CN115161205A - 一种含藜麦的裂褶菌培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含藜麦的裂褶菌培养基及其制备方法和应用。本发明所述含藜麦的裂褶菌培养基包括藜麦和基础培养基；所述基础培养基包括葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和酵母浸粉。本发明向改良的基础培养基中添加藜麦，从而提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量，并使得得到的裂褶菌发酵产物具有美白、抗氧化、抗衰老和祛痘的功效。

Description

一种含藜麦的裂褶菌培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种含藜麦的裂褶菌培养基及其制备方法和应用。
背景技术
裂褶菌(学名：Schizophyllum commune Fr.)是裂褶菌科、裂褶菌属真菌。子实体小，覆瓦状散生或丛生，扇形或肾形，无柄或短柄，盖面密生绒毛、白色至浅灰色；盖缘内卷，有条纹、多瓣裂，菌褶狭窄，沿褶缘纵裂向外反卷。
裂褶菌多糖是裂褶菌发酵得到的水溶性多糖，具有抑制肿瘤、抗菌消炎、抗辐射、提高机体免疫力等多种生理活性。目前，裂褶多糖的生产方法多采用单一食用菌液体发酵方式，再将发酵后的产物进行后处理，最终得到裂褶多糖。但发酵得到的裂褶多糖难于重新溶解、不利于生物吸收等特性，极大的限制了其应用。
CN113337545A公开了一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品、裂褶菌培养基。裂褶菌发酵产物的制备方法，包括：在裂褶菌培养基中培养裂褶菌，然后收集发酵产物；其中，所述裂褶菌培养基中含有葛根。在培养基中加入葛根粉末培养裂褶菌，收集发酵产物，得到的发酵产物在抗氧化和清除自由基方面体现了积极的效果，但裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量有待提高，且缺乏美白和祛痘方面的能力。
CN110305920A公开了一种活性发酵物及其制备方法和在化妆品中的应用。本发明制备方法包括：S1取燕麦麸皮和水混合，然后进行酶处理，酶处理后进行灭菌，制得燕麦麸皮培养液；S2取所述燕麦麸皮培养液，转到发酵罐中，接种经三级培养的裂褶菌菌种进行发酵，获得裂褶菌多糖发酵液；S3取所述裂褶菌多糖发酵液，采用板框压滤机过滤，获得裂褶菌发酵胞外产物，然后采用陶瓷膜对裂褶菌发酵胞外产物进行微滤水洗，直至获得澄清透亮的活性发酵物。该方法对于β-葡聚糖的含量提升较好，但对于裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量提升有限，因此缺乏抗氧化、美白和祛痘方面的能力。
CN112691125A公开了一种药物组合物及其制备方法、护肤品。药物组合物的制备方法，包括：在基础培养基中培养裂褶菌，再向所述基础培养基中加入甘草继续培养，然后收集发酵产物。在培养裂褶菌的过程中，在适当的时机加入甘草对裂褶菌进行培养，可以增加发酵产物的抗氧化性能以及抑制弹性蛋白酶、抑制酪氨酸酶的水平；可以扩展该药物组合物的用途，该药物组合物用于护肤品，在抗衰老及美白方面具有较好的效果，但裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量有待提高，且缺乏祛痘方面的能力。
因此，亟待开发一种能够进一步提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的培养基及制备方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种含藜麦的裂褶菌培养基及其制备方法和应用。本发明向改良的基础培养基中添加藜麦，从而提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量，并使得得到的裂褶菌发酵产物具有美白、抗氧化、抗衰老和祛痘的功效。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，所述含藜麦的裂褶菌培养基包括藜麦和基础培养基；所述基础培养基包括葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和酵母浸粉。
在本发明中，向改良的基础培养基中添加藜麦，在裂褶菌发酵的过程中，藜麦也进行了发酵，其发酵产物中富含藜麦多肽、藜麦皂苷、藜麦多酚、裂褶多糖，各组分相互配合，协同提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量。此外，部分藜麦经发酵后提取所得样品对自由基的清除率均显著高于未发酵藜麦提取物的，说明发酵处理可提高藜麦中的抗氧化活性成分；同时，裂褶多糖的高分子量特性赋予其良好的保湿活性，经藜麦经裂褶菌发酵后得到的发酵产物在保湿能力上也显著优于藜麦提取物。
优选地，所述藜麦包括白藜麦和/或黑藜麦。
优选地，所述含藜麦的裂褶菌培养基中藜麦的浓度为0.1-4g/L，例如可以是0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L等，优选为0.1-2g/L。
优选地，所述基础培养基按质量百分含量计包括：葡萄糖5-10％、磷酸二氢钾0.05-0.2％、硫酸镁0.01-0.02％、酵母浸粉0.1-0.2％、水85-90％。
以所述基础培养基的总质量为100％计，葡萄糖的含量为5-10％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％等。
以所述基础培养基的总质量为100％计，磷酸二氢钾的含量为0.05-0.2％，例如可以是0.05％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
以所述基础培养基的总质量为100％计，硫酸镁的含量为0.01-0.02％，例如可以是0.01％、0.012％、0.014％、0.016％、0.018％、0.02％等。
以所述基础培养基的总质量为100％计，酵母浸粉的含量为0.1-0.2％，例如可以是0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
以所述基础培养基的总质量为100％计，水的含量为85-90％，例如可以是85％、86％、87％、88％、89％、90％等。
在本发明中，基础培养基灭菌条件，一般为120℃以上(例如可以是120℃、121℃、122℃等)高温高压灭菌15-20min，例如可以是15min、16min、17min、18min、19min、20min等。
优选地，所述基础培养基中还包括营养添加剂。
优选地，所述营养添加剂占所述基础培养基总质量的0.01-0.2％，例如可以是0.01％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
优选地，所述营养添加剂包括大豆粉、燕麦粉、小麦麸粉、低聚异麦芽糖、低聚果糖或低聚木糖中的任意一种或至少两种的组合，优选为燕麦粉、小麦麸粉、低聚异麦芽糖和低聚木糖的组合。
在本发明中，所述基础培养基中还包括上述特定组合的营养添加剂，燕麦粉、小麦麸粉、低聚异麦芽糖和低聚木糖相互配合，协同增效，从而进一步地提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量，并使得得到的裂褶菌发酵产物具有美白、抗氧化、抗衰老和祛痘的功效得到进一步的提升。
优选地，所述燕麦粉、小麦麸粉、低聚异麦芽糖和低聚木糖的质量比为(4-6):(1-3):(0.5-2):(0.1-0.5)；
其中，“4-6”例如可以是4、4.5、5、5.5、6等；
其中，“1-3”例如可以是1、1.5、2、2.5、3等；
其中，“0.5-2”例如可以是0.5、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2等；
其中，“0.1-0.5”例如可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5等。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述含藜麦的裂褶菌培养基的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(a)将藜麦粉碎过筛，得到藜麦粉；将基础培养基中各组分溶解，得到培养基混合液；
(b)将藜麦粉和培养基混合液混合搅拌，得到所述含藜麦的裂褶菌培养基。
优选地，步骤(a)中，所述藜麦粉的粒径为100-500目，例如可以是100目、200目、300目、400目、500目等。
优选地，步骤(a)中，所述溶解的步骤为：将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母浸粉和水混合后，先以3-5℃/min(例如可以是3℃/min、3.5℃/min、4℃/min、4.5℃/min、5℃/min等)的升温速率、300-500rpm(例如可以是300rpm、350rpm、400rpm、450rpm、500rpm等)的转速升温至30-35℃(例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃等)，然后以2-3℃/min(例如可以是2℃/min、2.2℃/min、2.4℃/min、2.6℃/min、2.8℃/min、3℃/min等)的升温速率、100-300rpm(例如可以是100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm等)的转速升温至35-40℃(例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等)，最后在35-40℃(例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等)下保持1-3min(例如可以是1min、1.5min、2min、2.5min、3min等)。
在本发明中，采用上述特定的升温溶解程序，可以使得基础培养基中葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母浸粉中各成分溶解的更加均匀，得到更为均一的培养基混合液。
优选地，步骤(b)中，所述混合搅拌的转速为500-1000rpm，例如可以是500rpm、600rpm、700rpm、800rpm、900rpm、1000rpm等，所述混合搅拌的时间为5-20min，例如可以是5min、6min、8min、10min、12min、14min、16min、18min、20min等。
优选地，所述制备方法还包括步骤(c)：于无菌条件下，将营养添加剂添加入含有藜麦的裂褶菌培养基后，过0.22μm的滤膜后备用。
第三方面，本发明提供一种第一方面所述含藜麦的裂褶菌培养基在提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量中的应用。
第四方面，本发明提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，所述方法包括以下步骤：将裂褶菌接种于所述含藜麦的裂褶菌培养基中，进行培养后，收集裂褶菌发酵产物。
优选地，所述培养的温度为25-30℃(如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等)，培养的时间48-72h(例如可以是48h、54h、60h、66h、72h等)。
优选地，所述活化后的裂褶菌在所述含藜麦的裂褶菌培养基中的接种量为1-5vol％，例如可以是1vol％、1.5vol％、2vol％、2.5vol％、3vol％、3.5vol％、4vol％、4.5vol％、5vol％等。
优选地，所述裂褶菌在接种前还需要进行活化：将裂褶菌菌种通过斜面培养基活化，在25-30℃(如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等)，条件下培养5-7天(例如可以是5天、6天、7天等)直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基，扩大培养3-4天(例如可以是3天、3.5天、4天等)，得到活化后的裂褶菌种子液。
优选地，所述斜面培养基为PDA斜面培养基。
优选地，所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖1-5％、磷酸二氢钾0.05-0.2％、硫酸镁0.01-0.02％、酵母浸粉0.1-0.2％，余量为水。
以所述液体培养基的总质量为100％计，所述葡萄糖的含量为1-5％，例如可以是1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。
以所述液体培养基的总质量为100％计，所述磷酸二氢钾的含量为0.05-0.2％，例如可以是0.05％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
以所述液体培养基的总质量为100％计，所述硫酸镁的含量为0.01-0.02％，例如可以是0.01％、0.012％、0.014％、0.016％、0.018％、0.02％等。
以所述液体培养基的总质量为100％计，酵母浸粉的含量为0.1-0.2％，例如可以是0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
第五方面，本发明提供一种裂褶菌发酵产物，所述裂褶菌发酵产物由第一方面所述的提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法制备得到。
优选地，所述裂褶菌发酵产物中总糖的含量为5-20mg/mL，例如可以是5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、15.2mg/mL、15.4mg/mL、15.6mg/mL、15.8mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL等。
第六方面，本发明提供一种所述的裂褶菌发酵产物在制备化妆品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明向改良的基础培养基中添加藜麦，从而提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量(含量可达到15mg/mL以上)，并使得得到的裂褶菌发酵产物具有美白、抗氧化、抗衰老和祛痘的功效；
(2)本发明制备得到的裂褶菌发酵产物对于超氧阴离子自由基清除率在50％以上，本发明制备得到的裂褶菌发酵产物对羟自由基清除率在27％以上，对于DPPH自由基抑制率在55％以上；对酪氨酸酶的抑制率在54％以上，对黑色素合成抑制率在50％以上；本发明提供的裂褶菌发酵产物对弹性蛋白酶的抑制率在54％以上，对胶原蛋白酶抑制率在24％以上。
附图说明
图1为实施例1提供白藜麦发酵产物发酵形态图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
制备例1
本制备例提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，所述含藜麦的裂褶菌培养基包括白藜麦和基础培养基，藜麦的浓度为1g/L，所述基础培养基按质量百分含量计包括：葡萄糖6％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.015％、酵母浸粉0.15％、营养添加剂0.1％、余量为水；其中，所述营养添加剂包括质量比为5:2:1:0.2的燕麦粉、小麦麸粉、低聚异麦芽糖和低聚木糖。
所述含藜麦的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将白藜麦粉碎过筛，得到粒径为200目的藜麦粉；将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母浸粉和水混合后，先以4℃/min的升温速率、400rpm的转速升温至32℃，然后以2.5℃/min的升温速率、200rpm的转速升温至37℃，最后在37℃下保持2min，得到培养基混合液；
(b)将藜麦粉和培养基混合液混合，以600rpm的转速搅拌10min，灭菌备用；
(c)于无菌条件下，将营养添加剂添加入含有藜麦的裂褶菌培养基，过0.22μm滤膜后备用，得到所述含藜麦的裂褶菌培养基。
制备例2
本制备例提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，所述含藜麦的裂褶菌培养基包括黑藜麦和基础培养基，黑藜麦的浓度为1g/L，所述基础培养基按质量百分含量计包括：葡萄糖6％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.015％、酵母浸粉0.15％、营养添加剂0.1％、余量为水；其中，所述营养添加剂包括质量比为5:2:1:0.2的燕麦粉、小麦麸粉、低聚异麦芽糖和低聚木糖。
所述含藜麦的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将黑藜麦粉碎过筛，得到粒径为200目的藜麦粉；将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母浸粉和水混合后，先以4℃/min的升温速率、400rpm的转速升温至32℃，然后以2.5℃/min的升温速率、200rpm的转速升温至37℃，最后在37℃下保持2min，得到培养基混合液；
(b)将藜麦粉和培养基混合液混合，以600rpm的转速搅拌10min，灭菌备用；
(c)于无菌条件下，将营养添加剂添加入含有藜麦的裂褶菌培养基，过0.22μm滤膜后备用，得到所述含藜麦的裂褶菌培养基。
制备例3
本制备例提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，所述含藜麦的裂褶菌培养基包括白藜麦和基础培养基，藜麦的浓度为0.5g/L，所述基础培养基按质量百分含量计包括：葡萄糖10％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.01％、酵母浸粉0.1％、营养添加剂0.15％、余量为水；其中，所述营养添加剂包括质量比为6:1:2:0.5的燕麦粉、小麦麸粉、低聚异麦芽糖和低聚木糖。
所述含藜麦的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将白藜麦粉碎过筛，得到粒径为300目的白藜麦粉；将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母浸粉和水混合后，先以3℃/min的升温速率、300rpm的转速升温至30℃，然后以2℃/min的升温速率、100rpm的转速升温至35℃，最后在35℃下保持1min，得到培养基混合液；
(b)将白藜麦粉和培养基混合液混合，以700rpm的转速搅拌10min，灭菌备用；
(c)于无菌条件下，将营养添加剂添加入含有藜麦的裂褶菌培养基，过0.22μm滤膜后备用，得到所述含藜麦的裂褶菌培养基。
制备例4
本制备例提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，所述含藜麦的裂褶菌培养基包括黑藜麦和基础培养基，黑藜麦的浓度为1.8g/L，所述基础培养基按质量百分含量计包括：葡萄糖8％、磷酸二氢钾0.08％、硫酸镁0.012％、酵母浸粉0.15％、营养添加剂0.1％、余量为水；其中，所述营养添加剂包括质量比为4:1:0.5:0.1的燕麦粉、小麦麸粉、低聚异麦芽糖和低聚木糖。
所述含藜麦的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将黑藜麦粉碎过筛，得到粒径为400目的黑藜麦粉；将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母浸粉、营养添加剂和水混合后，先以5℃/min的升温速率、500rpm的转速升温至35℃，然后以2℃/min的升温速率、100rpm的转速升温至38℃，最后在38℃下保持3min，得到培养基混合液；
(b)将黑藜麦粉和培养基混合液混合，以800rpm的转速搅拌8min，灭菌备用；
(c)于无菌条件下，将营养添加剂添加入含有藜麦的裂褶菌培养基，过0.22μm滤膜后备用。
制备例5
本制备例提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述营养添加剂仅包括质量比为5:2:1的燕麦粉、小麦麸粉和低聚异麦芽糖。
制备例6
本制备例提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述营养添加剂仅包括质量比为5:2:0.2的燕麦粉、小麦麸粉和低聚木糖。
制备例7
本制备例提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述营养添加剂仅包括质量比为5:1:0.2的燕麦粉、低聚异麦芽糖和低聚木糖。
制备例8
本制备例提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述营养添加剂仅包括质量比为2:1:0.2的小麦麸粉、低聚异麦芽糖和低聚木糖。
制备例9
本制备例提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述营养添加剂包括质量比为5:2:1:0.2的燕麦粉、小麦麸粉、低聚异麦芽糖和低聚果糖。
制备例10
本制备例提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述营养添加剂仅包括质量比为5:2:1:0.2的燕麦粉、大豆粉、低聚异麦芽糖和低聚果糖。
制备例11
本制备例提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述含藜麦的裂褶菌培养基中不添加任一营养添加剂。
制备例12
本制备例提供一种含藜麦的裂褶菌培养基，与制备例2的区别仅在于，所述含藜麦的裂褶菌培养基中不添加任一营养添加剂。
对比制备例1
本制备例提供一种含葛根的裂褶菌培养基，所述含葛根的裂褶菌培养基包括葛根和基础培养基，葛根的浓度为1g/L，所述基础培养基按质量百分含量计包括：葡萄糖6％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.015％、酵母浸粉0.5％、酵母浸粉0.15％，余量为水。
所述含葛根的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将葛根粉碎过筛，得到粒径为200目的葛根粉；将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母浸粉和水混合后，先以4℃/min的升温速率、400rpm的转速升温至32℃，然后以2.5℃/min的升温速率、200rpm的转速升温至37℃，最后在37℃下保持2min，得到培养基混合液；
(b)将葛根粉和培养基混合液混合，以600rpm的转速搅拌10min，得到所述含葛根的裂褶菌培养基。
对比制备例2
本制备例提供一种含甘草的裂褶菌培养基，所述含甘草的裂褶菌培养基包括甘草和基础培养基，甘草的浓度为1g/L，所述基础培养基按质量百分含量计包括：葡萄糖6％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.015％、酵母浸粉0.5％、酵母浸粉0.15％，余量为水。
所述含甘草的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将甘草粉碎过筛，得到粒径为200目的葛根粉；将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母浸粉和水混合后，先以4℃/min的升温速率、400rpm的转速升温至32℃，然后以2.5℃/min的升温速率、200rpm的转速升温至37℃，最后在37℃下保持2min，得到培养基混合液；
(b)将甘草粉和培养基混合液混合，以600rpm的转速搅拌10min，得到所述含甘草的裂褶菌培养基。
实施例1
本实施例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将裂褶菌菌种通过PDA斜面培养基活化，在27℃，160rpm条件下培养6天直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基(所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖3％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.01％、酵母浸粉0.1％，余量为水)，扩大培养3天，得到活化后的裂褶菌种子液；
(2)将活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于制备例1提供的含藜麦的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述培养在搅拌下进行，培养的转速为160rpm，培养的温度为27℃，培养的时间72h，收集裂褶菌发酵产物(其发酵形态如图1所示)。
实施例2
本实施例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将裂褶菌菌种通过PDA斜面培养基活化，在27℃，160rpm条件下培养6天直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基(所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖3％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.01％、酵母浸粉0.1％，余量为水)，扩大培养4天，得到活化后的裂褶菌种子液；
(2)将活化后的裂褶菌种子液以3vol％的接种量接种于制备例2提供的含藜麦的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述培养在搅拌下进行，培养的转速为160rpm，培养的温度为27℃，培养的时间60h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例3
本实施例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将裂褶菌菌种通过PDA斜面培养基活化，在27℃，160rpm条件下培养6天直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基(所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖3％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.01％、酵母浸粉0.1％，余量为水)，扩大培养4天，得到活化后的裂褶菌种子液；
(2)将活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于制备例3提供的含藜麦的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述培养在搅拌下进行，培养的转速为160rpm，培养的温度为30℃，培养的时间48h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例4
本实施例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将裂褶菌菌种通过PDA斜面培养基活化，在27℃，160rpm条件下培养6天直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基(所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖4％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.02％、酵母浸粉0.2％，余量为水)，扩大培养4天，得到活化后的裂褶菌种子液；
(2)将活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于制备例4提供的含藜麦的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述培养在搅拌下进行，培养的转速为160rpm，培养的温度为27℃，培养的时间72h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例5
本实施例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含藜麦的裂褶菌培养基替换为制备例5提供的含藜麦的裂褶菌培养基。
实施例6
本实施例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含藜麦的裂褶菌培养基替换为制备例6提供的含藜麦的裂褶菌培养基。
实施例7
本实施例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含藜麦的裂褶菌培养基替换为制备例7提供的含藜麦的裂褶菌培养基。
实施例8
本实施例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含藜麦的裂褶菌培养基替换为制备例8提供的含藜麦的裂褶菌培养基。
实施例9
本实施例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含藜麦的裂褶菌培养基替换为制备例9提供的含藜麦的裂褶菌培养基。
实施例10
本实施例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含藜麦的裂褶菌培养基替换为制备例10提供的含藜麦的裂褶菌培养基。
实施例11
本实施例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含藜麦的裂褶菌培养基替换为制备例11提供的含藜麦的裂褶菌培养基。
实施例12
本实施例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含藜麦的裂褶菌培养基替换为制备例12提供的含藜麦的裂褶菌培养基。
对比例1
本对比例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含藜麦的裂褶菌培养基替换为对比制备例1提供的裂褶菌培养基。
对比例2
本对比例提供一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含藜麦的裂褶菌培养基替换为对比制备例2提供的裂褶菌培养基。
试验例1
裂褶多糖含量含量测定
测试样品：实施例1-12提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-2提供的裂褶菌发酵产物；
测试原理：裂褶多糖含量也可作为发酵产物的重要衡量指标，计算方法：裂褶多糖含量＝总糖含量-还原糖含量；
测试方法：
I.采用硫酸-苯酚法测定发酵产物总糖含量，多糖在浓硫酸的作用下，先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚反应生成橙黄色溶液，在490nm处有最大吸收。以葡萄糖标准品，测定发酵产物总糖含量，具体操作步骤如下：
(1)于10.0mL具塞试管中，添加稀释一定倍数待测液1.0mL；
(2)加入5％苯酚溶液1.0mL，再迅速垂直液面加入5.0mL浓硫酸，静置10min。使用旋涡振荡器使反应液充分混合，然后将具塞试管放置于30℃水浴反应20min。
(3)以相应试剂进行空白调零，于490nm处测定吸光度。
计算公式：总糖含量(mg/mL)＝吸光度对应葡萄糖浓度×稀释倍数N；
II.采用DNS法测定发酵产物还原糖含量，还原糖在碱性条件下可被氧化成糖酸及其他产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸则被还原成棕红色的3-氨基-5硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成正比关系，利用分光光度计在550nm处测定其吸光度。以葡萄糖为标准品，测定发酵产物还原糖含量，具体操作步骤如下：
(1)于10mL具塞试管中，添加稀释一定倍数待测液1.0mL；
(2)加入DNS溶液3.0mL，沸水浴5min后显色；待冷却后用水定容至25.0mL，充分摇匀；
(3)以相应试剂进行空白调零，于550nm处测定吸光度。
计算公式：还原糖含量(mg/mL)＝吸光度对应葡萄糖浓度×稀释倍数N；
具体测试结果如表1所示：
表1
Figure BDA0003794930590000181
由表1测试结果可知，本发明制备得到的裂褶菌发酵产物中总糖的含量在15mg/mL以上，还原糖的含量在0.5mg/mL以上，裂褶多糖的含量在15mg/mL以上。由此说明，本发明向改良的基础培养基中添加藜麦，从而提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量。
试验例2
抗氧化能力测试
测试样品：实施例1-12提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-2提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：
1、对超氧阴离子自由基清除能力评价
取0.05mol/L pH＝8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL，于25℃水浴锅中预热20min。再加入1mL试样和0.4mL 25mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后，于25℃水浴中反应5min，加入8mol/L的HCl 1.0mL终止反应。以Tris-HCl缓冲液作参比，在299nm处测吸光度值。空白对照用1mL试样的溶剂来替代样品。
超氧阴离子自由基清除率(％)＝[1-(A2/A1)]×100％；式中A1为空白对照的吸光度值；A2为样品的吸光度值。
2、对羟自由基的清除能力评价
在25mL比色管中依次加入2mmol/L FeSO43 mL，1mmol/L H2O23 mL，摇匀，接着加入6mmol/L水杨酸3mL，摇匀，于37℃水浴加热15min后取出，测其吸光度；分别加入一定浓度的待测液，摇匀，继续水浴加热15min，取出测其吸光度。下式为待测液对羟自由基(·OH)的清除率：
羟自由基清除率(％)＝[A1-A2-(A1-A3)]/A1×100％；式中A1为未加药品前反应体系的吸光度值；A2为样品清除·OH后体系的吸光度值；A3为空白对照清除·OH后体系的吸光度值；
3、对DPPH自由基的清除能力评价
试验参照Larrauri JA中规定的方法，配制20mmol/L的DPPH溶液；受试样品溶液：采用超纯水稀释实施例1-10提供的裂褶多糖组合物和对比例1-5提供的组合物，得到质量浓度为0.1％的溶液。取受试样品溶液2.0mL及20mmol/L的DPPH溶液2.0mL于试管之中，混匀后反应30min，于517nm下测定吸光度值，无水乙醇为空白对照，根据吸光度值计算DPPH抑制率。
DPPH自由基抑制率(％)＝[1-(A1-A2)/A3]×100％；其中，A1为2.0mL的DPPH溶液与2.0mL受试样品溶液的吸光度，A2为2.0mL受试样品溶液与2.0mL无水乙醇的吸光度，A3为2.0mL的DPPH溶液与2.0mL无水乙醇的吸光度，平行测试三次取平均值；
具体测试结果如表2所示：
表2
Figure BDA0003794930590000201
Figure BDA0003794930590000211
由表2测试数据可知，本发明制备得到的裂褶菌发酵产物具有很好的抗氧化和清除DPPH自由基的能力，对于超氧阴离子自由基清除率在50％以上，对羟自由基清除率在27％以上，对于DPPH自由基抑制率在55％以上。说明本发明所述含藜麦的裂褶菌培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物能进一步对于DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用，可增强皮肤组织的抗氧化能力，降低皮肤组织自由基含量。
试验例3
美白能力测试
测试样品：实施例1-12提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-2提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：
(1)酪氨酸酶活性抑制试验
检测前，对实施例1-12提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-2提供的裂褶菌发酵产物过0.45μm微孔滤膜；
向96孔板中依次加入磷酸盐缓冲液、不同供试液(磷酸缓冲液充当样品空白)、500U/mL酶液，最后加入底物1.5mmol/L L-酪氨酸，立即开始计时，测定反应20min时475nm波长下的吸光值。
Figure BDA0003794930590000221
式中：A1：添加样品，添加L-酪氨酸；A2：添加样品，没有添加L-酪氨酸；B1:没有添加样品，添加L-酪氨酸；B2：没有添加样品，没有添加L-酪氨酸，R'为对应样品对酪氨酸酶抑制率(％)。
(2)黑色素合成抑制实验
将B16黑色素瘤细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，每孔90μL，CO2孵箱中孵育24小时后，每孔加入样品溶液。同时设立培养基和细胞的空白对照组。
将培养板置于孵箱中孵育72小时后，弃去上清液，PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤两遍，然后每孔加入0.5mL胰酶消化细胞3min，每孔加入2mL维持液终止消化。混匀后，每种浓度取出0.5mL做细胞计数。其余细胞悬液以2500r/min离心分离5min，弃去上清液，于沉淀中加入NaOH溶液，加热使黑色素溶解，选择490nm波长在酶联免疫检测仪下测定吸光度值。
计算样品对黑色素合成抑制率(％)公式如下所示：
Figure BDA0003794930590000222
其中，A1为药物孔吸光度值，P1为药物孔细胞密度，A2为对照孔吸光度值；P2为对照孔细胞密度，I'为对应样品对黑色素合成抑制率(％)；
具体测试结果如表3所示：
表3
测试样品 酪氨酸酶的抑制率/％ 黑色素合成抑制率/％
实施例1 91.33±4.06 96.96±5.43
实施例2 79.14±3.90 89.23±2.02
实施例3 82.97±3.29 85.46±1.15
实施例4 77.35±1.27 89.66±4.84
实施例5 65.39±2.54 78.72±7.49
实施例6 62.64±0.26 72.95±4.54
实施例7 68.48±4.81 79.37±0.72
实施例8 62.17±2.07 66.84±4.01
实施例9 60.18±1.47 68.32±6.17
实施例10 65.58±2.01 64.75±2.29
实施例11 57.72±0.13 58.79±2.08
实施例12 54.66±0.74 56.83±6.56
对比例1 36.51±2.41 39.95±3.27
对比例2 44.55±3.22 46.25±1.40
由表3测试结果可知，本发明提供的裂褶菌发酵产物对酪氨酸酶的抑制率在54％以上，对黑色素合成抑制率在50％以上，说明本发明所述含藜麦的裂褶菌培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物，能够有效抑制黑色素转移至角质细胞，抑制黑色素沉着，促进肌肤的新陈代谢，进而减轻色素沉积，能够从多个方面实现美白效果，令皮肤健康白皙。
试验例4
抗衰能力测试
测试样品：实施例1-12提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-2提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：
(1)将50μL样品与100μL 0.9U/mL弹性蛋白酶和100μL Tris-HCl缓冲液于25℃孵育20min；随后加入50μL MAAPVN溶液以启动反应，对于样品空白对照，则加入50μL Tris-HCl缓冲液替代MAAPVN。在25℃孵育60min后，在410nm处测定吸光值。
Figure BDA0003794930590000241
式中：A1：添加样品，添加MAAPVN；A2：添加样品，没有添加MAAPVN；B1:没有添加样品，添加MAAPVN；B2：没有添加样品，没有添加MAAPVN，T'为对应样品对弹性蛋白酶抑制率(％)。
(2)对胶原蛋白酶的抑制活性
对2mL试管中，实验组分别加入25μL的胶原蛋白酶(1mg/mL)、50mM的TES缓冲液和样品(2mg/mL)；空白组包含75μL TES缓冲液，阴性对照组包含25μL的蛋白酶和50μLTES缓冲液；阳性对照组分别包含25μL的蛋白酶，TES缓冲液和EDTA(1mg/mL)；溶剂对照组T分别包含25μL的蛋白酶，TES缓冲液和溶解样品的溶剂。在37℃培养箱中培养20min后，各加入100μL的FALGPA并在37℃下继续培养1h。然后，各试管中加入100μL的200mM柠檬酸盐缓冲液和100μL的茚三酮溶液。所有的试管在100℃的水浴锅中浴5分min，冷却到室温，各加入200μL的50％的异丙醇溶液。混合均匀后，将试管中的溶液各取200μL转移到96孔板中，用多功能荧光酶标仪在540nm处测吸光度A。一式三份。计算得到弹性蛋白酶抑制率。
胶原蛋白酶抑制率(％)＝(Ac–At/Ac)×100％。
此处Ac为溶剂对照组的吸光值，At为阳性对照或实验组的吸光值。实验结果取平均值。
具体测试结果如表4所示：
表4
测试样品 弹性蛋白酶抑制率/％ 胶原蛋白酶抑制率/％
实施例1 89.70±2.77 49.43±8.90
实施例2 76.75±1.59 46.07±2.34
实施例3 81.70±0.10 48.11±0.04
实施例4 72.37±0.52 46.10±2.49
实施例5 63.29±0.65 33.65±0.45
实施例6 64.23±0.53 38.77±0.76
实施例7 57.99±1.92 43.57±4.10
实施例8 56.98±2.44 37.80±0.60
实施例9 61.34±7.52 36.45±0.68
实施例10 58.09±1.67 36.15±1.62
实施例11 55.46±1.95 28.11±0.04
实施例12 54.11±3.76 24.77±0.82
对比例1 45.69±1.07 13.65±0.45
对比例2 32.70±4.03 18.77±0.71
由表4测试结果可知，本发明提供的裂褶菌发酵产物对弹性蛋白酶的抑制率在54％以上，对胶原蛋白酶抑制率在24％以上，说明本发明所述含藜麦的裂褶菌培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物，够被激活并促进肌肤自身合成胶原蛋白，刺激神经酰胺的合成，能够有效提高的弹性蛋白酶抑制率和胶原蛋白酶抑制率。
试验例5
祛痘能力测试
测试样品：实施例1-12提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-2提供的裂褶菌发酵产物；
测试原料：群体效应(Quorum sensing)是一种细菌群体行为调控机制，很多细菌有这种能力，即分泌一种或多种自诱导剂(Autoinducer)，细菌通过感应这些自诱导剂来判断菌群密度和周围环境变化，当菌群数达到一定的阈值(菌落或集落数)后，启动相应一系列基因的调节表达，以调节菌体的群体行为。该方法相比于传统的直接杀死痤疮丙酸杆菌而言，更能维持皮肤微生态，达到持久抗痘的效果。
测试方法：
(1)AI-2产量检测：以1％的体积比将上述样品分别添加于痤疮丙酸杆菌培养基中，37℃无氧条件下培养痤疮丙酸杆菌72h，由埃尔曼分析法测量AI-2(AI-2自诱物是群体效应中使用的信号分子家族中的一员)产量；
(2)LuxS酶活性检测：以1％的体积比将上述样品分别添加于痤疮丙酸杆菌培养基中，37℃无氧条件下培养痤疮丙酸杆菌，再与腺苷同型半胱氨酸(SAH)反应1h，由埃尔曼分析法测量LuxS酶(核糖高半胱氨酸裂合酶，参与AI-2自诱物的合成，在群体效应中起到重要作用)的活性；
(3)生物膜形成量评估：以1％的体积比将上述样品分别添加于痤疮丙酸杆菌培养基中，37℃无氧条件下培养痤疮丙酸杆菌72h，痤疮丙酸杆菌的生物膜(痤疮丙酸杆菌可以在各种生物材料上形成高度耐药的生物膜)形成由结晶紫染色法评估；
具体测试结果如表5所示：
表5
Figure BDA0003794930590000271
由表5测试结果可知，本发明中提供的裂褶菌发酵产物能够抑制AI-2的生成，降低LuxS酶活性，AI-2的产量为53.4-73.8％，减少了26.2％以上，LuxS酶活性为51.2-81.2％，降低了18.8％以上，生物膜的形成量为58.9-87.6％，减少了22.4％以上；说明本发明所述含藜麦的裂褶菌培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物通过反群体效应，而不是简单的通过杀灭痤疮丙酸杆菌，来抑制痘痘的生成，该方法相比于传统的直接杀死痤疮丙酸杆菌而言，更能维持皮肤微生态，达到持久抗痘的效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的含藜麦的裂褶菌培养基及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种含藜麦的裂褶菌培养基，其特征在于，所述含藜麦的裂褶菌培养基包括藜麦和基础培养基；所述基础培养基包括葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和酵母浸粉。
2.根据权利要求1所述的含藜麦的裂褶菌培养基，其特征在于，所述藜麦包括白藜麦和/或黑藜麦；
优选地，所述含藜麦的裂褶菌培养基中藜麦的浓度为0.1-4g/L，优选为0.1-2g/L；
优选地，所述基础培养基按质量百分含量计包括：葡萄糖5-10％、磷酸二氢钾0.05-0.2％、硫酸镁0.01-0.02％、酵母浸粉0.1-0.2％、水85-90％；
优选地，所述基础培养基中还包括营养添加剂；
优选地，所述营养添加剂占所述基础培养基总质量的0.01-0.2％；
优选地，所述营养添加剂包括大豆粉、燕麦粉、小麦麸粉、低聚异麦芽糖、低聚果糖或低聚木糖中的任意一种或至少两种的组合，优选为燕麦粉、小麦麸粉、低聚异麦芽糖和低聚木糖的组合；
优选地，所述燕麦粉、小麦麸粉、低聚异麦芽糖和低聚木糖的质量比为(4-6):(1-3):(0.5-2):(0.1-0.5)。
3.一种根据权利要求1或2所述含藜麦的裂褶菌培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(a)将藜麦粉碎过筛，得到藜麦粉；将基础培养基中各组分溶解，得到培养基混合液；
(b)将藜麦粉和培养基混合液混合搅拌，得到所述含藜麦的裂褶菌培养基。
4.根据权利要求3所述含藜麦的裂褶菌培养基的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述藜麦粉的粒径为100-500目；
优选地，步骤(a)中，所述溶解的步骤为：将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母浸粉和水混合后，先以3-5℃/min的升温速率、300-500rpm的转速升温至30-35℃，然后以2-3℃/min的升温速率、100-300rpm的转速升温至35-40℃，最后在35-40℃下保持1-3min；
优选地，步骤(b)中，所述混合搅拌的转速为500-1000rpm，所述混合搅拌的时间为5-20min；
优选地，所述制备方法还包括步骤(c)：于无菌条件下，将营养添加剂添加入含有藜麦的裂褶菌培养基后，过0.22μm的滤膜后备用。
5.一种根据权利要求1或2所述含藜麦的裂褶菌培养基在提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量中的应用。
6.一种提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将裂褶菌接种于权利要求1或2所述含藜麦的裂褶菌培养基中，进行培养后，收集裂褶菌发酵产物。
7.根据权利要求6所述的提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法，其特征在于，所述培养的温度为25-30℃，培养的时间48-72h；
优选地，所述裂褶菌在接种前还需要进行活化：将裂褶菌菌种通过斜面培养基活化，在25-30℃条件下培养5-7天直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基，扩大培养3-4天，得到活化后的裂褶菌种子液；
优选地，所述斜面培养基为PDA斜面培养基；
优选地，所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖1-5％、磷酸二氢钾0.05-0.2％、硫酸镁0.01-0.02％、酵母浸粉0.1-0.2％，余量为水；
优选地，所述活化后的裂褶菌在所述含藜麦的裂褶菌培养基中的接种量为1-5vol％。
8.一种裂褶菌发酵产物，其特征在于，所述裂褶菌发酵产物由权利要求6或7所述的提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的方法制备得到。
9.根据权利要求8所述的裂褶菌发酵产物，其特征在于，所述裂褶菌发酵产物中裂褶多糖的含量为5-20mg/mL。
10.一种根据权利要求8所述的裂褶菌发酵产物在制备化妆品中的应用。
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