CN115161393A - 一种ikzf1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒 - Google Patents

一种ikzf1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN115161393A
CN115161393A CN202210399730.8A CN202210399730A CN115161393A CN 115161393 A CN115161393 A CN 115161393A CN 202210399730 A CN202210399730 A CN 202210399730A CN 115161393 A CN115161393 A CN 115161393A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ikzf1
gene
rpph1
exon
polyploidy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210399730.8A
Other languages
English (en)
Inventor
李红
易丽君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JIANGXI CHILDREN' HOSPITAL
Original Assignee
JIANGXI CHILDREN' HOSPITAL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JIANGXI CHILDREN' HOSPITAL filed Critical JIANGXI CHILDREN' HOSPITAL
Priority to CN202210399730.8A priority Critical patent/CN115161393A/zh
Publication of CN115161393A publication Critical patent/CN115161393A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种IKZF1基因外显子2‑3多倍体检测试剂盒。KZF1基因外显子2‑3和RPPH1基因的检测引物和探针组，具体如下：IKZF1‑F：5’‑GTAAGCGATACTCCAGATGAGG‑3’；IKZF1‑R：5’‑CACGACTCTGTCACTCTTGG‑3’；IKZF1‑Probe：5’‑FAM‑CGATGAGCCCATGCCGATCCC‑BHQ1‑3’；RPPH1‑F：5’‑GGCGGATGCCTCCTTTG‑3’；RPPH1‑R：5’‑TACCTCACCTCAGCCATTGA‑3’；RPPH1‑Probe：5’‑HEX‑ACTTCGCTGGCCGTGAGTCTGTTC‑BHQ2‑3’。本发明采用的数字PCR IKZF1基因外显子2‑3多倍体检测方法，其特点为单管反应，同时对RPPH1基因和IKZF1外显子2‑3进行定量，通过二者比值判断IKZF1基因外显子是否存在多倍体，验操作简便，检测时间短，成本较低。

Description

一种IKZF1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒
技术领域：
本发明属于数字PCR领域，具体涉及一种数字PCR法检测IKZF1基因外显子2-3多倍体试剂盒。
背景技术：
IKZF1基因编码一种具有锌指结构的转录因子蛋白，编码具有调控淋巴细胞生产功能的转录因子IKAROS，在正常骨髓、淋巴细胞、红细胞、巨核细胞等分化的不同阶段发挥重要作用，是造血系统的重要调节基因之一，在淋巴细胞的分化和发育过程中起着重要的调控作用。IKZF1基因突变是成人B细胞急性淋巴细胞白血病的预后不良因素，约30％的急性淋巴性白血病患者中可检测到IKZF1基因突变，多表现为部分外显子缺失，导致IKZF1蛋白功能异常，也有少数患者两条IKZF1基因完全缺失，导致IKZF1基因的表达阴性。由于IKZF1 基因外显子的可变剪切，目前临床常见的IKZF1突变具有13种转录本，表现为N端DNA结合区锌指结构不同程度的缺失，从而影响DNA的结合能力和转录活性。临床上可使用基因芯片、琼脂糖凝胶电泳等方法对IKZF1基因缺失型突变进行检测，作为治疗和预后评估的参考依据。近年来，临床中又发现除传统的IKZF1基因缺失外，部分患者还伴随有IKZF1基因染色体上基因外显子2和外显子3出现多个拷贝，同样提示患者预后不良，但目前常规的染色体核型分析和基因芯片方法均无法对此突变类型进行检测。
目前检测IKZF1基因突变的方法主要包括染色体核型分析、基因芯片杂交、PCR-琼脂糖凝胶电泳等，其中染色体核型分析分辨率较低，对小片段的重复序列和多倍体无法检出，基因芯片杂交需要对突变区域设计特异性探针，成本较高，PCR-琼脂糖凝胶电泳容易受到基因缺失和拷贝数变化影响，无法准确判断罕见的基因变化类型和多倍体数量。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高、成本较低的基于数字PCR方法的IKZF1 基因外显子2-3多倍体检测试剂盒。
本发明的第一个目的是提供IKZF1基因外显子2-3和RPPH1基因的检测引物和探针组，具体如下：
IKZF1-F：5’-GTAAGCGATACTCCAGATGAGG-3’；
IKZF1-R：5’-CACGACTCTGTCACTCTTGG-3’；
IKZF1-Probe：5’-FAM-CGATGAGCCCATGCCGATCCC-BHQ1-3’；
RPPH1-F：5’-GGCGGATGCCTCCTTTG-3’；
RPPH1-R：5’-TACCTCACCTCAGCCATTGA-3’；
RPPH1-Probe：5’-HEX-ACTTCGCTGGCCGTGAGTCTGTTC-BHQ2-3’。
本发明的第二个目的是提供基于数字PCR方法的IKZF1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒，包括PCR预混液和上述特异性扩增IKZF1基因外显子2-3和RPPH1基因的检测引物和探针组。
本发明的第三个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的基于数字PCR方法的IKZF1 基因外显子2-3多倍体检测方法，其是提取样本DNA，用上述IKZF1基因外显子2-3和RPPH1 基因的检测引物和探针组分别进行PCR扩增，对IKZF1外显子2-3和管家基因RPPH1进行拷贝数定量，通过计算IKZF1基因外显子2-3和RPPH1拷贝数比例，判断是否存在IKZF1外显子2-3多倍体。
优选，所述的PCR扩增程序是95℃，10min；60℃，45sec升温速率：1.5℃/S。
优选，所述的PCR反应试剂包括2×PCR MIX，12.5μL；IKZF1-F，0.5μM；IKZF1-R，0.5μM；IKZF1-Probe，0.25μM；RPPH1-F，0.5μM，RPPH1-R，0.5μM，RPPH1-Probe，0.25μM，模板1.0μL。
本发明采用的数字PCR IKZF1基因外显子2-3多倍体检测方法，其特点为单管反应，同时对RPPH1基因和IKZF1外显子2-3进行定量，通过二者比值判断IKZF1基因外显子是否存在多倍体，验操作简便，检测时间短，成本较低。
本发明主要的技术特点是：(1)同时对IKZF1外显子2-3和管家基因RPPH1进行拷贝数定量，通过计算IKZF1基因外显子2-3和RPPH1拷贝数比例，判断是否存在IKZF1外显子2-3多倍体。不受IKZF1基因其他区域突变如缺失、易位等影响。(2)操作简单，结果判读客观方便。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中所使用的方法如无特殊说明，均采取本领域常规技术方法，所使用的原料如无特殊说明，均为市售原料。
实施例1：数字PCR检测IKZF1外显子2-3多倍体
本发明采取了以下技术方案
一种基于数字PCR方法的IKZF1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒，包括特异性扩增基因IKZF1外显子2-3和内参基因RPPH1的正向引物、反向引物和探针；
引物、探针具体序列信息如下：
IKZF1-F：5’-GTAAGCGATACTCCAGATGAGG-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
IKZF1-R：5’-CACGACTCTGTCACTCTTGG-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
IKZF1-Probe：5’-FAM-CGATGAGCCCATGCCGATCCC-BHQ1-3’，核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
RPPH1-F：5’-GGCGGATGCCTCCTTTG-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
RPPH1-R：5’-TACCTCACCTCAGCCATTGA-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
RPPH1-Probe：5’-HEX-ACTTCGCTGGCCGTGAGTCTGTTC-BHQ2-3’，核苷酸序列如 SEQID NO.6所示；
基于数字PCR方法的IKZF1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒的反应体系为25.0μL，包括2×PCR MIX，12.5μL；IKZF1-F，0.5μM；IKZF1-R，0.5μM；IKZF1-Probe，0.25μM；RPPH1-F， 0.5μM，RPPH1-R，0.5μM，RPPH1-Probe，0.25μM，模板1.0μL。
一种基于数字PCR方法的IKZF1基因外显子2-3多倍体检测方法，包括如下步骤：
适用样本为EDTA抗凝全血，住院样本0-10℃保存不超过3个月，-20℃保存不超过6个月，避免反复冻融。使用人基因组DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司) 进行核酸提取，提取的基因组DNA-20℃保存不超过6个月。
①试剂准备：首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。
(1)PCR反应液的配制标准为：取所述的PCR反应试剂包括2×PCR MIX 12.5μL(北京康为世纪生物科技有限公司)；IKZF1-F，0.5μM；IKZF1-R，0.5μM；IKZF1-Probe，0.25μM；RPPH1-F，0.5μM，RPPH1-R，0.5μM，RPPH1-Probe，0.25μM，模板1.0μL。加入到1.5mL 离心管中，振荡混匀数秒，3000g离心数秒。
(2)PCR反应液液滴生产：使用北京新弈数字PCR液滴生成仪进行液滴生成。
(3)将制备好液滴的PCR管放至PCR仪上进行扩增，反应条件95℃，10min；60℃，45sec升温速率：1.5℃/S。
(4)将反应完的PCR管放至北京新弈芯片阅读仪上进行液滴信号读取。
(5)结果分析：根据FAM和HEX荧光信号进行判读，以NTC对照为标准划分荧光阈值，软件进行计数统计，然后计算FAM荧光阳性液滴数和HEX荧光阳性液滴数比值。
结果分析具体如下：
在鉴定具体样品的时候：
1.空白对照应FAM、HEX阳性液滴数均小于100。
2.阴性对照管：FAM阳性液滴数/HEX阳性液滴数比值应<1.2且>0.8。
3.阳性对照管：FAM阳性液滴数/HEX阳性液滴数应>1.6且<2.4。
4.若满足以上要求，表明此次实验成功，对样品管进行分析，计算样品管FAM阳性液滴数/HEX阳性液滴数比值，若比值<1.2且>0.8，则判断无IKZF1基因外显子2-3多倍体，若比值>1.2，则判断存在IKZF1基因外显子多倍体。
实施例2基于数字PCR检测IKZF1健康人群IKZF1基因外显子2-3多倍体情况。
样本选择：使用不同健康人群抗凝的静脉外周血作为样本进行检测，操作方法同实施例 1，检测结果如下，所有健康人群的IKZF1基因外显子2-3均为正常。
Figure RE-GDA0003825429210000051
Figure RE-GDA0003825429210000061
实施例3基于数字PCR检测IKZF1健康人群不同浓度基因组DNA基因外显子2-3多倍体情况。
样本选择，选择一名健康人，提取基因组DNA后以紫外分光光度计进行核酸定量，并梯度稀释后作为模板进行检测，检测结果如下，说明本方法检测限可低至1ng基因组DNA：
Figure RE-GDA0003825429210000062
实施例4基于数字PCR检测IKZF1阳性样本基因组DNA IKZF1基因外显子2-3多倍体情况
样本选择，选择一名一条染色体上存在IKZF1基因外显子2-3 2个拷贝，另一条染色体正常的患者外周血标本，提取基因组DNA后以紫外分光光度计进行核酸定量，并梯度稀释后作为模板进行检测，检测结果如下，说明本方法检测限可低至0.5ng基因组DNA：
Figure RE-GDA0003825429210000071
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围，因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 江西省儿童医院
<120> 一种IKZF1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtaagcgata ctccagatga gg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacgactctg tcactcttgg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgatgagccc atgccgatcc c 21
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcggatgcc tcctttg 17
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tacctcacct cagccattga 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acttcgctgg ccgtgagtct gttc 24

Claims (5)

1.IKZF1基因外显子2-3和RPPH1基因的检测引物和探针组，其特征在于，具体如下：
IKZF1-F：5’-GTAAGCGATACTCCAGATGAGG-3’；
IKZF1-R：5’-CACGACTCTGTCACTCTTGG-3’；
IKZF1-PROBE：5’-FAM-CGATGAGCCCATGCCGATCCC-BHQ1-3’；
RPPH1-F：5’-GGCGGATGCCTCCTTTG-3’；
RPPH1-R：5’-TACCTCACCTCAGCCATTGA-3’；
RPPH1-PROBE：5’-HEX-ACTTCGCTGGCCGTGAGTCTGTTC-BHQ2-3’。
2.一种基于数字PCR方法的IKZF1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒，其特征在于，包括PCR预混液和权利要求1所述的IKZF1基因外显子2-3和RPPH1基因的检测引物和探针组。
3.一种非疾病的诊断和治疗目的的基于数字PCR方法的IKZF1基因外显子2-3多倍体检测方法，其特征在于，提取样本DNA，用权利要求1所述的IKZF1基因外显子2-3和RPPH1基因的检测引物和探针组分别进行PCR扩增，对IKZF1外显子2-3和管家基因RPPH1进行拷贝数定量，通过计算IKZF1基因外显子2-3和RPPH1拷贝数比例，判断是否存在IKZF1外显子2-3多倍体。
4.根据权利要求3所述的非疾病的诊断和治疗目的的基于数字PCR方法的IKZF1基因外显子2-3多倍体检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增程序是95℃，10min；60℃，45sec升温速率：1.5℃/S。
5.根据权利要求3所述的非疾病的诊断和治疗目的的基于数字PCR方法的IKZF1基因外显子2-3多倍体检测方法，其特征在于，所述的PCR反应试剂包括2×PCRMIX，12.5μL；IKZF1-F，0.5μM；IKZF1-R，0.5μM；IKZF1-Probe，0.25μM；RPPH1-F，0.5μM，RPPH1-R，0.5μM，RPPH1-Probe，0.25μM，模板1.0μL。
CN202210399730.8A 2022-04-15 2022-04-15 一种ikzf1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒 Pending CN115161393A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210399730.8A CN115161393A (zh) 2022-04-15 2022-04-15 一种ikzf1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210399730.8A CN115161393A (zh) 2022-04-15 2022-04-15 一种ikzf1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115161393A true CN115161393A (zh) 2022-10-11

Family

ID=83482643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210399730.8A Pending CN115161393A (zh) 2022-04-15 2022-04-15 一种ikzf1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115161393A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102339760B1 (ko) 대규모 병렬 게놈 서열분석을 이용한 태아 염색체 이수성의 진단 방법
CN110760580B (zh) 一种肝癌的早期诊断设备
CN106834502A (zh) 一种基于基因捕获和二代测序技术的脊髓性肌萎缩症相关基因拷贝数检测试剂盒及方法
CN108588230B (zh) 一种用于乳腺癌诊断的标记物及其筛选方法
CN111073961A (zh) 一种基因稀有突变的高通量检测方法
CN110079594B (zh) 基于dna和rna基因突变检测的高通量方法
CN106591273A (zh) 一组与先天性代谢缺陷病相关的基因新突变及检测试剂盒
CN106521023B (zh) 一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒及方法
CN111051511A (zh) 用于与生物靶相关的表征的靶相关分子
CN112048560B (zh) 一种多内参结合序贯概率比检验分析her2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法
CN108753974B (zh) 一种结直肠癌肿瘤标志物及其检测方法与装置
CN116716397A (zh) 检测dmd基因变异的方法及装置和探针、试剂盒
JP2020512000A (ja) 胎児の染色体異常を検出する方法
CN105441454B (zh) Scap基因突变体及其应用
CN113980961A (zh) 一种用于smn1和smn2基因数字pcr检测的组合物及试剂盒
CN108342474A (zh) 一种用于检测端粒长度预测冠心病风险的试剂盒
CN104745594B (zh) Cyp4v2基因突变体及其应用
CN115161393A (zh) 一种ikzf1基因外显子2-3多倍体检测试剂盒
CN116732158A (zh) 22q11微缺失和/或微重复检测引物组、引物探针组合物、试剂盒及其应用
CN116064775A (zh) TRECs、KRECs和SMN1的检测试剂盒和检测方法
CN115011695A (zh) 基于游离环状dna基因的多癌种识别标志物、试剂盒及应用
CN110894531A (zh) 用于猪的str基因座集及用途
JP4922778B2 (ja) 遺伝子検査結果判定法およびプログラムおよびその装置
CN110438235B (zh) 基于毛干蛋白质组nsSNP进行人群来源推断的方法
CN112501306A (zh) 一种用于CpG岛甲基化表型检测的试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination