CN115161359A - 一种天然化（6s）-5-甲基四氢叶酸盐及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种天然化(6S)‑5‑甲基四氢叶酸盐及其制备方法，其中所述天然化(6S)‑5‑甲基四氢叶酸盐以叶酸为原料经还原等工艺制得，生产过程中不使用含铂或铅等重金属，以及甲醛、苯磺酸及其酯等原料；所述天然化(6S)‑5‑甲基四氢叶酸盐的含量不低于98％，JK12A量不高于0.1％，甲基四氢蝶酸不得检出，苯磺酸及其酯类不得检出，酶蛋白残留不高于1ng/g；本发明由于使用绿色生物的生产工艺，具有后处理方便、绿色环保、产品纯度高等优点。

Description

一种天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐及其制备方法

技术领域

本发明涉及合成技术领域，特指一种天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐及其制备方法。

背景技术

叶酸是最重要的维生素补充剂之一：功能重要，而且人体不能自行合成。人们最早发现的叶酸来自于自然界，属于天然叶酸范畴。天然叶酸是指天然存在的叶酸，先后在酵母提取物，动物肝脏等发现。1941年，美国学者米切尔(H.K.Mitchell)从菠菜叶发现了同样的成分，并将其命名为叶酸(folate)，这是人类最早对叶酸存在的认定，也是天然叶酸的原型物质。距今已经过了接近一个世纪，但是天然叶酸仍然不能以商品形式大规模供应。因为天然叶酸的高活性，换言之的不稳定性，提取，应用并保持足够的货架期还是一个艰难的任务。目前在食品和药品中人为添加的叶酸还只能是人工合成的叶酸。在亚洲国家，主要是非活性的合成叶酸，也就是蝶啶谷氨酸(folic acid)，简称FA，需要经过多步骤人体内酶促反应转化后才可以被利用；在欧美国家，从上世纪六十年代就出现了可以被直接吸收利用的叶酸，也就是活性叶酸。虽然活性叶酸也经历了漫长的不断提升的过程，但是其好处是显而易见的：不再需要经过非活性叶酸必须的转化过程，直接被吸收利用，可以绕过人体代谢酶活性也就是基因分型的差异，还可以绕过未代谢叶酸带来的种种问题。当然，这些问题的存在也是促成人工合成的活性叶酸出现的主要推动力。

所以，叶酸的本来面目应该是指天然叶酸，而合成叶酸则是天然叶酸的替代品。人工合成的活性叶酸是升级版的天然叶酸替代品。

合成的活性叶酸显著改善了叶酸补充剂的使用性能。但是由于技术的复杂性，活性叶酸经历了两个阶段的提升：第一阶段，从混旋的甲基四氢叶酸钙，到6S-5-甲基四氢叶酸钙。后者具备了天然叶酸的相同的空间结构，从而具备了相同的生物活性；第二阶段从无定型的6S-5-甲基四氢叶酸钙到结晶的6S-5-甲基四氢叶酸钙。科学家发现，通过形成稳定的结晶在干燥的情况下6S-5-甲基四氢叶酸盐可以抵御氧化降解。这才使活性叶酸真正具备了大规模使用的条件。上述阶段的跨越是随着时间的推进而实现的，符合人类文明的进步趋势。

结晶的活性叶酸是叶酸进步史的一个里程碑。但是，这个阶段的产品还存在较大问题，就是虽然满足了一般人群，但是忽视了最重要人群：胎儿的安全性需求。问题包含两个方面：1.生产过程使用了安全隐患比较大的原料：重金属离子，铂或者铅；甲醛，对甲基苯磺酸等直接和间接具有基因毒性的物质。有的物质比如对甲基苯磺酸及其酯还没有被列入检测控制项目。这些物质如果控制一定的残留，可以满足一般人群的安全需求，但是对于胎儿还是不够的。我们都知道，当生命处在单细胞或少细胞阶段是非常脆弱的。一个有害分子可能就会造成其发育异常，并随着发育放大传递缺陷。所以，这些有害物质，不是低于某个限度或者检测不出就可以了，而是不应该存在。多哈理论认为，胚胎发育期处于不良环境或者营养不良。2.工艺杂质控制粗糙。缺乏对工艺杂质的系统性安全性评估和控制。

上述问题，催生了新的天然化叶酸的问世。

天然化叶酸包含两个方面的特征：具备天然叶酸相同的化学和空间结构，从而具有和天然叶酸相同的生理活性；具备和天然叶酸相当的安全特性，具体说，就是使用先进技术提升合成工艺，规避有害原料；以目前技术能够实现的最高标准控制有害杂质JK12A和甲基蝶酸。

天然化叶酸不仅具备天然叶酸的优良活性，还具备以满足单细胞为生命起点的胚胎的安全需求，和天然叶酸相比，天然化叶酸突出的优点是稳定性方面的突破性提高。

提升天然化叶酸并不是简单的要求与天然叶酸结构近似或相同，而是在生产合成的过程中，利用绿色化学的理念，更环保的生产，并且所合成的6S-5-甲基四氢叶酸原料过程中不能使用任何可能对人体存在安全风险溶剂、催化剂，以达到非天然却在安全性方面胜似天然要求的叶酸产品。

目前6S-5-甲基四氢叶酸的大规模的合成方法主要是使用叶酸作为原料进行还原，制备成二氢叶酸，之后进一步还原得到四氢叶酸，还原过程中二氢叶酸蝶啶环上的SP2碳原子向SP3碳原子的转化会伴随手性中心的产生，因此化学合成中5-甲基四氢叶酸含有两个不对称中心，通常在5,6位双键加氢时，在6位形成光学活性碳原子，以外消旋(6R,S)形式存在，而(6S)形式是5-甲基四氢叶酸以自然形式存在的惟一形式，是在人体中具有活性的成分。现有技术中，二氢叶酸还原为四氢叶酸通常是需要使用硼氢化物还原法，常用的还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾，专利US201300409561A1描述了硼氢化钠还原进行甲基化的方法，专利CN103214487A描述了被硼氢化钾还原的方法。上述的利用化学还原的合成工艺方法不可避免的使用拆分剂以及催化剂，由于还原后需要针对性的分离手性化合物，将6R-四氢叶酸与6S-四氢叶酸分离，因此必需使用苯磺酸作为拆分剂，而苯磺酸酯类化合物是存在基因毒的风险的。

绿色化学是当今科研和生产的世界潮流，充分利用资源和能源，采用无毒、无害的原料；减少废物向环境的排放；提高原子的利用率；生产出有利于环境保护、社区安全和人体健康的环境友好的产品已经是大势所趋。可以看出使用有机合成的方法制备的6S-5-甲基四氢叶酸的工艺中，需要使用多种可能对胚胎发育产生负面影响的原料，上述工艺虽然是主流手段，但是其缺陷是显而易见的，产品中可能存在杂质残留对人体有一定危害，部分废料进入大自然也会污染环境。因此目前化工合成的方向逐渐转变为绿色生物合成。专利US20100151533A1描述了使用二氢叶酸还原酶生产6S-5-甲基四氢叶酸的方法，其中使用葡萄糖和葡萄糖脱氢酶作为NADPH的回收方法，来进行合成。

一般来言，目前的酶促方法合成的第一步是获得二氢叶酸，通过锌粉的碱性溶剂将合成叶酸还原为二氢叶酸，副产物为氢气。之后使用二氢叶酸还原酶，利用葡萄糖和葡萄糖脱氢酶作为NADPH的再生体系对二氢叶酸进行还原，获得手性的四氢叶酸。使用二氢叶酸还原酶进行生产的关键在于烟酰胺辅酶的再生，作为还原辅酶NADPH的价格昂贵因此无法按照反应方程以对应剂量添加。上述工艺不可避免使用较多的葡萄糖，要进一步从高浓度葡萄糖溶液分离所得的四氢叶酸，不可避免带来成本和产物纯度的下降。不仅如此，该工艺需要较大剂量的葡萄糖脱氢酶，最终产品中的酶蛋白残留难以控制，因此虽然酶促合成工艺已经基本可实现大规模的6S-5-甲基四氢叶酸的生产，但是考虑到成本和其他因素，目前很少有企业采用该工艺进行生产6S-5-甲基四氢叶酸。

发明内容

本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐及其制备方法，具有后处理方便、绿色环保、产品纯度高等优点。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐，所述天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐以叶酸为原料经还原等工艺制得，生产过程中不使用含铂或铅等重金属，以及甲醛、苯磺酸及其酯等原料；所述天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的含量不低于98％，JK12A量不高于0.1％，甲基四氢蝶酸不得检出，苯磺酸及其酯类不得检出，酶蛋白残留不高于1ng/g。

本发明还公开了一种合成天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

步骤1：叶酸用碱性溶液溶解，在惰性气体保护下用锌粉还原得到二氢叶酸，之后用酸调节pH值至约中性；

步骤2：氢化酶溶液使用氢气进行孵育；

步骤3：在NADP+或NADPH、氢化酶、氢气存在下，用二氢叶酸还原酶立体选择性还原二氢叶酸，得到(6S)-四氢叶酸；

步骤4：使用甲酸将(6S)-四氢叶酸转化为相关衍生物后，还原转化为天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐。

其中所述(6S)-5-甲基四氢叶酸盐选自(6S)-5-甲基四氢叶酸的酸加成盐，优选(6S)-5-甲基四氢叶酸盐酸盐、(6S)-5-甲基四氢叶酸硫酸盐或(6S)-5-甲基四氢叶酸磷酸盐。

在另一种方案中，(6S)-5-甲基四氢叶酸加入金属盐反应，得到(6S)-5-甲基四氢叶酸碱盐；所述金属盐可以选择氯化钙、氯化镁、碳酸钠等，所述(6S)-5-甲基四氢叶酸碱盐优选(6S)-5-甲基四氢叶酸钙盐、(6S)-5-甲基四氢叶酸镁盐或(6S)-5-甲基四氢叶酸钠盐。

更具体的，在第一步骤中，在适当大小的反应容器中，通过叶酸、氢氧化钠或碳酸钠溶液(PH约13-13.5)搅拌溶解制成叶酸钠盐，之后加入锌粉和磷酸，将叶酸钠还原成二氢叶酸。需要注意的是，第一步中所有反应应在惰性气体保护下(例如，氮气或氩气)下进行。

在本发明所述方法的第二步骤中，将步骤1中生成的氢气收集，步骤1的主要反应的示意图见说明书附图1。步骤1的反应的投入原料是叶酸、磷酸、水、氢氧化钠、锌，而产出的是二氢叶酸钠，水，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，磷酸锌，氢气。

在该反应过程中叶酸钠通过还原生成二氢叶酸，还原过程中会产生的副产物包括磷酸锌和氢气，反应会产生较多的氢气，而氢气作为易燃易爆的危险气体，在其他(6S)5-甲基四氢叶酸合成工艺中往往作为废气排出，而在本发明则利用合成路线中产生的氢气作为下一步骤反应的原料之一。本发明步骤1中的氢气与惰性气体的混合气体，在p＝1.1-1.3par的压力下与氢化酶溶液进行饱和孵育。

本发明的氢化酶需要在隔绝氧气的环境下才具有高活性，而本发明步骤1中由于二氢叶酸的不稳定，反应本身也是在惰性气体保护下进行，因此反应过程中，反应釜中气体主要为不含氧气的惰性气体，且氢气比例逐渐增加，可以直接通过管道转移至氢化酶溶液的容器中进行孵育。之后可在氢化酶溶液中加入连二硫酸钠以除去残余的氧气。

在本发明的步骤3中，在保持惰性气体保护的同时，将步骤1的一系列的反应物加入反应容器中，并添加但不限于以下的反应物：二氢叶酸还原酶，NADP+或NADPH。同时将步骤2中的氢化酶溶液混合物加入，在40℃下搅拌，直到二氢叶酸基本转换完毕，然后过滤反应液，反应示意图见附图2。

在本发明的步骤4中，将(6S)-四氢叶酸转化为(6S)-5-甲基四氢叶酸，常规方法一般使用适量的甲醛，转化为5-10-亚甲基四氢叶酸，之后通过硼氢化物还原，得到(6S)-5-甲基四氢叶酸，在本发明中优选甲酸作为环合溶剂，首先将(6S)-5-甲基四氢叶酸转化为(6R)-5-10-亚甲基四氢叶酸盐，之后通过CN201711459340.0所描述的方法，利用Pd/CNTs或Pd/AC，催化反应最后得到(6S)-5-甲基四氢叶酸。

本发明所述的氢化酶来源于嗜热古菌Pyrococcus furiosus的可溶性氢化酶，一种经典的氢化酶。基于本发明的理解，氢化酶也可选自脱硫弧菌Desulfovibrio vulgaris的氢化酶，产碱杆菌Ralstonia eutropha H16的氢化酶，等可以提供氢离子的氢化酶。本发明所述氢化酶为厌氧酶，酶活会因氧气而损失。本发明所述步骤(2)中，所述氢化酶溶液在通入氢气之前需提前真空脱气并使用惰性气体保护。所述副产物氢气中惰性气体的体积分数ψi小于40％，优选小于30％，最优选小于20％。所述氢化酶溶液在通入氢气之前加入连二亚硫酸钠，所述连二亚硫酸钠的浓度为2-10μM，优选5μM。

本发明步骤(2)中氢气与氢化酶孵育温度为50-85℃，优先的孵育温度为60-80℃，更优选的孵育温度为70℃，孵育的压力应大于1.1bar，优选为1.3bar，氢化酶浓度为1-5g/L，孵育时间不小于10min。实验发现使用氢气孵育氢化酶溶液必需提供一定的压力，以利于氢分子在溶液中溶解，但过高的压力也会对设备产生影响，并且影响酶的活性。孵育时间与温度有关，温度越低所需的孵育时间约长。由于氢化酶的酶活无法重复的测量，因此本发明氢化酶的浓度以质量分数给出，而不是酶活。

优选本发明步骤(3)中反应浓度NADPH 5-30mM，优选的浓度为10mM，氢化酶的反应浓度为1-100mg/L，优选的氢化酶浓度为2.5mg/L，Tris盐酸盐浓度为50-400mM，优选的200mM，二氢叶酸还原酶浓度为2000U-60000U/L，优选浓度为3000-10000U/L。反应过程中维持pH值至7.3-8.0之间，优选pH7.5。

在本发明的步骤(4)中，将6S-四氢叶酸转化为6S-5-甲基四氢叶酸，常规方法为使用甲醛将其转化为5-甲基四氢叶酸的衍生物，本发明使用替代方法甲酸，将6S-四氢叶酸转换为(6R)-5,10-亚甲基四氢叶酸盐的环合物，通过还原开环得到(6S)-5-甲基四氢叶酸。

已经有人报道通过二氢叶酸还原酶生产(6S)-5-甲基四氢叶酸的方法，即通过葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的存在下，二氢叶酸还原酶选择性的立体还原二氢叶酸。该反应的原子利用效率很低，葡萄糖添加量几乎与二氢叶酸相当，所得的6S-四氢叶酸纯化较为复杂。发明人发现使用氢气与氢化酶不仅反应效率高，而且几乎没有副产物的产生，所得6S-四氢叶酸纯度高，同时由于前序工艺中同样需要使用惰性气体保护，副产物氢气不需要复杂的处理即可使用，符合循环，无污染的绿色化学要求。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、本发明所述天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐由于使用绿色生物的生产工艺，因此避免了可能产生基因杂质的拆分剂的使用，同时也避免甲醛的使用，所述的天然化叶酸对于常规方法中使用的手性拆分剂苯甲酸及其酯类不得检出，对于甲醛不得检出；

2、本发明率先使用氢气作为辅酶的再生系统，而氢气的副产物仅是质子或水，众所周知的是上述副产物对环境是非常友好，而且该反应的效率比葡萄糖/葡萄糖脱氢酶效率高，添加氢气的质量仅需葡萄糖的千分之一，并且本发明也充分利用上游的翻译的副产物氢气，实现了高水平的原子利用率；

3、本发明使用氢化酶的量非常少，所生产的天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的酶残留非常低，进一步体现了本发明的优越性。

附图说明

下面结合附图对本发明技术方案作进一步说明：

附图1为本发明步骤1中叶酸还原为二氢叶酸反应示意图；

附图2为本发明步骤2中二氢叶酸酶法还原反应示意图；

附图3为现有JK12A对斑马鱼心率的影响结果图；

附图4为现有JK12A斑马鱼胚胎发育的影响结果图；

附图5为现有5-甲基四氢蝶酸致斑马鱼发育畸形结果图；

附图6为现有5-甲基四氢蝶酸对斑马鱼胚胎发育的影响结果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

HPLC检测方法：

本发明所述纯度采用高效液相色谱法进行检测，具体条件为：

检测波长：280nm；

色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶(250×4.6mm,5μm)；

缓冲盐溶液：NaH2PO4溶液；

流动相A：用32％NaOH溶液调节缓冲盐溶液pH至6.5；

流动相B：甲醇和缓冲盐溶液(35：65)，用32％NaOH溶液调节pH至8.0；

流速为1.0ml/min；

进样量为10μl；

洗脱梯度；

T(min)	A％	B％
			0	100	0
14	45	55
			17	0	100
24	0	100
			24.01	100	0
33	100	0

实施例1：天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备

选择市售的合成叶酸10g，加入反应瓶中，加入60ml纯水，2.2g的氢氧化钠搅拌至叶酸完全溶解，之后添加锌粉5g，溶液在氮气保护下搅拌3小时，之后向溶液中添加磷酸将pH值调节值7.0。

取氢化酶(p.furiosus氢化酶Ⅰ，纯度23％)5mg，溶于5ml的50mM的Tris盐酸盐缓冲液中，缓冲液通过真空和氮气反复处理以排除氧气，最后加入20μl的1M的连二硫酸钠。用氢气在1.2bar压力下，饱和氢化酶缓冲液，并维持80℃，1个小时进行孵育。

在保持氮气保护的同时，将二氢叶酸反应液转入反应容器中，加入抗坏血酸2g，二氢叶酸还原酶溶液10ml(酶活65000U/L)，NADPH 0.1g，氢气孵育后的氢化酶缓冲液40μl，向反应瓶通入惰性气体和氢气的混合气体(V:V＝1:1)，加入50ml的100mM的Tris盐酸盐缓冲液加入反应维持40℃，搅拌3小时。

反应完毕后，向反应液加入适量的40g甲酸(浓度30％)，搅拌1小时，向反应液中加入1g Pd/CNTs，通氢气，维持压力0.8Mpa；反应温度60℃，反应3小时。过滤，滴加氢氧化钠溶液至中性，然后缓慢滴加盐酸溶液调pH至4，析出固体，搅拌1小时后，过滤，水洗真空50～60℃干燥得(6S)-5-甲基四氢叶酸盐酸盐。

取粗品(6S)-5-甲基四氢叶酸盐酸盐加入氯化钙，加入20％的抗坏血酸，重结晶得(6S)-5-甲基四氢叶酸钙，纯度99.7％。

实施例2：天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备

选择市售的合成叶酸10g，加入反应瓶中，加入60ml纯水，2.2g的氢氧化钠搅拌至叶酸完全溶解，之后添加锌粉5g，溶液在氮气保护下搅拌3小时，之后向溶液中添加磷酸将pH值调节值7.0。

取氢化酶(p.furiosus氢化酶Ⅰ，纯度30％)5mg，转移至高压反应釜中，溶于5ml的Tris盐酸盐缓冲液中，缓冲液通过真空和氩气反复处理以排除氧气，最后加入20μl的1M的连二硫酸钠。用氢气在1.3bar压力下，饱和氢化酶缓冲液，并维持70℃，2个小时进行孵育。

在保持氮气保护的同时，将二氢叶酸反应液转入反应容器中，加入抗坏血酸2g，二氢叶酸还原酶溶液10ml(酶活65000U/L)，NADPH 0.1g，氢气孵育后的氢化酶缓冲液40μl，向反应瓶通入惰性气体和氢气的混合气体(V:V＝1:1)，加入50ml的200mM的Tris盐酸盐缓冲液加入反应维持37℃，搅拌4小时。

反应完毕后，向反应液加入适量的40g甲酸(浓度30％)，搅拌1小时，向反应液中加入1g Pd/CNTs，通氢气，维持压力0.8Mpa；反应温度60℃，反应3小时。过滤，滴加氢氧化钠溶液至中性，然后缓慢滴加盐酸溶液调pH至4，析出固体，搅拌1小时后，过滤，水洗真空50-60℃干燥得(6S)-5-甲基四氢叶酸盐酸盐。

实施例3：天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备

选取500L的反应釜，投入50kg的叶酸(含量96％)的反应物料，之后投入150kg的氢氧化钠，水280L，搅拌至叶酸全部溶解，之后加入锌粉25kg，在惰性气体氩气保护下搅拌2小时，之后加入磷酸，以生成磷酸锌和去除未反应的锌粉。由于氢气的密度远小于氩气，在反应釜上方管道收集的气体中，氢气纯度较高，净得500L左右的氢气与氩气的混合气体，氢气占比达79％(体积比)。

在氩气保护下，取氢化酶(p.furiosus氢化酶Ⅰ，纯度30％)5g，转移至高压反应釜中，溶于5L的100mM的Tris盐酸盐缓冲液中，并添加0.8g的连二硫酸钠。将氢气压缩后不断通入氢化酶缓冲液中，80℃，搅拌2小时进行孵育，压力为1.3bar。

在氩气的保护下，向二氢叶酸的反应釜中添加二氢叶酸还原酶的酶液28L(酶活65000U/L)，辅酶NADP+0.6Kg，并加入Tris盐酸盐缓冲液至浓度为100mM，从高压反应罐中抽取已孵化完毕的氢化酶缓冲溶液以及氢气至反应釜中。搅拌反应釜3小时。

反应完毕后，反应液中加入12kg甲酸(浓度30％)，搅拌1小时，向反应液中加入500g Pd/CNTs，通氢气，维持压力0.8Mpa；反应温度60℃，反应3小时。过滤，滴加氢氧化钠溶液至中性，然后缓慢滴加盐酸溶液调pH至4，析出固体，搅拌1小时后，过滤，水洗真空50-60℃干燥得(6S)-5-甲基四氢叶酸盐酸盐。

取粗品(6S)-5-甲基四氢叶酸盐酸盐加入氯化钙，加入20％的抗坏血酸，重结晶得(6S)-5-甲基四氢叶酸钙，纯度99.7％。

实施例4：天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备

选择市售的合成叶酸10g，加入反应瓶中，加入60ml纯水，2.2g的氢氧化钠搅拌至叶酸完全溶解，之后添加锌粉5g，溶液在氮气保护下搅拌3小时，之后向溶液中添加磷酸将pH值调节值7.0。

取氢化酶(p.furiosus氢化酶Ⅰ，纯度30％)25mg，转移至高压反应釜中，溶于5ml的Tris盐酸盐缓冲液中，缓冲液通过真空和氩气反复处理以排除氧气，最后加入20μl的1M的连二硫酸钠。用氢气在1.5bar压力下，饱和氢化酶缓冲液，并维持80℃，2个小时进行孵育。

在保持氮气保护的同时，将二氢叶酸反应液转入反应容器中，加入抗坏血酸2g，二氢叶酸还原酶溶液10ml(酶活65000U/L)，NADPH 0.1g，氢气孵育后的氢化酶缓冲液40μl，向反应瓶通入惰性气体和氢气的混合气体(V:V＝1:1)，加入50ml的100mM的Tris盐酸盐缓冲液加入反应维持37℃，搅拌4小时。

反应完毕后，向反应液加入适量的40g甲酸(浓度30％)，搅拌1小时，向反应液中加入1g Pd/CNTs，通氢气，维持压力0.8Mpa；反应温度60℃，反应3小时。过滤，滴加氢氧化钠溶液至中性，然后缓慢滴加盐酸溶液调pH至4，析出固体，搅拌1小时后，过滤，水洗真空50-60℃干燥得(6S)-5-甲基四氢叶酸盐酸盐。

实施例5：天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备

选取5000L的高压反应釜，投入叶酸525kg，氢氧化钠1508kg，水2950L，搅拌5分钟至叶酸全部溶解，之后加入锌粉90kg，在惰性气体氩气保护下搅拌2小时，之后加入磷酸780L，以生成磷酸锌和去除未反应的锌粉。收集并储存反应副产物氢气。过滤，滤液转下一工序生产四氢叶酸。

在氩气保护下，取氢化酶(p.furiosus氢化酶Ⅰ，纯度30％)25g，转移至高压反应釜中，溶于5L的200mM的Tris盐酸盐缓冲液中，并添加0.8g的连二硫酸钠。将氢气压缩后不断通入氢化酶缓冲液中，60℃，搅拌5小时进行孵育，压力为1.1bar。

在氩气保护下，二氢叶酸混合液转入10000L反应容器中，投入物料抗坏血酸钠52.5kg，添加288L的二氢叶酸还原酶液(酶活65000U/L)，添加辅酶NADP+6.4Kg，并添加Tris盐酸盐缓冲液使其浓度达到200mM，之后将氢化酶缓冲液转移至二氢叶酸混合液中。40摄氏度下搅拌，期间使用氢气和氩气的混合气体保护，搅拌3小时。过滤，取滤液进入下一工序。

滤液加入甲酸120kg，搅拌1小时，向反应液中加入1000g Pd/CNTs，通氢气，维持压力0.8Mpa；反应温度60℃，反应3小时。过滤，滴加氢氧化钠溶液至中性，然后缓慢滴加盐酸溶液调pH至4，析出固体，搅拌1小时后，过滤，水洗真空50～60℃干燥得(6S)-5-甲基四氢叶酸盐酸盐。

取粗品(6S)-5-甲基四氢叶酸盐酸盐加入氯化钙，加入20％的抗坏血酸，重结晶得(6S)-5-甲基四氢叶酸钙，共得540kg，纯度99.3％。

实施例6

大鼠急性毒性试验

SD大鼠，SPF级，动物20只，雌雄各半，体重180-213g，由上海西普尔-必凯试验动物有限公司提供。生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016。饲养室温度20-25℃，相对湿度40-70％。动物饲料由苏州双狮实验动物饲料科技服务有限公司提供。样品名称：6S-5-甲基四氢叶酸钙(本发明所述新的天然化叶酸)。称取样品5g，加蒸馏水至20ml后充分混匀，按此比例配置制成最大可灌胃混悬液。动物禁食(不禁水)16小时后，按体重要求选用雌、雄大鼠各10只，分放于鼠笼内，按最大耐受量试验原则，采用经口灌胃方式给予各组实验动物相应剂量的供试液，动物逐只称重，灌胃容量按20ml/kg.BW计。24小时内分3次灌胃，时间间隔4小时。染毒后，观察动物一般状态、体重变化、中毒症状和死亡情况等，观察期为一周。

结果，试验期间各组动物活动正常，毛色光泽度好，未见任何中毒体征和死亡；到期处死动物，大体解剖肉眼观察各脏器情况，未见异常。

小结，样品对雌雄大鼠经口毒性试验的最大耐受剂量MTD均大于15g/kg，属无毒级。

小鼠急性毒性试验

昆明种小鼠，SPF级，动物数20只，雌雄各半，体重19-22g，由上海杰思捷试验动物有限公司提供，生产许可证号：SCCK(沪)2016-0006。饲养室温度20-25℃，相对湿度40-70％。样品名称：6S-5-甲基四氢叶酸钙(本发明所述天然化叶酸)。称取样品5g，加蒸馏水至20ml后充分混匀，按此比例配制成最大可灌胃混悬液。动物禁食(不禁水)16小时后，按体重要求选用雌、雄动物各10只，按性别分别放于鼠笼内，采用经口灌胃方式对实验动物染毒，动物逐只称重；灌胃容量按20ml/kg.Bw计。在24小时内分3次灌胃，时间间隔4小时。染毒后，观察动物的一般状态、体重变化、中毒症状和死亡情况等，观察期为一周。试验前后各队动物称重一次。对死亡动物及到期处死的动物进行尸体解剖，肉眼观察大体病理改变情况。

结果，试验期间各组动物活动正常，毛色光泽度好，未见任何中毒体征和死亡；到期处死动物，大体解剖肉眼观察各脏器情况，未见异常。

样品对雌雄小鼠急性经口毒性试验的最大耐受剂量MTD均大于15g/kg，属无毒级。

实施例7

JK12A的胚胎毒性试验

转基因型斑马鱼(fli-1:EGFP)来自于南京大学模式动物研究所。实验所用鱼是年龄小于1年的成年斑马鱼，饲养水体的pH值为7±0.2，温度在28℃左右，光照和黑暗的时间比是14h:10h，每天喂食两次丰年虫卵。前一天晚上把一雌两雄三条斑马鱼放在产卵盒中，第二天早上收集鱼卵。鱼卵放于胚胎培养液(0.2g/L的海盐配制而成)中，28℃培养

JK12A首先用水尝试溶解，发现溶解不佳，根据之前相关实验记录，选择用20mMNaHCO3溶解进行溶解，发现在14.08mM时JK12A完全溶解；溶解后的JK12A在恒温50℃水浴中孵育4个小时后取出备用。本次实验设置最大浓度14.08mM,此外设立7.04mM，3.52mM,1.76mM,20mM NaHCO3及control组进行实验。

试验方法

斑马鱼胚胎在2hpf开始置于24孔板加药培养，每孔10条，加入1mL的以上各浓度的JK12A溶液，一直作用到72hpf终止；发现胚胎死亡及时清理；每组3个复孔，每孔10个胚胎；8hpf，观察发育是否迟缓；24hpf，观察是否有发育畸形表型；48hpf，观察色素发育、心脏水肿、心率、体节间血管；72hpf，观察肠下网血管发育、定量体长。

结果：8hpf时，所有加药组均没有出现明显胚胎发育迟缓，各组生存率相当；24hpf时，斑马鱼胚胎已经形成头部和尾部的发育，并且尾部会有摆动现象，除了20mM NaHCO3组，其余各组斑马鱼生存率均发生下调，以7.04mM组下调幅度最大；48hpf时，斑马鱼胚胎心率受JK12A影响发生抑制，并且表现出明显的浓度依赖性(见说明书附图3)，同时生存率与24hpf时相比没有变化，此外体节间发育正常，未有心包膜水肿的情况出现；72hpf时，斑马鱼胚胎体长有被JK12A抑制的现象，但是抑制情况不显著，生存率较之前有降幅，但是降幅不大，整体生存率在0.8～1之间，并且所有实验组斑马鱼组肠下网发育正常，没有发生畸形现象(见说明书附图4)。结论，JK12A对斑马鱼的胚胎的生长发育是存在负面影响的，心率是较为突出的指标特征，显示可能JK12A对胚胎的心脏发育存在一定影响。

蝶酸的胚胎毒性

转基因型斑马鱼(fli-1:EGFP)来自于南京大学模式动物研究所。实验所用鱼是年龄小于1年的成年斑马鱼，饲养水体的pH值为7±0.2，温度在28℃左右，光照和黑暗的时间比是14h:10h，每天喂食两次丰年虫卵。前一天晚上把一雌两雄三条斑马鱼放在产卵盒中，第二天早上收集鱼卵。鱼卵放于胚胎培养液(0.2g/L的海盐配制而成)中，28℃培养。

用20mM的NaHCO3作为溶剂，在杂质C浓度为7.84mM时有最大溶解，以此为基础下设0.49mM,0.98mM,1.96mM及3.92mM五个浓度进行实验。溶解后的5-甲基四氢蝶酸(杂质C)母液在50℃水浴中孵育4个小时后，取出稀释进行后续试验。20mM NaHCO3作为溶剂对照。

斑马鱼胚胎在2hpf开始置于24孔板加药培养，每孔10条，加入1mL的以上各浓度的杂质C溶液和对照，一直作用到72hpf终止；发现胚胎死亡及时清理；每组3个复孔，每孔10个胚胎。8hpf，观察发育是否迟缓；24hpf，观察是否有发育畸形表型；48hpf，观察色素发育、心脏水肿、心率、体节间血管；72hpf，观察肠下网血管发育、定量体长。

试验结果

8hpf时，所有组的斑马鱼胚胎生存率都略有下调，发育正常，没有延迟；24hpf时，斑马鱼胚胎已经形成头部和尾部的发育，并且尾部会有摆动现象，生存率和8hpf相比没有变化；48hpf时，斑马鱼胚胎的心率并没有受杂质-C的影响被抑制下调，生存率与24hpf相比没有发生较大变化，且未有心包膜水肿的情况出现，体节间发育正常；72hpf时，胚胎在7.84mM杂质-C组中出现少量畸形现象，主要表现为躯干弯曲，此外，生存率与前两天相比只有control组和3.92mM组有略微下调，总体生存率都是在0.8以上，胚胎体长也随杂质-C浓度增长而变短，肠下网发育正常(见说明书附图5，6)。

5-甲基四氢蝶酸对斑马鱼的生长发育是存在一定的负面影响。由于溶解度限制，本次测试的最高浓度为7.8mM，由于样本数较少是否存在其他负面作用需要进一步研究。0.49mM左右浓度下即显示出一定的致畸性，由于本实验各组样本数较少，实际畸形发生率有待确认，从统计学角度看实际畸形发生率可能更高。

实施例7

二氢叶酸还原酶-葡萄糖脱氢酶工艺

选取500L的反应釜，投入叶酸52kg，氢氧化钠150kg，水295L，搅拌5分钟至叶酸全部溶解，之后加入锌粉9kg，在惰性气体保护下搅拌2小时，之后加入磷酸78L，过滤，滤液转下一工序生产四氢叶酸。

在惰性气体保护下，二氢叶酸混合液转入酶催化还原反应釜中，投入物料抗坏血酸钠5kg，添加29L的二氢叶酸还原酶液(酶活65000U/L)，添加辅酶NADP+0.65Kg，添加葡萄糖脱氢酶液29L(酶活72000U/L)，葡萄糖25Kg，搅拌3小时。过滤，取滤液进入下一工序。

滤液加入甲酸12kg，搅拌1小时，向反应液中加入1000g Pd/CNTs，通氢气，维持压力0.8Mpa；反应温度60℃，反应3小时。过滤，滴加氢氧化钠溶液至中性，然后缓慢滴加盐酸溶液调pH至4，析出固体，搅拌1小时后，过滤，水洗真空50～60℃干燥得(6S)-5-甲基四氢叶酸盐酸盐。

取粗品(6S)-5-甲基四氢叶酸盐酸盐加入氯化钙，加入20％的抗坏血酸，重结晶得(6S)-5-甲基四氢叶酸钙，共得48.9kg，纯度99.2％。

实施例8

7批次6S-5-甲基四氢叶酸产品进行基因毒杂质残留测试

如本发明背景技术所述，6S-5-甲基四氢叶酸钙的有机合成工艺制成中会使用到苯磺酸，而溶剂会用到乙醇或者异丙醇，因此可能含有苯磺酸乙酯或苯磺酸异丙酯。使用液质联用仪对7批产品进行检测。

仪器：安捷伦1290-ABSCIEX4500，液质联用仪；色谱柱，安捷伦C18柱(50mm*2.1mm)。检测条件：流动相A，5mM甲酸铵；流动相B，甲醇；洗脱梯度：70％B相等度洗脱7分钟；进样量：1μL；离子源温度：350℃(EI)；采集模式：SIM法选择离子检测(离子选择参数如下)：

标准品苯磺酸乙酯、苯磺酸异丙酯和苯磺酸标准品，用乙酸乙酯溶解并稀释成系列浓度。

购买商品原料3批，2批葡萄糖脱氢酶工艺原料，2批本发明所述天然化叶酸。上述7批次的6S-5-甲基四氢叶酸钙进行检测。

结果如下:

表1：7批次样品苯磺酸乙酯检测结果

表2：7批次样品苯磺酸异丙酯检测结果

结果表明，使用还原酶来加工，避免了工艺中苯磺酸的引入，天然化叶酸的苯磺酸乙酯和苯磺酸异丙酯均未检出。

实施例9

9批酶法工艺的酶蛋白残留的检测

研究项目：二氢叶酸还原酶酶蛋白含量，氧化型辅酶含量，葡萄糖脱氢酶含量，氢化酶含量。方法，利用凝胶色谱法测定二氢叶酸还原酶酶蛋白含量，氧化型辅酶含量，葡萄糖脱氢酶含量，氢化酶含量。色谱条件：采用TSK GEL凝胶色谱柱(300mm*7.8mm),以含0.15mol/L氯化钠的0.06mol/L的Tris-HCl溶液(pH 9.0)为流动相，流速0.5ml/min。

对照品，以原型蛋白为对照。

结果如下：

结果表明，使用新工艺后的天然化叶酸其酶蛋白残留与普通酶法工艺产品相比，酶蛋白残留下降了至少70％以上，有关蛋白残留不超过1ng/L。

以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐，其特征在于：所述天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐以叶酸为原料经还原等工艺制得，生产过程中不使用含铂或铅等重金属，以及甲醛、苯磺酸及其酯等原料；所述天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的含量不低于98％，JK12A量不高于0.1％，甲基四氢蝶酸不得检出，苯磺酸及其酯类不得检出，酶蛋白残留不高于1ng/g。

2.一种合成天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

步骤1：叶酸用碱性溶液溶解，在惰性气体保护下用锌粉还原得到二氢叶酸，之后用酸调节pH值至约中性；

步骤2：氢化酶溶液使用氢气进行孵育；

步骤3：在NADP+或NADPH、氢化酶、氢气存在下，用二氢叶酸还原酶立体选择性还原二氢叶酸，得到(6S)-四氢叶酸；

步骤4：使用甲酸将(6S)-四氢叶酸转化为相关衍生物后，还原转化为天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐。

3.根据权利要求2所述的合成天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述酸为磷酸。

4.根据权利要求2所述的合成天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备方法，其特征在于：步骤2中，收集步骤1中的副产物氢气与氢化酶溶液一起孵育。

5.根据权利要求3所述的合成天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述氢化酶来源于嗜热古菌的可溶性氢化酶，脱硫弧菌的氢化酶，产碱杆菌的氢化酶中的一种。

6.根据权利要求4所述的合成天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述氢化酶溶液孵育温度为50-85℃，优先的孵育温度为60-80℃，孵育的压力应大于1.1bar。

7.根据权利要求5所述的合成天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述氢化酶含量为1-5g/L，孵育时间不小于10min，氢气中惰性气体的体积分数ψi小于40％；所述氢化酶溶液在通入氢气之前加入连二亚硫酸钠，所述连二亚硫酸钠的浓度为2-10μM。

8.根据权利要求2-7任意一项中所述的合成天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备方法，其特征在于：步骤3中，所述反应中还包含pH值缓冲盐。

9.根据权利要求8所述的合成天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备方法，其特征在于：步骤3中，所述NADPH或NPDP+的浓度为5-30mM，氢化酶的反应浓度为1-100mg/L，Tris盐酸盐浓度为50-400mM，二氢叶酸还原酶浓度为2000-60000U/L。

10.根据权利要求9所述的合成天然化(6S)-5-甲基四氢叶酸盐的制备方法，其特征在于：步骤4中，所述衍生物为6R-5-10-亚甲基四氢叶酸及其盐。

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