CN115166064A - 一种氟伐替尼杂质的分离检测方法 - Google Patents

一种氟伐替尼杂质的分离检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氟伐替尼杂质分离检测方法，所述杂质为4‑氯‑7‑甲氧基喹啉‑6‑甲酰胺。该方法采用液相色谱法，以十八烷基硅胶色谱柱为固定相，以甲醇‑水‑高氯酸和乙腈‑甲醇‑水‑高氯酸为流动相进行梯度洗脱，可以实现杂质4‑氯‑7‑甲氧基喹啉‑6‑甲酰胺的有效分离及准确定量。该方法的专属性好、灵敏度高，杂质的峰形较佳，且该方法的系统适用性、准确度、线性及灵敏度均符合验证要求。

Description

一种氟伐替尼杂质的分离检测方法
技术领域
本发明属于药物分析化学领域，具体涉及氟伐替尼杂质（即4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺）的分离检测方法。
背景技术
氟伐替尼是一种处于研究阶段的小分子多靶点激酶抑制剂，其化学结构式如下式I：
Figure 103543DEST_PATH_IMAGE001
氟伐替尼可作用于血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR1/2/3），纤维细胞生长因子受体（FGFR1/2/3/4）和转染期间重新排列（RET）等多个靶点，具有靶向治疗肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的潜力。其药理作用机制是通过抑制 VEGF/VEGFR、FGF/FGFR信号通路，从而控制肿瘤细胞生长、存活、增殖和迁移。HCC是最常见的恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、进展快、复发早和预后差的临床特点；我国原发性肝癌发病率一直居高不下，约90%是肝细胞肝癌（HCC），严重威胁着国人生命健康，是一种临床急需的药物。用法用量：需根据I期临床和II期临床试验结果确定。
杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺为氟伐替尼合成路线的起始原料之一，属于不饱和卤代化合物，其结构式如上式II。该杂质化合物属于Ames阳性杂质，本身具有基因毒性，需要作为基因毒性杂质在药物成品中进行严格控制。
WO2019092625A1公开了一种采用HPLC色谱法检测4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的色谱纯度的方法，其HPLC方法参数如下：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，稀释剂乙腈:水=8:2，检测波长241&272nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样体积10μl 。
CN108299294A公开了一种通过HPLC方法监控反应过程中起始原料4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的剩余量，其HPLC方法是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，三乙胺和乙腈溶液为流动相进行洗脱。
本发明人在氟伐替尼有关物质方法学研究过程中，采用上述两件专利公开的HPLC方法，分离检测氟伐替尼中4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺杂质含量（参见对比例1），实验结果发现上述HPLC方法专属性差，在4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的出峰位置存在其他杂质的干扰，无法准确定量基因毒性杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的含量。此外，本发明人发现采用常规的HPLC-UV检测体系，如流动相A选用醋酸盐缓冲液或甲酸水溶液，流动相B采用纯乙腈，也难以将4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺与氟伐替尼中的其他有关物质很好的分离，同样存在专属性差的问题；同时，根据ICH M7的要求，计算得到氟伐替尼中杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的限度为500ppm，这对方法的灵敏度提出了较高的要求；本发明人采用CN108299294A中的三乙胺和乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱检测（参见对比例2），发现方法的检测灵敏度低，不能满足基因毒性杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺含量检测的需求。综上，采用HPLC-UV方法对氟伐替尼中的基因毒性杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺进行定量分析难度较大，不能保证氟伐替尼及其制剂产品的质量控制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氟伐替尼杂质的分离检测方法，该方法对基因毒性杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺能进行有效的分离和定量检测，专属性好、灵敏度高，对氟伐替尼原料药和制剂的质量控制具有重要的意义。
为实现本发明的目的，提供如下实施方案。
在一实施方案中，本发明的一种氟伐替尼杂质的分离检测方法，所述杂质为4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺，该方法为液相色谱法，包括：1）色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，2）流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为甲醇-水-高氯酸，所述流动相B为乙腈-甲醇-水-高氯酸，3）采用梯度洗脱法。
上述本发明的方法，所述流动相A，甲醇-水-高氯酸的体积比为（4~6）：（96~94）：（0.05~0.2），所述流动相B，乙腈-甲醇-水-高氯酸的体积比为（60~70）：（35~15）：（5~15）：（0.05~0.2）。
优选的，上述本发明的方法所述流动相A，甲醇-水-高氯酸的体积比为5：95：0.1，所述流动相B，乙腈-甲醇-水-高氯酸其中甲醇的体积比为70：20：10：0.1。
优选的，上述本发明的方法，所述梯度洗脱法，其流动相梯度变化如下：
Figure 20683DEST_PATH_IMAGE002
上述本发明的方法，具体过程包含以下步骤：
a)对照品溶液：取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺适量，精密称定，加有机溶剂溶解并用稀释剂稀释制成每1ml中约含4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺0.075μg的溶液，作为对照品溶液；
b)供试品溶液：取供试品适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含供试品0.15mg的溶液，作为供试品溶液；
c)设置流动相的流速为0.9~1.1ml/min，流动相中高氯酸含量为0.05%~0.2%，检测波长为200~400nm，色谱柱的柱温为25℃~40℃，进样量为5μl ~100μl；
d)取相同体积的步骤a）的对照品溶液、b）的供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，使用外标法计算得到4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的含量。
上述本发明的方法，步骤a）或b）中所述有机溶剂为乙腈，稀释剂为1~3g/L碳酸钠溶液-乙腈-甲醇的混合溶液，其体积比为（460~540）：（500~400）：（40~60），优选其体积比为500:450:50；步骤c）中所述流动相的流速为1.0ml/min，流动相中高氯酸含量为0.1%，检测波长为252nm，所述色谱柱的柱温为37℃，所述进样量为10μl。
在一具体实施方案中，本发明的一种氟伐替尼杂质的分离检测方法，所述杂质为4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺，该方法包含以下过程：
1）配制对照品溶液
2）配制供试品溶液
3）将步骤1）和/或2）的对照品溶液和供试品溶液分别注入液相色谱仪，其特征在于：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为甲醇-水-高氯酸，其体积比为（4~6）：（96~94）：（0.05~0.2），优选为5：95：0.1，所述流动相B为乙腈-甲醇-水-高氯酸，体积比为（60~70）：（35~15）：（5~15）：（0.05~0.2），优选为70：20：10：0.1，采用梯度洗脱法。
上述本发明的方法，优选的，所述梯度洗脱法，其流动相梯度变化如下：
Figure 800420DEST_PATH_IMAGE003
在上述具体实施方案中，本发明的方法，过程1）中所述配制对照品溶液：取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺适量，精密称定，加有机溶剂溶解并用稀释剂稀释制成每1ml中约含4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺0.075μg的溶液，作为对照品溶液；过程2）中所述配制供试品溶液：取供试品适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含供试品0.15mg的溶液，作为供试品溶液；其中，所述有机溶剂为乙腈，稀释剂为1~3g/L碳酸钠溶液-乙腈-甲醇的混合溶液，其体积比为（460~540）：（500~400）：（40~60），优选2g/L碳酸钠溶液-乙腈-甲醇的混合溶液，其体积比为500:450:50。
在上述具体实施方案中，本发明的方法，色谱仪参数设置：流动相的流速为0.9~1.1ml/min，优选为1.0ml/min，流动相中高氯酸含量为0.05%~0.2%，优选为0.1%，检测波长为200~400nm，优选为252nm，色谱柱的柱温为25℃~40℃，优选为37℃，进样量为5μl~100μl，优选为10μl。
本发明的方法的有益效果：本发明采用简单实用的HPLC-UV的检测方法，实现了氟伐替尼中基因毒性杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的有效分离和定量检测。该方法可以将氟伐替尼中的4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺与氟伐替尼中的其他有关物质有效分离，能准确测定4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的含量，其专属性好、灵敏度高，且简单、快速，从而可以准确控制氟伐替尼的质量。
特别是，本发明的方法采用常规十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，采用此色谱柱不仅成本低，又能够有效的分离检测氟伐替尼的基因毒性杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺，同时灵敏度也能达到相应要求。选用2g/L碳酸钠溶液-乙腈-甲醇（500:450:50）作为稀释剂溶解样品，避免了溶剂效应的产生；柱温为37℃，柱温耐用性好，峰形较好，又能让分离度达到最佳。流动相以梯度运行，能有效分离氟伐替尼中的基因毒性杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺，同时提高工作效率。本发明解决了氟伐替尼中基因毒性杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺不能有效分离、专属性差、灵敏度低的问题，从而保证了氟伐替尼的质量可控。
附图说明
图1 对比例1的液相色谱图；
图2 对比例2的液相色谱图与实施例1的液相色谱图对比；
图3 实施例1的空白溶剂的液相色谱图；
图4 实施例1的4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品溶液的液相色谱图；
图5 实施例1的氟伐替尼供试品溶液的液相色谱图；
图6 实施例1的氟伐替尼+100%限度浓度的杂质对照品的液相色谱图；
图7 实施例3的4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺线性关系图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明和理解本发明的精神实质，但不以任何方式限制本发明的范围。
对比例1
参照现有技术WO2019/092625A1和CN108299294A的方法
仪器与条件
仪器：岛津LC-20AD + 高灵敏检测器
色谱柱：Waters XBridge shield RP18 4.6*150 mm, 3.5 μm；
进样量：10μl；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：252nm；
稀释剂：乙腈-水（8:2）；
流动相A：10mM三乙胺水溶液（醋酸调整pH至6.8）；流动相B：乙腈；
梯度如下：
Figure 759411DEST_PATH_IMAGE004
实验步骤：
配制4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品溶液：取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰对照品约1mg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液1mL置50mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；
配制供试品溶液：取供试品约24.4mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；
分别取对照品溶液和供试品溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图；
结果见图1，实验结果显示，在4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的出峰位置存在其他杂质的干扰，方法专属性差，不符合质量管控要求。
对比例2
将本发明中的流动相替换为现有技术CN108299294A中的流动相
仪器与条件
仪器：岛津LC-20AD + 高灵敏检测器
色谱柱：YMC Pack Pro C18，4.6×250mm，5μm；
进样量：10μl；
流速：1.0ml/min；
柱温：37℃；
检测波长：252nm；
稀释剂：乙腈-水（8:2）；
流动相A：10mM三乙胺水溶液（醋酸调整pH至6.8）；流动相B：乙腈；
梯度如下：
Figure 573783DEST_PATH_IMAGE005
实验步骤：
配制4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品储备液：取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液1mL置50mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；
配制100%限度浓度杂质的供试品溶液：取供试品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品储备液2ml，置同一100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
取100%限度浓度杂质的供试品溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图；
结果见图2，实验结果显示，对比例2的方法专属性虽然能够满足要求，但方法灵敏度无法满足要求：100%限度浓度杂质的供试品溶液，在对比例2的方法中，目标杂质峰的S/N为31，当方法的定量限设置为限度浓度的30%时，目标杂质峰的S/N则会低于10，不符合定量限的要求；但100%限度浓度杂质的供试品溶液，在实施例1的方法中，目标杂质峰的S/N为120，灵敏度明显优于对比例2；同时，实施例1方法中目标杂质峰的峰形和基线也明显优于对比例2的方法。
实施例1 4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺HPLC-UV检测方法
仪器与条件：
仪器：岛津LC-20AD + 高灵敏检测器
色谱柱：YMC Pack Pro C18，4.6×250mm，5μm；
进样量：10μl；
流速：1.0ml/min；
柱温：37℃；
检测波长：252nm；
稀释剂：2g/L碳酸钠溶液-乙腈-甲醇（500:450:50）；
流动相A：甲醇-水-高氯酸（5%-95%-0.1%）；流动相B：乙腈-甲醇-水-高氯酸（70%-20%-10%-0.1%）；
梯度如下：
Figure 458563DEST_PATH_IMAGE006
实验步骤：
配制4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品储备液：称取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺约10mg，精密称定，置50ml量瓶，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液0.3ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得；
配制4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品溶液：精密量取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品储备液2.5ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
配制供试品溶液：取供试品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
配制100%限度浓度杂质的供试品溶液：取供试品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品储备液2.5ml，置同一100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
分别取空白溶液（稀释剂）、对照品溶液、供试品溶液和100%限度浓度杂质的供试品溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图；结果见图3、图4、图5和图6。
图3表明，溶剂不干扰测定。
图4表明，杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺响应较高，峰形较好。
图5表明，氟伐替尼中的基因毒性杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺为未检出。
图6表明，本发明的方法专属性好、灵敏度高，可以有效分离检测氟伐替尼中4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺这种基因毒性杂质，可用于氟伐替尼中基因毒性杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的分离测定。
实施例2 准确度实验
仪器与条件：
仪器：岛津LC-20AD+标准检测器
条件同实施例1
配制4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品储备液：称取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺约10mg，精密称定，置50ml量瓶，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液0.3ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
配制4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品溶液：精密量取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品储备液2.5ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
配制100%限度浓度杂质的供试品溶液：取供试品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品储备液2.5ml，置同一100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制6份。
分别取空白溶液（稀释剂）、对照品溶液、100%限度浓度杂质的供试品溶液，准确度结果汇总见下表1。
表 1 准确度实验结果汇总
Figure 725596DEST_PATH_IMAGE007
准确度实验结论：6份加标溶液的回收率为97.0%~101.3%，均在80%~120%之间，且RSD为1.8%，小于10%，符合要求，故准确度符合要求。
实施例3 线性实验
仪器与条件：
仪器：岛津LC-20AD+标准检测器
条件同实施例1
配制线性储备液：称取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺约10mg，精密称定，置50ml量瓶，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液0.3ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液照下表2进行配制：
表 2 线性溶液配制
Figure 986813DEST_PATH_IMAGE008
取各线性溶液，各进样1针，记录色谱图。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制线性关系图，见图5，并计算回归方程结果为Y = 184548.5119X + 300.0938（Y-峰面积；X-浓度，μg/ml），相关系数为0.9993，大于0.99，故4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺在0.0230μg/ml~0.1151μg/ml（相当于限度30%~150%，相当于主成分0.015%~0.06%）范围内线性符合要求。
实施例4 灵敏度实验
仪器与条件：
仪器：岛津LC-20AD+标准检测器
条件同实施例1
配制定量限溶液：同实施例3中线性溶液1，浓度为0.0230μg/ml。
配制检测限溶液：精密移取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
取定量限溶液连续进样6次，取检测限溶液进样1次，记录色谱图。
定量限结果见表3，连续进样6针，4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的RSD为4.9%，S/N均大于10。符合接受标准。故定量限为：0.0230μg/ml，相当于限度浓度的30%，相当于供试品溶液的0.015%（150ppm）。
检测限结果见表4，4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺S/N大于3。符合接受标准。故检测限为：0.0046μg/ml，相当于限度浓度的10%，相当于供试品溶液的0.005%（50ppm）。
表3 定量限试验结果
Figure 655692DEST_PATH_IMAGE009
表 4 检测限试验结果
Figure 711372DEST_PATH_IMAGE010
表3~4的灵敏度实验结果表明本发明提供的方法灵敏度良好。
上述表1~4的实验结果表明，本发明的技术方案能获得良好的分离测试效果，且系统适用性、准确度、线性及灵敏度均符合验证要求，能够很好的控制氟伐替尼中基因毒性杂质4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的含量，从而保证氟伐替尼的质量。
在不改变本发明的精神实质的条件下，对本发明作简单的替换或调整也属于本发明的范围。

Claims (10)

1.一种氟伐替尼杂质的分离检测方法，所述杂质为4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺，该方法为液相色谱法，包括：1）色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，2）流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为甲醇-水-高氯酸，所述流动相B为乙腈-甲醇-水-高氯酸，3）采用梯度洗脱法。
2.根据权利要求1所述的方法，所述流动相A，甲醇-水-高氯酸的体积比为（4~6）：（96~94）：（0.05~0.2）。
3.根据权利要求1所述的方法，所述流动相B，乙腈-甲醇-水-高氯酸的体积比为（60~70）：（35~15）：（5~15）：（0.05~0.2）。
4.根据权利要求2所述的方法，所述流动相A，甲醇-水-高氯酸的体积比为5：95：0.1。
5.根据权利要求3所述的方法，所述流动相B，乙腈-甲醇-水-高氯酸的体积比为70：20：10：0.1。
6.根据权利要求1所述的方法，所述梯度洗脱法，其流动相梯度变化如下：
Figure 54905DEST_PATH_IMAGE001
。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，包含以下步骤：
a)对照品溶液：取4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺适量，精密称定，加有机溶剂溶解并用稀释剂稀释制成每1ml中约含4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺0.075μg的溶液，作为对照品溶液；
b)供试品溶液：取供试品适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含供试品0.15mg的溶液，作为供试品溶液；
c)设置流动相的流速为0.9~1.1ml/min，流动相中高氯酸含量为0.05%~0.2%，检测波长为200~400nm，色谱柱的柱温为25℃~40℃，进样量为5μl~100μl；
d)取相同体积的步骤a）的对照品溶液、b）的供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，使用外标法计算得到4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的含量。
8.根据权利要求7所述的方法，步骤a）或b）中所述有机溶剂为乙腈，稀释剂为1~3g/L碳酸钠溶液-乙腈-甲醇的混合溶液，其体积比为（460~540）：（500~400）：（40~60）。
9.根据权利要求7所述的方法，步骤c）中所述流动相的流速为1.0ml/min，流动相中高氯酸含量为0.1%，检测波长为252nm，所述色谱柱的柱温为37℃，所述进样量为10μl 。
10.根据权利要求8所述的方法，所述稀释剂为2g/L碳酸钠溶液-乙腈-甲醇的混合溶液，其体积比为500:450:50。
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