、5kb至300kb、5kb至200kb、5kb至200kb、5kb至100kb、5kb至90kb、5kb至80kb、5kb至70kb、5kb至60kb、5kb至50kb、5kb至40kb、5kb至30kb、5kb至20kb、1kb至10kb、5kb至9kb、5kb至8kb、5kb至7kb或5kb至6kb。在一些实施方案中，插入序列为约10kb至500kb、10kb至400kb、10kb至300kb、10kb至200kb、10kb至200kb、10kb至100kb、10kb至90kb、10kb至80kb、10kb至70kb、10kb至60kb、10kb至50kb、10kb至40kb、10kb至30kb或10kb至20kb。在一些实施方案中，插入序列为约30kb至500kb、30kb至400kb、30kb至300kb、30kb至200kb、30kb至200kb、30kb至100kb、30kb至90kb、30kb至80kb、30kb至70kb、30kb至60kb、30kb至50kb或30kb至40kb。
在一些实施方案中，插入序列不编码蛋白质。在一些实施方案中，插入序列小于500bp、400bp、300bp、200bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp、10bp、5bp、4bp、3bp或2bp。
插入序列可包括例如非编码序列、编码RNA的序列、编码蛋白质的序列或其组合。在一些实施方案中，插入序列不编码功能蛋白。在一些实施方案中，插入序列编码蛋白质。在一些实施方案中，插入序列编码功能蛋白。
在一些实施方案中，插入序列编码至少一种蛋白质。在一些实施方案中，插入序列编码膜蛋白。在一些实施方案中，插入序列编码跨膜蛋白。在一些实施方案中，插入序列编码跨膜受体蛋白。在一些实施方案中，插入序列编码胞内蛋白(例如，细胞质或核蛋白)。在一些实施方案中，插入序列编码分泌蛋白。在一些实施方案中，插入序列编码嵌合蛋白。在一些实施方案中，插入序列编码融合蛋白。
在一些实施方案中，插入序列编码在免疫细胞表面上表达的受体(例如，在T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、调节性T细胞(Treg)、细胞毒性T淋巴细胞、记忆T细胞、效应T细胞、效应-记忆T细胞(TEM)、中央记忆T细胞(TCM)、常驻记忆T细胞(TRM)、初始T细胞、B细胞、浆细胞、NK细胞、NK T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、抗原呈递细胞、嗜中性粒细胞或肿瘤浸润淋巴细胞表面上表达的受体)。
在一些实施方案中，插入序列编码T细胞受体(TCR)或其功能部分。在一些实施方案中，插入序列编码嵌合抗原受体(CAR)或其功能部分。在一些实施方案中，插入序列编码B细胞受体或其功能部分。在一些实施方案中，插入序列编码趋化因子受体。在一些实施方案中，插入序列编码细胞因子受体。在一些实施方案中，插入序列编码包含一个或多个抗原识别结构域(例如，TCR、BCR、抗体或其抗原结合片段、DARPin等的抗原识别结构域)、一个或多个跨膜结构域和一个或多个信号传导结构域(例如，来自TCR、BCR、免疫共受体、细胞因子受体、趋化因子受体、基于免疫受体酪氨酸的抑制性结构域(ITIM)、基于免疫受体酪氨酸的活化结构域(ITAM)、免疫检查点基因或其组合的信号传导结构域)的融合蛋白。
在一些实施方案中，插入序列编码与由癌细胞表达的抗原或新抗原特异性结合的受体。在一些实施方案中，插入序列编码与在癌细胞表面上表达或呈递的抗原或新抗原特异性结合的受体。在一些实施方案中，抗原或新抗原来自癌基因或肿瘤抑制基因(例如，突变的肿瘤抑制基因)。在一些实施方案中，抗原包括T细胞表位。在一些实施方案中，癌症是实体瘤、血液学癌症或软组织癌。在一些实施方案中，癌细胞选自由以下组成的组：膀胱癌、上皮癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食管癌、胃肠道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、肺泡状横纹肌肉瘤、肛管癌、直肠癌、眼癌、颈部癌、胆囊癌、胸膜癌、口腔癌、外阴癌、结肠癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、腹膜癌、肾脏癌、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，癌细胞选自由胃肠道癌、乳腺癌、淋巴瘤和前列腺癌组成的组。
在一些实施方案中，插入序列编码与由病原体表达的抗原特异性结合的蛋白质。在一些实施方案中，插入序列编码与由病原体表达的抗原特异性结合的受体(例如，免疫受体)。在一些实施方案中，抗原包括T细胞表位。在一些实施方案中，病原体是细菌、病毒、真菌、酵母、寄生物(例如，单细胞或多细胞真核寄生物)或其他微生物。
在一些实施方案中，插入序列编码与疾病(例如，炎性或自身免疫性疾病)相关的抗原特异性结合的蛋白质。在一些实施方案中，插入序列编码与疾病相关的抗原特异性结合的受体(例如，免疫受体)。在一些实施方案中，抗原包括T细胞表位。在一些实施方案中，疾病是急性播散性脑脊髓炎、急性运动性轴索神经病(acute motor axonal neuropathy)、阿迪森氏病(Addison's disease)、痛性肥胖症(adiposis dolorosa)、成人斯蒂尔病(adult-onset still's disease)、斑秃、强直性脊柱炎、抗肾小球基底膜肾炎(anti-glomerular basement membrane nephritis)、抗中性粒细胞细胞质抗体相关血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis)、抗n-甲基-d-天冬氨酸受体脑炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性血管性水肿、自体免疫性脑炎、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自体免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺综合征、2型自身免疫性多内分泌腺综合征、3型自身免疫性多内分泌腺综合征、自身免疫性孕酮皮炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛同心性硬化(balo concentric sclerosis)、白塞氏病(
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disease)、比克斯塔夫氏脑炎(bickerstaff's encephalitis)、大疱性类天疱疮、乳糜泻、慢性疲劳综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、变应性肉芽肿性综合征(churg-strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮、寇甘综合征(cogan syndrome)、冷凝集素病、复杂性区域疼痛综合征、肢端硬皮综合征、克罗恩氏病(crohn's disease)、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、盘状红斑狼疮、子宫内膜异位症、肌腱接骨点炎(enthesitis)、肌腱接骨点相关关节炎、嗜酸性食管炎、嗜酸性筋膜炎、获得性大疱性表皮松解、结节性红斑、特发性混合型冷球蛋白血症(essential mixed cryoglobulinemia)、伊万斯综合征(evans syndrome)、费尔蒂综合征(felty syndrome)、纤维肌痛、胃炎、妊娠期类天疱疮、巨细胞性动脉炎、肺出血肾炎综合征(goodpasture syndrome)、格雷氏病(graves'disease)、格雷氏眼病、吉兰-巴雷综合征(guillain–barrésyndrome)、桥本氏脑病变(hashimoto's encephalopathy)、桥本甲状腺炎、亨-舍二氏紫癜(henoch-schonlein purpura)、化脓性汗腺炎、特发性扩张型心肌病、特发性炎性脱髓鞘病、IgA肾病、IgG4相关系统病、包涵体肌炎、炎性肠病、中间葡萄膜炎、间质性膀胱炎、青少年关节炎、川崎病(kawasaki's disease)、兰伯特-伊顿肌无力综合征(lambert-eaton myasthenic syndrome)、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样性结膜炎(ligneous conjunctivitis)、线状IgA病、狼疮肾炎、狼疮血管炎、莱姆病(lyme disease)(慢性)、梅尼埃病(ménière's disease)、显微镜型结肠炎、显微镜型多血管炎、混合性结缔组织病、蚕蚀性角膜溃疡(mooren's ulcer)、硬斑病、穆-哈二氏病(mucha-habermann disease)、多发性硬化、重症肌无力、心肌炎、肌炎、视神经脊髓炎、神经性肌强直、斜视眼阵挛-肌阵挛综合征(opsoclonus myoclonus syndrome)、视神经炎、奥德氏甲状腺炎(ord's thyroiditis)、复发性风湿病、副肿瘤性小脑变性、柏罗氏综合征(parry romberg syndrome)、牧师特纳综合征(parsonage-turner syndrome)、链球菌感染相关的儿童自身免疫性神经精神障碍、寻常型天疱疮、恶性贫血、急性痘疮样苔藓状糠疹、诗歌综合征(poems syndrome)、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性免疫缺陷、原发性硬化性胆管炎、进行性炎性神经病、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍、坏疽性脓皮病(pyodermagangrenosum)、雷诺氏现象(raynaud’s phenomenon)、反应性关节炎、复发性多软骨炎、下肢不宁综合征(restless leg syndrome)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、类风湿性血管炎、结节病、施尼茨勒综合征(schnitzler syndrome)、硬皮病、修格兰氏综合征(sjogren's syndrome)、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、苏萨克氏综合征(susac'ssyndrome)、小舞蹈症、交感性眼炎、系统性红斑狼疮、系统性硬皮病、血小板减少症、托洛萨-亨特综合征(tolosa-hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化型结缔组织病、荨麻疹、荨麻疹性血管炎、血管炎或白癜风。
在一些实施方案中，插入序列编码细胞因子受体或其功能部分(例如，细胞因子识别结构域或信号传导结构域)。在一些实施方案中，插入序列编码4-1BBL、APRIL、CD153、CD154、CD178、CD70、G-CSF、GITRL、GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1RA、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-20、IL-23、LIF、LIGHT、LT-β、M-CSF、MSP、OSM、OX40L、SCF、TALL-1、TGF-β、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TNF-α、TNF-β、TRAIL、TRANCE、TWEAK、其功能部分或其组合的受体。在一些实施方案中，插入序列编码共同的γ链受体、共同的β链受体、干扰素受体、TNF家族受体、TGF-B受体、其功能部分或其组合。在一些实施方案中，插入序列编码Apo3、BCMA、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD120、CD120a、CD120b、CD121、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD130、CD131、CD132、CD212、CD213、CD213a1、CD213a13、CD213a2、CD25、CD27、CD30、CD4、CD40、CD95(Fas)、CDw119、CDw121b、CDw125、CDw131、CDw136、CDw137(41BB)、CDw210、CDw217、GITR、HVEM、IL-11R、IL-11Ra、IL-14R、IL-15R、IL-15Ra、IL-18R、IL-18Rα、IL-18Rβ、IL-20R、IL-20Rα、IL-20Rβ、IL-9R、LIFR、LTβR、OPG、OSMR、OX40、RANK、TACI、TGF-βR1、TGF-βR2、TGF-βR3、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、其功能部分或其组合。
在一些实施方案中，插入序列编码趋化因子或其功能部分(例如，与趋化因子受体结合的部分)。在一些实施方案中，插入序列编码ACT-2、AMAC-a、ATAC、ATAC、BLC、BCA-1-、BRAK-、CCL1、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CKb-6、CKb-8、CTACK、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、DC-CK1、ELC、ENA-78+、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、Eskine、exodus-1、exodus-2、exodus-3、分形趋化因子、GCP-2+、GROa、GROb、GROg、HCC-1、HCC-2、HCC-4、I-309、IL-8、ILC、IP-10-、I-TAC-、LAG-1、LARC、LCC-1、LD78α、LEC、Lkn-1、LMC、淋巴肌动蛋白、淋巴肌动蛋白b、MCAF、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC、MDNCF+、MGSA-a、MGSA-b、MGSA-g、Mig-、MIP-1d、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2a+、MIP-2b+、MIP-3、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、MIP-4a、MIP-5、MPIF-1、MPIF-2、NAF、NAP-1、NAP-2、制瘤素A-、PARC、PF4、PPBP+、RANTES、SCM-1a、SCM-1b、SDF-1α/β-、SLC、STCP-1、TARC、TECK、XCL1、XCL2、其功能部分或其组合。在一些实施方案中，插入序列编码CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CX3CR1、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、XCR1、XCR1、其功能部分或其组合。
在一些实施方案中，插入序列编码转录因子(例如，影响免疫基因表达、免疫细胞功能、免疫细胞分化或其组合的转录因子)。可由本公开的插入序列编码的转录因子的实例包括但不限于AP-1、Bcl6、E2A、EBF、Eomes、FoxP3、GATA3、Id2、Ikaros、IRF、IRF1、IRF2、IRF3、IRF3、IRF7、NFAT、NFkB、Pax5、PLZF、PU.1、ROR-γ-T、STAT、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT5A、STAT5B、STAT6、T-bet、TCF7和ThPOK。
在一些实施方案中，插入序列编码转录因子，所述转录因子编码包含药物反应域的融合蛋白(例如，可由药物活化或失活的蛋白质)。在一些实施方案中，插入序列编码酶。
在一些实施方案中，插入序列编码抗体、抗原结合蛋白或其功能部分。举例来说，插入序列可编码抗体重链、轻链或其组合(例如，来自IgM、IgG、IgD、IgE、IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2的重链或轻链)。插入序列可编码具有恒定区或Fc区的抗体，所述抗体被选择或修饰以提供合适的抗体特性，例如用于治疗本文公开的疾病或病状的合适的特性。在一些实施方案中，IgG1可用于例如促进免疫活化效应功能(例如，ADCC、ADCP、CDC、ITAM信号传导、细胞因子诱导或其组合用于治疗癌症)。在一些实施方案中，IgG4可以例如在免疫效应功能不存在时需要抗体的拮抗特性的情况下使用。
插入序列可编码可结合靶抗原的非抗体产物，例如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)或适体。
在一些实施方案中，插入序列可编码抗体或抗体衍生蛋白的功能部分。举例来说，插入序列可编码包含一个或多个互补决定区(CDR)的蛋白质。插入序列可编码包含一个或多个来源于抗体的可变区的蛋白质。抗体和抗体衍生蛋白的功能部分的非限制性实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fab缀合物的二聚体和三聚体、Fv、scFv、微型抗体、双抗体、三抗体和四抗体、线性抗体。Fab和Fab'为抗原结合片段，其可包含通过二硫键与轻链的VL和CL结构域连接的重链VH结构域和CH1结构域。F(ab')2可包含通过二硫键连接的两个Fab或Fab'。Fv可包含通过非共价相互作用保持在一起的VH结构域和VL结构域。scFv(单链可变片段)是一种融合蛋白，其可包含通过肽接头连接的VH结构域和VL结构域。对VH和VL结构域的方向以及接头长度的操纵可用于产生不同形式的分子，所述分子可为单体、二聚体(双抗体)、三聚体(三抗体)或四聚体(四抗体)。
插入序列可编码包含一个或多个抗原结合区的融合蛋白。插入序列可编码包含两个或更多个抗原结合区的融合蛋白。举例来说，插入序列可编码多特异性抗原结合蛋白。在一些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白可结合癌抗原和免疫细胞抗原，从而将免疫细胞引导至癌细胞。免疫细胞抗原可存在于例如T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、调节性T细胞(Treg)、细胞毒性T淋巴细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Th9细胞、初始T细胞、记忆T细胞、效应T细胞、效应-记忆T细胞(TEM)、中央记忆T细胞(TCM)、常驻记忆T细胞(TRM)、自然杀伤T细胞(NKT)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤细胞(NK)、固有淋巴细胞(ILC)、B细胞、B1细胞、B1a细胞、B1b细胞、B2细胞、浆细胞、调节性B细胞、抗原呈递细胞(APC)、单核细胞、巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞或其组合上。多特异性抗原结合蛋白可包含例如二、三、四、五、六、七、八、九、十、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个抗原结合位点或更多个抗原结合位点。多特异性抗原结合蛋白可包含对于例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种不同靶抗原的结合特异性。
在一些实施方案中，插入序列编码T细胞受体、B细胞受体、细胞因子受体、趋化因子受体、NK细胞受体、NK T细胞受体、树突状细胞受体、巨噬细胞受体或单核细胞受体。在一些实施方案中，插入序列编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，插入序列编码TCR或CAR。
在一些情况下，插入序列编码CAR。一方面，CAR包含CD3ζ链(有时称为第1代CAR)。另一方面，CAR包含CD-3ζ链和单个共刺激结构域(例如，CD28或4-1BB)(有时称为第2代CAR)。另一方面，CAR包含CD-3ζ链和两个共刺激结构域(CD28/OX40或CD28/4-1BB)(有时称为第3代CAR)。与诸如CD8的共受体一起，这些不同的信号传导链可产生激酶途径的下游活化，这支持基因转录和功能性细胞反应。
CAR可包含胞外靶向结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。CAR可包含至少第一结合部分。结合部分的非限制性实例包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体或其功能衍生物、变体或片段，包括但不限于限于，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)、微型抗体、双抗体和单结构域抗体，诸如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)及其任何组合。CAR通常可包含来源于单链抗体的靶向结构域、铰链结构域(H)或间隔子、提供对质膜的锚定的跨膜结构域(TM)和负责T细胞活化的信号传导结构域。
一方面，本文提供的受体，诸如CAR，还包含铰链。铰链可位于CAR的任何区域。一方面，铰链位于结合部分与跨膜区之间。另一方面，主题CAR包含铰链或间隔子。铰链或间隔子可指结合部分与跨膜结构域之间的区段。在一些实施方案中，铰链可用于为靶向部分(例如scFv)提供柔性。在一些实施方案中，铰链可用于检测CAR在细胞表面上的表达，例如当检测scFv的抗体不起作用或不可用时。在某些情况下，铰链来源于免疫球蛋白分子，并且可能需要根据第一表位或第二表位在靶标上的位置而进行优化。在一些情况下，铰链可能不属于免疫球蛋白分子，而是属于另一分子，诸如CD8α分子的天然铰链。CD8α铰链可含有半胱氨酸和脯氨酸残基，所述半胱氨酸和脯氨酸残基可在CD8共受体与MHC分子的相互作用中发挥作用。在一些实施方案中，半胱氨酸和脯氨酸残基可影响CAR的性能并且因此可被工程化以影响CAR性能。I
在一些实施方案中，本文提供的铰链可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，例如在CAR中使用的铰链可为大小可调的并且可在某种程度上补偿表达CAR的细胞与靶细胞之间的正交突触距离的归一化。表达CAR的细胞与靶细胞之间的免疫突触的这种形貌特征也可定义一种距离，所述距离由于细胞表面靶分子上的膜远端表位，而无法由CAR在功能上桥接，即使是短铰链CAR，也无法使突触距离达到用于信号传导的近似值。同样，已经描述了膜近端CAR靶抗原表位，其信号传导输出仅在长铰链CAR的情况下观察到。本文公开的铰链可根据可使用的单链可变片段区域进行调整。在一些实施方案中，铰链来自CD28、IgG1和/或CD8α。
在一些情况下，CAR的结合部分可通过跨膜结构域与胞内信号传导结构域连接。跨膜结构域可为跨膜区段。CAR的跨膜结构域可将CAR锚定到细胞(例如免疫细胞)的质膜上。在一些实施方案中，跨膜区段包含多肽。连接CAR的靶向部分和胞内信号传导结构域的跨膜多肽可具有任何合适的多肽序列。在一些情况下，跨膜多肽包含内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分的多肽序列。在一些实施方案中，与内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分相比，跨膜多肽包含具有至少1个(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)氨基酸取代、缺失和插入的多肽序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含非天然多肽序列，诸如多肽接头的序列。多肽接头可以是柔性的或刚性的。多肽接头可以是结构化的或非结构化的。在一些实施方案中，跨膜多肽将信号从胞外靶向部分传递至胞内区域。一方面，主题CAR可包含将靶向部分连接至胞内区域的跨膜区。跨膜区可来自或衍生自外源细胞跨膜区。各种跨膜区是本领域已知的并且可以来自免疫细胞受体。一方面，跨膜结构域来自T细胞受体(TCR)的α链、TCR的β链、CD3ε、CD8、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD86、CD134、CD137、PD-1和/或CD152。在一些情况下，也可以使用多种人铰链，包括人Ig(免疫球蛋白)铰链。CD28的天然跨膜部分可用于CAR。在其他情况下，CD8α的天然跨膜部分也可用于主题CAR。一方面，跨膜结构域来自TCR的α链。一方面，跨膜结构域来自CD8并且为CD8α。在一个实施方案中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，所述跨膜结构域将主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将在合成跨膜结构域的每一端发现。
主题融合蛋白的CAR的胞内信号传导结构域可包含参与免疫细胞信号传导的信号传导结构域或其任何衍生物、变体或片段。CAR的胞内信号传导结构域可诱导包含CAR的免疫细胞的活性。胞内信号传导结构域可转导效应功能信号并指导细胞执行特定功能。信号传导结构域可包含其他分子的信号传导结构域。虽然另一分子的信号传导结构域通常可用于CAR中，但在许多情况下，没有必要使用整个链。在一些情况下，信号传导结构域的截短部分用于主题融合蛋白的CAR中。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含多个参与免疫细胞信号传导的信号传导结构域，或其任何衍生物、变体或片段。举例来说，胞内信号传导结构域可包含至少2个免疫细胞信号传导结构域，例如至少2、3、4、5、7、8、9或10个免疫细胞信号传导结构域。免疫细胞信号传导结构域可以刺激方式或抑制方式参与调节TCR复合物的初级活化。胞内信号传导结构域可以是TCR复合物的胞内信号传导结构域。主题融合蛋白中的主题CAR的胞内信号传导结构域可包括Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70的信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。包含ITAM的信号传导结构域可包含由6-8个氨基酸隔开的氨基酸序列YxxL/I的两个重复序列，其中每个x独立地为任何氨基酸，产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。当靶向部分与表位结合时，可以例如通过磷酸化修饰包含ITAM的信号传导结构域。磷酸化的ITAM可以作为其他蛋白质(例如参与各种信号传导途径的蛋白质)的停靠位点。在一些实施方案中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如突变的、截短的和/或优化的ITAM结构域，其与天然ITAM结构域相比具有改变(例如，增加或减少)的活性。
在一些实施方案中，主题融合蛋白中的CAR的胞内信号传导结构域包括FcγR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcγR信号传导结构域可选自FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包括FcεR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcεR信号传导结构域可选自FcεRI和FcεRII(CD23)。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包括FcαR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcαR信号传导结构域可选自FcαRI(CD89)和Fcα/μR。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，初级信号传导结构域包括CD3ζ的ITAM。
在一些实施方案中，主题CAR的胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序或ITIM。包含ITIM的信号传导结构域可包含在免疫系统的一些抑制性受体的胞质尾部中发现的氨基酸保守序列(S/I/V/LxYxxI/V/L)。包含ITIM的初级信号传导结构域可由诸如Src激酶家族成员(例如Lck)的酶修饰，例如磷酸化。磷酸化后，包括酶在内的其他蛋白质可招募至ITIM。这些其他蛋白质包括但不限于诸如磷酸酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2的酶、称为SHIP的肌醇-磷酸酶和具有一个或多个SH2结构域的蛋白质(例如ZAP70)。胞内信号传导结构域可包括以下各项的信号传导结构域(例如ITIM)：BTLA、CD5、CD31、CD66a、CD72、CMRF35H、DCIR、EPO-R、FcγRIIB(CD32)、Fc受体样蛋白2(FCRL2)、Fc受体样蛋白3(FCRL3)、Fc受体样蛋白4(FCRL4)、Fc受体样蛋白5(FCRL5)、Fc受体样蛋白6(FCRL6)、蛋白G6b(G6B)、白介素4受体(IL4R)、免疫球蛋白超家族受体易位相关1(IRTA1)、免疫球蛋白超家族受体易位相关2(IRTA2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL1(KIR2DL1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL2(KIR2DL2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL3(KIR2DL3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4(KIR2DL4)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL5(KIR2DL5)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体3DL1(KIR3DL1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体3DL2(KIR3DL2)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1(LIR1)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2(LIR2)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员3(LIR3)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员5(LIR5)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员8(LIR8)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)、肥大细胞功能相关抗原(MAFA)、NKG2A、天然细胞毒性触发受体2(NKp44)、NTB-A、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、PILR、SIGLECL1、唾液酸结合Ig样凝集素2(SIGLEC2或CD22)、唾液酸结合Ig样凝集素3(SIGLEC3或CD33)、唾液酸结合Ig样凝集素5(SIGLEC5或CD170)、唾液酸结合Ig样凝集素6(SIGLEC6)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素10(SIGLEC10)、唾液酸结合Ig样凝集素11(SIGLEC11)、唾液酸结合Ig样凝集素4(SIGLEC4)、唾液酸结合Ig样凝集素8(SIGLEC8)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、血小板和内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)、信号调节蛋白(SIRP 2)和信号阈值调节跨膜衔接头1(SIT)。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含修饰的ITIM结构域，例如突变的、截短的和/或优化的ITIM结构域，其与天然ITIM结构域相比具有改变(例如，增加或减少)的活性。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含至少2个ITAM结构域(例如，至少3、4、5、6、7、8、9或10个ITAM结构域)。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含至少2个ITIM结构域(例如，至少3、4、5、6、7、8、9或10个ITIM结构域)(例如，至少2个初级信号传导结构域)。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含ITAM结构域和ITIM结构域两者。一方面，主题CAR的胞内信号传导结构域来自Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。另一方面，主题CAR的胞内信号传导结构域来自CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ和/或CD3ε。
在一些情况下，本文提供的融合蛋白包含胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含共刺激结构域。一方面，共刺激结构域可为本文提供的融合蛋白的主题CAR的一部分。在一些实施方案中，例如来自细胞共刺激分子的共刺激结构域可提供用于免疫细胞信号传导(诸如来自ITAM和/或ITIM结构域的信号传导)的共刺激信号，例如用于免疫细胞活性的活化和/或去活化。在一些实施方案中，共刺激结构域可操作用于调节免疫细胞中的增殖和/或存活信号。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域包含以下各项的信号传导结构域：MHC I类蛋白、MHC II类蛋白、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA或Toll配体受体。在一些实施方案中，共刺激结构域包含选自由以下组成的组的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、树凝素(Dectin)-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含多个共刺激结构域，例如至少两个，例如至少3、4或5个共刺激结构域。一方面，本文提供的受体，诸如CAR，包含至少2个或3个共刺激结构域。一方面，受体包含至少2个共刺激结构域，并且其中所述至少2个共刺激结构域是CD28和CD137。一方面，受体包含至少3个共刺激结构域，并且其中所述至少3个共刺激结构域是CD28、CD137和OX40L。共刺激信号传导区可提供与初级效应活化信号协同的信号，并且可以完成活化T细胞的要求。在一些实施方案中，向CAR中添加共刺激结构域可增强本文提供的免疫细胞的功效和持久性。
在一些情况下，插入序列编码TCR或其功能片段。TCR是指T细胞或T淋巴细胞表面上负责识别抗原的分子。TCR是一种异二聚体，其可由两条不同的蛋白质链构成。在一些实施方案中，本公开的TCR由α链和β链组成，并称为αβTCR。αβTCR识别从与细胞表面处的主要组织相容性复合物分子(MHC)结合的蛋白质降解的抗原肽。在一些实施方案中，本公开的TCR由γ和δ链组成，并称为γδTCR。γδTCR以MHC非依赖性方式识别肽和非肽抗原。γδT细胞已表明在识别脂质抗原中起重要作用。特别地，TCR的γ链包括但不限于Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9、Vγ10、其功能变体及其组合；并且TCR的δ链包括但不限于δ1、δ2、δ3、其功能变体及其组合。在一些实施方案中，γδTCR可为Vγ2/Vδ1TCR、Vγ2/Vδ2TCR、Vγ2/Vδ3TCR、Vγ3/Vδ1TCR、Vγ3/Vδ2TCR、Vγ3/Vδ3TCR、Vγ4/Vδ1TCR、Vγ4/Vδ2TCR、Vγ4/Vδ3TCR、Vγ5/Vδ1TCR、Vγ5/Vδ2TCR、Vγ5/Vδ3TCR、Vγ8/Vδ1TCR、Vγ8/Vδ2TCR、Vγ8/Vδ3TCR、Vγ9/Vδ1TCR、Vγ9/Vδ2TCR、Vγ9/Vδ3TCR、Vγ10/Vδ1TCR、Vγ10/Vδ2TCR和/或Vγ10/Vδ3TCR。在一些实例中，γδTCR可为Vγ9/Vδ2TCR、Vγ10/Vδ2TCR和/或Vγ2/Vδ2TCR。
在一些情况下，插入序列编码TCR，其包括先前识别的TCR。在一些情况下，可以使用全外显子测序来识别TCR。举例来说，TCR可靶向通过靶细胞的全外显子测序识别的新抗原或新表位。可替代地，可以从自体、同种异体或异种库中识别TCR。自体和同种异体识别可能需要一个多步骤的过程。在自体和同种异体识别中，树突状细胞(DC)均可由CD14选择的单核细胞产生，并在成熟后用特定肽脉冲或转染。肽脉冲的DC可用于刺激自体或同种异体免疫细胞，诸如T细胞。单细胞肽特异性T细胞克隆可通过有限稀释从这些肽脉冲的T细胞系中分离出来。可以识别和分离感兴趣的主题TCR。感兴趣的TCR的α、β、γ和δ链可以被克隆、密码子优化和编码到载体中，例如慢病毒载体。在一些实施方案中，TCR的部分可以被替换。举例来说，人TCR的恒定区可以用对应的鼠区域替换。可以用对应的鼠区域替换人恒定区以增加TCR稳定性。TCR也可以通过离体的高生理性或超生理性亲合力来识别。在一些情况下，识别TCR的方法可包括用人肿瘤蛋白免疫表达人白细胞抗原(HLA)系统的转基因小鼠，以产生表达针对人抗原的TCR的T细胞(参见例如，Stanislawski等,Circumventing toleranceto a human MDM2-derived tumor antigen by TCR gene transfer,Nature Immunology2,962-970(2001))。替代方法可以是同种异体TCR基因转移，其中肿瘤特异性T细胞从经历肿瘤缓解的受试者中分离，并且可以将反应性TCR序列转移到来自另一患有所述疾病但可能无反应的受试者的T细胞(de Witte,M.A.,等,Targeting self-antigens throughallogeneic TCR gene transfer,Blood 108,870–877(2006))。在一些情况下，体外技术可用于改变TCR的序列，通过增加弱反应性肿瘤特异性TCR与靶抗原的相互作用力度(亲合力)，增强所述TCR肿瘤杀伤活性(Schmid,D.A.,等,Evidence for a TCR affinitythreshold delimiting maximal CD8 T cell function.J.Immunol.184,4936–4946(2010))。
在一些实施方案中，插入序列编码在免疫细胞上表达的蛋白质，所述蛋白质特异性结合在癌细胞上表达的抗原。在一些实施方案中，插入序列编码在免疫细胞上表达的蛋白质，所述蛋白质特异性结合在癌细胞上表达的新抗原。在一些实施方案中，插入序列编码在免疫细胞上表达的蛋白质，所述蛋白质特异性结合癌症相关抗原。在一些实施方案中，插入序列编码在免疫细胞上表达的蛋白质，所述蛋白质特异性结合在癌细胞上表达的抗原。在一些实施方案中，插入序列编码在免疫细胞上表达的蛋白质，所述蛋白质特异性结合与自身免疫性疾病相关的抗原。在一些实施方案中，插入序列编码在免疫细胞上表达的蛋白质，所述蛋白质特异性结合在病原体(例如微生物体，例如病毒、细菌、寄生物、真菌或酵母)上表达的抗原。
在一些实施方案中，插入序列编码在免疫细胞上表达的蛋白质并特异性结合癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、碳酸酐酶IX、甲胎蛋白(AFP)、α-辅肌动蛋白-4、ART-4、A1847、Ba 733、BAGE、BCMA、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD56、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD7OL、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD123、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CTLA-4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠持异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、纤维母细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、CRP、MDA-MB-231、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、间皮素、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌粘蛋白、PD1、PD-1受体、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、5100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原(Thomson-Friedenreichantigen)、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A-抗原、补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5a、补体因子C5、707-AP、生物素化分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-ablp210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CAG-3、CAIX、CAMEL、半胱天冬酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2 M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、Lewis Y、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活素、存活素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ-轻链。
在一些情况下，插入物中提供的细胞受体能够与新抗原和/或新表位结合。新抗原和新表位通常是指在一些情况下会触发抗肿瘤T细胞反应的肿瘤特异性突变。举例来说，可使用全外显子测序方法识别这些内源突变。Tran E,等,“Cancer immunotherapy based onmutation-specific CD4+T cells in a patient with epithelial cancer,”Science344:641-644(2014)。抗原结合结构域，例如主题CAR或修饰的TCR复合物的抗原结合结构域可表现出与肿瘤特异性新抗原的特异性结合。由修饰的TCR复合物的抗原结合结构域结合的新抗原可在靶细胞上表达，并且所述新抗原例如是由任何内源基因中的突变编码的新抗原和新表位。在一些情况下，两个或更多个抗原结合结构域结合由突变基因编码的新抗原或新表位。所述基因可选自由以下组成的组：ABL1、ACOl 1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2Μ、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、NY-ESO、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B 1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL和XPOT。
在一些实施方案中，插入物中提供的细胞受体可结合可能存在于基质上的抗原或表位。基质通常是指除其他事项之外提供生物细胞、组织或器官的结缔和功能支持的组织。基质可为肿瘤微环境的基质。表位可存在于基质抗原上。这种抗原可在肿瘤微环境的基质上。举例来说，新抗原和新表位可存在于肿瘤内皮细胞、肿瘤脉管系统、肿瘤纤维母细胞、肿瘤周细胞、肿瘤基质和/或肿瘤间充质细胞上。示例性抗原包括但不限于CD34、MCSP、FAP、CD31、PCNA、CD117、CD40、MMP4和生腱蛋白。
同源臂
多核酸构建体可包含一个或多个同源臂。同源臂可包含与待编辑的免疫细胞基因组中的序列具有一定程度同源性的序列，例如以使用多核酸构建体或其一部分作为修复模板指导免疫细胞基因组中的双链断裂修复(例如，通过包括单链退火、同源性介导的末端连接、微同源性介导的末端连接、替代末端连接、同源性定向修复、同源重组或其组合的途径进行修复)。同源臂可将多核酸构建体或其一部分靶向免疫细胞基因组中的所需位点，例如邻近双链断裂的位点。多核酸构建体可包含一个同源臂。本公开的多核酸构建体可包含两个同源臂。多核酸构建体中的两个同源臂可侧接待插入免疫细胞基因组(例如，转基因)中的序列。多核酸构建体中的两个同源臂可彼此直接相邻(例如，用于在免疫细胞基因组中产生缺失)。本公开的多核酸构建体可包含三个或更多个同源臂。
本公开的同源臂可为单链DNA(ssDNA)。在其他方面，同源臂是双链的(dsDNA)。在一些方面，一个或多个同源臂为100nt并且可侧接供体插入序列的每一侧。在一些方面，一个或多个同源臂为约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200nt的ssDNA并且可侧接供体插入序列的每一侧。在一些方面，一个或多个同源臂为约100nt的ssDNA并且可侧接供体插入序列的每一侧。
同源臂可包含与待编辑的免疫细胞基因组中的序列具有约或至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.1％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.99％或100％序列同一性的序列。同源臂可包含具有足以允许多核酸构建体或其一部分用作免疫细胞基因组中双链断裂的修复模板的同源性程度的序列。在一些实施方案中，同源臂可含有与免疫细胞基因组中的同源序列不匹配的一个或多个核苷酸(例如，用于校正一个或多个单核苷酸多态性(SNP)或用于引入一个或多个SNP)。在一些实施方案中，多核酸构建体中的两个或更多个同源臂含有与免疫细胞基因组中的对应位点相同程度的同源性。在一些实施方案中，多核酸构建体中的两个或更多个同源臂含有与免疫细胞基因组中的对应位点不同程度的同源性。同源臂可含有与基因中的核苷酸、开放阅读框中的核苷酸、非编码区中的核苷酸或其组合同源的核酸序列。
在一些实施方案中，同源臂长度为约24个核苷酸。在一些实施方案中，同源臂长度为约48个核苷酸。同源臂长度可为例如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950或2000个核苷酸。
在一些实施方案中，本公开的同源臂长度为至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950或2000个核苷酸。
在一些实施方案中，本公开的同源臂长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950或2000个核苷酸。
同源臂可为短同源臂。短同源臂长度可为例如至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400个核苷酸。
短同源臂长度可为例如约3-400、5-300、5-200、5-100、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-49、5-48、5-47、5-46、5-45、5-44、5-43、5-42、5-41、5-40、5-39、5-38、5-37、5-36、5-35、5-34、5-33、5-32、5-31、5-30、5-29、5-28、5-27、5-26、5-25、5-24、5-23、5-22、5-21、5-20、5-19、5-18、5-7、5-16、5-15、5-14、5-13、5-12、5-11、5-10、10-50、10-49、10-48、10-47、10-46、10-45、10-44、10-43、10-42、10-41、10-40、10-39、10-38、10-37、10-36、10-35、10-34、10-33、10-32、10-31、10-30、10-29、10-28、10-27、10-26、10-25、10-24、10-23、10-22、10-21、10-20、10-19、10-18、10-17、10-16、10-15、15-50、15-49、15-48、15-47、15-46、15-45、15-44、15-43、15-42、15-41、15-40、15-39、15-38、15-37、15-36、15-35、15-34、15-33、15-32、15-31、15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、20-50、20-49、20-48、20-47、20-46、20-45、20-44、20-43、20-42、20-41、20-40、20-39、20-38、20-37、20-36、20-35、20-34、20-33、20-32、20-31、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、24-50、24-49、24-48、24-47、24-46、24-45、24-44、24-43、24-42、24-41、24-40、24-39、24-38、24-37、24-36、24-35、24-34、24-33、24-32、24-31、24-30、24-29或24-28个核苷酸。
同源臂可为长同源臂。长同源臂长度可为例如至少400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450或1500个核苷酸。
在一些实施方案中，同源臂含有是三的倍数的多个核苷酸。在一些实施方案中，同源臂含有不是三的倍数的多个核苷酸。在一些实施方案中，同源臂含有是四的倍数的多个核苷酸。在一些实施方案中，同源臂含有不是四的倍数的多个核苷酸。
本公开的多核酸构建体可包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个同源臂或更多个同源臂。在一些实施方案中，多核酸构建体中的两个或更多个同源臂长度相同。在一些实施方案中，多核酸构建体中的两个或更多个同源臂长度不同。
在一些实施方案中，同源臂包含与邻近靶位点的基因组基因座至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，同源臂包含与邻近靶位点的基因组基因座70％-100％、80％-100％、90％-100、95％-100％、96％-100％、97％-100％、98％-100％、99％-100％互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，同源臂包含与邻近靶位点的基因组基因座约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补的核苷酸序列。
在一些实施方案中，同源臂可包含与表1中的基因、免疫检查点基因、安全港基因或其任何组合约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补的序列。
裂解位点
在一些实施方案中，多核酸构建体中侧接插入序列的一个或多个(例如，两个)同源臂由裂解位点侧接。举例来说，在一些实施方案中，多核酸构建体包含两个同源臂，一个在插入序列(例如，转基因)的每一端，并且每个同源臂由裂解位点侧接。举例来说，从5′到3′，多核酸可包含第一裂解位点、第一同源臂、插入序列(例如，转基因)、第二同源臂和第二裂解位点。在一些实施方案中，多核酸构建体含有一个同源臂。举例来说，从5′到3′，多核酸可包含裂解位点、同源臂、插入序列(例如，转基因)；或插入序列、同源臂和裂解位点；或裂解位点、插入序列、同源臂和裂解位点；或裂解位点、同源臂、插入序列和裂解位点。
在一些实施方案中，所述裂解位点邻近由指导RNA(gRNA)识别的所靶向的序列。在一些实施方案中，所靶向的序列由将内切核酸酶引导至裂解位点的gRNA(例如，sgRNA)识别。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是CRISPR系统内切核酸酶(例如，Cas内切核酸酶)、TALEN内切核酸酶或锌指内切核酸酶。在一些实施方案中，所述内切核酸酶是本文所述的内切核酸酶。
在一些实施方案中，裂解位点为CRISPR系统裂解位点。在一些实施方案中，CRISPR系统裂解位点包含PAM基序和与gRNA至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补的序列。在一些实施方案中，所述gRNA与所述序列结合。
在一些实施方案中，CRISPR系统裂解位点包含PAM基序。在一些实施方案中，多核酸构建体包含PAM基序与同源臂之间的间隔子。在一些实施方案中，间隔子为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10bp。在一些实施方案中，间隔子为约1-10bp、1-9bp、1-8bp、1-7bp、1-6bp、1-5bp、1-4bp、1-3bp或1-2bp。在一些实施方案中，间隔子为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10bp。在一些实施方案中，间隔子为约3bp。在一些实施方案中，间隔子为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子为约1-10个核苷酸、1-9个核苷酸、1-8个核苷酸、1-7个核苷酸、1-6个核苷酸、1-5个核苷酸、1-4个核苷酸、1-3个核苷酸或1-2个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子为约3个核苷酸。
启动子和增强子
在一些实施方案中，所述多核酸构建体包含启动子。本领域普通技术人员可以选择合适的启动子。转基因的表达可由至少一个启动子控制。示例性启动子包括但不限于CMV、U6、MND、PKG、MND或EF1a。
启动子可以是遍在的、组成型(允许相关基因连续转录的未调节启动子)、组织特异性启动子或诱导型启动子。示例性遍在的启动子包括但不限于CAGGS启动子、hCMV启动子、PGK启动子、SV40启动子或ROSA26启动子。
启动子可为内源的或外源的。举例来说，可邻近内源或外源ROSA26启动子或者在内源或外源ROSA26启动子附近插入一个或多个转基因。此外，启动子可为T细胞特异性的。举例来说，可邻近猪ROSA26启动子或在猪ROSA26启动子附近插入一个或多个转基因。
组织特异性启动子或细胞特异性启动子可用于控制表达位置。举例来说，可邻近组织特异性启动子或在组织特异性启动子附近插入一个或多个转基因。组织特异性启动子可为FABP启动子、Lck启动子、CamKII启动子、CD19启动子、角蛋白启动子、白蛋白启动子、aP2启动子、胰岛素启动子、MCK启动子、MyHC启动子、WAP启动子或Col2A启动子。
也可以使用诱导型启动子。这些诱导型启动子可以在需要时通过添加或去除诱导剂来开启和关闭。预期诱导型启动子可为但不限于Lac、tac、trc、trp、araBAD、phoA、recA、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、PL、cspA、T7、VHB、Mx和/或Trex。
在一些实施方案中，插入序列包含增强子。在一些实施方案中，增强子是组织特异性的。在一些实施方案中，插入序列包含多个增强子(例如，至少2个)。
基因修饰细胞的方法
本文提供了制备基因组修饰的细胞，例如免疫细胞，例如本文所述的免疫细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向细胞(例如，免疫细胞)中(例如离体)引入内切核酸酶系统(例如，包含gRNA和Cas核酸酶的CRISPR系统)，所述系统在所靶向的基因序列中引入基因组破坏；以及向细胞中引入多核酸构建体(例如，本文所述的)，所述多核酸构建体包含至少一个(例如，2个)裂解序列、至少一个同源臂(例如，两个同源臂)和插入序列(例如转基因)，其中所述转基因插入所述基因组破坏中。在一些实施方案中，内切核酸酶在至少一个裂解位点处引入双链断裂。在一些实施方案中，引入单一内切核酸酶。在一些实施方案中，使用至少两种内切核酸酶。在一些实施方案中，插入序列通过微同源性介导的末端连接并入基因组中。在一些实施方案中，插入序列通过单链退火并入基因组中。插入序列通过同源性介导的末端连接并入基因组中。
多核酸构建体的裂解
在一些实施方案中，多核酸构建体中侧接插入序列的一个或多个(例如，两个)同源臂由裂解位点侧接。举例来说，在一些实施方案中，多核酸构建体包含两个同源臂，一个在插入序列(例如，转基因)的每一端，并且每个同源臂由裂解位点侧接。举例来说，从5′到3′，多核酸可包含第一裂解位点、第一同源臂、插入序列(例如，转基因)、第二同源臂和第二裂解位点。在一些实施方案中，多核酸构建体含有一个同源臂。举例来说，从5′到3′，多核酸可包含裂解位点、同源臂、插入序列(例如，转基因)；或插入序列、同源臂和裂解位点；或裂解位点、插入序列、同源臂和裂解位点；或裂解位点、同源臂、插入序列和裂解位点。
在一些实施方案中，裂解位点由内切核酸酶识别。在一些实施方案中，裂解位点包括如本文所述的CRISPR、锌指或TALEN系统裂解位点。在一些实施方案中，裂解位点包含CRISPR系统裂解位点。在一些实施方案中，CRISPR系统裂解位点包含PAM序列(例如，如本文所述的)和由gRNA识别的靶向核酸序列(例如，如本文所述的)。
在一些实施方案中，裂解位点处的裂解是通过将内切核酸酶引入细胞中来介导的。在一些实施方案中，裂解位点处的裂解是通过将CRISPR系统(例如，如本文所述的)引入细胞中来介导的。在一些实施方案中，CRISPR系统包含内切核酸酶(例如，如本文所述的)和gRNA(例如，如本文所述的)。
基因组靶位点
在一些实施方案中，将插入序列插入细胞基因组中的内源基因中。在一些实施方案中，所述基因是安全港基因座，例如，AAVS(例如，AAVS1、AAVS2)、CCR5、hROSA26、白蛋白或HPRT。
在一些实施方案中，所述基因编码细胞表面受体(例如，TCR、BCR)。
在一些实施方案中，所述基因编码抑制性免疫检查点蛋白。在一些实施方案中，抑制性免疫检查点蛋白为A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA或CISH。在一些实施方案中，基因编码表1中的基因。
在一些情况下，本文提供的构建体可包含靶向来自表1的示例性内源基因中的任一种和/或其他类似基因的同源臂。举例来说，构建体可包含对表1中基因的区域具有特异性的同源臂。在一些方面，示例性内源基因可用本文提供的转基因插入序列进行破坏。所述破坏可能足以降低和/或消除由内源基因编码的RNA或蛋白质的表达。
表1.示例性内源基因
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在一些实施方案中，所述基因编码包含ITIM的细胞表面受体。在一些实施方案中，内源基因为TRAC；TCRB；腺苷A2a受体(ADORA)；CD276；含V组结构域的T细胞活化抑制因子1(VTCN1)；B淋巴细胞和T淋巴细胞相关(BTLA)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)；吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体，三个结构域，长胞质尾部1(KIR3DL1)；淋巴细胞活化基因3(LAG3)；程序性细胞死亡1(PD-1)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)；T细胞活化的V结构域域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)；自然杀伤细胞受体2B4(CD244)；细胞因子诱导的含SH2蛋白(CISH)；次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT)；腺相关病毒整合位点(AAVS(例如AAVS1、AAVS2))或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)；CD160分子(CD160)；具有Ig结构域域和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；CD96分子(CD96)；细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)；唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)；肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B)；肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(TNFRSF10A)；半胱天冬酶8(CASP8)；半胱天冬酶10(CASP10)；半胱天冬酶3(CASP3)；半胱天冬酶6(CASP6)；半胱天冬酶7(CASP7)；Fas相关死亡结构域(FADD)；Fas细胞表面死亡受体(FAS)；转化生长因子β受体II(TGFBRII)；转化生长因子β受体I(TGFBR1)；SMAD家族成员2(SMAD2)；SMAD家族成员3(SMAD3)；SMAD家族成员4(SMAD4)；SKI原癌基因(SKI)；SKI样原癌基因(SKIL)；TGFB诱导因子同源框1(TGIF1)；白介素10受体亚基α(IL10RA)；白介素10受体亚基β(IL10RB)；血红素加氧酶2(HMOX2)；白介素6受体(IL6R)；白介素6信号转导子(IL6ST)；c-src酪氨酸激酶(CSK)；具有鞘糖脂微结构域域的磷蛋白膜锚1(PAG1)；信号传导阈值调节跨膜衔接头1(SIT1)；叉头框P3(FOXP3)；PR结构域1(PRDM1)；碱性亮氨酸拉链转录因子，ATF样(BATF)；鸟苷酸环化酶1，可溶，α2(GUCY1A2)；鸟苷酸环化酶1，可溶，α3(GUCY1A3)；鸟苷酸环化酶1，可溶，β2(GUCY1B2)；鸟苷酸环化酶1，可溶，β3(GUCY1B3)；蛋白质的脯氨酰羟化酶结构域(PHD1、PHD2、PHD3)家族；A2AR；B7-H3；B7-H4；IDO；KIR；LAG3；TIM-3；VISTA；CD27；CD40；CD122；OX40；GITR；CD137；CD28；ICOS；A2AR；B7-H3；B7-H4或PPP1R12C。
在一些实施方案中，宿主基因组中的多个(例如，至少2、3、4、5、6个或更多个)靶基因被破坏。在一些实施方案中，基因组破坏为双链DNA。在一些实施方案中，将一个双链断裂引入宿主基因组中的靶位点中。在一些实施方案中，将至少两个双链断裂引入宿主基因组中的两个不同靶位点中。在一些实施方案中，将两个双链断裂引入宿主基因组中的两个不同靶位点中以便介导大段DNA的缺失。在一些实施方案中，将两个双链断裂引入宿主基因组中的单个基因中以介导大段DNA的缺失。在一些实施方案中，基因组破坏抑制由包含基因组破坏的基因编码的蛋白质的表达。在一些实施方案中，基因组破坏抑制由包含基因组破坏的基因编码的功能蛋白的表达。
DNA修复途径
在一些实施方案中，本文提供了使用引入了至少一个双链断裂的修复模板来解决调用基因组中引入的双链断裂的方法。在修复模板中引入至少一个双链断裂允许使用替代或额外的修复途径，例如，包括末端切除的途径、在修复模板中仅需要短同源臂的途径或其组合，用于将插入序列插入基因组中。可使用的替代或额外修复途径的非限制性实例包括包含单链退火、同源性介导的末端连接、微同源性介导的末端连接、替代末端连接及其组合的途径。
在一些实施方案中，与使用不具有至少一个双链断裂的修复模板的类似方法相比，本文提供的方法表现出增加的整合效率。
在一些实施方案中，相对于使用不具有至少一个双链断裂的修复模板的类似群体，本文所述的方法提供了并入插入序列的细胞的百分比增加。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少10％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少20％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少30％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少40％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少50％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少60％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少70％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少80％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少90％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少10％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少20％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少30％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少40％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少50％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少60％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少70％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少80％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少90％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，转基因的整合是在引入所述转基因之后1-30、1-21、1-14、1-7、1-5、1-4、1-3、1-2天测量的。在一些实施方案中，细胞生存力是在引入所述转基因之后1-30、1-21、1-14、1-7、1-5、1-4、1-3、1-2天测量的。
在一些实施方案中，插入序列整合的效率随着在包含插入序列的多核酸构建体中引入至少一个双链断裂的效率而变化。在一些实施方案中，插入序列整合的效率随着从包含插入序列的多核酸构建体中切除转基因的效率而变化。
在一些实施方案中，扩增包含整合的转基因的细胞。在一些实施方案中，选择性扩增包含整合的转基因的细胞。在一些实施方案中，体外选择性扩增包含整合的转基因的细胞。
细胞生存力和整合效率
本文提供了增强基因组移植的方法。在一些情况下，本文提供的方法增加细胞生存力。在一些情况下，本文提供的方法增加转基因整合效率(也称为“转染效率”)。在一些情况下，本文提供的方法增加细胞生存力和转基因整合效率。
在一些情况下，细胞生存力是通过各种方法通过细胞计数来测量的。在一些情况下，细胞计数可以通过活细胞染色来辅助。在一些情况下，细胞计数可为自动化的，例如，通过流式细胞术或目标识别算法。在一些情况下，细胞计数可以手动进行。在一些情况下，细胞生存力可以直接观察，例如，培养皿中的细胞在死亡时往往会团聚。在一些情况下，细胞生存力可以通过生存力测定来测量，所述生存力测定可以测量例如但不限于细胞溶解、膜渗漏、线粒体活性或半胱天冬酶表达、某些细胞功能、某些基因的表达、基因组完整性。在一些情况下，细胞生存力可以通过生存力染料染色来测量。在一些情况下，生存力染料染色后可进行流式细胞术。生存力染料可以区分活的或死的细胞或垂死的细胞。可以例如通过流式细胞术或显微镜检查来检测细胞的差异染色。
整合效率可以通过检测细胞中转基因的基因组插入来测量。在一些情况下，整合效率可以通过检测转基因产物来测量。举例来说，外源多核酸可包括报告基因，例如荧光蛋白，例如GFP、YFP或mCherry。在一些情况下，整合效率可以通过检查报告基因的表达来测量，例如通过可以对表达荧光蛋白的细胞进行计数的流式细胞术。在一些情况下，整合效率可以通过直接评估电穿孔细胞的基因组序列来测量，例如通过测序检查转基因的插入。
在一些实施方案中，与使用不具有至少一个双链断裂的修复模板的类似方法相比，本文提供的方法表现出增加的整合效率。
在一些实施方案中，相对于使用不具有至少一个双链断裂的修复模板的类似群体，本文所述的方法提供了并入插入序列的细胞的百分比增加。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少10％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少20％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少30％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少40％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少50％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少60％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少70％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少80％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少90％的细胞包含插入序列。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少10％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少20％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少30％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少40％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少50％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少60％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少70％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少80％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞群中至少90％的细胞包含插入序列并且是活细胞。在一些实施方案中，转基因的整合是在引入所述转基因之后1-30、1-21、1-14、1-7、1-5、1-4、1-3、1-2天测量的。在一些实施方案中，细胞生存力是在引入所述转基因之后1-30、1-21、1-14、1-7、1-5、1-4、1-3、1-2天测量的。
在一些实施方案中，插入序列整合的效率随着在包含插入序列的多核酸构建体中引入至少一个双链断裂的效率而变化。在一些实施方案中，插入序列整合的效率随着从包含插入序列的多核酸构建体中切除转基因的效率而变化。
在一些实施方案中，扩增包含整合的转基因的细胞。在一些实施方案中，选择性扩增包含整合的转基因的细胞。在一些实施方案中，体外选择性扩增包含整合的转基因的细胞。
核酸酶处理
本文提供了提高细胞工程化的总产率的方法，包括例如提高细胞工程化后的细胞生存力和/或提高转染效率，所述方法包括使基因修饰的细胞与足量的至少一种核酸酶接触。在一些情况下，与足量的至少一种核酸酶接触一段足够长的时间可以增加细胞生存力。在一些情况下，与足量的至少一种核酸酶接触一段时间可以增加转染效率。在一些情况下，与足量的至少一种核酸酶接触一段足够长的时间可以增加细胞生存力和转染效率两者。
不希望受特定理论的束缚，如本领域技术人员将理解的，在转染期间，细胞膜的至少一个点被破坏以允许外源核酸和/或其他剂进入细胞，导致尽管膜的开放具有可逆性，但仍对细胞完整性造成侵入性损害并可能具有持久的影响。此外，当外源剂被引入胞内环境时，细胞未必对其胞内存在耐受。另一潜在的不利影响可能来自外源剂，所述外源剂可能因为细胞膜在暂时开放后重新密闭，而被困在细胞膜的脂质双层之间。
在一些情况下，提高细胞生存力的方法可包括使细胞与核酸酶接触，根据定义，所述核酸酶可以选择性地催化多核酸中磷酸二酯键的水解裂解(水解或消化)。核酸酶可包括脱氧核糖核酸酶(DNA酶)、核糖核酸酶(RNA酶)或两者。DNA酶可特异性消化DNA，而RNA酶可特异性消化RNA。核酸酶也可分类为内切核酸酶或外切核酸酶。外切核酸酶可指催化多核酸分子从其5'、3'两端水解的任一组酶。内切核酸酶可指催化多核酸分子内部的核酸之间的多核酸分子水解的任一组酶。一些酶可同时具有外切核酸酶和内切核酸酶特性。此外，一些酶能够消化DNA和RNA序列两者。
与核酸酶接触可使得生存力百分比增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％或甚至更多。在一些情况下，生存力百分比的增加可为约50％至约200％。与核酸酶接触可使得整合效率增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％或甚至更多。在一些情况下，整合效率的增加可为约50％至约200％。
与本文所述的主题相关的DNA酶的非限制性实例可包括DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶以及专门用于断裂其各自识别序列中的磷酸二酯键的各种限制酶。与本文公开的主题相关的RNA酶的非限制性实例可包括RNA酶A、RNA酶H、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶P、RNA酶PhyM、RNA酶T1、RNA酶T1、RNA酶U2、RNA酶V、多核苷酸磷酸化酶、RNA酶PH、RNA酶R、RNA酶D、RNA酶I、RNA酶II、RNA酶T、寡核糖核酸酶、外切核糖核酸酶I和外切核糖核酸酶II。可根据引入细胞中的多核酸的特性和被转染的细胞的类型来选择适当的核酸酶。
在一些情况下，可在细胞转染后应用核酸酶。在一些情况下，可在细胞转染完成后立即引入核酸酶。在一些情况下，可在进行细胞转染的同时引入核酸酶，例如，在进行电穿孔的同时施加，或在细胞仍暴露于转染试剂时施加。在一些情况下，可在转染后数分钟至数小时引入核酸酶。细胞转染完成与核酸酶施加之间的时间延迟可为约30秒、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约1.5小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约7.5小时、约8小时、约10小时、约12小时、约20小时、约30小时、约40小时、约50小时、约60小时、约70小时、约80小时、约90小时或约1周。在一些情况下，时间延迟可能甚至更长。
在一些情况下，可在细胞转染之前施加核酸酶。在转染之前的一段时间内，核酸酶可存在于细胞培养物中。在一些情况下，核酸酶的“预处理”可促进靶细胞的整体健康。举例来说，在许多情况下，所述预处理可促进从生物体的活器官中分离出来的细胞的存活。核酸酶可在细胞转染之前和之后都存在。
核酸酶可在培养基中以约1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、950μg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、500mg/ml或这些值中任意两个之间的一个大约值的浓度供应。核酸酶可在培养基中以约1mg/mL的浓度供应。核酸酶可在培养基中供应，并且含有核酸酶的培养基可约每3小时、6小时、12小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、40小时、44小时、48小时、50小时、60小时更换一次。频繁更换培养基可使核酸酶浓度维持在一定水平。
如本领域技术人员将了解，核酸酶的选择、核酸酶的浓度以及核酸酶孵育的时间和持续时间可根据本文所述主题的特定应用的许多参数而变化。各种参数可包括但不限于细胞类型、待转移的多核酸的特性、细胞的整体健康状况、预期达到的生存力以及转染细胞的预期用途。
在一些情况下，可以用核酸酶处理/孵育细胞一段时间。孵育时间可为至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟或至少约60分钟。孵育时间可为至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约7.5小时、至少约8小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约20小时、至少约30小时、至少约40小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时或至少约1周。在一些情况下，孵育时间可为至少1周、至少2周、至少3周或甚至更长。
在一些情况下，细胞可在18℃-25℃下在混合物中暴露于核酸酶1至30分钟。在一些实例中，混合物可包含PBS、FBS、镁和DNA酶。
免疫刺激剂
本文提供了提高细胞工程化的总产率的方法，包括例如提高细胞工程化后的细胞生存力和/或提高转染效率，所述方法包括使基因修饰的细胞与足量的至少一种免疫刺激剂接触。在一些情况下，与足量的至少一种免疫刺激剂接触一段足够长的时间可以增加细胞生存力。在一些情况下，与足量的至少一种免疫刺激剂接触一段时间可以增加转染效率。在一些情况下，与足量的至少一种免疫刺激剂接触一段足够长的时间可以增加细胞生存力和转染效率两者。
免疫刺激剂可包括可以刺激免疫细胞的任何类型的试剂。举例来说，免疫刺激剂可包括细胞因子。在一些情况下，免疫刺激剂可包括针对免疫细胞受体的抗体或免疫细胞受体的配体。
细胞因子是指由细胞释放的可影响细胞行为的蛋白质(例如，趋化因子、干扰素、淋巴因子、白介素和肿瘤坏死因子)。细胞因子由广泛范围的细胞产生，包括免疫细胞(诸如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞)以及内皮细胞、纤维母细胞和各种基质细胞。给定的细胞因子可由超过一种类型的细胞产生。细胞因子可参与产生全身或局部免疫调节作用。示例性细胞因子包括但不限于IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21或其任何组合。
在一些情况下，aAPC可能不会诱导同种异体特异性。在一些情况下，aAPC可能不表达HLA。可对aAPC进行基因修饰以稳定表达可用于活化和/或刺激的基因。在一些情况下，K562细胞可用于活化。K562细胞还可用于扩增。K562细胞可为人红白血病细胞系。可对K562细胞进行工程化以表达感兴趣的基因。K562细胞可能不内源表达HLA I类、II类或CD1d分子，但可能表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。可对K562进行工程化以将信号1传递至T细胞。举例来说，可对K562细胞进行工程化以表达HLA I类。在一些情况下，可对K562细胞进行工程化以表达额外分子，诸如B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19或任意组合。在一些情况下，除CD80和CD83以外，工程化K562细胞还可以表达膜形式的抗CD3mAb、克隆OKT3。在一些情况下，除CD80和CD83以外，工程化K562细胞还可以表达膜形式的抗CD3 mAb、克隆OKT3、膜形式的抗CD28 mAb。在一些情况下，本公开的修饰的靶细胞可包括免疫细胞，例如T细胞或B细胞。免疫细胞可由免疫刺激剂刺激来扩增。举例来说，T细胞可通过与附着有可刺激CD3 TCR复合物相关信号的剂和可刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。具体地，可诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与有时与钙离子载体结合使用的蛋白激酶C活化因子(例如苔藓抑素)接触来刺激T细胞群。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，可使用结合辅助分子的配体。举例来说，T细胞群可在可以刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。在一些情况下，4-1BB可用于刺激细胞。举例来说，可以用4-1BB和IL-21或另一细胞因子刺激细胞。
为了刺激CD4 T细胞或CD8 T细胞的增殖，可使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。举例来说，提供信号的剂可以在溶液中或与表面偶联。在一些情况下，诸如T细胞的细胞可与剂包覆的珠子组合。每个珠子可以用抗CD3抗体或抗CD28抗体包覆，或在一些情况下，用两者的组合包覆。可使用任何珠子与细胞比。在一些情况下，珠子:细胞之比为5:1；2.5:1；1:1；1:2；1:5；1:2.5；或2:1。适用于修饰的T细胞增殖和生存力的免疫刺激剂包括但不限于白介素-2(IL-2)、IFN-g、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-21、IL-15、TGFβ和TNFα或其任何衍生物。
在一些情况下，可在制备修饰的细胞期间使用额外刺激方案。额外刺激可包括利用本文提供的免疫刺激剂的初始刺激。可对刺激进行定时，以使得在电穿孔之前、同时和/或之后刺激细胞。在一些情况下，细胞可能经受一次或多次刺激。在一些情况下，细胞可能经受利用抗体、其抗体片段和/或展示刺激性抗体或其片段的任何珠子中的任一者的1、2、3、4、5或至多约6次刺激。在一些情况下，额外刺激包括连续刺激。举例来说，在电穿孔之后，随后可使用本文提供的组合物和方法中的任一种，例如抗CD3和/或抗CD28，连续刺激细胞。与缺乏额外刺激的类似方法相比，额外刺激可增加细胞扩增。在一些情况下，在细胞电穿孔之后进行额外刺激，诸如第二刺激。在一些情况下，电穿孔之后立即进行第二刺激。在其他情况下，在电穿孔之后约5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时或至多约20小时进行第二刺激。额外刺激可进行任何时间长度。举例来说，额外刺激可进行约2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时或至多约50小时。在一些情况下，额外刺激为约24-48小时，或约30-40小时。在一些情况下，刺激包括电穿孔之前的第一刺激，然后是电穿孔之后的第二刺激。电穿孔的细胞可以用前述比率的珠子刺激，例如2:1或1:2.5(珠子:细胞)。
在一些情况下，可通过与组织或细胞共培养来活化或扩增靶细胞或修饰的靶细胞。细胞可为抗原呈递细胞或人工抗原呈递细胞。抗原呈递细胞(APC)可包括但不限于树突状细胞、巨噬细胞、B细胞和其他非专业APC。APC可在其表面上表达多种免疫刺激分子，诸如但不限于B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合IL-15、膜结合IL-17、膜结合IL-21、膜结合IL-2、截短CD19、其衍生物或其任何组合。
人工抗原呈递细胞(aAPC)可以表达T细胞受体和共刺激分子的配体，并且可活化和扩增T细胞以进行转移，同时在一些情况下提高其效力和功能。可对aAPC进行工程化以表达任何用于T细胞活化的基因。可对aAPC进行工程化以表达任何用于T细胞扩增的基因。aAPC可为珠子、细胞、蛋白质、抗体、细胞因子或任何组合。aAPC可将信号传递至可能经受基因组移植的细胞群。举例来说，aAPC可传递信号1、信号2、信号3或任何组合。信号1可为抗原识别信号。举例来说，信号1可为通过肽-MHC复合物进行的TCR的连接，或针对CD3的激动性抗体的结合，这可导致CD3信号转导复合物的活化。信号2可为共刺激信号。举例来说，共刺激信号可为分别与ICOS-L、CD70和4-1BBL结合的抗CD28、诱导型共刺激因子(ICOS)、CD27和4-1BB(CD137)。信号3可为细胞因子信号。
aAPC可为珠子。球形聚苯乙烯珠可包覆有针对CD3和CD28的抗体，并用于T细胞活化。珠子可具有任何大小。在一些情况下，珠子可为或可为约3微米和6微米。珠子大小可为或可为约4.5微米。可以任何细胞与珠子比率使用珠子。举例来说，可使用每毫升100万个细胞的3:1的珠子:细胞比率。aAPC也可为刚性球形颗粒；聚苯乙烯乳胶微珠；磁性纳米或微米颗粒；纳米级量子点；4，聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球，一种非球形颗粒；5，碳纳米管束；6，椭圆体PLGA微粒；7，纳米蠕虫，一种含流体脂质双层的系统；8，二维支持的脂质双层(2D-SLB)；9，脂质体；10，RAFT体/微结构域脂质体；11，SLB颗粒或其任何组合。
在一些情况下，aAPC可扩增CD4 T细胞。举例来说，可对aAPC进行工程化以模拟HLAII类限制性CD4 T细胞的抗原处理和呈递途径。可对K562进行工程化以表达HLA-D、DPα、DPβ链、Ii、DMα、DMβ、CD80、CD83或其任何组合。举例来说，可用HLA限制性肽对工程K562细胞进行脉冲，以便扩增HLA限制性抗原特异性CD4 T细胞。在一些情况下，aAPC的使用可以与外源引入的细胞因子组合用于T细胞活化、扩增或任何组合。细胞也可以体内扩增，例如在将修饰的细胞施用于受试者后在受试者的血液中扩增。
在一些情况下，本文提供的方法和组合物可包括基本上不含抗生素的细胞培养基。例如青霉素和链霉素的抗生素可仅包含于实验培养物中，可能不包含于待输注到受试者体内的细胞培养物中。术语“基本上不含抗生素的培养基”可指其中不含或几乎不含抗生素的培养基，例如具有0g/ml抗生素的培养基，或具有至多1μg/ml、至多0.5μg/ml、至多0.2μg/ml、至多100ng/ml、至多50ng/ml、至多20ng/ml、至多10ng/ml、至多5ng/ml、至多2ng/ml、至多1ng/ml、至多500pg/ml、至多200pg/ml、至多100pg/ml、至多50pg/ml、至多20pg/ml、至多10pg/ml、至多5pg/ml、至多2pg/ml、至多1pg/ml、至多500fg/ml、至多200fg/ml、至多100fg/ml、至多50fg/ml、至多20fg/ml、至多10fg/ml或至多1fg/ml抗生素的培养基。
在一些情况下，可在细胞转染后施加免疫刺激剂。在一些情况下，可在细胞转染完成后立即引入免疫刺激剂。在一些情况下，可在进行细胞转染的同时引入免疫刺激剂，例如，在进行电穿孔的同时施加，或在细胞仍暴露于转染试剂时施加。在一些情况下，可在转染后数分钟至数小时引入免疫刺激剂。细胞转染完成与免疫刺激剂施加之间的时间延迟可为约30秒、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约1.5小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约7.5小时、约8小时、约10小时、约12小时、约20小时、约30小时、约40小时、约50小时、约60小时、约70小时、约80小时、约90小时或约1周。在一些情况下，时间延迟可能甚至更长。
在一些情况下，可在细胞转染之前施加免疫刺激剂。在某些情况下，在转染之前的一段时间内，免疫刺激剂可存在于细胞培养物中。免疫刺激剂可在细胞转染之前和之后都存在。
免疫刺激剂可在培养基中以约20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、600pg/ml、700pg/ml、800pg/ml、900pg/ml、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、12ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、750ng/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml或这些值中任意两个之间的一个大约值的浓度供应。免疫刺激剂可在培养基中以约5ng/mL的浓度供应。免疫刺激剂可在培养基中供应，并且含有免疫刺激剂的培养基可约每6小时、12小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、40小时、44小时、48小时、50小时、60小时更换一次。频繁更换培养基可使免疫刺激剂浓度维持在一定水平。
如本领域技术人员将了解，免疫刺激剂的选择、免疫刺激剂的浓度以及免疫刺激剂孵育的时间和持续时间可根据如上文所讨论的许多参数而变化。
在一些情况下，可以用免疫刺激剂处理/孵育细胞一段时间。孵育时间可为至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟或至少约60分钟。孵育时间可为至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约7.5小时、至少约8小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约20小时、至少约30小时、至少约40小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时或至少约1周。在一些情况下，孵育时间可为至少1周、至少2周、至少3周或甚至更长。
双链断裂修复调节子
本文提供了提高细胞工程化的总产率的方法，包括例如提高细胞工程化后的细胞生存力和/或提高转染效率，所述方法包括使基因修饰的细胞与足量的至少一种DNA双链断裂修复调节子接触。在一些情况下，与足量的至少一种DNA双链断裂修复调节子接触一段足够长的时间可以增加细胞生存力。在一些情况下，与足量的至少一种DNA双链断裂修复调节子接触一段时间可以增加转染效率。在一些情况下，与足量的至少一种DNA双链断裂修复调节子接触一段足够长的时间可以增加细胞生存力和转染效率两者。
在一些情况下，DNA双链断裂修复调节子可包括参与DNA双链断裂修复的蛋白质。在一些情况下，DNA双链断裂修复调节子可包括化合物。双链断裂修复调节子可为人的、非人的和/或合成的。在一些情况下，双链断裂修复调节子是人的。在一些情况下，双链断裂修复调节子是非人的。合适的非人来源包括以下非限制性物种中的任一种：大鼠、小鼠、驴、猪、牛、狗、猫、雪貂、猴子、山羊、绵羊、鱼或其任何组合。
可用于提高基因组编辑的参与DNA双链断裂修复的蛋白质的非限制性实例可包括Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K、其同源物和衍生物、Scr7及其任何组合。在一些情况下，可用于提高基因组编辑的参与DNA双链断裂修复的蛋白质可包括RAD51。在一些情况下，可用于提高基因组编辑的参与DNA双链断裂修复的蛋白质可包括RS-1。可使用RS-1或RAD51的蛋白质。也可使用编码RS-1或RAD-51的多核苷酸。也可使用RS-1或RAD-51的mRNA。
在一些情况下，如本文所述的基因组编辑可包括插入转基因。转基因通常与其所在的基因组序列不同。插入转基因通常涉及靶基因组序列的切除，从而导致DNA双链断裂。在一些情况下，涉及如Ku70和Ku80的蛋白质的非同源末端连接(NHEJ途径)以及涉及如BRCA、BRCA2和Rad51的蛋白质的同源重组途径(HR途径)在细胞中的双链断裂事件期间被活化。在一些情况下，如本文所述的DNA双链断裂修复调节子可包括HR增强子。HR增强子可促进同源重组介导的DNA双链断裂修复。在一些情况下，HR增强子可抑制NHEJ介导的DNA双链断裂修复。在一些情况下，如本文所述的DNA双链断裂修复调节子可包括NHEJ增强子。NHEJ增强子可促进NHEJ介导的DNA双链断裂修复。在一些情况下，NHEJ增强子可抑制HR介导的DNA双链断裂修复。
如本文所述的转基因可通过同源重组引入基因组。在一些情况下，转基因可由同源臂侧接。在一些情况下，同源臂可包含将转基因靶向所需整合位点的互补区域。在一些情况下，供体转基因可含有由两个同源区域侧接的非同源序列，以允许在感兴趣的位置处进行有效的HDR。另外，转基因序列可包含载体分子，其含有不与细胞染色质中的感兴趣区域同源的序列。转基因可含有若干个与细胞染色质同源的不连续区域。举例来说，为了靶向插入通常不存在于感兴趣区域中的序列，序列可存在于供体核酸分子中并由与感兴趣区域中的序列同源的区域侧接。
转基因可由同源臂侧接，其中臂与其互补序列之间的同源性程度足以允许两者之间的同源重组。举例来说，臂与其互补序列之间的同源性程度可为50％或更高。两个同源的不同序列可为任何长度，并且其非同源性程度可以小至单个核苷酸(例如，用于通过靶向同源重组校正基因组点突变)或大至10或更多千个碱基(例如，用于在染色体中的预定异位位点插入基因)。两个包含同源的不同序列的多核苷酸不需要是相同的长度。任何其他基因，例如本文所述的基因可用于产生重组臂。
转基因也可由与基因组中所靶向的双链断裂区域互补的工程化位点侧接。在一些情况下，工程化位点不是同源臂。工程化位点可与双链断裂区域具有同源性。工程化位点可与基因具有同源性。工程化位点可与编码基因组区域具有同源性。工程化位点可与非编码基因组区域具有同源性。在一些情况下，可以从多核酸中切除转基因，以便将其在没有同源重组的情况下插入双链断裂区域。转基因可以在没有同源重组的情况下整合到双链断裂中。
在一些情况下，同源重组HR增强子可用于抑制非同源末端连接(NHEJ)。非同源末端连接可导致双链断裂末端的核苷酸丢失；非同源末端连接也可能导致移码。在一些情况下，同源性定向修复在敲入基因时使用可能是一种更具吸引力的机制。为了抑制非同源末端连接，可递送HR增强子。在一些情况下，可递送超过一种HR增强子。HR增强子可抑制参与非同源末端连接的蛋白质，例如KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。在一些情况下，可递送诸如Scr7的连接酶IV抑制剂。在一些情况下，HR增强子可为L755507。在一些情况下，可使用不同的连接酶IV抑制剂。在一些情况下，HR增强子可为腺病毒4蛋白，例如E1B55K和/或E4orf6。在一些情况下，可使用化学抑制剂。
可通过使用多种方法抑制非同源末端连接分子，诸如KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。举例来说，可通过基因沉默抑制非同源末端连接分子，诸如KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。举例来说，在因子转录或翻译期间可通过基因沉默抑制非同源末端连接分子KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。也可通过因子降解抑制非同源末端连接分子KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。也可抑制非同源末端连接分子KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。KU70、KU80和/或DNA连接酶IV的抑制剂可包括E1B55K和/或E4orf6。也可通过螯合作用抑制非同源末端连接分子KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。可通过敲除、改变基因的启动子和/或通过施用针对因子的干扰RNA来抑制基因表达。
在一些情况下，插入可包括同源性定向修复。在一些情况下，可以使用HR的增强子，诸如RS-1。RS-1可以添加到细胞培养物的培养基中。RS-1可以增加核酸酶介导的外源多核酸整合到基因组中的效率。举例来说，RS-1可以提高TCR序列通过同源重组整合到细胞基因组中的效率。RS-1还可以增加细胞工程化后细胞的生存力。RS-1蛋白或其部分可以约3μM至约12μM的浓度引入细胞群。RS-1蛋白或其部分可以约7μM至约8μM的浓度引入细胞群。在一些情况下，RS-1蛋白或其部分可以约3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM或至多约12μM的浓度引入细胞群。在一些情况下，可以利用RS-1途径中的下游因子。RS-1(3-((苄氨基)磺酰基)-4-溴-N-(4-溴苯基)苯甲酰胺)可刺激RAD51，所述RAD51是HR复合物中的参与者。在一些情况下，调节RAD51相互作用因子，诸如PALB2(BRCA2的配偶体和定位子)、Nap1(核小体组装蛋白1)、p400 ATP酶、EVL(Ena/Vasp样)等也可导致核酸酶介导的基因靶向中的整合频率增强。举例来说，可将RAD51引入细胞培养物以提高外源序列到细胞基因组中的整合。
Rad51可通过多种方法协助HR。举例来说，HR可能依赖性模板的可用性，所述模板在细胞周期的S期合成。乳腺癌易感基因(BRCA2)和细菌RecA重组酶的结构和功能同源物Rad51可用于HR对DSB的无错误修复。检测到DSB之后，BRCA2将Rad51募集至DSB的接合点处。在一些情况下，可将Rad 51蛋白或其部分以约100ng至约20μg的浓度引入细胞群。举例来说，可将Rad 51以约100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、17μg、18μg、19μg或至多约20μg引入细胞群。
在一些情况下，同源重组的增强子可为N-乙酰-半胱氨酸(NAC)。NAC可为一种含硫醇的化合物，其与活性亲电试剂和自由基发生非酶促相互作用并解毒。在一些情况下，可将NAC引入细胞培养物中。举例来说，NAC可在电穿孔之前、在电穿孔期间或在电穿孔之后引入。在其他情况下，NAC可在扩增步骤期间与细胞一起培养。在一些情况下，可将编码NAC的载体引入细胞。NAC可在培养基中以约1μM、5μM、10μM、20μM、50μM、75μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、12mM、14mM、15mM、16mM、18mM、20mM、22mM、24mM、25mM、26mM、28mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、75mM、100mM、200mM、500mM、750mM、1M、10M、100M或这些值中任意两个之间的一个大约值的浓度供应。NAC可在培养基中以约10mM的浓度供应。
增强子可为参与双链断裂修复的蛋白质。参与双链断裂修复的蛋白质可为MRE11、RAD50、NBS1(XRS2)复合物、BRCA1、组蛋白H2AX、PARP-1、RAD18、DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)和ATM。在一些情况下，增强子可为AKT或可参与AKT途径。AKT可参与NHEJ介导的双链断裂修复。在一些情况下，AKT1可通过诱导Brca1和Rad51的细胞质易位来抑制HR。AKT，也称为蛋白激酶B(PKB)，属于cAMP依赖性、cGMP依赖性、蛋白激酶C激酶家族。AKT家族可具有3种进化上保守的同工型：AKT1(PKBα)(包括3个剪接变体)、AKT2(PKBβ)和AKT3(PKBγ)(包括2个剪接变体)。生长因子和细胞因子，诸如IL-2，可与跨膜受体结合并刺激脂质酶磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族成员的活性，所述PI3K家族成员可磷酸化磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)以在质膜处产生PIP3。PIP3可构成含有普列克底物蛋白(pleckstrin)同源(PH)结构域的蛋白质(诸如AKT和PDK1)的结合位点，从而将它们募集到膜上。在一些情况下，可将PI3K家族成员引入细胞以增强外源序列的整合。
在一些情况下，可抑制AKT。通过选择性化学抑制剂或AKT siRNA抑制AKT可以恢复DNA损伤诱导的RPA、CtIP、Rad51和Chk1活化的募集。在一些情况下，生长因子、细胞因子或两者的阻断可抑制AKT途径。在一些情况下，生长因子、细胞因子或两者，例如抗IFNAR2抗体(针对人干扰素(α、β和ω)受体2的抗体)的阻断可促进HR介导的DNA双链断裂修复。IFNAR2抗体可在培养基中以约100pg/ml、500pg/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、750ng/ml、1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、18μg/ml、20μg/ml、22μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、500mg/ml、1g/ml或这些值中任意两个之间的一个大约值的浓度供应。IFNAR2抗体可在培养基中以约10μg/ml的浓度供应。
抑制非同源末端连接的HR增强子可与质粒DNA一起递送。有时，质粒可为双链DNA分子。质粒分子也可为单链DNA。质粒还可携带至少一个基因。质粒还可携带超过一个基因。也可使用至少一种质粒。也可使用超过一种质粒。抑制非同源末端连接的HR增强子可以与质粒DNA以及CRISPR-Cas、引物和/或改性剂化合物一起递送。改性剂化合物可降低质粒DNA的细胞毒性并提高细胞生存力。可在基因组工程化之前将HR增强子和改性剂化合物引入细胞。HR增强子可为小分子。在一些情况下，可将HR增强子递送至T细胞混悬液中。HR增强子可提高用双链DNA转染的细胞的生存力。
抑制非同源末端连接的HR增强子可与待整合的HR底物一起递送。底物可为多核酸。多核酸可包含TCR转基因。多核酸可作为mRNA递送。多核酸可包含基因组内源区域的同源臂，用于整合TCR转基因。多核酸可为载体。载体可以有义或反义方向插入另一载体(例如，病毒载体)中。在病毒基因组的5'LTR区的上游，可以放置T7、T3或其他转录起始序列以用于病毒盒的体外转录。然后，此载体盒可用作mRNA体外转录的模板。举例来说，当这种mRNA与其同源逆转录酶一起递送(也以mRNA或蛋白质的形式递送)到任何细胞时，然后，单链mRNA盒可用作模板来产生双链DNA(dsDNA)形式的数百到数千个拷贝，所述拷贝可用作所需同源重组事件的HR底物，以将转基因盒整合到基因组中的预期靶位点处。这种方法可以避免为CRISPR介导的同源重组递送毒性质粒DNA的需要。另外，由于每个mRNA模板均可制成数百或数千个dsDNA拷贝，因此细胞内可用的同源重组模板的量可能非常高。大量同源重组模板可驱动所需的同源重组事件。此外，mRNA还可产生单链DNA。单链DNA也可用作同源重组的模板，例如通过重组AAV(rAAV)基因靶向。mRNA可原位逆转录成DNA同源重组HR增强子。这种策略可避免质粒DNA的毒性递送。另外，mRNA可将同源重组底物扩增到比质粒DNA更高的水平，且/或可提高同源重组的效率。如果细胞中仅发生单链DNA的强逆转录，那么可以引入编码病毒载体的有义链和反义链两者的mRNA。在这种情况下，两条mRNA链都可以在细胞内进行逆转录和/或自然退火以产生dsDNA。
抑制非同源末端连接的HR增强子可以化学抑制剂形式递送。举例来说，HR增强子可以通过干扰连接酶IV-DNA结合来发挥作用。HR增强子还可以活化内在凋亡途径。HR增强子还可为连接酶IV抑制剂的肽模拟物。HR增强子还可以与Cas9系统共表达。HR增强子还可以与病毒蛋白，诸如E1B55K和/或E4orf6共表达。HR增强子还可为SCR7、L755507或其任何衍生物。HR增强子可与降低外源DNA插入的毒性的化合物一起递送。
在一些情况下，同源重组HR增强子可用于抑制非同源末端连接。在一些情况下，同源重组HR增强子可用于促进同源定向修复。在一些情况下，同源重组HR增强子可用于促进CRISPR-Cas双链断裂后的同源定向修复。在一些情况下，同源重组HR增强子可用于促进CRISPR-Cas双链断裂以及一个或多个基因的敲入和敲除之后的同源定向修复。
使用HR增强子的HR效率的增加可为或可为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。使用HR增强子的NHEJ的降低可为或可为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
与DNA双链断裂修复调节子的接触可导致细胞生存力增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％或甚至更多。在一些情况下，细胞生存力的增加可为约50％至约200％。与DNA双链断裂修复调节子的接触可导致整合效率增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％或甚至更多。在一些情况下，整合效率的增加可为约50％至约200％。
在一些情况下，可在细胞转染后施加DNA双链断裂修复调节子。在一些情况下，可在细胞转染完成后立即引入DNA双链断裂修复调节子。在一些情况下，可在进行细胞转染的同时引入DNA双链断裂修复调节子，例如，在进行电穿孔的同时施加，或在细胞仍暴露于转染试剂时施加。在一些情况下，可在转染后数分钟至数小时引入DNA双链断裂修复调节子。细胞转染完成与DNA双链断裂修复调节子施加之间的时间延迟可为约30秒、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约1.5小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约7.5小时、约8小时、约10小时、约12小时、约20小时、约30小时、约40小时、约50小时、约60小时、约70小时、约80小时、约90小时或约1周。在一些情况下，时间延迟可能甚至更长。
在一些情况下，可在细胞转染之前施加DNA双链断裂修复调节子。在某些情况下，在转染之前的一段时间内，DNA双链断裂修复调节子可存在于细胞培养物中。DNA双链断裂修复调节子可在细胞转染之前和之后都存在。
DNA双链断裂修复调节子可在培养基中供应，并且含有DNA双链断裂修复调节子的培养基可约每6小时、12小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、40小时、44小时、48小时、50小时、60小时更换一次。频繁更换培养基可使DNA双链断裂修复调节子浓度维持在一定水平。
如本领域技术人员将了解，DNA双链断裂修复调节子的选择、DNA双链断裂修复调节子的浓度以及DNA双链断裂修复调节子孵育的时间和持续时间可根据如上文所讨论的许多参数而变化。
在一些情况下，可以用DNA双链断裂修复调节子处理/孵育细胞一段时间。孵育时间可为至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟或至少约60分钟。孵育时间可为至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约7.5小时、至少约8小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约20小时、至少约30小时、至少约40小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时或至少约1周。在一些情况下，孵育时间可为至少1周、至少2周、至少3周或甚至更长。
小环和线性化双链DNA构建体
本文提供了提高细胞工程化的总产率的方法，包括例如提高细胞工程化后的细胞生存力和/或提高转染效率，所述方法包括使细胞群与编码转基因的小环载体接触，从而产生修饰的细胞群。
本文还提供了提高细胞工程化的总产率的方法，包括例如提高细胞工程化后的细胞生存力和/或提高转染效率，所述方法包括使细胞群与编码转基因的线性化双链DNA构建体接触，从而产生修饰的细胞群。
本公开的一个方面提供了一种基因组编辑的方法，所述方法包括将编码转基因的小环载体引入细胞群，从而产生修饰的细胞群。本公开的一个方面提供了一种基因组编辑的方法，所述方法包括将编码转基因的线性化双链DNA构建体引入细胞群，从而产生修饰的细胞群。
在一些情况下，可将外源多核酸(例如，转基因)在小环载体中引入细胞中。如本文所用的术语“小环”可指不含大部分(如果不是全部的话)原核载体部分(例如，控制序列和其他原核来源的非功能序列)的小环状质粒衍生物。希望受某种理论的束缚，最小化外源核酸的大小可降低细胞毒性并潜在地提高整合效率。在一些情况下，本文提供的包括将编码转基因的小环载体引入细胞的方法可增加细胞生存力。在一些情况下，本文提供的包括将编码转基因的小环载体引入细胞的方法可增加整合效率。
小环载体的大小可为约1.5kb、约2kb、约2.2kb、约2.4kb、约2.6kb、约2.8kb、约3kb、约3.2kb、约3.4kb、约3.6kb、约3.8kb、约4kb、约4.2kb、约4.4kb、约4.6kb、约4.8kb、约5kb、约5.2kb、约5.4kb、约5.6kb、约5.8kb、约6kb、约6.5kb、约7kb、约8kb、约9kb、约10kb、约12kb、约25kb、约50kb或这些数字中任意两个之间的一个值。有时，本文提供的小环的大小可为至多2.1kb、至多3.1kb、至多4.1kb、至多4.5kb、至多5.1kb、至多5.5kb、至多6.5kb、至多7.5kb、至多8.5kb、至多9.5kb、至多11kb、至多13kb、至多15kb、至多30kb或至多60kb。
小环载体浓度可为约0.5纳克(ng)至约50μg。小环载体浓度可为约0.5ng至约50μg、约1ng至约25μg、约5ng至约10μg、约10ng至约5μg、约20ng至约1μg、约50ng至500ng或约100ng至250ng。
在一些情况下，可将外源多核酸(例如，转基因)在线性化双链DNA(dsDNA)构建体中引入细胞中。在一些情况下，本文提供的包括将编码转基因的线性化dsDNA构建体引入细胞的方法可增加细胞生存力。在一些情况下，本文提供的包括将编码转基因的线性化dsDNA构建体引入细胞的方法可增加整合效率。
线性化dsDNA构建体的大小可为至少500bp、至少750bp、至少1kb、至少1.1kb、至少1.2kb、至少1.3kb、至少1.4kb、至少1.5kb、至少1.6kb、至少1.7kb、至少1.8kb、至少1.9kb、至少2kb或甚至更大。线性化dsDNA构建体的大小可为约500bp、约750bp、约1kb、约1.1kb、约1.2kb、约1.3kb、约1.4kb、约1.5kb、约1.6kb、约1.7kb、约1.8kb、约1.9kb或约2kb。
线性化dsDNA构建体浓度可为约0.5纳克(ng)至约50μg。线性化dsDNA构建体浓度可为约0.5ng至约50μg、约1ng至约25μg、约5ng至约10μg、约10ng至约5μg、约20ng至约1μg、约50ng至500ng或约100ng至250ng。
小环载体或双链线性化构建体可含有如上文所讨论的转基因。小环或双链线性化构建体可包含任何核苷酸序列，例如任何感兴趣的基因。小环或双链线性化构建体可包含编码细胞受体的转基因。细胞受体可包括但不限于TCR、BCR、CAR及其任何组合。小环或双链线性化构建体可包含编码如上文所讨论的TCR的转基因。
核酸酶系统
可使用核酸酶进行基因编辑，包括CRISPR相关蛋白(Cas蛋白，例如Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或兆核酸酶。核酸酶(例如，内切核酸酶)可为天然存在的核酸酶、基因修饰的和/或重组的核酸酶。也可以使用基于转座子的系统(例如，PiggyBac，睡美人(Sleeping beauty))进行基因编辑。举例来说，可以使用转座酶进行基因编辑。
CRISPR系统
在一些实施方案中，本文所述的方法使用CRISPR系统。存在至少五种类型的CRISPR系统，它们都并入了RNA和Cas蛋白。I型、III型和IV型组装了一种多Cas蛋白复合物，其能够裂解与crRNA互补的核酸。I型和III型都需要在将处理后的crRNA组装成多Cas蛋白复合物之前进行预crRNA处理。II型和V型CRISPR系统包含与至少一种指导RNA复合的单个Cas蛋白。合适的核酸酶包括但不限于CRISPR相关(Cas)蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关(Cas)多肽、II型CRISPR相关(Cas)多肽、III型CRISPR相关(Cas)多肽、IV型CRISPR相关(Cas)多肽、V型CRISPR相关(Cas)多肽和VI型CRISPR相关(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)；兆核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；Argonaute蛋白；其任何衍生物；其任何变体；及其任何片段。
CRISPR系统的一般机制和最新进展在Cong,L.等,“Multiplex genomeengineering using CRISPR systems,”Science,339(6121):819-823(2013)；Fu,Y.等,“High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases inhuman cells,”Nature Biotechnology,31,822–826(2013)；Chu,VT等“Increasing theefficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise geneediting in mammalian cells,”Nature Biotechnology 33,543–548(2015)；Shmakov,S.等,“Discovery and functional characterization of diverse Class 2CRISPR-Cassystems,”Molecular Cell,60,1-13(2015)；Makarova,KS等,“An updated evolutionaryclassification of CRISPR-Cas systems,”,Nature Reviews Microbiology,13,1-15(2015)中讨论。靶DNA的位点特异性裂解在通过以下两者确定的位置处发生：1)指导RNA与靶DNA(也称为原间隔序列)之间的碱基配对互补性，以及2)靶DNA中的短基序，称为原间隔序列邻近基序(PAM)。举例来说，工程化细胞可使用CRISPR系统(例如，II型CRISPR系统)产生。本文公开的方法中所用的Cas酶可为催化DNA裂解的Cas9。来源于酿脓链球菌的Cas9或任何密切相关的Cas9的酶促作用可在靶位点序列处产生双链断裂，所述靶位点序列与指导序列的20个核苷酸杂交，并且在靶序列的20个核苷酸之后具有原间隔序列邻近基序(PAM)。
Cas蛋白
载体可以可操作地连接至编码CRISPR酶(诸如Cas蛋白(CRISPR-相关蛋白))的酶编码序列。Cas蛋白的非限制性实例包括但不限于Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1或Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰型式。在一些实施方案中，Cas酶是未修饰的。在一些实施方案中，CRISPR酶在靶序列处，诸如在靶序列内和/或在靶序列的互补序列内，指导一条或两条链的裂解。举例来说，CRISPR酶可指导从靶序列的第一个核苷酸或最后一个核苷酸开始的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对内或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对内的一条或两条链的裂解。在一些实施方案中，CRISPR酶相对于对应的野生型酶发生突变，使得可以使用缺乏裂解含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力的突变的CRISPR酶。在一些实施方案中，Cas蛋白是高保真cas蛋白，诸如Cas9HiFi。
Cas9是指Cas9蛋白的野生型或修饰形式，其可包含氨基酸变化，诸如缺失、插入、取代、变异、突变、融合、嵌合或其任何组合。在一些实施方案中，编码内切核酸酶(例如，Cas蛋白，诸如Cas9)的多核苷酸被密码子优化以在特定细胞诸如真核细胞中表达。这种类型的优化可能需要外来(例如，重组)DNA突变以模拟预期的宿主生物体或细胞的密码子偏好同时编码相同蛋白质。在一些实施方案中，内切核酸酶包含与野生型示例性定点多肽的核酸酶结构域(例如来自酿脓链球菌的Cas9)具有至少或至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
可将任何功能浓度的Cas蛋白引入细胞。举例来说，可将15微克的Cas mRNA引入细胞。在其他情况下，Cas mRNA可以0.5微克至100微克引入。Cas mRNA可以0.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100微克引入。
在一些实施方案中，编码CRISPR酶的载体包含一个或多个核定位序列(NLS)，诸如可使用超过或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个NLS。举例来说，CRISPR酶可包含在氨基末端处或附近的超过或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个NLS，在羧基末端处或附近的超过或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个NLS，或这些的任何组合(例如，在氨基末端处的一个或多个NLS和在羧基末端处的一个或多个NLS)。当存在超过一个NLS时，可以独立于其他NLS选择每个NLS，使得单个NLS可以超过一个拷贝存在和/或以一个或多个拷贝与一个或多个其他NLS组合存在。在一些实施方案中，所述方法中所用的CRISPR酶包含NLS。NLS可位于多肽链内的任何位置，例如靠近N末端或C末端。举例来说，NLS可沿多肽链在从N末端或C末端开始的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个氨基酸内或约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个氨基酸内。有时NLS可在从N末端或C末端开始的50个氨基酸或更多个氨基酸内或约50个氨基酸或更多个氨基酸内，例如，100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个氨基酸。
NLS的非限制性实例包括来源于以下的NLS序列：SV40病毒大T抗原的NLS，其具有氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO:2)；来自核质蛋白的NLS(例如，具有序列KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:63)的核质蛋白二分NLS)；具有氨基酸序列PAAKRVKLD(SEQID NO:64)或RQRRNELKRSP(SEQ ID NO:65)的c-mycNLS；具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO:66)的hRNPA1 M9 NLS；来自输入蛋白-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:67)；肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP(SEQ ID NO:68)和PPKKARED(SEQ ID NO:69)；人p53的序列PQPKKKPL(SEQ ID NO:70)；小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:71)；流感病毒NS1的序列DRLRR(SEQID NO:72)和PKQKKRK(SEQ ID NO:73)；肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:74)；小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR(SEQ ID NO:75)；人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO:76)；以及类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:77)。
指导RNA
如本文所用，术语“指导RNA(gRNA)”及其语法对等词是指可对靶DNA具有特异性并且可与Cas蛋白形成复合物的RNA。指导RNA可包含指导序列或间隔子序列，所述指导RNA指定靶位点并将RNA/Cas复合物引导至指定靶DNA以进行裂解。靶DNA的位点特异性裂解在通过以下两者确定的位置处发生：1)指导RNA与靶DNA(也称为原间隔序列)之间的碱基配对互补性，以及2)靶DNA中的短基序，称为原间隔序列邻近基序(PAM)。
本文公开的方法可包括将至少一种指导RNA或核酸，例如编码至少一种指导RNA的DNA，引入细胞或胚胎中。指导RNA可与RNA指导的内切核酸酶相互作用以将内切核酸酶引导至特定靶位点，在所述位点处，指导RNA的5'端与染色体序列中的特定原间隔序列碱基配对。
在一些实施方案中，指导RNA包括两种RNA，例如，CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一些实施方案中，指导RNA包括通过crRNA和tracrRNA的一部分(例如，功能部分)融合而形成的单指导RNA(sgRNA)。指导RNA也可为包含crRNA和tracrRNA的双重RNA。指导RNA可包括crRNA但缺少tracrRNA。此外，crRNA可与靶DNA或原间隔序列杂交。
如上文所讨论的，指导RNA可为表达产物。举例来说，编码指导RNA的DNA可为包含编码指导RNA的序列的载体。指导RNA可通过用分离的指导RNA或包含编码指导RNA的序列和启动子的质粒DNA转染细胞或生物体而转移到细胞或生物体中。指导RNA也可通过其他方式转移到细胞或生物体中，诸如使用病毒介导的基因递送。
可分离指导RNA。举例来说，指导RNA可以分离的RNA的形式转染到细胞或生物体中。可使用任何体外转录系统通过体外转录制备指导RNA。指导RNA可以分离的RNA的形式而不是以包含指导RNA的编码序列的质粒的形式转移到细胞中。
在一些实施方案中，指导RNA包含DNA靶向区段和蛋白质结合区段。DNA靶向区段(或DNA靶向序列，或间隔子序列)包含可与靶DNA内的特定序列(例如，原间隔序列)互补的核苷酸序列。蛋白质结合区段(或蛋白质结合序列)可与定点修饰多肽相互作用，例如RNA指导的内切核酸酶，诸如Cas蛋白。“区段”意指分子的区段/部分/区域，例如RNA中的一段连续核苷酸。区段还可意指复合物的区域/部分，使得区段可包含超过一个分子的区域。举例来说，在一些情况下，DNA靶向RNA的蛋白质结合区段为一个RNA分子并且因此蛋白质结合区段包含所述RNA分子的区域。在其他情况下，DNA靶向RNA的蛋白质结合区段包含两个沿着具有互补性的区域杂交的独立分子。
在一些实施方案中，指导RNA包含两个独立RNA分子或单个RNA分子。示例性单个分子指导RNA包含DNA靶向区段和蛋白质结合区段。
示例性双分子DNA靶向RNA可包括crRNA样(“CRISPR RNA”或“靶向物-RNA”或“crRNA”或“crRNA重复”)分子和对应的tracrRNA样(“反式作用型CRISPR RNA”或“活化因子-RNA”或“tracrRNA”)分子。第一RNA分子可为crRNA样分子(靶向物-RNA)，其可包含DNA靶向区段(例如，间隔子)和可形成双链RNA(dsRNA)双链体的一半的一段核苷酸，所述双链体包含指导RNA的蛋白质结合区段。第二RNA分子可为对应tracrRNA样分子(活化因子-RNA)，其可包含可形成指导RNA的蛋白质结合区段的dsRNA双链体的另一半的一段核苷酸。换言之，crRNA样分子的一段核苷酸可与tracrRNA样分子的一段核苷酸互补并可与其杂交以形成指导RNA的蛋白质结合结构域的dsRNA双链体。因此，每个crRNA样分子均可被称为具有对应的tracrRNA样分子。crRNA样分子可额外地提供单链DNA靶向区段或间隔子序列。因此，crRNA样分子与tracrRNA样分子(作为对应对)可杂交以形成指导RNA。主题双分子指导RNA可包含任何对应的crRNA与tracrRNA对。
在一些实施方案中，指导RNA的DNA靶向区段或间隔子序列与染色体序列中的靶位点处的序列(例如，原间隔序列)互补，使得指导RNA的DNA靶向区段可与靶位点或原间隔序列碱基配对。在一些情况下，指导RNA的DNA靶向区段包含或包含约10个核苷酸至或至约25个或更多个核苷酸。举例来说，指导RNA的第一区域与染色体序列中的靶位点之间的碱基配对区域的长度可为或可为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25个或超过25个核苷酸。在一些实施方案中，指导RNA的第一区域的长度为约19、20或21个核苷酸。
在一些实施方案中，指导RNA靶向或靶向约20个核苷酸的核酸序列。靶核酸可少于或少于约20个核苷酸。靶核酸可为至少或至少约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸可为至多或至多约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸序列可为或可为约20个紧邻PAM的第一核苷酸的5'的碱基。指导RNA可靶向核酸序列。
指导核酸(例如，指导RNA)可指可与另一核酸(例如，细胞基因组中的靶核酸或原间隔序列)杂交的核酸。指导核酸可为RNA。指导核酸可为DNA。指导核酸可被编程或设计以与核酸序列位点特异性结合。指导核酸可包含多核苷酸链并且可称为单指导核酸。指导核酸可包含两条多核苷酸链并且可称为双指导核酸。
指导核酸可与基因组位点(诸如表1中提供的内源基因)杂交。在其他情况下，指导核酸可与包含插入转基因的构建体杂交，例如如图1A-图1C中所示例的。在一些方面，指导核酸与非人序列杂交。举例来说，在其中指导核酸与包含插入物的构建体杂交的情况下，所述指导核酸可能对非人序列，诸如异种序列或合成序列，具有特异性。在一些情况下，非人序列是芝诺基因(zenogeneic)。异种序列可获自任何非人来源，包括但不限于鱼、牛、猫、山羊、猴、猪、狗、马、绵羊、鸟、雪貂、仓鼠、兔、蛇或其组合。在一些情况下，异种序列来自鱼，并且鱼是斑马鱼。
在其他情况下，为简化靶向构建体设计和/或允许通过CRISPR核酸酶(例如Cas9)在体内一致、可重复地释放供体转基因负载物，可以使用通用的指导RNA序列UgRNA，并所述UgRNA在Wierson等,2019中描述。在一些情况下，通用指导物可包括使用CRISPRScan(例如，如Moreno-Mateos等,2015中所提供的)的最佳碱基组成。示例性通用UgRNA可能不包含异种基因组(诸如斑马鱼、猪或人基因组)中的预测靶标。当使用通用指导物时，可在例如指导多核酸的靶位点处和/或整合到斑马鱼noto基因中的荧光报告基因中的靶位点处显示有效的双链断裂诱导和同源性介导的修复(Wierson等,2019a)。
指导核酸可包含一种或多种修饰以提供具有新的或增强的特征的核酸。指导核酸可包含核酸亲和标签。指导核酸可包括合成核苷酸、合成核苷酸类似物、核苷酸衍生物和/或修饰的核苷酸。
指导核酸可例如在5'末端或3'末端处或附近包含核苷酸序列(例如，间隔子)，所述核苷酸序列可与靶核酸(例如，原间隔序列)中的序列杂交。指导核酸的间隔子可通过杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。间隔子序列可与位于原间隔序列邻近基序(PAM)的5'或3'的靶核酸杂交。间隔子序列的长度可为至少或至少约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。间隔子序列的长度可为至多或至多约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。
指导RNA还可包含形成二级结构的dsRNA双链体区域。举例来说，由指导RNA形成的二级结构可包含茎(或发夹)和环。环和茎的长度可变化。举例来说，环的长度可在约3个核苷酸至约10个核苷酸范围内，而茎的长度可在约6个碱基对至约20个碱基对范围内。茎可包含一个或多个1个核苷酸至约10个核苷酸的凸起。第二区域的总长度可在约16个核苷酸至约60个核苷酸的长度范围内。举例来说，环的长度可为或可为约4个核苷酸，并且茎可为或可为约12个碱基对。dsRNA双链体区域可包含可与RNA结合蛋白(诸如RNA指导的核内切酸酶，例如Cas蛋白)形成复合物的蛋白质结合区段。
指导RNA还可在5'或3'端包含尾区，所述尾区可基本上是单链的。举例来说，尾区有时与感兴趣的细胞中的任何染色体序列均不互补，并且有时与指导RNA的其余部分不互补。此外，尾区的长度可以变化。尾区的长度可多于或多于约4个核苷酸。举例来说，尾区的长度可在或在约5个核苷酸至或至约60个核苷酸长度范围内。
指导RNA可作为RNA分子引入细胞或胚胎中。举例来说，RNA分子可在体外转录和/或可化学合成。然后，指导RNA可作为RNA分子引入细胞或胚胎中。指导RNA也可以非RNA核酸分子(例如，DNA分子)的形式引入细胞或胚胎中。举例来说，可将编码指导RNA的DNA可操作地连接至启动子控制序列，用于有在感兴趣的细胞或胚胎中表达指导RNA。RNA编码序列可以可操作地连接至由RNA聚合酶III(Pol III)识别的启动子序列。
编码指导RNA的DNA分子也可以是线性的。编码指导RNA的DNA分子也可以是环状的。编码指导RNA的DNA序列也可以是载体的一部分。载体的一些实例可包括质粒载体、噬菌粒、黏粒、人工/微型染色体、转座子和病毒载体。举例来说，编码RNA引导的内切核酸酶的DNA存在于质粒载体中。合适的质粒载体的其他非限制性实例包括pUC、pBR322、pET、pBluescript及其变体。此外，载体可包含额外的表达控制序列(例如，增强子序列、Kozak序列、聚腺苷酸化序列、转录终止序列等)、选择性标记序列(例如，抗生素抗性基因)、复制起点等。
当RNA指导的内切核酸酶和指导RNA都作为DNA分子引入细胞时，每个都可以是独立分子的一部分(例如，一个载体含有融合蛋白编码序列，而另一个载体含有指导RNA编码序列)或两者可以是同一分子的一部分(例如，一个载体含有融合蛋白和指导RNA两者的编码(和调节)序列)。
Cas蛋白，诸如Cas9蛋白或其任何衍生物，可与指导RNA预复合以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。可将RNP复合物引入原代免疫细胞中。RNP复合物的引入可以定时。所述细胞可在细胞周期的G1期、S期和/或M期与其他细胞同步。RNP复合物可以在细胞期递送，使得HDR得以增强。RNP复合物可以促进同源性定向修复。
也可以修饰指导RNA。修饰可包括化学改变、合成修饰、核苷酸添加和/或核苷酸减去。修饰还可以增强CRISPR基因组工程化。修饰可改变gRNA的手性。在一些情况下，手性在修饰后可能是均匀的或立体纯的。可合成指导RNA。合成的指导RNA可增强CRISPR基因组工程化。指导RNA也可以被截短。截短可用于减少不需要的脱靶诱变。截短可包含任何数目的核苷酸缺失。举例来说，截短可包含1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个或更多个核苷酸。指导RNA可包含任意长度的靶互补区域。举例来说，靶互补区域的长度可小于20个核苷酸。靶互补区域的长度可超过20个核苷酸。
在一些情况下，修饰在5'端、3'端、从5'端到3'端、单个碱基修饰、2'-核糖修饰或其任何组合。修饰可选自由以下组成的组：碱基取代、插入、缺失、化学修饰、物理修饰、稳定化、纯化及其任何组合。
在一些情况下，修饰是化学修饰。修饰可选自5'腺苷酸、5'鸟苷-三磷酸帽、5'N7-甲基鸟苷-三磷酸帽、5'三磷酸帽、3'磷酸、3'硫代磷酸、5'磷酸、5'硫代磷酸、Cis-Syn胸苷二聚体、三聚体、C12间隔子、C3间隔子、C6间隔子、d间隔子、PC间隔子、r间隔子、间隔子18、间隔子9、3'-3'修饰、5'-5'修饰、脱碱基、吖啶、偶氮苯、生物素、生物素BB、生物素TEG、胆固醇TEG、脱硫生物素TEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-生物素、双生物素、PC生物素、补骨脂素C2、补骨脂素C6、TINA、3'DABCYL、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDyeQC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、羧基接头、硫醇接头、2'脱氧核糖核苷类似物嘌呤、2'脱氧核糖核苷类似物嘧啶、核糖核苷类似物、2'-0-甲基核糖核苷类似物、糖修饰的类似物、摆动/通用碱基、荧光染料标签、2'氟RNA、2'O-甲基RNA、甲基膦酸酯、磷酸二酯DNA、磷酸二酯RNA、硫代磷酸酯DNA、硫代磷酸酯RNA、UNA、假尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞苷-5'-三磷酸酯、3硫代磷酸2-O-甲酯或其任何组合。
在一些情况下，修饰是3硫代磷酸2-O-甲酯加成。3硫代磷酸2-O-甲酯加成可在1个碱基至150个碱基上进行。3硫代磷酸2-O-甲酯加成可在1个碱基至4个碱基上进行。3硫代磷酸2-O-甲酯加成可在2个碱基上进行。3硫代磷酸2-O-甲酯加成可在4个碱基上进行。修饰也可以是截短。截短可以是5个碱基的截短。
在一些情况下，可使用双切口酶方法来引入双链断裂。Cas蛋白可在任一核酸酶结构域内的已知氨基酸处发生突变，从而缺失一个核酸酶结构域的活性并产生能够产生单链断裂的切口酶Cas蛋白。切口酶连同靶向相反链的两种不同的指导RNA可用于在靶位点内产生DSB(常称为“双切口”或“双切口酶”CRISPR系统)。这种方法可以显著增加靶标特异性，因为不太可能在足够接近的距离内产生两个脱靶切口以引起DSB。
gRNA可以任何功能浓度引入。举例来说，gRNA可以10微克引入细胞。在其他情况下，gRNA可以0.5微克至100微克引入。gRNA可以0.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100微克引入。
在一些情况下，可进行GUIDE-Seq分析以确定工程化的指导RNA的特异性。通过CRISPR系统核酸酶脱靶裂解的GUIDE-Seq分析的一般机制和方案在Tsai,S.等,“GUIDE-Seqenables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR systemnucleases,”Nature,33:187-197(2015)中讨论。
在一些情况下，将一个或多个指导物引入细胞中。在其他情况下，将两个或更多个指导物引入细胞中。两个或更多个指导核酸可同时存在于同一表达载体上或作为裸指导物引入。两个或更多个指导核酸可处于相同的转录控制之下。在一些实施方案中，两个或更多个(例如，3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个、45个或更多或50个或更多个)指导核酸同时在靶细胞(来自相同或不同载体)中表达。在一些情况下，指导核酸可由死亡Cas蛋白(例如，来自诸如酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、无害李斯特菌和膜炎奈瑟菌(N.meningitides)的不同细菌的dCas9蛋白)不同地识别。
非同源重组的抑制
可通过使用多种方法抑制非同源末端连接分子，诸如KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。举例来说，可通过基因沉默抑制非同源末端连接分子，诸如KU70、KU80和/或DNA连接酶IV(例如，在转录或翻译期间)。也可通过蛋白质降解抑制非同源末端连接分子KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。也可抑制非同源末端连接分子KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。KU70、KU80和/或DNA连接酶IV的抑制剂可包括E1B55K和/或E4orf6。也可通过螯合作用抑制非同源末端连接分子KU70、KU80和/或DNA连接酶IV。抑制非同源末端连接的剂可为小分子。
递送系统
常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将编码内切核酸酶(例如，CRISPR、TALEN、基于转座子的、ZEN、兆核酸酶或Mega-TAL分子)的核酸、多核酸构建体(例如，包含插入序列)和gRNA体外、离体或体内引入细胞。
示例性病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，所述DNA和RNA病毒在递送至细胞后具有游离或整合的基因组。可使用本领域普通技术人员已知的转导方法将病毒载体引入细胞中。示例性非病毒载体递送系统包括DNA质粒、小环DNA、裸核酸、mRNA和与递送媒介物(诸如脂质体或泊洛沙姆(poloxamer))复合的核酸。
非病毒递送核酸的方法包括电穿孔、脂质转染、核转染(nucleofection)、纳米金递送、微注射、基因枪(biolistics)、病毒微体(virosome)、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、mRNA、人工病毒粒体和剂增强的DNA摄取。其他示例性核酸递送系统包括由
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Biosystems(Cologne,Germany)、Life Technologies(Frederick,Md.)、MAXCYTE,Inc.(Rockville,Md.)、BTX Molecular Delivery Systems(Holliston,Mass.)和Copernicus Therapeutics Inc.提供的那些系统(参见例如，美国专利号6,008,336)。脂质转染试剂在商业上出售(例如，
Figure BDA0003657959080001722
和
Figure BDA0003657959080001723
)，使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)进行超声穿孔。
在一些实施方案中，内切核酸酶使用编码所述内切核酸酶的mRNA分子引入细胞中。在一些实施方案中，内切核酸酶使用病毒载体引入细胞中。在一些实施方案中，gRNA使用合成RNA分子引入细胞中。在一些实施方案中，多核酸构建体使用DNA质粒引入细胞中。在一些实施方案中，多核酸构建体使用小环DNA质粒引入细胞中。在一些实施方案中，多核酸构建体使用病毒载体引入细胞中。在一些实施方案中，多核酸构建体使用AAV载体引入细胞中。
在一些情况下，本文所述的多核酸构建体通过RNA(例如信使RNA(mRNA))引入细胞中。在一些实施方案中，mRNA多核酸可以用逆转录酶(RT)(以蛋白质形式或编码RT的多核酸形式)引入细胞中。示例性RT包括但不限于来源于禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV RT)、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)(M-MLV RT)、人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶(RT)、其衍生物或其组合的那些RT。一旦转染，逆转录酶可以将工程化mRNA多核酸转录成双链DNA(dsNDA)。逆转录酶(RT)可为用于由RNA模板生成互补DNA(cDNA)的酶。在一些情况下，RT酶可使用RNA(cDNA合成)或单链DNA作为模板从引物开始合成互补DNA链。
电穿孔方案
本文提供了提高细胞工程化的总产率的方法，包括例如提高细胞工程化后的细胞生存力和/或提高转染效率。本公开的一个方面提供了一种基因组编辑的方法，其包括第一电穿孔步骤和第二电穿孔步骤。在一些情况下，本文提供的顺序电穿孔方案可增加细胞生存力。在一些情况下，本文提供的顺序电穿孔方案可增加转染效率。在一些情况下，本文提供的顺序电穿孔方案可增加细胞生存力和转染效率两者。
在一些情况下，第一电穿孔步骤可包括将指导核酸酶引入细胞中。第二电穿孔步骤可包括将包含与基因的至少一部分互补的区域的指导多核酸引入细胞中。第二电穿孔步骤还可包括将外源多核酸引入细胞中。方法可产生修饰的细胞。第一电穿孔可随时进行。在一些情况下，在诸如使用抗CD3和/或抗CD28刺激后进行电穿孔。任何数目的细胞因子或白介素也可与抗CD3或抗CD28组合用于刺激。电穿孔可从电穿孔后0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时、50小时、52小时、54小时、56小时、58小时、60小时、62小时、64小时、66小时、68小时、70小时、72小时、74小时、76小时、78小时、80小时、82小时、84小时、86小时、88小时、90小时、92小时、94小时、96小时、98小时或至多约100小时开始进行。在一些情况下，电穿孔从刺激后约30小时-40小时开始进行。在一些情况下，电穿孔在刺激后36小时进行。在一些情况下，转染是基于细胞群的S期定时的，参见例如，示出了各种DNA传感器的表达水平随着刺激后的小时数而变化的图29A和图29B。
在一些情况下，第一电穿孔步骤可包括将指导核糖核蛋白复合物引入细胞中。第二电穿孔步骤可包括将外源多核酸引入细胞中。方法可产生修饰的细胞。
本文提供的方法可包括对待修饰的细胞进行顺序电穿孔。在一些情况下，方法可包括第一电穿孔步骤和第二电穿孔步骤。在一些情况下，第一电穿孔步骤和第二电穿孔步骤是间隔进行的。第一电穿孔步骤与第二电穿孔步骤之间的间隔可为约10分钟至约48小时、约30分钟至约44小时、约1小时至约40小时、约2小时至约36小时、3小时至约32小时、约4小时至约30小时、约5小时至约28小时、约5.5小时至约26小时、约6小时至约24小时、约6.5小时至约22小时、约7小时至约20小时、约8小时至约16小时、约9小时至约12小时或约10小时至约11小时。在一些情况下，第一电穿孔步骤与第二电穿孔步骤之间的间隔可为约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时。
第一电穿孔步骤与第二电穿孔步骤之间的间隔可能有利于细胞生存力。与包括由第一电穿孔步骤和第二电穿孔步骤组成的单一电穿孔的类似细胞相比，如本文提供的包括第一电穿孔步骤和第二电穿孔步骤的方法可促进生存力百分比的增加。生存力百分比的增加可为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％或甚至更多。在一些情况下，生存力百分比的增加可为约50％至约200％。
第一电穿孔步骤与第二电穿孔步骤之间的间隔可能有利于转基因整合效率。与包括由第一电穿孔步骤和第二电穿孔步骤组成的单一电穿孔的类似细胞相比，如本文提供的包括第一电穿孔步骤和第二电穿孔步骤的方法可促进整合效率百分比的增加。整合效率的增加可为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％或甚至更多。在一些情况下，整合效率的增加可为约50％至约200％。
第一电穿孔步骤可包括将指导核酸酶引入细胞中。如本文所提供的，指导核酸酶可包括CRISPR相关蛋白(Cas蛋白，例如Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)、转座酶和兆核酸酶。指导核酸酶可为天然存在的核酸酶、基因修饰的和/或重组的核酸酶。指导核酸酶可以可能导致细胞内指导核酸酶功能性存在的任何形式引入靶细胞。在一些情况下，指导核酸酶可以DNA的形式转染到细胞中。在一些情况下，指导核酸酶可以mRNA的形式转染。在一些情况下，指导核酸酶可以蛋白质或蛋白质复合物的形式递送到细胞中。在一些情况下，指导核酸酶可包括Cas蛋白。可用于本文提供的方法的Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1或Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰型式。
第二电穿孔步骤可包括将包含与基因的至少一部分互补的区域的指导多核酸引入细胞。第二电穿孔步骤可包括将外源多核酸引入细胞。第二电穿孔步骤可包括将包含与基因和外源多核酸的至少一部分互补的区域的指导多核酸引入细胞。在一些情况下，包含与基因的至少一部分互补的区域的指导多核酸可包含如在CRISPR系统中所用的指导RNA。指导RNA可包括crRNA和tracrRNA。在一些情况下，包含与基因和外源多核酸的至少一部分互补的区域的指导多核酸可存在于单个多核苷酸分子上，例如单个DNA质粒上。
可用于本文提供的方法的外源多核酸可包含任何核苷酸序列。在一些情况下，外源多核酸可包含转基因。转基因可为任何基因或其衍生物。在一些情况下，转基因可包含细胞受体，诸如T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其组合。
治疗应用
本公开的基因编辑的免疫细胞可用于治疗方法中，例如用于癌症、炎性病症、自身免疫性病症或传染病的疗法。可以引入免疫细胞基因组中的修饰包括例如插入、缺失、序列替换(例如，取代)及其组合。可将一个或多个序列插入基因组中，例如，以允许表达外源基因产物(例如，具有已知抗原特异性的T细胞受体或嵌合抗原受体、具有已知特异性的免疫球蛋白、细胞因子或细胞因子受体、趋化因子或趋化因子受体、或包含药物反应结构域的蛋白质)。可将启动子序列插入基因组中，例如，以允许内源基因产物或外源(插入的)基因产物的调节或组成型表达。可破坏一个或多个基因，例如，以破坏有助于疾病发病机制的产物的表达(例如，降低抗癌或抗病原体免疫反应的免疫检查点基因，或有助于炎性病症或自身免疫性病症的促炎性基因)。可从基因组中删除定义的序列，例如，以改变基因产物的功能(例如，外显子的缺失或蛋白质的一个或多个结构域的缺失)。基因组中的序列可由另一序列替换，例如，以用正常序列替换疾病相关序列(例如，SNP或突变)，或改变基因产物的功能(例如，对抗原、配体、激动剂、拮抗剂等的结合亲和力)。
示例性癌症包括但不限于急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、肺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌、直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌、胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌、中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌、肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾脏癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和尿膀胱癌。
在一些实施方案中，癌症为膀胱癌、上皮癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、食管癌、胃肠道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、肺泡状横纹肌肉瘤、肛管癌、直肠癌、眼癌、颈部癌、胆囊癌、胸膜癌、口腔癌、外阴癌、结肠癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、腹膜癌、肾脏癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。在一些实施方案中，癌症为胃肠道癌、乳腺癌、淋巴瘤或前列腺癌。
示例性自身免疫性疾病包括但不限于贲门失驰缓症(achalasia)、阿迪森氏病、成人斯蒂尔病、无γ球蛋白血症(agammaglobulinemia)、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经功能障碍、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病、巴娄病(balódisease)、白塞氏病(behcet’s disease)、良性黏膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、卡斯尔曼病(castleman disease)、乳糜泻、恰加斯病(chagas disease)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、慢性复发性多病灶性骨髓炎、变应性肉芽肿性综合征、嗜酸性肉芽肿、瘢痕性类天疱疮、寇甘综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯赛基病毒性心肌炎(coxsackie myocarditis)、CREST综合征、克罗恩氏病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克病(devic’s disease)(视神经脊髓炎)、盘状红斑狼疮、德莱斯勒综合征(dressler’s syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、特发性混合型冷球蛋白血症、伊万斯综合征、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征(goodpasture’ssyndrome)、肉芽肿性多血管炎、格雷氏病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮、化脓性汗腺炎、低丙球蛋白血症(hypogammalglobulinemia)、IgA肾病、IgG4相关硬化病、免疫性血小板减少性紫癜、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、青少年关节炎、青少年糖尿病、青少年肌炎、川崎病、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样性结膜炎、线状IgA病、狼疮、慢性莱姆病、梅尼埃病、显微镜型多血管炎、混合性结缔组织病、蚕蚀性角膜溃疡、穆-哈二氏病、多灶性运动神经病、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少、眼部瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿、柏罗氏综合征、睫状体平坦部炎(pars planitis)、牧师特纳综合征、天疱疮、周围神经病、静脉周脑脊髓炎(perivenous encephalomyelitis)、恶性贫血、诗歌综合征、结节性多动脉炎、I、II、III型多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、孕酮皮炎、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍、坏疽性脓皮病、雷诺氏现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、复发性多软骨炎、下肢不宁综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征(schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、修格兰氏综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、苏萨克氏综合征、交感性眼炎、高安氏动脉炎(Takayasu’s arteritis)、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、血小板减少性紫癜、托洛萨-亨特综合征、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、未分化型结缔组织病、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和伏格特-小柳-原田病(Vogt-Koyanagi-Harada disease)。
本文所述的细胞可施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，细胞对于它们所施用的受试者是同种异体的或自体的。在一些实施方案中，细胞以单剂量施用。在一些实施方案中，细胞以多剂量施用。在一些实施方案中，细胞通过静脉输注施用。
在一些实施方案中，诸如癌细胞的靶细胞可形成肿瘤。用本文提供的组合物和方法治疗的肿瘤可导致稳定的肿瘤生长(例如，一个或多个肿瘤的大小增加不超过1％、5％、10％、15％或20％，和/或不转移)。在一些实施方案中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周。在一些实施方案中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月。在一些实施方案中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。在一些实施方案中，肿瘤的大小或肿瘤细胞的数目减少至少约5％、10％、15％、20％、25、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，肿瘤被完全消除，或降低到检测水平以下。在一些实施方案中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周保持无肿瘤(例如，处于缓解中)。在一些实施方案中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月保持无肿瘤。在一些实施方案中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年保持无肿瘤。
诸如癌细胞的靶细胞的死亡可通过任何合适的方法来确定，所述方法包括但不限于在治疗之前和之后计数细胞，或测量与活细胞或死细胞(例如，活靶细胞或死靶细胞)相关的标记的水平。可通过任何合适的方法确定细胞死亡程度。在一些实施方案中，细胞死亡程度是相对于起始条件确定的。举例来说，个体可具有已知起始量的靶细胞，诸如已知大小的起始细胞团或已知浓度的循环靶细胞。在此类情况下，细胞死亡程度可表示为处理后存活细胞与起始细胞群的比率。在一些实施方案中，细胞死亡程度可通过合适的细胞死亡测定来确定。有多种细胞死亡测定可供使用，并且可利用多种检测方法。检测方法的实例包括但不限于使用细胞染色、显微镜检查、流式细胞术、细胞分选和这些方法的组合。当肿瘤在治疗期完成后接受手术切除时，治疗在减小肿瘤大小方面的功效可通过测量切除的坏死(即死亡)组织的百分比来确定。在一些实施方案中，如果切除组织的坏死百分比大于约20％(例如，至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)，那么治疗是治疗上有效的。在一些实施方案中，切除组织的坏死百分比为100％，即不存在或检测不到活的肿瘤组织。
将癌细胞暴露于本文公开的免疫细胞或免疫细胞群可在体外或体内进行。将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群通常是指使靶细胞与免疫细胞接触和/或足够接近，使得靶细胞的抗原(例如，膜结合的或非膜结合的抗原)可结合至免疫细胞中表达的嵌合跨膜受体多肽的抗原相互作用结构域。在体外将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群可通过共培养靶细胞和免疫细胞来完成。靶细胞和免疫细胞可例如作为贴壁细胞或可替代地在混悬液中共培养。靶细胞和免疫细胞可在各种合适类型的细胞培养基(例如具有补充剂、生长因子、离子等)中共培养。在一些情况下，通过将免疫细胞施用于受试者，例如人类受试者，并允许免疫细胞通过循环系统定位于靶细胞，可完成在体内将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群。在一些情况下，可将免疫细胞递送至靶细胞所在的紧邻区域，例如通过直接注射。暴露可进行任何合适的时间长度，例如至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时、至少20小时、至少24小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月或更长时间。
试剂盒
本文所述的任何组合物都可包含在试剂盒中。在一个非限制性实例中，转基因、载体、多核苷酸、肽、产生本文提供的组合物的试剂及其任何组合都可包含在试剂盒中。在一些情况下，试剂盒组分提供于合适的容器装置中。
试剂盒可包含适当等分的组合物。所述试剂盒的组分可以水性介质形式或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，组分可以放置在所述容器装置中并且优选地适当等分。在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，试剂盒通常还含有第二容器、第三容器或其他额外容器，额外组分可分开放置在所述第二容器、第三容器或其他额外容器中。然而，各种组分的组合可包含在小瓶中。试剂盒通常还将包括用于将组分封闭起来以供商业销售的装置。此类容器可包括注射或吹塑塑料容器，所需的小瓶保持在所述注射或吹塑塑料容器中。
然而，试剂盒的组分可以干粉形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可通过添加合适的溶剂来复原粉末。设想溶剂也可以提供于另一个容器装置中。
在一些实施方案中，试剂盒可包含工程化指导RNA、前体工程化指导RNA、包含工程化指导RNA或前体工程化指导RNA的载体、或工程化指导RNA或前体工程化指导RNA的核酸、工程化细胞受体、编码工程化细胞受体的多核苷酸或包含上述中的任一种的药物组合物，以及容器。在一些情况下，容器可为塑料、玻璃、金属或其任何组合。
在一些情况下，包含本文所述的组合物的包装产品可适当地标记。在一些情况下，本文所述的药物组合物可根据良好生产规范(cGMP)和标签规定制造。在一些情况下，本文公开的药物组合物可为无菌的。
虽然本文已经示出并描述了优选的实施方案，但对于本领域技术人员将显而易见的为此类实施方案仅借助于实施例提供。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应理解，可采用本文所述的实施方案的各种替代方案。这意味着以下权利要求限定范围并且这些权利要求和其等同物范围内的方法和结构因此涵盖在本文中。
实施例
实施例1：T细胞的分离。
使用基于氯化铵的RBC裂解和/或密度梯度离心(例如，Ficoll-Paque)从全血或单采单元中分离外周血单核细胞(PBMC)。对PBMC进行计数，在EasySep缓冲液或含2％FBS和1mM EDTA的PBS(不含钙和镁)中将细胞密度调整为5x10^7个细胞/mL，并且可将至多8mL转移到圆底管中。将来自EasySep人T细胞分离试剂盒(目录号19051)的分离混合物以50uL/mL添加到细胞中。通过移液混合细胞并将其在室温下孵育5分钟。RapidSpheres通过涡旋混合30秒，并以40uL/mL添加到样品中。将样品加满至5mL或10mL，并通过移液温和混合。将试管置于EasySep磁铁中并在室温下孵育3分钟。非T细胞被捕获在磁铁上，而T细胞保持未结合。通过小心移液或以一个连续动作倾倒上清液将分离的T细胞转移到新的锥形管中。对T细胞进行计数，并通过流式细胞术验证纯度(例如，对>90％CD3+细胞进行验证)。可培养、刺激或等分并冷冻细胞以备将来使用(例如，使用Cryostor CS10)。
实施例2：T细胞的扩增
将分离的T细胞以1x10^6个细胞/mL的密度于OpTmizerTM T细胞扩增基础培养基中铺种于24孔板中，所述培养基具有2.6％OpTmizerTM T细胞扩增补充剂、2.5％CTSTM免疫细胞血清替代物、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、10mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、300IU/mL重组人IL-2、5ng/mL重组人IL-7和5ng/mL重组人IL-15。如果使用冷冻细胞冷冻分离的T细胞，那么将细胞在解冻后在刺激前静置至少4-5小时。
将人T活化因子CD3/CD28 Dynabeads用培养基洗涤，使用磁铁收集，并以每细胞2个珠子或每2.5个细胞1个珠子的比率添加到分离的T细胞中。将细胞在37℃、5％CO2下孵育。12-24小时后，将样品温和移液以重新分布珠子。在总计36小时的孵育后，使用磁铁去除珠子。
实施例3：T细胞的核转染
将分离的T细胞如实施例2所概述进行刺激，并使用Lonza 4D NucleofectorTM X单元和Amaxa 4D-Nucleofector X试剂盒进行电穿孔。将细胞沉淀，用试剂盒提供的缓冲液洗涤一次，重悬于试剂盒提供的缓冲液中，并根据试剂盒说明书转移到比色皿中。
对于100uL比色皿，每个比色皿添加5-15ug Cas9 mRNA和5-25ug gRNA-RNA。如果将质粒DNA添加到100uL比色皿中，则添加5-10ug质粒DNA。
对于20uL比色皿，每个比色皿添加1-3ug Cas9 mRNA和1-5ug gRNA-RNA。如果将质粒DNA添加到20uL比色皿中，则添加1-2ug质粒DNA。
根据试剂盒说明书进行核转染。将细胞在比色皿中静置15分钟，然后转移到含有无抗生素培养基的恢复板中。用最小的移液温和处理细胞。对于100uL比色皿，将内容物转移到每孔1mL的6孔板中。对于20uL比色皿，将内容物转移到每孔300uL的24孔板中。如果添加质粒DNA，则恢复孔中包含1ug DNA酶。将细胞在37℃、5％CO2下孵育30分钟，然后添加额外的培养基以使细胞浓度达到1x10^6个细胞/mL，并将培养物维持在37℃、5％CO2下。定期监测生长和生存力，例如通过使用自动细胞计数器的台盼蓝拒染法(trypan blueexclusion)。
实施例4：包括单链退火的T细胞的基因组编辑
设计并合成了包含图1A中所示出的元件的DNA小环构建体。“插入”盒代表包含启动子(MND启动子)和编码T细胞受体(包含可被特异性单克隆抗体识别的小鼠TCRb序列的外源G12D KRAS特异性TCR)的开放阅读框的DNA序列，其包括聚A尾。T1代表被靶向用于由指导RNA(例如，不靶向基因组的指导RNA(例如，斑马鱼指导RNA或算法设计的指导RNA)，或靶向基因组中的破坏靶位点的指导RNA)裂解的序列。H1和H2代表具有与基因组中所选位点同源的序列(TRAC外显子1内的48个碱基对序列)的短同源臂。作为对照，设计了包含具有1000个碱基对同源臂而非48个碱基对同源臂的插入物的DNA小环构建体。
构建体被设计用于在图1B中所示出的基因组中的TRAC靶位点处插入。H1和H2代表基因组中与DNA小环构建体中的H1和H2同源的序列。C2代表被靶向用于由指导RNA(例如，靶向C1的相同指导RNA或不同指导RNA)裂解的序列。
将人T细胞如实施例1中进行分离，并如实施例2中进行扩增，并且使用Lonza 4DNucleofectorTM X单元和Amaxa 4D-Nucleofector X试剂盒进行电穿孔。将细胞沉淀，用试剂盒提供的缓冲液洗涤一次，重悬于试剂盒提供的缓冲液中，并根据试剂盒说明书转移到20uL比色皿中。
将DNA和/或RNA以表2中所示的量添加到比色皿中。
Figure BDA0003657959080001851
根据试剂盒说明书进行核转染。将细胞在比色皿中静置15分钟，然后转移到每孔含有300uL无抗生素培养基并具有1ug DNA酶的24孔板中。用最小的移液温和处理细胞。将细胞在37℃、5％CO2下孵育30分钟，然后添加额外的培养基以使细胞浓度达到1x10^6个细胞/mL。将培养物在37℃、5％CO2下维持7天，根据需要更换培养基和分离培养物。
在核转染后第7天，通过流式细胞术分析细胞以确定表达由DNA小环构建体编码的TCR的细胞的频率和数目。每个实验条件下取5x10^5个细胞，将其沉淀，并用对CD3和插入TCR具有特异性的荧光偶联单克隆抗体进行染色。细胞也用生存力染料进行染色。染色后，对细胞进行流式细胞术，并分析活细胞的CD3和插入TCR的表达。
图2呈现了实验条件1至实验条件3的结果，并示出在没有核酸酶或指导RNA的条件下，不表达插入TCR。每列代表一种条件。每行代表来源于不同供体的样品。y轴代表由CD3染色产生的荧光，而X轴代表由插入TCR的染色产生的荧光。数字代表落入象限内的活细胞的百分比。
图3呈现了来自实验条件4至实验条件7的结果并示出了与具有1000个碱基对同源臂(条件4和条件5)的实验条件相比，在具有48个碱基对同源臂和小环靶向指导RNA(条件6和条件7)的实验条件下，更高比例和更多数目的细胞表达插入TCR。每列代表一种条件。每行代表来源于不同供体的样品。y轴代表由CD3染色产生的荧光，而X轴代表由插入TCR的染色产生的荧光。数字代表落入象限内的活细胞的百分比。这些结果表明，与同源重组相比，使用包括单链退火的方法进行免疫细胞基因组编辑的效率提高。
图4提供了表达来自实验条件1至实验条件7的插入TCR的活细胞的百分比。呈现了来自两个供体的处理的样品的数据，其中每个供体两次技术复制。结果示出了与具有1000个碱基对同源臂(条件4和条件5)的实验条件相比，在具有48个碱基对同源臂和小环靶向指导RNA(条件6和条件7)的实验条件下，更高比例和更多数目的细胞表达插入TCR。这些结果表明，与同源重组相比，使用包括单链退火的方法进行免疫细胞基因组编辑的效率提高。
表3：示例性多核酸构建体
Figure BDA0003657959080001861
实施例5：包括单链退火的T细胞的基因组编辑
设计并合成了包含图1A中所示出的元件的DNA小环构建体。“插入”盒代表包含启动子和编码绿色荧光蛋白(GFP)的开放阅读框的DNA序列。T1代表被靶向用于由指导RNA(例如，不靶向基因组的指导RNA(例如，斑马鱼指导RNA或算法设计的指导RNA)，或靶向基因组中的破坏靶位点的指导RNA)裂解的序列。H1和H2代表具有与基因组中所选位点同源的序列(AAVS1安全港基因座内的48个碱基对序列)的短同源臂。作为对照，设计了包含具有1000个碱基对同源臂而非48个碱基对同源臂的插入物的DNA小环构建体。
靶向异种序列(诸如通用序列)的示例性gRNA可包括与以下约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性：GGGAGGCGUUCGGGCCACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:82)。示例性前述gRNA还可包含修饰，诸如以下中描述的那些修饰：mG*mG*mG*rArGrG rCrGrU rUrCrG rGrGrC rCrArC rArGrG rUrUrU rUrArG rArGrC rUrArG rArArArUrArG rCrArA rGrUrU rArArA rArUrA rArGrG rCrUrA rGrUrC rCrGrU rUrArU rCrArArCrUrU rGrArA rArArA rGrUrG rGrCrA rCrCrG rArGrU rCrGrG rUrGrC mU*mU*mU*rU(SEQ ID NO:83)。示例性通用指导(斑马鱼)gRNA的间隔子序列可包括与以下约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性：gggaggcguucgggccacag(SEQ ID NO:84)。可由前述通用gRNA(示例性通用序列)结合的靶序列T1包含：CTGTGGCCCGAACGCCTCCC(SEQ ID NO:85)。
由AAVS1 gRNA结合的基因组靶序列包含：CTAGGGACAGGATTGGTGAC(SEQ ID NO:86)。AAVS1 gRNA可共享SEQ ID NO:79或82中任一个的主链或缺少间隔子序列的区域。举例来说，AAVS1 gRNA可包含SEQ ID NO:79的主链，其对应于残基21-100。
构建体被设计用于在图1B中所示出的基因组中的AAVS1靶位点处插入。H1和H2代表基因组中与DNA小环构建体中的H1和H2同源的序列。T2代表被靶向用于由指导RNA(例如，靶向C1的相同指导RNA或不同指导RNA)裂解的序列。
将人T细胞如实施例1中进行分离，并如实施例2中进行扩增，并且使用Lonza 4DNucleofectorTM X单元和Amaxa 4D-Nucleofector X试剂盒进行电穿孔。将细胞沉淀，用试剂盒提供的缓冲液洗涤一次，重悬于试剂盒提供的缓冲液中，并根据试剂盒说明书转移到20uL比色皿中。
将DNA和/或RNA以表4中所示的量添加到比色皿中。
Figure BDA0003657959080001881
根据试剂盒说明书进行核转染。将细胞在比色皿中静置15分钟，然后转移到每孔含有300uL无抗生素培养基并具有1ug DNA酶的24孔板中。用最小的移液温和处理细胞。将细胞在37℃、5％CO2下孵育30分钟，然后添加额外的培养基以使细胞浓度达到1x10^6个细胞/mL。将培养物在37℃、5％CO2下维持7天，根据需要更换培养基和分离培养物。
在核转染后第7天，通过流式细胞术分析细胞以确定表达来自DNA小环构建体的GFP报告基因的细胞的频率。每个实验条件下取5x10^5个细胞，将其沉淀并用生存力染料进行染色。染色后，对细胞进行流式细胞术，并分析活细胞的GFP表达。
图5提供了来自实验条件1至实验条件7的表达GFP报告基因的活细胞的百分比。呈现了来自两个供体的处理的样品的数据，其中每个供体三次技术复制。结果示出了使用包括单链退火的方法进行的有效免疫细胞基因组编辑。
实施例6：用于T细胞修饰的材料和方法
本实施例提供了用于实施例7至实施例11的材料和方法，其涉及原代T细胞分离、培养、转染和电穿孔后培养的某些步骤。
示例性方案1
材料
培养基：
·含庆大霉素、含L-谷氨酰胺、含转铁蛋白、含酚红的X-VIVO15
·不含庆大霉素、不含酚红、含L-谷氨酰胺、含转铁蛋白的X-VIVO 15(*恢复培养基)
·10％AB人血清
·DNA酶I溶液(1mg/ml)
·300IU/ml IL-2
·5ng/ml IL-7
·5ng/ml IL-15
冷冻培养基：
·Cryostor CS10
细胞分离试剂：
·人T细胞分离试剂盒
·氯化铵RBC裂解溶液
其他试剂：
·Dynamag-2
·Neon试剂盒
抗体清单：
·抗人CTLA4
·抗人PD-1
·抗人CD3
方法
使用基于氯化铵的RBC裂解从单采单元(leukopak)中分离外周血单核细胞(PBMC)
(a)测量leukopak中的血量
(b)将leukopac分配到500ml无菌瓶中，并添加等体积的氯化铵溶液
(c)通过颠倒数次来混合
(d)在冰上孵育15分钟
(e)将样品均匀分布到50ml锥形瓶中，并以500x g离心10分钟。
(f)小心取出并丢弃上清液。
(g)用1xPBS+2％人AB血清加满试管，并在制动器关闭的情况下以150x g离心10分钟。
(h)重复此洗涤步骤至少1次以去除血小板。
(i)使用EasySep人T细胞分离试剂盒重悬于适当的培养基中以进行T细胞纯化。
使用基于氯化铵的RBC裂解从Trima锥形瓶中分离外周血单核细胞(PBMC)
(a)测量锥形瓶中的血量(通常约10ml)
(b)将体积分到两个50ml锥形瓶中
(c)添加15ml的1x ACK裂解溶液
(d)在冰上孵育20分钟并用20ml 1x PBS+2％人AB血清淬灭
(e)以500x g离心10分钟。
(f)小心取出并丢弃上清液。
(g)用1x PBS+2％人AB血清加满试管，并在制动器关闭的情况下以150x g离心10分钟。
(h)重复此洗涤步骤至少1次以去除血小板。
(i)使用EasySep人T细胞分离试剂盒重悬于适当的培养基中以进行T细胞纯化。
使用EasySep人T细胞分离试剂盒(目录号19051)分离CD3+T细胞
(a)计数Ficoll分离的PBMC(*或洗涤的单采单元/Leukopac)并将细胞密度调整为5x10^7个细胞/mL。
(b)将至多45mL转移至50ml锥形管(用于Easy“50”磁铁)。
(c)向细胞中加入50uL/mL的分离混合物。
(d)通过移液混合并在室温下孵育10分钟。
(e)涡旋RapidSpheres 30秒，并向样品中加入50uL/mL。通过上下移液混合，并在室温下孵育10分钟。
(f)对于>10mL的样品，加满至50mL。
(g)将锥形管置于Easy“50”磁铁中并在室温下孵育10分钟。
(h)小心地将混悬液从磁铁中的锥形管中移液出来，并分配到新的50mL锥形管中。
(i)将锥形管放回磁铁中进行第二次分离并孵育5分钟。
(j)通过使用50ml移液器在一轮移液中小心取出上清液来去除未结合的T细胞，并转移到新的50ml锥形管中。
(k)计数T细胞并通过流式细胞术验证％CD3+的纯度(>90％)
(l)等分并冷冻未使用的细胞以备将来使用(Crystor或90％FBS:10％DMSO)
解冻最初在CryoStor CS10中冷冻的样品
(a)在预温热的培养基(37℃)中解冻细胞。使用它们将培养于其中的相同类型的培养基。
(b)向无菌15mL锥形管中添加1mL培养基。
(c)在37℃水浴中解冻冷冻的小瓶，直到剩下一个冰晶。立即将小瓶带到生物安全柜，喷洒70％乙醇并擦拭。
(d)小心地打开小瓶。温和地从一个小瓶移液细胞混悬液并逐滴滴入15ml锥形管中。
(e)再逐滴添加1ml培养基并温和旋转。
(f)逐滴添加另1ml培养基并温和旋转。
(g)再添加4ml培养基并温和混合。
(h)以175g离心10分钟。较高的离心力将会导致细胞死亡。
(i)吸出上清液并将细胞沉淀物悬浮于培养基中。
(j)细胞已准备好进行计数和测试或置于培养物中。不要延迟将细胞放入培养基和孵育箱中。
用dynabeads刺激CD3+T细胞
(a)在X-vivo培养基+10％人AB血清+300IU/ml IL、5ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15的24孔板中，以1x10^6个细胞/mL的密度板分离T细胞。
(b)计算获得2:1比率(珠子:细胞)所需的Dynabeads人T活化因子CD3/CD28珠子(Gibco,Life Technologies)的数目，并用含0.2％BSA的1X PBS洗涤，使用dynamagnet-2收集珠子。
(c)以2:1比率或1:2.5(珠子:细胞)将经洗涤的珠子添加到细胞中。
(d)在37C和5％CO2下孵育细胞24-36小时。
(e)使用dynamagnet-2去除珠子。
(f)在电穿孔前培养没有珠子的细胞至少30分钟。
CD3+T细胞的Neon转染
(a)使用Neon转染系统(100uL或10ul试剂盒，Invitrogen，Life Technologies)对经刺激的T细胞进行电穿孔。
(b)将细胞沉淀并用PBS或T缓冲液洗涤一次。
(c)将细胞以3x10^5个细胞的密度重悬于10ul吸头的10uL T缓冲液中，并以3x10^6个细胞的密度重悬于100ul吸头的100ul T缓冲液中。
(d)添加指定质量的mRNA/DNA并在1400V、10ms、3个脉冲下进行电穿孔。
a.对于使用所有mRNA的敲除：
i.100ul吸头：15ug Cas9 mRNA，10ug gRNA-RNA
ii.10ul吸头：1.5ug Cas9 mRNA，1ug gRNA-RNA
b.当包括用于敲入的质粒供体时：
i.100ul吸头：5-20ug质粒
ii.10ul吸头：0.5-2ug质粒
c.对于顺序电穿孔：
-在0小时时间点时递送指定为“a”的量的Cas9
ii.在时间点0小时和6-24小时，一起递送指定为“a”和“b”的量的gRNA和质粒。
(e)转染后，在含有10ug/ml DNA酶I的无抗生素培养基中以3000个细胞/ul铺种细胞，并在37C下在5％CO2中孵育约20分钟。
(f)恢复期后，向孔中添加2倍体积的含抗生素的培养基，并在37C下在5％CO2中培养。
CD3+T细胞的rAAV转导
(a)在冰上解冻rAAV并在加入细胞之前充分混合。
(b)在电穿孔后的以下时间点添加指定的MOI
a.对于Cas9 mRNA编辑的细胞：
i.添加病毒4-6小时后
b.对于Cas9蛋白(RNP)：
i.添加病毒15分钟后
原代T细胞的电穿孔后培养
1.观察电穿孔后的培养基颜色作为培养基添加的指标。时间将根据特定实验/供体的细胞健康状况而变化。当培养基开始变成橙色时(在一些情况下最早48小时)，用含有2X浓度细胞因子的培养基(2X培养基)将培养基的体积加倍。在培养期过程中根据需要继续这一过程。
2.在一些情况下，如果细胞生长非常迅速(特别是在第7-9天左右)并且培养基消耗很快，那么细胞可以在2-3倍体积的1X培养基中旋转沉降并复原。
3.在细胞生长不良并且3-4天后不需要培养基加倍的情况下，小心地从顶部移液取出约50％的培养基，小心不要干扰沉淀在烧瓶底部的细胞，并用等体积的2X培养基更换。
示例性方案2(额外刺激)：对示例性方案1的修改
试剂和材料
(A)培养基：1L OpTmizerTM T细胞扩增基础培养基(Gibco目录号A10221-01)，其具有2.6％OpTmizerTM T细胞扩增补充剂(Gibco目录号A10484-02)、2.5％CTSTM免疫细胞血清替换物(Gibco目录号A25961-01)、1％L-谷氨酰胺(Gibco目录号25030-081)、1％青霉素/链霉素(Millipore目录号TMS-AB2-C)、10mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(Sigma目录号A9165-256)、300IU/ml重组人IL-2(Peprotech目录号200-02)、5ng/ml重组人IL-7(Peprotech目录号200-07)、5ng/ml重组人IL-15(Peprotech目录号200-15)。
(B)恢复培养基：不含青霉素/链霉素的培养基。
(C)冷冻培养基：Cryostor CS10(Stemcell目录号07930)。
(D)分离缓冲液：1L磷酸盐缓冲盐水1X(Hyclone目录号SH302-56-01)，其具有0.2％人AB血清热灭活(Valley Biomedical目录号HP1022HI)、1％青霉素/链霉素(Millipore目录号TMS-AB2-C)和0.1M EDTA pH 8.0(Invitrogen目录号AM9261)
(E)FACS缓冲液：500ml磷酸盐缓冲盐水1X(Hyclone目录号SH302-56-01)，其具有0.5％青霉素/链霉素(Millipore目录号TMS-AB2-C)、0.1％人AB血清热灭活(ValleyBiomedical目录号HP1022HI)和0.1M EDTA pH 8.0(Invitrogen目录号AM9261)
(F)细胞分离试剂：人T细胞分离试剂盒(Stem Cell Technologi es目录号17951)和ACK裂解缓冲液(Quality Biological目录号118-156-101)。
(G)其他试剂：Dynabeads人T活化因子CD3/CD28(Gibco目录号11132D)、Amaxa 4D-Nucleofector X试剂盒(Lonza目录号V4XP-3032、V4XP-3024)、Stemcell EasySep人T细胞分离试剂盒(目录号19051)。
(H)抗体：APC小鼠抗人CD3(BD Pharmingen目录号555335)、抗小鼠TCRb PE CY 7克隆H57-597(eBioscience目录号25-5961-80)、抗小鼠TCRb PE CY 7克隆SK7(BDBiosciences目录号340440)和可固定生存力染料eFluor 780(eBioscience目录号65-0865-14)。
(I)材料：DynaMagTM-2磁铁(ThermoFisher Scientific目录号12321D)、Big EasyEasySepTM磁铁(Stemcell目录号18001)和Invitroge nTM CountessTM II FL自动细胞计数器(ThermoFisher Scientific目录号AMQAF1000)。
如前所述，使用基于氯化铵的RBC裂解从Trima锥形瓶中分离外周血单核细胞(PBMC)。
使用EasySep人T细胞分离试剂盒(目录号19051)分离CD3+T细胞
(A)计数Ficoll分离的PBMC(*或洗涤的单采单元/Leukopac)并将细胞密度调整为5x10^7个细胞/ml。
(B)将至多8mL转移到14ml圆底管中(用于“The Big Easy”EasySep磁铁)。
(C)向细胞中加入50uL/mL的分离混合物。
(D)通过移液混合并在室温下孵育5分钟。
(E)涡旋RapidSpheres 30秒，并向样品中加入40uL/mL。通过上下移液混合，并在室温下孵育3分钟。
(F)对于<4mL的样品加满至5mL，对于>4ml的样品加满至10ml。
(G)通过使用无菌移液器在一轮移液中小心取出上清液来去除未结合的T细胞以转移到新的锥形管中。
(H)计数T细胞并通过流式细胞术验证％CD3+的纯度(>90％)。
(I)等分并冷冻未使用的细胞以备将来与Cryostor CS10(Stemcell目录号07930)一起使用。
CD3+T细胞的Amaxa核转染
使用Lonza 4D NucleofectorTM X单元和Amaxa 4D-Nucleofector X试剂盒，使用P3缓冲液(V4XP-3032，V4XP-3024)对经刺激的T细胞进行电穿孔。
1)对于P3试剂盒，缓冲溶液Master Mix必须事先准备好并允许其达到室温。一旦混合，所述缓冲溶液将在4C下良好储存90天，因此只需比给定实验所需的量略多一点。
·18uL补充剂1+82uL P3原代细胞Nucleofector溶液
-100ul比色皿：90uL P3缓冲液混合/反应
-20ul比色皿：18uL P3缓冲液混合/反应
2)使用移液器充分混合和搅拌细胞，以破坏与Dynabeads的结合。
3)使用dynamagnet-2去除珠子。
4)用PBS以400x g洗涤细胞一次持续5分钟。
5)重悬细胞并计数。
·对于100ul比色皿，您可以使用2-20x10^6个细胞/条件。
·对于20ul比色皿，您可以使用0.5-1x10^6个细胞/条件。
6)将适当数目的细胞+1个额外的反应价值移至新的50mL锥形瓶中(即，对于10个反应，从11x10^6个细胞开始)。
7)用PBS将锥形瓶填充至50mL，并以200x g旋转10分钟。
8)通过在抽吸器收集液体同时缓慢倒出锥形瓶，尽可能小心地抽吸PBS。不要将抽吸器移动到低于管底部有角度的边缘的位置，因为沉淀物会松动。我们发现最好以这种方式简单地保持15-20秒。
9)在您准备好的P3 Master Mix中重悬细胞。
100ul比色皿：90uL P3缓冲液混合/反应
20ul比色皿：18uL P3缓冲液混合/反应
10)在无菌环境中将所需体积的mRNA/DNA添加到在冰上的100uL PCR管中
·对于使用所有mRNA的敲除：
-100ul比色皿：5-15ug Cas9 mRNA，5-25ug gRNA
-20ul比色皿：1-3ug Cas9 mRNA，1-5ug gRNA
·当包括质粒供体/DNA时：
-100ul比色皿：5-10ug质粒
-20ul比色皿：1-2ug质粒
·核酸量是基于反应体积而不是此系统中的细胞数目来衡量的，因此无论使用200万个细胞或2000万个细胞，大比色皿都应含有来自小比色皿的5x优化量的mRNA/gRNA/DNA。
·确保在此方案中使用浓缩核酸(1ug/uL或更高)，以确保不会稀释缓冲试剂。
11)将含有细胞的Master Mix添加到步骤10中准备的每个试管中。
100ul比色皿：90uL P3缓冲液与细胞/反应混合
20ul比色皿：18uL P3缓冲液与细胞/反应混合
12)用移液器将每个试管混合一次，以合并所有试剂并将总反应混合物移入适当的比色皿中。
·比色皿的最大装载量–在PCR管中留下任何多余的东西
-100ul比色皿：120uL
-20ul比色皿：24uL
13)盖上它，轻敲它，攻击它
·将盖子放在比色皿上
·在平坦表面上轻敲几次，以确保去除所有气泡
·带至Amaxa X模块并对样品进行电穿孔
-对于所有mRNA/gRNA攻击，使用程序EO-115
-对于含有DNA的所有攻击，使用程序FI-115
14)核转染后，允许细胞在罩内的比色皿中静置10-15分钟。
15)在这一孵育期间，如果使用20ul比色皿，那么准备含有每孔300ul的24孔板的恢复板，并且如果使用100ul比色皿，那么准备含有每孔1ml的6孔板的恢复板。请确保为此使用恢复培养基(不含抗生素的培养基)
*如果使用质粒DNA，那么在恢复孔中包含1ug DNA酶*
16)15分钟后，从您设置的板中取出80uL恢复培养基并将其添加到比色皿中，来转移到恢复板中。
17)在37C和5％CO2下孵育30-60分钟。
18)孵育30分钟后，添加具有抗生素的额外常规培养基，以使细胞达到1X10^6个细胞/ml，并在37C下在5％CO2中培养。
·700uL用于24孔板中的1X10^6个细胞
·3mL用于6孔板中的2-20x10^6个细胞
19)培养细胞，小心地将旧培养基从培养孔顶部取出，并且根据培养的需要加回新的孔/板中或者将细胞移动至更大的孔/板中进行喂养。
T细胞的额外“连续”刺激
(A)计算获得1:2比率(珠子:细胞)所需的Dynabeads人T活化因子CD3/CD28珠子的数目，并用培养基洗涤，使用dynamagnet-2收集珠子。利用在初始T细胞活化中使用的量的1/4。
(B)在Amaxa核转染方案的步骤18添加培养基期间，将珠子添加到常规培养基中，然后添加到细胞中。
(C)将珠子/培养基混合物添加到细胞中并温和混合一次。
(D)正常培养细胞，不要用移液器打散珠子/细胞团块。
流式细胞术
(A)使用细胞计数，每个样品抽取0.5-1x10^6个细胞以进行FACS。
(B)通过添加1X PBS来洗涤准备细胞，以1000x g旋转3分钟，倒出上清液，然后根据制造商对每种抗体的建议添加染色剂。
(C)混合并在黑暗中孵育20-30分钟。
(D)孵育30分钟后，添加1mL FACS缓冲液进行淬灭，再次旋转并倒出上清液。
(E)使用FACS缓冲液再重复洗涤1次。
(F)在300ul FACS缓冲液中重悬沉淀物以运行FACS。
实施例7：通过流式细胞术检查转染效率
转染后约24-48小时通过流式细胞术分析电穿孔的T细胞，以测试GFP或其他荧光染料(转基因表达的标记)的表达。对于敲除实验，在转染后7-9天进行靶蛋白丢失分析。对于敲入实验，在第7天和第14天测量标记表达。根据制造商对每种抗体的建议，通过用含有0.5％FBS的冷冻1X PBS洗涤和染色剂来准备细胞。
实施例8：电穿孔后DNA酶处理增加T细胞存活
本实施例检查了DNA酶对电穿孔后T细胞存活的影响。如图14中的代表性照片所示，在用质粒供体载体电穿孔后24小时，未用DNA酶处理的活化T细胞培养物表现出细胞团聚和死细胞漂浮在培养基上，而用DNA酶处理的T细胞培养物未表现出细胞团聚或漂浮的细胞尸体。
实施例9：DNA酶处理增加了T细胞的生存力和转染效率
本实施例检查了DNA酶对电穿孔后T细胞存活以及转染效率的影响。培养并用IL-2、IL-7和IL-15刺激原代人T细胞。稍后，T细胞在刺激后36小时或48小时被脉冲(对照)或用1.5μg pMND-GFP质粒(约7.5kb)转染。为了比较，将DNA酶以10μg/ml添加到一组转染细胞的恢复培养基中。电穿孔后将细胞在此恢复培养基中孵育30分钟。并且在恢复后，添加2倍体积的完全培养基，而无需任何洗涤步骤(因此稀释的DNA酶保留在培养基中)。
电穿孔后24小时通过流式细胞术分析细胞以确定恢复的活细胞的百分比，如图15A中所示。图15B是示出每组中转染的细胞的恢复百分比的图。DNA酶增加了“36小时pMND-GFP”组(其中细胞在刺激后36小时用pMND-GFP质粒转染)和“48小时pMND-GFP”组(其中细胞在刺激后48小时用pMND-GFP转染)两者的恢复百分比。
还通过检查由质粒引入的转基因的稳定表达来评估转染效率。图15C是示出每组细胞中表达GFP的细胞的百分比的图。图15D是示出每组细胞中表达mTCR的细胞的百分比的图。在这些实验中，在第0天或第1天，用表达GFP或mTCR的质粒供体通过电穿孔来转染原代T细胞，在电穿孔后第14天进行FACs以检查转基因表达。如图15C和图15D所示，在所有测试条件下，DNA酶处理增加了GFP和mTCR两者的整合效率。
实施例10.DNA酶和RS-1处理增加了T细胞的转染效率
本实施例检查了用DNA酶、RS-1或DNA酶和RS-1两者处理电穿孔的T细胞对转染效率的影响。在第0天或第1天，用表达GFP或mTCR的质粒供体通过电穿孔来转染原代T细胞，在电穿孔后第14天进行FACs以检查转基因表达。
图16A和图16B分别示出了GFP+和mTCR+细胞的百分比。如图所示，当T细胞在第1天被转染时，DNA酶以及RS-1与DNA酶组合的处理均提高了GFP表达和mTCR表达。
图17A-17D为电穿孔后第7天T细胞的FACs密度图。图17A示出了在用脉冲(对照)、Cas9和gRNA、供体(GFP)、供体和DNA酶或供体、DNA酶和RS-1刺激后第0天进行电穿孔的T细胞的第7天GFP表达百分比。图17B示出了在用脉冲(对照)、Cas9和gRNA、供体(GFP)、供体和DNA酶或供体、DNA酶和RS-1刺激后第0天进行电穿孔的T细胞的第7天mTCR表达百分比。图17C示出了在用脉冲(对照)、Cas9和gRNA、供体(GFP)、供体和DNA酶或供体、DNA酶和RS-1刺激后第1天进行电穿孔的T细胞的第7天GFP表达百分比。图17D示出了在用脉冲(对照)、Cas9和gRNA、供体(GFP)、供体和DNA酶或供体、DNA酶和RS-1刺激后第1天进行电穿孔的T细胞的第7天mTCR表达百分比。每个图中的数字示出具有阳性GFP或mTCR信号的细胞的百分比。
图18A-图18B是电穿孔后第14天T细胞的FACs密度图。图18A示出了在用脉冲(对照)、Cas9和gRNA、供体(GFP或mTCR)、供体和DNA酶或供体、DNA酶和RS-1刺激后第0天进行电穿孔的T细胞的第14天GFP和mTCR表达。图5B示出了在用脉冲(对照)、Cas9和gRNA、供体(GFP或mTCR)、供体和DNA酶或供体、DNA酶和RS-1刺激后第1天进行电穿孔的T细胞的第14天GFP和mTCR表达百分比。
图19示出了在刺激后36小时或在刺激后36小时以及初始电穿孔后6小时处对用或不用RS-1或DNA酶电穿孔的供体055330的T细胞的电穿孔效率和mTCR的FACs分析。
图20示出了在刺激后36小时或在刺激后36小时以及初始电穿孔后6小时处对用或不用RS-1或DNA酶电穿孔的供体119866的T细胞的电穿孔效率和mTCR的FACs分析。
图21示出了在刺激后36小时或在刺激后36小时以及初始电穿孔后6小时处对用或不用RS-1或DNA酶电穿孔的供体120534的T细胞的电穿孔效率和mTCR的FACs分析。
图22A示出了在刺激后36小时和初始电穿孔后24小时处对用或不用RS-1或DNA酶电穿孔的供体055330和119866的T细胞的电穿孔效率以及mTCR的FACs分析。图22B示出了在刺激后36小时和初始电穿孔后24小时处对用或不用RS-1或DNA酶电穿孔的供体120534的T细胞的电穿孔效率和mTCR的FACs分析。
实施例11.NAC、Akt抑制剂和抗IFNAR2对T细胞的生存力和转染效率的影响
本实施例检查了用NAC、Akt VIII抑制剂或抗IFNAR2处理对电穿孔后T细胞存活以及转染效率的影响。在这些实验中，在刺激后36小时处对100μl中的2x106个细胞进行非顺序电穿孔。电穿孔后，细胞恢复15分钟，然后在5种不同的补充条件中平均分配，如表5中所列。将NAC以10mM添加到培养基中持续一段时间，将Akt VIII抑制剂以8μM添加到培养基中持续一段时间，并将抗IFNAR2抗体以10μg/ml添加到培养基中一次。表2和图22A-图22D中的“Nuc”表示以20μg(“+20μg”)、35μg(“+35μg”)或50μg(“+50μg”)添加外源DNA以将其插入细胞基因组中的条件。
表5.补充条件
Figure BDA0003657959080002051
图23A-图23C分别示出了在电穿孔后第2天、第5天和第7天在每种条件下的活细胞计数的图。图23D-图23F分别示出了在电穿孔后第2天、第5天和第7天在每种条件下的活细胞的百分比的图。如图23B和图23C所示，在实验条件下，NAC处理以及IFNAR2抗体处理在电穿孔后第7天增加细胞生存力。图24示出了在电穿孔后第7天mTCR阳性细胞的百分比的图，发现当以30μg和50μg添加外源DNA时，用IFNAR2抗体处理增加了表达mTCR的细胞的百分比，表明整合效率增加。
实施例12.DNA修复蛋白在供体转基因表达中的评价
在HCT116细胞系中敲除示例性DNA修复蛋白，例如与修复机制诸如SSA或HR相关的那些DNA修复蛋白。在体外测定中使用修饰的细胞以确定任何修复蛋白是否对已经历转染的细胞中供体(诸如细胞受体)的表达有影响。将在RAD52、Exo1、PolQ、BRD3、Lig3、RAD54B或无(WT)中具有敲除的细胞用AAVS1剪接受体(SA)-GFP供体进行电穿孔。在电穿孔后第10天测量的流式细胞术结果示于26A中并在图26B和图26C中绘制。
实施例13.转基因供体的递送时间和敲入效率
电穿孔时间
为了确定转基因供体递送至细胞的时间是否在转基因表达中起任何作用，在刺激后24小时、36小时、48小时和72小时时间点用1ug具有对AAVS1具有特异性的同源臂(来自人PPP1R12C基因内含子1内的腺相关病毒整合位点(AAVS1)的左同源臂)的示例性剪接受体GFP供体(HR或SSA供体)或1ug通过小环载体(抗间皮素CAR SSA供体)转基因递送的示例性嵌合抗原受体转染细胞。电穿孔后7天评价细胞的GFP或CAR表达。图28A示出了对照细胞与递送HR供体的细胞的S期中的完美T细胞。图28B示出了电穿孔后第7天的GFP百分比，并且图28C示出了电穿孔后第7天的CD34(CAR)百分比。
出于报告目的，使用了增强的GFP。哺乳动物密码子优化的序列包含：MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK(SEQ ID NO:87)。
表6：示例性多核酸构建体
Figure BDA0003657959080002071
Figure BDA0003657959080002081
Figure BDA0003657959080002091
Figure BDA0003657959080002101
Figure BDA0003657959080002111
Figure BDA0003657959080002121
Figure BDA0003657959080002131
DNA传感器表达与电穿孔时间的交叉
为了评价DNA传感器(RIG-1、STING、IFI16和AIM2)的表达时间，用抗CD3和抗CD28珠子以1:2.5(珠子:细胞)的比率刺激T细胞。在刺激后12小时、24小时、30小时、36小时、48小时和72小时用SA-GFP质粒单独(质粒对照)或SA-供体组合Cas9和AAVS1 gRNA(HR)对经刺激的细胞进行电穿孔。在电穿孔后评价DNA传感器的表达，图29A。还确定了细胞周期的阶段，并在相同的时间点绘制，图29B。GFP表达百分比在电穿孔后被量化，图29C。
实施例14.整合机制影响插入负载物的表达
使用抗CD3和抗CD28包覆的珠子刺激T细胞36小时，并用1ug仅具有抗KRAS TCR的供体质粒(对照)或具有抗KRAS TCR组合1.5ug Cas9 mRNA和1ug AAVS1 gRNA(HR)的供体质粒，或者对于HMEJ含有抗KRAS TCR、Cas9 mRNA、抗AAVS1 gRNA和通用gRNA的质粒进行电穿孔。HR和HMEJ负载物均为在AAVS1处整合的SA-GFP构建体。HR和HMEJ负载物均为具有1kb同源臂(对于HR)和具有48bp同源臂(HMEJ)的MND-KRAS TCR。在电穿孔后7天，分析GFP百分比，图30A(1Kb)和图30B(2.6kb)。结果表明，至少对于较大的负载物，HMEJ构建体是优选的递送机制。
实施例15.同源臂长度对HR和HMEJ整合的影响
生成了具有不同同源臂长度(48、100、250、500、750和1000个碱基)的由“通用”gRNA切割位点侧接的供体转基因，并用于在刺激后与Cas9和AAVS1 gRNA一起转染细胞。图33示出了敲入后CD4和CD8细胞两者中GFP的表达。仅质粒(不具有CRISPR试剂的供体转基因-游离表达对照)。数据表明，随着同源臂长度的增加，供体插入物表达增加。
在第二个实验中，刺激T细胞，随后用1ug仅供体(对照)、SA-eGFP-pA(HR)或SA-eGFP-pA(HMEJ)构建体进行电穿孔，每种构建体独立地包含长度为48、100、250、500、750和100个碱基对的同源臂。细胞经历第二刺激，并在第7天通过流式细胞术评价敲入百分比，图34A。相同数据列于图34B。结果表明，与类似的HR供体相比，HMEJ构建体具有更高的敲入效率，特别是在48个和100个碱基对的较低同源臂长度下。
实施例16.额外刺激
为了评价如方案2中所述进行额外刺激的任何益处，活化并刺激T细胞，并且用包含SA-eGFP-pA(HR)或包含同源臂(HR)的SA-eGFP-pA(HMEJ)供体或靶向AAVS1的HMEJ供体(表示为SSA)的构建体进行电穿孔，本文先前已描述了电穿孔方法。电穿孔后约30分钟，将细胞暴露于额外刺激。在电穿孔后第7天测量GFP。额外刺激有助于克服电穿孔后细胞中的任何细胞扩增缺陷，参见例如图25A和图25B。另外，结果表明额外刺激增加了SA-EGFP-pA(HMEJ)修饰的T细胞的倍数扩增，参见图35A和图35B。
可以将额外的刺激引入到图36中概述的临床工作流程中。举例来说，可以在步骤(2)之后和/或步骤(3)之后进行额外刺激。
实施例17.使用TCR修饰的T细胞治疗癌症患者
CRISPR-Cas9系统可被设计用于将TCR基因转移到来自癌症患者的自体原代T细胞中。TCR基因可被设计为对患者体内鉴定的癌细胞表达的靶抗原具有高亲和力。TCR基因可由强启动子驱动，以与由原代T细胞表达的内源TCR竞争，所述启动子例如巨细胞病毒(CMV)、类干细胞病毒(MSCV)U3、磷酸甘油酸激酶(PGK)、β-肌动蛋白、泛素和猿病毒40(SV40)/CD43复合启动子。患者将施用TCR修饰的T细胞。
将根据实施例6中所述的方案从患者的外周血中获得自体CD3+T细胞。将根据GMP指导在标准条件下培养分离的T细胞。
电穿孔前至少30分钟，使用抗CD3和抗CD28包覆的珠子刺激CD3+T细胞。珠子可以按每个细胞2个珠子或每2.5个细胞1个珠子的比率进行铺种。电穿孔将以两个步骤进行：首先，CD3+T细胞将在Cas9 mRNA的存在下进行；并且6-24小时后，细胞将进行用含有TCR基因的小环构建体和gRNA的电穿孔。gRNA将被设计为靶向人基因组的安全港位点，像AAVS1位点。TCR基因的稳定表达将在转染后2周通过下一代测序进行验证。将评估电穿孔的T细胞中的细胞生存力、转染效率和转基因负荷。还将采取某些措施以最小化任何安全问题。
验证后，将TCR修饰的T细胞输注至癌症患者。预期输注的TCR修饰的T细胞在体外扩增至临床所需水平，包括患者外周血流中的TCR修饰的T细胞数目，以及移植的TCR基因的表达水平。输注方案也将基于临床评价确定，例如癌症的阶段、患者的治疗史、CBC(全血细胞计数)和患者在治疗当天的生命体征。输注剂量可能根据疾病的进展、患者的排斥反应和许多其他医学因素而增加或减少。

Claims (113)

1.一种产生工程化哺乳动物细胞群的方法，其包括：
(a)使多个哺乳动物细胞与包含由同源臂侧接的插入序列的多核酸构建体接触，其中所述同源臂中的每一个包含与邻近所述多个哺乳动物细胞中的哺乳动物细胞基因组中的靶位点的序列的至多400个连续核苷酸同源的序列；
(b)裂解所述多核酸构建体；以及
(c)将所述插入序列插入所述靶位点，从而产生工程化哺乳动物细胞群。
2.一种产生工程化哺乳动物细胞群的方法，其包括：
(a)使多个哺乳动物细胞与包含由同源臂侧接的插入序列的多核酸构建体接触，其中所述同源臂中的每一个包含与邻近所述多个哺乳动物细胞中的哺乳动物细胞基因组中的靶位点的序列同源的序列；
(b)裂解所述多核酸构建体；以及
(c)将所述插入序列插入所述靶位点，其中所述插入的效率比不包括(b)的方法高至少10％，从而产生工程化哺乳动物细胞群。
3.一种产生工程化哺乳动物细胞群的方法，其包括：
(a)使多个哺乳动物细胞与包含由同源臂侧接的包含至少1000个碱基对的插入序列的多核酸构建体接触，其中所述同源臂中的每一个包含与邻近所述多个哺乳动物细胞中的哺乳动物细胞基因组中的靶位点的序列的至多400个连续核苷酸同源的序列；
(b)裂解所述多核酸构建体；以及
(c)将所述插入序列插入所述靶位点，其中所述插入的效率比包括使所述多个哺乳动物细胞与包含由同源臂侧接的插入序列的另一种多核酸构建体接触的方法高至少10％，所述同源臂包含与邻近所述靶位点的所述序列的至少500个连续核苷酸同源的序列，从而产生工程化哺乳动物细胞群。
4.一种产生工程化哺乳动物细胞群的方法，其包括：
(a)使多个哺乳动物细胞与包含由同源臂侧接的插入序列的多核酸构建体接触，其中所述同源臂中的每一个包含与邻近所述多个哺乳动物细胞的基因组中的靶位点的序列的至多400个连续核苷酸同源的序列；
(b)裂解所述多核酸构建体；
(c)在所述多个哺乳动物细胞的基因组中在所述靶位点处产生第一双链断裂并在所述多个哺乳动物细胞的基因组中在第二位点处产生第二双链断裂；以及
(d)将所述插入序列插入所述靶位点，从而产生工程化哺乳动物细胞群。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其还包括扩增所述工程化哺乳动物细胞群。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括使所述多个哺乳动物细胞与DNA酶接触。
7.如权利要求6所述的方法，其中与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中的活细胞的百分比增加。
9.如权利要求6至8中任一项所述的方法，其中与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述DNA酶的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。
10.如权利要求6至9中任一项所述的方法，其中如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少55％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
11.如权利要求10所述的方法，其中如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测所述转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％、65％、70％、75％、80％或90％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
12.如权利要求6至11中任一项所述的方法，其中所述DNA酶选自由以下组成的组：DNA酶I、苯甲酸酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ外切核酸酶、RecJ、T7外切核酸酶、限制性酶及其任何组合。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述DNA酶是DNA酶I。
14.如权利要求6至13中任一项所述的方法，其中所述DNA酶以约5μg/ml至约15μg/ml的浓度存在。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其还包括使所述多个哺乳动物细胞与外源免疫刺激剂接触。
16.如权利要求15所述的方法，其中与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，使所述多个细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中的活细胞的百分比增加。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。
19.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
20.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述外源免疫刺激剂是B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7或截短CD19。
21.如权利要求15至20中任一项所述的方法，其中所述外源免疫刺激剂被配置来刺激所述多个哺乳动物细胞中的至少一部分的扩增。
22.如权利要求15至21中任一项所述的方法，其中所述免疫刺激剂的浓度为约50IU/ml至约1000IU/ml。
23.如权利要求15至22中任一项所述的方法，其中(a)的所述接触在与所述外源免疫刺激剂的所述接触后30小时-36小时发生。
24.如权利要求23所述的方法，其中(a)的所述接触在与所述外源免疫刺激剂的所述接触后36小时发生。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其还包括使所述多个哺乳动物细胞与调节DNA双链断裂修复的外源剂接触。
26.如权利要求23所述的方法，其中与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的细胞的百分比增加。
27.如权利要求23或26所述的方法，其中与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中的活细胞的百分比增加。
28.如权利要求23至27中任一项所述的方法，其中与未进行所述接触的类似工程化哺乳动物细胞群相比，所述多个哺乳动物细胞与所述外源免疫刺激剂的所述接触使得所述工程化哺乳动物细胞群中表达由所述插入序列编码的转基因的活细胞的百分比增加。
29.如权利要求23至28中任一项所述的方法，其中如通过在使所述多个哺乳动物细胞与所述多核酸构建体接触之后7天通过流式细胞术检测转基因所测量的，所述工程化哺乳动物细胞群中至少60％的细胞表达由所述插入序列编码的所述转基因。
30.如权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述剂包含参与DNA双链断裂修复的蛋白质。
31.如权利要求30所述的方法，其中参与DNA双链断裂修复的所述蛋白质选自由以下组成的组：Ku70、Ku80、BRCA1、BRCA2、RAD51、RS-1、PALB2、Nap1、p400 ATP酶、EVL、NAC、MRE11、RAD50、RAD52、RAD55、RAD57、RAD54、RAD54B、Srs2、NBS1、H2AX、PARP-1、RAD18、DNA-PKcs、XRCC4、XLF、Artemis、TdT、polμ和polλ、ATM、AKT1、AKT2、AKT3、Nibrin、CtIP、EXO1、BLM、E4orf6、E1b55K和Scr7。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述多个哺乳动物细胞在培养基中体外或离体培养，其中所述培养基基本上不含抗生素。
33.如任一前述权利要求所述的方法，其中使用质粒、小环载体、线性化双链DNA构建体或病毒载体将所述插入序列引入所述多个哺乳动物细胞中。
34.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述转基因包含编码外源受体的序列。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、B细胞受体(BCR)、自然杀伤细胞(NK细胞)受体、细胞因子受体或趋化因子受体。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中所述外源受体是对疾病相关抗原具有特异性的免疫受体。
37.如权利要求34、35或36所述的方法，其中所述外源受体是与癌抗原特异性结合的免疫受体。
38.如权利要求34或35所述的方法，其中所述外源受体是特异性结合自身免疫抗原的免疫受体。
39.如权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述外源受体是TCR。
40.如权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述外源受体是CAR，并且其中所述CAR由包括与SEQ ID NO:91的多肽至少60％的同一性的序列编码。
41.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述多核酸构建体包括与SEQ ID NO:90的至少一部分至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述多核酸构建体包含SEQ ID NO:90。
43.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述插入序列包括启动子序列、增强子序列或启动子序列和增强子序列两者。
44.如任一前述权利要求所述的方法，其还包括裂解所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述靶位点。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述裂解所述靶位点包括用内切核酸酶裂解。
46.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述裂解所述多核酸构建体包括用内切核酸酶裂解。
47.如权利要求44或46所述的方法，其中所述内切核酸酶是CRISPR相关内切核酸酶。
48.如权利要求4747所述的方法，其中所述内切核酸酶是Cas9。
49.如权利要求45至48中任一项所述的方法，其中(a)还包括将第一指导RNA(gRNA)或编码所述第一gRNA的多核酸引入所述多个哺乳动物细胞中。
50.如权利要求49所述的方法，其中(a)还包括将第二指导RNA(gRNA)或编码所述第二gRNA的多核酸引入所述多个哺乳动物细胞中。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生至少一个双链断裂。
52.如权利要求49至51所述的方法，其中所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在所述多核酸构建体中产生至少一个双链断裂。
53.如权利要求49至52中任一项所述的方法，其中所述第一指导RNA靶向所述内切核酸酶以在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生至少一个双链断裂并且在所述多核酸构建体中产生至少一个双链断裂。
54.如权利要求51至53中任一项所述的方法，其中将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入安全港基因座中。
55.如权利要求51至53中任一项所述的方法，其中将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入免疫调节基因基因座中。
56.如权利要求51至53中任一项所述的方法，其中将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入免疫检查点基因基因座中。
57.如权利要求51至53中任一项所述的方法，其中将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入编码受体的基因中。
58.如权利要求51至53中任一项所述的方法，其中将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入编码T细胞受体组分的基因中。
59.如权利要求58所述的方法，其中将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入T细胞受体α恒定(TRAC)或T细胞受体β基因座(TCRB)基因座中。
60.如权利要求59所述的方法，其中由所述TRAC或TCRB基因座编码的所述内源蛋白的表达被破坏。
61.如权利要求59至60中任一项所述的方法，其中将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入所述TRAC基因座中。
62.如权利要求59至61中任一项所述的方法，其中将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入所述TRAC基因座的外显子1中。
63.如权利要求62所述的方法，其中将所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述双链断裂引入所述外显子1中并且所述双链断裂包含SEQ ID NO:80的至少一部分。
64.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
65.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是原代细胞。
66.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是免疫细胞。
67.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。
68.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述多个哺乳动物细胞包括人T细胞、NK细胞、NKT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。
69.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述多个哺乳动物细胞包括人T细胞。
70.如任一前述权利要求所述的方法，其中(c)包括在所述多核酸构建体中产生两个双链断裂。
71.如任一前述权利要求所述的方法，其中(b)包括在所述多个哺乳动物细胞的基因组中产生两个双链断裂，其中将所述插入序列插入所述多个哺乳动物细胞的基因组中并桥接所述多个哺乳动物细胞的基因组中的所述两个双链断裂。
72.如任一前述权利要求所述的方法，其中将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸从哺乳动物细胞基因组中缺失。
73.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述同源臂中的每一个均包含是三或四的倍数的多个核苷酸。
74.如任一前述权利所述的方法，其中所述同源臂中的每一个均包含5-100个碱基对。
75.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述同源臂侧接用于插入的序列。
76.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述同源臂中的至少一个由指导RNA所靶向的序列侧接。
77.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述同源臂包含相同的序列。
78.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述同源臂包含不同的序列。
79.如权利要求77所述的方法，其中所述同源臂侧接用于插入的所述序列。
80.如权利要求77所述的方法，其中所述同源臂包含与TRAC或TCRB基因座中的序列同源的序列。
81.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述同源臂包含与30-70、35-65、40-60、45-55、45-50、60-80、60-100、50-200、100-400、200-600或500-1000个碱基长度同源的序列。
82.如权利要求80所述的方法，其中所述同源臂包含与48个碱基长度同源的序列。
83.如任一前述权利要求所述的方法，其还包括破坏所述哺乳动物细胞基因组中的一个或多个额外基因。
84.如任一前述权利要求所述的方法，其还包括在(a)中引入包含用于插入的序列的一个或多个额外多核酸构建体，在(b)中在所述哺乳动物细胞基因组中的额外位点处产生双链断裂，在(c)中在所述一个或多个额外多核酸构建体中产生双链断裂，以及将用于插入的所述一个或多个额外序列插入所述哺乳动物细胞基因组中的所述额外位点中。
85.如权利要求50至84中任一项所述的方法，其中所述第一gRNA和所述第二指导RNA包含包括与SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:82中的至少一部分至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性的序列。
86.一种制造工程化T细胞的方法，其包括：
(a)提供来自人类受试者的原代T细胞；
(b)将以下离体引入所述原代T细胞中：
(i)核酸酶或编码所述核酸酶的多核酸，其中所述核酸酶是CRISPR相关核酸酶；
(ii)第一指导RNA或编码所述第一指导RNA的多核酸，其中所述第一指导RNA靶向所述原代T细胞的TRAC或TCRB基因座中的序列；
(iii)第二指导RNA或编码所述第二指导RNA的多核酸；以及
(iv)包含用于插入的序列的多核酸构建体，其中用于插入的所述序列包含编码外源T细胞受体或嵌合抗原受体的序列，其中所述多核酸构建体包含侧接用于插入的所述序列的第一短同源臂和第二短同源臂，其中所述第一短同源臂和所述第二短同源臂包含与所述原代T细胞的TRAC或TCRB基因座中的序列同源的序列，其中所述第一短同源臂少于50个碱基对并且所述第二短同源臂少于50个碱基对，其中所述第一短同源臂和所述第二短同源臂由所述第二指导RNA所靶向的序列侧接；
(c)在所述原代T细胞的基因组的所述TRAC或TCRB基因座中产生双链断裂，其中所述TRAC或TCRB基因座中的双链断裂由所述CRISPR相关核酸酶和所述第一指导RNA产生，其中所述双链断裂在与所述第一短同源臂同源的第一序列和与所述第二短同源臂同源的第二序列之间；以及
(d)在所述多核酸构建体中产生两个双链断裂，从而产生裂解的多核酸构建体，其中所述裂解的多核酸构建体在第一末端包含所述第一短同源臂并在第二末端包含所述第二短同源臂，其中所述两个双链断裂由所述CRISPR相关核酸酶和所述第二指导RNA产生；
(e)通过同源性介导的末端连接将编码所述外源T细胞受体的所述序列在所述TRAC或TCRB基因座中的所述双链断裂位点处插入所述原代T细胞基因组中。
87.如权利要求86所述的方法，其中(b)的所述引入在与外源免疫刺激剂的接触之后30小时至36小时发生。
88.如权利要求87所述的方法，其中(b)的所述引入在与所述外源免疫刺激剂的所述接触之后36小时发生。
89.如权利要求87至88中任一项所述的方法，其中所述外源免疫刺激剂是B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、S-2-羟基戊二酸酯、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、IL-15、IL-17、IL-21、IL-2、IL-7或截短CD19。
90.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求1至89中任一项所述的组合物。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述癌症为膀胱癌、上皮癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、食管癌、胃肠道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、肺泡状横纹肌肉瘤、肛管癌、直肠癌、眼癌、颈部癌、胆囊癌、胸膜癌、口腔癌、外阴癌、结肠癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、腹膜癌、肾脏癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述癌症为胃肠道癌、乳腺癌、淋巴瘤或前列腺癌。
93.如权利要求90至92中任一项所述的方法，其中如权利要求1至88中任一项所述的所述工程化哺乳动物细胞群对于所述受试者是同种异体的或自体的。
94.一种哺乳动物细胞，其包含：
(a)多核酸构建体，其包含由同源臂侧接的外源序列，其中所述同源臂包含与邻近所述哺乳动物细胞的基因组中的靶位点的序列的至多400个连续核苷酸同源的序列，其中所述多核酸已经裂解并包含切除末端；以及
(b)所述哺乳动物细胞的基因组中的双链断裂，其中由所述双链断裂暴露的至少一个末端被切除。
95.一种哺乳动物细胞，其包含：
(a)多核酸构建体，其包含由同源臂侧接的具有至少1000个碱基对的插入序列，其中所述同源臂包含与邻近所述哺乳动物细胞的基因组中的靶位点的序列的至多400个连续核苷酸同源的序列；以及
(b)所述哺乳动物细胞的基因组中的双链断裂，其中由所述双链断裂暴露的至少一个末端被切除。
96.如权利要求94或95所述的哺乳动物细胞，其中所述同源臂包含与30-70、35-65、40-60、45-55或45-50个碱基长度同源的序列。
97.如权利要求96所述的哺乳动物细胞，其中所述同源臂包含与48个碱基长度同源的序列。
98.如权利要求94至97中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
99.如权利要求94至98中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是原代细胞。
100.如权利要求94至99中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是免疫细胞。
101.如权利要求100所述的哺乳动物细胞，其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。
102.如权利要求101所述的哺乳动物细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。
103.一种哺乳动物细胞，其通过如权利要求1至89中任一项所述的方法制备。
104.一种哺乳动物细胞群，其通过如权利要求1至89中任一项所述的方法制备。
105.一种药物组合物，其包含通过如权利要求1至89中任一项所述的方法制备的哺乳动物细胞。
106.一种药物组合物，其包含通过如权利要求1至89中任一项所述的方法制备的哺乳动物细胞群。
107.一种工程化多核苷酸，其包含包括如通过BLAST所确定的与SEQ ID NO:81或SEQID NO:84的至少一部分至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性的序列。
108.一种工程化多核苷酸，其包括如通过BLAST所确定的与SEQ ID NO:79或SEQ IDNO:82的至少一部分至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性。
109.一种核糖核蛋白(RNP)，其包含如权利要求107至108中任一项所述的工程化多核苷酸。
110.如权利要求109所述的RNP，其还包含内切核酸酶，其中所述内切核酸酶包括CRISPR内切核酸酶。
111.一种细胞，其包含如权利要求107至108中任一项所述的工程化多核苷酸或如权利要求109至110所述的RNP。
112.一种细胞群，其包括如权利要求111所述的细胞。
113.一种试剂盒，其在容器中包含如权利要求107至108中任一项所述的工程化多核苷酸和/或如权利要求109至110中任一项所述的核糖核蛋白。
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