CN115141278A - 抗vista抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抗VISTA抗体或抗原结合片段及其应用，本发明抗体或抗原结合片段可以特异性结合VISTA，阻断VISTA与其配体之间的相互作用。本发明抗体或抗原结合片段可有助于免疫系统清除肿瘤细胞，也可以用于肿瘤或癌症的诊断和预后。

Description

抗VISTA抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及抗VISTA抗体及其应用。

背景技术

T细胞活化V结构域Ig抑制蛋白(V domain immunoglobulin suppressor of Tcell activation，VISTA)，又称PD-1H、B7-H5、DD1α、c10orf54、Gi24或Dies1，是一种I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族。人类VISTA基因主要在造血细胞系和富含浸润白细胞的组织中表达。在人外周血单核细胞(PBMC)中，CD14⁺单核细胞、中性粒细胞、髓系CD11c⁺DCs、CD4⁺和CD8⁺T细胞等均表达VISTA。VISTA在不同物种间高度保守(>80％)。

在免疫反应调节过程中，VISTA既可以作为配体在酸性条件下结合共抑制受体(p选择素糖蛋白配体-1，PSGL-1)，也可以作为受体结合配体(含V型免疫球蛋白域蛋白3，VSIG-3)。研究表明，VISTA在初始T细胞表面表达，对于维持T细胞静默与外周免疫耐受至关重要。

在膀胱癌和黑色素瘤模型中，VISTA单克隆抗体或VISTA基因敲除都能显著改善CD4⁺和CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫；在EAE(实验性变态反应性脑脊髓炎)模型中，VISTA单克隆抗体或VISTA基因敲除都会加重疾病的进展；在卵巢癌模型中，VISTA单克隆抗体显著延长高水平表达VISTA的小鼠的生存期。

VISTA是癌症治疗的潜在靶标。

发明内容

本发明提供了抗VISTA抗体或抗原结合片段，这些抗体或抗原结合片段可以特异性结合VISTA，阻断VISTA下游的免疫抑制信号通路，有助于免疫系统清除肿瘤细胞。

一些实施方案提供了抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合VISTA，并且包含以下中的一个或多个氨基酸序列：

(a)HCDR1，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(b)HCDR2，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(c)HCDR3，其包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(d)LCDR1，其包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(e)LCDR2，其包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(f)LCDR3，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

一些实施方案中提供了抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合VISTA，并且包含：

(a)HCDR1，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(b)HCDR2，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；和

(c)HCDR3，其包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或由其组成，HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或由其组成。

一些实施方案提供了抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合VISTA，并且包含：

(d)LCDR1，其包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(e)LCDR2，其包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；和

(f)LCDR3，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或由其组成，LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或由其组成。

一些实施方案提供了抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合VISTA，并且包含：

(a)HCDR1，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(b)HCDR2，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(c)HCDR3，其包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(d)LCDR1，其包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(e)LCDR2，其包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；和

(f)LCDR3，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的HCDR2、如SEQ ID NO:3所示的HCDR3、如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、如SEQ ID NO:5所述的LCDR2和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3。

在一些实施方案中，所述取代为保守氨基酸取代。

一些实施方案提供了抗体或抗体原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合VISTA，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:7或8所示的序列，与SEQID NO:7或8所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:7或8所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列，或由其组成。

一些实施方案提供了抗体或抗体原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合VISTA，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:9所示的序列，与SEQ IDNO:9所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:9所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列，或由其组成。

在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:9所示的序列。

在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:8所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:9所示的序列。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其组合。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD其中一种同种型。在一些实施方案中，同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。

在一些实施方案中，Fc是变体Fc区。在一些实施方案中，相对于亲本Fc区，变体Fc区具有一个或多个氨基酸修饰，如取代、缺失或插入。在一些实施方案中，相对于亲本Fc区活性，Fc区的氨基酸修饰改变了效应功能活性。在一些实施方案中，变体Fc区可以具有改变的(即，增加的或降低的)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CDC)、吞噬作用、调理作用或细胞结合。在一些实施方案中，相对于亲本Fc区，Fc区氨基酸修饰可以改变变体Fc区对FcγR(Fcγ受体)的亲和力。在一些实施方案中，所述Fc区来源于IgG1或IgG4。在一些实施方案中，Fc区突变是N297A。

在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为分离的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为scFv、Fab或F(ab)₂。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体。

在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的序列，或与SEQ ID NO:10所述序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:10所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列，或由其组成；和/或

所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的序列，或与SEQ ID NO:11所述序列具有相比至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:11所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列，或由其组成。

在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含氨基酸序列如SEQID NO:11所示的序列。

在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:12或13所示的序列，与SEQ ID NO:12或13所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:12或13所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列，或由其组成；和/或

所述抗体的轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的序列，与SEQ ID NO:14所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:14所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列，或由其组成。

在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的序列。

在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的序列。

在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体或多特异性抗体或抗原结合片段(例如双特异性抗体或抗原结合片段)。

在一些实施方案中，所述抗体具有两条序列相同的重链和两条序列相同的轻链，Fc区配对形成二硫键。

在一些实施方案中，所述抗原结合片段为Fab、Fv或scFv。

本发明还提供了一种编码所述的抗体或抗原结合片段的核酸。在一些实施方案中，所述核酸为分离的核酸。

本发明还提供了一种包含所述的核酸的载体。在一些实施方案中，所述载体为分离的载体。

本发明还提供了一种包含所述核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为分离的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为CHO细胞、HEK细胞(如HEK293F细胞)、BHK细胞、Cos1细胞、Cos7细胞、CV1细胞或鼠L细胞。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述的抗体或抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。

本发明还提供了预防或治疗肿瘤、癌症或感染的方法和用途。在一些实施方案中，提供了用于治疗或改善T细胞功能障碍病症的方法，所述方法包括向患者施用有效剂量的所述抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，提供了所述抗体或抗原结合片段在用于治疗或改善T细胞功能障碍病症中的应用。在一些实施方案中，提供了所述抗体或抗原结合片段在制备用于治疗或改善T细胞功能障碍的药物中的应用。

在一些实施方案中，所述T细胞功能障碍病症包括但不限于由细菌、病毒、真菌或原生动物导致的感染，以及癌症和肿瘤。

在一些实施方案中，所述癌症和肿瘤包括但不限于乳腺癌、消化道癌/胃肠癌、内分泌癌、神经内分泌癌、眼睛癌、泌尿生殖癌、生殖细胞癌、妇科癌、头颈癌、血液学/血液癌、肌肉骨骼癌、神经癌、呼吸道癌/胸腔癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、子宫内膜癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、睾丸癌、食道癌、前列腺癌、脑癌、宫颈癌、卵巢癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，癌症和肿瘤包括但不限于白血病、黑色素瘤和淋巴瘤。在一些实施方案中，白血病包括但不限于淋巴细胞白血病或髓细胞性白血病(如例如急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓(髓细胞性)白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML))、毛细胞白血病、T细胞幼淋巴细胞白血病、大颗粒淋巴细胞白血病或成人T细胞白血病。在一些实施方案中，淋巴瘤包括但不限于组织细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，感染包括但不限于慢性感染性疾病，如HIV、HBV、HCV和HSV等。

本发明还提供了诊断方法和用途。在一些实施方案中，提供了检测样品中VISTA表达的方法，使样品与所述抗体或抗原结合片段进行接触，使得所述抗体或抗原结合片段结合VISTA，并检测其结合，即样品中VISTA的含量。在一些实施方案中，提供了所述抗体或抗原结合片段在制备用于诊断或预后癌症或肿瘤试剂盒中的应用。在一些实施方案中，提供了一种包含所述抗体或抗原结合片段的诊断或预后试剂盒；任选的，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗VISTA抗体；任选的，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶；任选的，所述试剂盒用于检测VISTA在样品中的存在或其水平；任选的，所述试剂盒还包括针对其它抗原的抗体或抗原结合片段，和/或细胞毒性剂，和任选的，使用说明书。

本发明提供了抗VISTA抗体或抗原结合片段及其应用，本发明抗体或抗原结合片段可以特异性结合VISTA，阻断VISTA下游的免疫抑制信号通路，有助于免疫系统清除肿瘤细胞。本发明抗体或抗原结合片段可以用于治疗或改善T细胞功能障碍病症，也可以用于癌症或肿瘤的诊断和预后。

附图说明

图1为本发明实施例1中抗VISTA抗体的SDS-PAGE图谱；其中，泳道M表示maker，泳道1表示抗体P48-6-K，泳道2表示抗体P48-6-T，泳道3表示抗体VSTB112。

图2示抗VISTA抗体阻断VSIG-3与VISTA的结合。

图3示抗VISTA抗体促进T细胞增殖；图中，**表示p<0.01，****表示p<0.0001。

图4A示抗体对肿瘤体积的影响。

图4B示抗体对肿瘤重量的影响；图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图5示抗体对小鼠体重的影响。

术语

除非另作说明，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。

定义

应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。

术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的氨基酸单体组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得，它可能以包括化学合成的任何方式产生。

“氨基酸”是指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如α-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。天然氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：ala，一字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。

“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似的侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般而言，保守氨基酸取代不大会在实质上改变蛋白质的功能性质。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括：1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸。

“VL、VH的保守氨基酸取代”的氨基酸数目为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。“重链恒定区、轻链恒定区、重链或轻链的保守氨基酸取代”的氨基酸数目为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个、约18个、约19个、约22个、约24个、约25个、约29个、约31个、约35个、约38个、约41个、约45个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。

本发明中关于细胞、核酸、多肽、抗体等所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA、RNA、多肽、抗体是指分别于细胞天然环境中的其它组分如DNA或RNA中的一种或多种所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。分离的多肽、抗体等通常通过至少一个纯化步骤制备。在一些实施方案中，分离的核酸、多肽、抗体等的纯度至少为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。

术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。

“至少80％同一性”为约80％同一性、约81％同一性、约82％同一性、约83％同一性、约85％同一性、约86％同一性、约87％同一性、约88％同一性、约90％同一性、约91％同一性、约92％同一性、约94％同一性、约95％同一性、约98％同一性、约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。

多聚核苷酸或多聚核苷酸序列(或多肽或抗体序列)与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“同一性或序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用目测或本领域已知的软件程序来确定该比对和同一性百分比或序列同一性，比如Ausubel et al.eds.(2007)在CurrentProtocols in Molecular Biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST，例如BLASTN和BLASTP，两者使用下列默认参数：Geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同一性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。

多聚核苷酸是由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)，或当多聚核苷酸是RNA时胸腺嘧啶换为尿嘧啶(U)。“多聚核苷酸序列”可以以多聚核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。

术语“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是不受限制的多聚核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多聚核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。

术语“编码”应用于多聚核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多聚核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。

本发明公开的抗体、抗原结合片段包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、全人源抗体、人源化抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段(例如类Fab、类Fab'和类F(ab')₂)、类单链Fvs(scFv)。

“抗体”、“抗原结合片段”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。抗体和抗原结合片段包括但不局限重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)、框架区(FR)或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。CDR区包括轻链的CDR区(LCDR1-3)和重链的CDR区(HCDR1-3)。抗体及抗原结合片段可以特异性识别和结合一个或多个(如两个)抗原的多肽或多肽复合物。特异性识别和结合多个(如两个)抗原的抗体或抗原结合片段可以被称为多特异性(如双特异性)抗体或抗原结合片段。

术语“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的一部分，本发明抗体片段的组成形式可类似于单特异性抗体片段中的F(ab’)₂、F(ab)₂、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗原结合片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。

“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。scFv分子通常是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。

术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。在一些实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG种类。

轻链可以分为kappa(κ)或lambda(λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤，B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为Vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为V_λ。

轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能被使用。轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)部分决定了抗原识别和特异性。轻链和重链的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。

在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是形成抗原结合结构域的短的、非连续的与抗原特异性结合的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“构架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。构架区大部分采用β-折叠构象，CDR形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使CDR定位在正确的方位上。具有特定位置的CDR的抗原结合域形成了与抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其抗原表位的非共价结合。对于给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以通过已知方法鉴定出包含CDR和框架区的氨基酸(参见Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,Sequences ofProteins of Immunological Interest,(1983)和Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))。

在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括所有这些含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“CDR”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences ofProteins of Immunological Interest(1983)和Chothia等在J.Mol.Biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过引用全部并入本文。

根据Kabat和Chothia定义的CDR包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的CDR都在本发明范围内。包含特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员通常可以根据抗体的可变区氨基酸序列确定出CDR包含哪些特定的残基。

Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以不依赖于序列本身以外的其他实验数据将该“Kabat编号”系统应用到任何可变区序列。“Kabat编号”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services在“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。抗体还可以用EU或Chothia编号系统。

本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施方案中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。

“重链恒定区”包括CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域，或变体或片段中的至少一种。抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自IgG₁分子的CH1结构域和源自IgG₃分子的铰链区。在另一实施方案中，重链恒定区可以包括部分源自IgG₁分子和部分源自IgG₃分子的铰链区。在另一实施方案中，部分重链可以包括部分源自IgG₁分子和部分源自IgG₄分子的嵌合铰链区。

“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的一部分氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。“轻链-重链对”是指可通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。这四条链通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”口开始并延续通过可变区包围重链。

“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(大部分氨基末端)恒定区。完整的天然IgG分子中两个CH2结构域中N297各连接一个分支碳水化合物链。CH3结构域从CH2结构域开始延伸到IgG分子的C-末端，大约包含108个残基。“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的部分重链区域。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个N端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Rouxetal.,J.Immunol 161:4083(1998))。

“二硫键”指两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸的硫醇基团可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接。

“嵌合抗体”指其可变区从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。某些实施方案中，可变区来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区来自人源。

“特异性结合”或“对……具有特异性”通常是指抗体或抗原结合片段与特定抗原通过其抗原结合结构域与表位互补性结合形成相对稳定的复合物。“特异性”可以用抗体或抗原结合片段与特定抗原或表位结合的相对亲和力表达。例如，如果抗体“A”比抗体“B”与同一抗原的相对亲和力大，可以认为抗体“A”比抗体“B”对该抗原具有更高的特异性。特异性结合可以用平衡解离常数(K_D)来描述，较小的K_D意味着较紧密的结合。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振、生物膜层光学干涉测量法等。“特异性结合”抗原a的抗体包括与抗原a平衡解离常数K_D小于或等于约100nM、小于或等于约10nM、小于或等于约5nM、小于或等于约1nM或小于或等于约0.5nM的抗体。

“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防、减缓、改善或停止不良的生理改变或紊乱，例如疾病的进程，包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善、缓和、减轻或消失(无论是部分还是全部)、延长与不接受治疗时预期的生存期限等。需要治疗的患者包括已经患有病症或紊乱的患者，容易患有病症或紊乱的患者，或者需要预防该病症或紊乱的患者，可以或预期从施用本发明公开的抗体或药物组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的患者。

“患者”指需要诊断、预后或治疗的任何哺乳动物，包括人类、狗、猫、兔子、鼠、马、牛等。

抗VISTA抗体

本发明提供了对VISTA蛋白具有高亲和力的抗体或抗原其结合片段。本发明的抗体或抗原结合片段表现出有效的结合活性、生物学活性，并可用于治疗和诊断的用途。比如，这些抗体或抗原结合片段可以有效阻断抑制性的免疫检查点，激活淋巴细胞释放细胞因子，用于治疗各种类型的癌症、肿瘤或感染等相关疾病。

在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:12中除Fc以外的序列，所述抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的序列。

在一些实施方案中，所述抗体的重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的序列。在一些实施方案中，所述抗原结合片段的重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:13中除Fc以外的序列，所述抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的序列。

在一些实施方案中，本发明抗体含有两条序列相同的重链(或重链片段)和两条序列相同的轻链(或轻链片段)。

本领域普通技术人员还应当理解，本发明所公开抗体或抗原结合片段序列是可以被替换的，替换后其氨基酸序列不同于该抗体的天然存在的氨基酸序列。例如，替换后的氨基酸序列可以是与起始序列相似的，比如与起始序列具有一定比例的同一性，比如它可以与起始序列的同一性是约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列具有一个或多个修饰基团。例如，本发明公开的抗体或抗原结合片段可以包含有韧性的接头序列，或者可以被修饰以添加功能性基团(例如PEG、药物、毒素或标签)。

本发明公开的抗体、抗原结合片段包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体或抗原结合片段的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体或抗原结合片段与表位结合。包括但不限制以下实例，抗体或抗原结合片段可以被糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。本发明公开的抗体、抗原结合片段及其被修饰的衍生物包括其与酸和/或碱形成的盐。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以与治疗剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或PEG缀合。

抗体或抗原结合片段可通过将其偶联至化学发光化合物来被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光从而确定化学发光标记的抗体或抗原结合片段的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

抗体和编码抗体的多聚核苷酸的制备方法

本发明还公开了编码本发明所述抗体、抗原结合片段、及其衍生物的多聚核苷酸或核酸分子。本发明公开的多聚核苷酸可以编码重链可变区、轻链可变区、Fc区、部分重链可变区、部分轻链可变区、重链或轻链等。制备抗体的方法是本领域公知的并且在本发明中有所描述。

在某些实施方案中，制备的抗体不会在待治疗的动物(例如人类)中引起有害的免疫应答。在一些实施方案中，本发明公开的抗体、抗原结合片段、或衍生物使用本领域公认的技术修饰以降低其免疫原性。例如，抗体可以被人源化、灵长类化、去免疫化或者可以制备嵌合抗体。这些类型的抗体来源于非人抗体，通常是鼠类或灵长类抗体，其保留或基本保留亲本抗体的抗原结合特性但在人体中免疫原性较低。其可以通过多种方法来实现，包括(a)将整个非人源的可变区移植到人源的恒定区以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(CDR)的至少一部分移植到人源的框架和恒定区中，保留或不保留关键的框架残基；或(c)移植整个非人源的可变区，但通过用类人源的部分置换表面残基从而“隐藏”它们。通常人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，比如能够改善抗原结合的残基。这些框架替换可以通过本领域公知的方法鉴定，例如通过模拟CDR和框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合起重要作用的框架残基和通过序列对比以鉴定特定位置上异常的框架残基。(参考美国专利5,585,089；Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)；其全部内容通过引用并入本文)。可以使用本领域公知的多种技术使抗体人源化，例如CDR移植(EP 239,400；WO 91/09967；美国专利5,225,539,5,530,101和5,585,089)，修复或者表面重排(EP592,106；EP519,596；Padlan,et al.,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguska,etal.,Proc.Natl.Sci.USA 91:969-973(1994))，以及链的重排(美国专利5,565,332)，其全部内容通过引用并入本文。

去免疫化也可用于降低抗体的免疫原性。在本发明中，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰T细胞表位(参见例如WO/9852976A1和WO/0034317A2)。例如，分析来自起始抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列，并产生来自每个可变区的人T细胞表位“图谱”，显示表位相对于互补决定区(CDRs)和序列内其它关键残基的位置。分析来自T细胞表位图的单个T细胞表位，以鉴定具有较低改变抗体活性风险的可选择的氨基酸取代。设计包含氨基酸取代组合的一系列可选的重链可变区序列和轻链可变区序列，随后将这些序列掺入到一系列结合多肽中。然后将包含修饰过的可变区和人类恒定区的完整重链和轻链的基因克隆到表达载体中，随后将质粒转入细胞系以产生完整的抗体。然后利用合适的生物化学和生物学实验中比较抗体，鉴定出最佳的抗体。

本发明公开的抗体或抗原结合片段的结合特异性可以通过体外实验，例如免疫共沉淀、放射免疫实验(RIA)或酶联免疫吸附实验(ELISA)来检测。

scFv的制备可参见生产单链单元的技术(美国专利4,694,778；Bird,Science242:423-442(1988)、Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55:5879-5883(1988)和Wardet al.,Nature 334:544-554(1989)和Nie et al.,Antibody Therapeutics 3(1):18-62(2020))。通过氨基酸桥接Fv区的重链和轻链片段形成单链单元，产生单链融合肽。也可以使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra et al.,Science 242:1038-1041(1988))。

可用于生产单链Fv(scFv)和抗体的技术的实例包括如美国专利4,946,778和5,258,498，以及Huston et al.,Methods in Enzymology 203:46-88(1991)、Shu et al.,Proc.Natl.Sci.USA 90:1995-1999(1993)和Skerra et al.,Science 240:1038-1040(1988)中所述。对于包括在人体内使用抗体和体外检测实验的某些用途，可以使用嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物物种的一类分子，例如具有鼠源单克隆抗体的可变区和人源免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi et al.,BioTechniques 4:214(1986)；Gillies et al.,J.Immunol.Methods 125:191-202(1989)；Neuberger etal.,Nature 372:604-608(1984)；Takeda et al.,Nature 314:452-454(1985)；和美国专利5,807,715、4,816,567和4,816,397，其全部内容通过引用并入本文。

此外，在Newman,Biotechnology 10:1455-1460(1992)中公开了另一种生产重组抗体的高效方法，特别地，该技术能产生含有猴可变区和人恒定区序列的灵长类抗体，该参考文献的全部内容通过引用并入本文。此外，该技术也在美国专利5,658,570、5,693,780和5,756,096中有所提及，每个专利的全部内容通过引用并入本文。

抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来自免疫球蛋白序列的抗体文库进行的噬菌体展示方法。也可参考美国专利4,444,887和4,716,111，以及PCT公布文本WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO91/10741，每个专利的全部内容通过引用并入本文。

在另一实施方案中，使用常规方法(例如使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以分离编码所需单克隆抗体的DNA并对其进行测序。分离的和亚克隆的杂交瘤细胞可以作为此类DNA的来源。一旦分离出来，DNA可以被置于表达载体中，然后被转染到原核或真核宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生其他免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中。分离的DNA(如本文所述可以是合成的)也可用于制备抗体的恒定区和可变区的序列，如美国专利5,658,570中所述，其全部内容通过引用并入本文。该方法从所选细胞中提取RNA并转化成cDNA，然后使用Ig特异性引物通过PCR技术进行扩增。适于此目的的合适的探针在美国专利5,658,570中也有所提及。

此外，使用常规重组DNA技术，可将本发明的抗体的一个或多个CDR插入框架区，例如插入到人类框架区以构建人源化非全人源抗体。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人类框架区(参见Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)，其列出一系列人类框架区)。一些多核苷酸可以编码框架区和CDR组合产生的与目标抗原的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内可以进行一个或多个氨基酸取代，可以选择能够改善抗体与其抗原结合的氨基酸取代。另外，可用此法进行参与链间二硫键形成的一个或多个可变区中半胱氨酸残基的取代或缺失，从而产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。本领域技术范围内的对多核苷酸进行的其他改变也涵盖于本发明中。

抗体可以通过使用常规重组DNA技术制备。使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体的载体及细胞系等。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如Recombinant DNA Technology for Production of ProteinTherapeutics in Cultured Mammalian Cells，D.L.Hacker,F.M.Wurm,in ReferenceModule in Life Sciences,2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。

在一些实施方案中，可以按常规方法根据本文所述抗体氨基酸序列设计合成编码抗体的DNA，将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生单克隆抗体。在一些实施方案中，表达抗体载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polyA尾。其他元件包括增强子，Kozak序列及插入序列两侧RNA剪接的供体和受体位点。可以通过SV40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN，或者Plncx，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro(+/-)，PSVL，PMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI和pCS2等。常使用的哺乳动物细胞包括293细胞，Cos1细胞，Cos7细胞，CV1细胞，鼠L细胞和CHO细胞等。

在一些实施方案中，插入基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶，谷氨酰胺合成酶，新霉素抗性，潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到无上述基因的宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。

此外，可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本发明所述抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点突变和PCR介导的突变。变体(包括衍生物)编码相对于原重链可变区和轻链可变区来说少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的替换、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代或少于2个氨基酸的取代。或者可以沿着全部或部分编码序列时随机引入突变，例如通过饱和突变，以及可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。

治疗方法

本发明还提供了治疗方法和用途。在一些实施方案中，提供了用于治疗或改善各种类型的癌症、肿瘤或感染等相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效剂量的抗VISTA抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，提供了抗VISTA抗体或抗原结合片段在用于治疗或改善癌症、肿瘤或感染等相关疾病中的应用。在一些实施方案中，提供了所述抗VISTA抗体或抗原结合片段在制备用于治疗或改善癌症、肿瘤或感染等相关疾病的药物中的应用。

对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定抗体或衍生物、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄频率、药物组合，以及所治疗的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所述剂量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度以及所需的效果。所用剂量可以通过本领域熟知的药理学和药代动力学原理确定。在一些实施方案中，本发明抗体施用于患者的剂量为每次0.01mg/kg至100mg/kg患者体重。在一些实施方案中，每1星期、2星期、3星期、或每月给药一次。

抗体或衍生物的施用方法包括但不限于真皮内、肌肉、腹腔、静脉、皮下、鼻腔、硬脊膜外和口服注射。药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，含有本发明抗体或抗原结合片段的药物组合物可以口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾给药。

本发明使用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。

施用方式可以是全身施用或局部施用。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的抗体引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管连接到如贮液囊(可以是Ommaya贮液囊)来辅助注射。也可以通过肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及使用雾化的制剂。

本发明抗体可以局部施用于需要治疗的区域；可以通过但不限于以下方式：手术期间局部施用，例如与手术后伤口敷料联合的局部应用，通过注射，通过导管，借助栓剂或借助植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜(例如硅橡胶膜)或纤维。在一些实施方式中，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。

在一些实施方案中，本发明组合物包含编码抗体的核酸或多聚核苷酸，可以通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分来体内施用所述核酸以促进其编码的蛋白质的表达，然后通过下述方式施用上述部分载体使其变为胞内部分，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或者通过与已知进入细胞核的同源异型盒类肽连接施用(参见例如Joliot et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1864-1868)等等。可选地，核酸可以通过同源重组在引入细胞内并整合至宿主细胞DNA中用于表达。

在一些实施方案中，本发明抗体施用于患者的剂量为0.01mg/kg至100mg/kg患者体重，或0.1mg/kg至20mg/kg患者的体重。在初始剂量之后可随后给予第二剂或多剂该抗体或抗原结合片段，其剂量与初始剂量大致相同或较少，其中该随后的剂量可相隔至少1天至3天；或至少一星期。可以通过例如脂质化等修饰来增强抗体的摄取和组织穿透能力(例如进入脑内)，从而减少本发明抗体的施用的剂量和频率。

通常在进行体外测试用于治疗疾病的方法，包括施用本发明所述抗体或衍生物，然后在可接受的动物模型中体内测试期望的治疗性或预防性活性，最后施用于人体。合适的动物模型(包括转基因动物)是本领域普通技术人员所公知的。例如，用于证明本发明所述抗体、抗原结合片段的治疗用途的体外测定包括抗体对细胞系或患者组织样品的影响。抗体对细胞系和/或组织样品的作用可以利用本领域技术人员已知的技术进行检测，例如本发明其他部分公开的技术。根据本发明的内容，可用于确定是否施用特异性抗体的体外测定实验包括体外细胞培养实验，其中患者组织样品在培养物中培养，并暴露于或以其他方式施用化合物，并观察这种化合物对组织样品的影响。

各种已知输送系统可用于施用本发明抗体或衍生物或编码其的多核苷酸，例如包封于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。

联合疗法

在一些实施方案中，本发明抗VISTA抗体或抗原结合片段可以结合其它治疗或预防方案，包括施用一种或多种本发明抗体或抗原结合片段，以及一种或多种其它治疗剂或方法一起使用或组合使用。在一些实施方案中，其他治疗方案包括但不限于放射疗法、化学疗法、激素疗法等。对于组合治疗，抗体可以与其它治疗剂可同时或分开施用。当分开施用时，可以在施用另一种其它治疗剂之前或之后施用本发明抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，可以与本发明抗体或抗原结合片段一起施用的血管生成抑制剂包括但不限于血管抑制素(血纤蛋白溶解酶原片段)、抗血管生成抗凝血酶III和核酶。

在一些实施方案中，可以与本发明抗体或抗原结合片段一起施用的抗癌剂包括但不限于：5-氟尿嘧啶、阿西维辛、阿地白介素、六甲蜜胺、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、安曲霉素、天冬酰胺酶、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴马司他、比卡鲁胺、硫酸博来霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、卡铂、卡莫司汀、盐酸卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗霉素、顺铂、克拉屈滨、甲横酸克立那托(crisnatol mesylate)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、盐酸柔红霉素、地西他滨、右奥马铂、地扎胍宁、甲磺酸地扎胍宁(dezaguanine mesylate)、地吖醌、多西他赛、多柔比星、盐酸阿霉素、屈洛昔芬、柠檬酸屈洛昔芬、丙酸屈他雄酮、达佐霉素、依达曲沙、盐酸依氟鸟氨酸、恩洛铂、恩普氨酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸伊索比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、法扎拉滨、芬维A胺、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、伊莫福新、白介素II(包括重组白介素II)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-m、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-I b、异丙铂、盐酸伊立替康、醋酸兰瑞肽、来曲唑、亮丙瑞林乙酸盐、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀、盐酸洛索蒽醌、马索罗酚、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、乙酸甲烯雌醇、美法仑、美诺立尔、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、丝裂霉素、米托司培、米托坦、盐酸米托蒽醌、麦考酚酸、诺考达唑、奥马铂、紫杉醇、培门冬酶、紫菜霉素(porfromycin)、泼尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、嘌呤霉素、罗谷亚胺、盐酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、司泊索非钠、司帕霉素、螺莫司汀、螺铂、链黑霉素、链脲菌素、磺氯苯脲、太利苏霉素、替加氟、盐酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酯、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、噻替派、噻唑呋林、替拉扎明、拓扑替康、三甲曲沙、葡萄糖醛酸三甲曲沙、曲普瑞林、乌拉莫司汀、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬(verteporfn)、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸长春罗辛、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春罗定、硫酸长春利定、伏氯唑、折尼铂、净司他丁和盐酸佐柔比星等。

在一些实施方案中，可以与本发明抗体或抗原结合片段一起施用的治疗性抗体包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、替西木单抗(tremelimumab)、伊匹木单抗、曲妥珠单抗、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG-3抗体、抗OX40抗体和抗GITR抗体等。

药物组合物

本发明还提供了药物组合物。这样的组合物包含有效剂量的抗VISTA抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物包含0.1％-90％的抗VISTA抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，药物组合物还包含抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂)。

在一些实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由政府的监管机构批准的或公认药典中列出的用于动物，特别是用于人类的物质。此外，“药学上可接受的载体”通常指是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂等。

术语“载体”是指可以与活性成分一起施用于患者的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸，以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖也是可以预见的。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的Remington'sPharmaceutical Sciences中有描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体或抗原结合片段，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。亲本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

在一些实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。用于静脉内给药的组合物通常是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。

本发明的化合物可以配制成中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括衍生自如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的与阴离子形成的盐，以及衍生自如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的与阳离子形成的盐。

“约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”指所描述的数值以及其±10％、±5％或±1％的范围。

“EC₅₀”即半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,EC₅₀)是指能引起50％最大效应的浓度。

本发明中“亲本Fc区”可以为天然存在的Fc区，编码Fc区的基因可来自人、鼠、兔、骆驼、猴子，优选为人和小鼠；例如，亲本Fc区为SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中Fc区。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改或调整仍属于本发明的保护范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1抗体制备方法

本实施例制备的抗体包括抗VISTA抗体，抗体实施例相关的氨基酸序列和核酸序列见表1-表5；表4中重链的Fc区用单下划线标出，表5中信号肽的核酸序列用双下划线标出。

将抗体的重链和轻链的核苷酸序列依照宿主细胞密码子偏好性特点进行序列优化，得到重链和轻链的DNA序列。为了便于在宿主细胞中表达，在重链和轻链的N端添加信号肽。

将优化并合成的核酸序列分别克隆至载体(载体可选pCDNA3.1，来源于Invitrogen的V79020)中，然后分别抽提大量质粒。重链表达载体和轻链表达载体按质粒摩尔比1:1瞬时表达转染HEK293F细胞。以抗体P48-6-K为例，其重链核酸序列如SEQ ID NO:17所示(包含信号肽的核酸序列)，轻链核酸序列如SEQ ID NO:18所示(包含信号肽的核酸序列)，将P48-6-K的重链可变区核酸序列(SEQ ID NO:20，包含信号肽的核酸序列)和轻链可变区核酸序列(SEQ ID NO:21，包含信号肽的核酸序列)通过酶切分别克隆至含有编码人IgG1重链恒定区的核酸(SEQ ID NO：22)的表达载体和含有编码人Ig kappa轻链恒定区的核酸(SEQ ID NO：23)的表达载体中；其中，重链信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:15，轻链信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:16；重链采用的限制位点内切酶是HindIII/KpnI，轻链采用的限制位点内切酶是HindIII/BsiWI。以抗体P48-6-T为例，将重链可变区核酸序列和轻链可变区核酸序列通过酶切分别克隆至含有编码人IgG1重链恒定区的核酸(SEQ ID NO：22)的表达载体和含有编码人Ig kappa轻链恒定区的核酸(SEQ ID NO：23)的表达载体中；其中，重链信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:15，轻链信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:16；重链采用的限制位点内切酶是HindIII/KpnI，轻链采用的限制位点内切酶是HindIII/BsiWI。阳性参照抗体VSTB112为抗VISTA抗体，其制备方法与上述类似(序列见专利申请CN107922497A)。细胞表达后，培养液由采用Protein A柱(GE Healthcare)的固定化金属亲和层析(IMAC)进行纯化，纯化后的抗体蛋白的纯度＞95％。

对纯化后抗体进行凝胶电泳检测，如图1所示，本申请抗体P48-6-K和P48-6-T为单一物质，分子量与理论值是一致的。对纯化后抗体进行测序，测序结果与预计的序列相同。纯化后抗体用于亲和力检测和生物活性鉴定等。本发明实施例的抗体CDR氨基酸残基根据Kabat编号系统确认。

表1抗体的组成

表2抗VISTA抗体的CDR区(Kabat编号)

名称	氨基酸序列	SEQ ID NO:
			HCDR1	GYDMS	1
HCDR2	GIDGHFDSSFYADSVKG	2
			HCDR3	SSYAVDLAFDY	3
LCDR1	RASQGISSYLA	4
			LCDR2	AASSLQS	5
LCDR3	QQHYTTPPT	6

表3抗VISTA抗体的可变区和恒定区

表4抗体的重链和轻链

表5抗体相关核酸序列(双下划线为编码信号肽的核酸)

实施例2抗体亲和力的测定

采用Biacore T200表面等离子体共振仪测定抗体的亲和力常数，主要试验过程如下：用Protein A芯片进行检测，100nM抗体稀释液以10μl/min的流速通过实验流路(Fc2、Fc4)，捕获20s使捕获量约为560RU；之后流速调为30μl/min，依次进不同浓度(0nM、1.23nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM、100nM)的VISTA-His(Acro，B75-H52H0)稀释液(稀释的溶剂为水)，同时经过实验流路(Fc2、Fc4)和参比流路(Fc1、Fc3)表面，结合时间120s，解离时间300s，最后进Glycine 1.5对芯片进行再生并进入下一个循环；用数据分析软件EvaluationSoftware3.1对试验结果进行分析，将样品实验流路采集所得传感信号进行参比流路、样品空白双扣减，并选用动力学“1:1”模型进行拟合，得出动力学参数(Kon(Ka)：结合速率常数；Koff(Kd)：解离速率常数；K_D：结合解离平衡常数)。

1)如表6所示，与抗体VSTB112相比，本发明抗体P48-6-K与VISTA-His具有良好的亲和力。

表6抗体P48-6-K与VISTA-His结合的亲和力常数

抗体编号	K<sub>D</sub>(M)	K<sub>on</sub>(1/Ms)	K<sub>off</sub>(1/s)
				VSTB112	3.32E-10	9.92E+05	3.29E-04
P48-6-K	3.31E-10	1.04E+06	3.44E-04

2)如表7所示，与抗体VSTB112相比，本发明抗体P48-6-T与VISTA-His具有更好的亲和力。

表7抗体P48-6-T与VISTA-His结合的亲和力常数

抗体编号	K<sub>D</sub>(M)	K<sub>on</sub>(1/Ms)	K<sub>off</sub>(1/s)
				VSTB112	4.00E-10	4.68E+05	1.87E-04
P48-6-T	1.76E-10	4.87E+05	8.58E-05

实施例3抗体与不同种属VISTA结合情况的检测

100μL VISTA-Fc(人、食蟹猴、小鼠种属，Sino biological Inc)包板，抗VISTA抗体的起始浓度为2μg/mL，2倍梯度稀释(稀释的溶剂为PBS缓冲液)，4℃冰箱放置过夜；PBST(PBS+0.05％吐温，1升PBS含NaCl 8.0g，Na₂HPO₄ 0.9g，KH₂PO₄ 0.156g，KCl 0.125g，pH7.2-7.4)洗涤3次，5％BSA(牛血清白蛋白)室温封闭2h，PBST洗涤4次；2μg/mL抗体室温孵育1.5h，PBST洗涤4次；洗涤后再用羊抗人kappa轻链-过氧物酶抗体(SIGMA，货号为A7164)孵育0.5h；PBST洗涤6次，加入100μL四甲基联苯胺(TMB)，37℃孵育5min，加入50μL 0.1M硫酸终止；酶标仪读取450nm吸光值。

如表8所示，抗体VSTB112、P48-6-K、P48-6-T与人、食蟹猴的VISTA结合，且不与小鼠VISTA结合。

表8抗体与VISTA-FC结合的EC₅₀(μg/mL)

抗体编号	人源VISTA-Fc	食蟹猴VISTA-Fc	鼠源VISTA-Fc
				VSTB112	0.1	0.065	NA
P48-6-K	0.082	0.05	NA
				P48-6-T	0.086	0.049	NA

注：NA表示不结合。

实施例4抗体与表达VISTA细胞的结合力的检测

CHO-VISTA细胞的制备方法为：人VISTA全长氨基酸序列(来自UniProtKB-Q9H7M9)：“MGVPTALEAGSWRWGSLLFALFLAASLGPVAAFKVATPYSLYVCPEGQNVTLTCRLLGPVDKGHDVTFYKTWYRSSRGEVQTCSERRPIRNLTFQDLHLHHGGHQAANTSHDLAQRHGLESASDHHGNFSITMRNLTLLDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVHGAMELQVQTGKDAPSNCVVYPSSSQDSENITAAALATGACIVGILCLPLILLLVYKQRQAASNRRAQELVRMDSNIQGIENPGFEASPPAQGIPEAKVRHPLSYVAQRQPSESGRHLLSEPSTPLSPPGPGDVFFPSLDPVPDSPNFEVI”(SEQ ID NO:19)；合成SEQ ID NO:19对应的核酸序列，并在序列两端添加HindIII和EcoRI酶切位点，然后构建到pcDNA3.1表达载体上，接着通过电转的方法转染到CHO细胞中，电转条件为：电压300V，时间17毫秒，4mm电转杯，48h后加入50μM的MSX(蛋氨酸亚氨基代砜)筛选阳性细胞。利用FACS(流式细胞术)检测，筛选高表达的细胞株并收集细胞，用PBS洗一遍后，加入3μg/ml抗体VSTB112，4℃孵育1h后，用PBS洗2遍，再加入100μl 1:500稀释的羊抗人IgG-Fc PE荧光二抗(货号为12-4998-82，eBioscience)，4℃孵育1h后，用PBS洗2遍，采用C6流式细胞仪分析；将最终得到的细胞命名为CHO-VISTA细胞。

抗VISTA抗体起始浓度为5μg/mL，2倍梯度稀释，每孔100μL抗体稀释液和100μL 5×105个CHO-VISTA细胞；混合均匀，4℃孵育30min；PBS洗两次细胞后，加入羊抗人IgG-FcPE荧光二抗(1:1000PBS稀释)后，4℃孵育30min，PBS洗两次细胞；再用200μL PBS(Gibco公司)重悬，用流式细胞仪CytoFLEX测量第二通道荧光强度。

结果显示，抗体VSTB112、P48-6-K和P48-6-T与VISTA-CHO细胞的结合的EC₅₀值分别为1.52μg/mL、1.01μg/mL和1.22μg/mL。

实施例5抗体阻断VISTA与配体VSIG-3的结合

10μg/mL VSIG-3(Recombinant Human VSIG3 Fc Chimera Protein，R&D，货号9229-VS-050)包板4℃过夜；PBST洗涤3次，5％BSA室温封闭2h，PBST洗涤4次；10μg/mL生物素标记的VISTA与抗体稀释液混合(以15μg/mL为起始浓度，2倍梯度稀释)，室温孵育1.5h，PBST洗涤4次；洗涤后再用链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)孵育0.5h；PBST洗涤6次，加入100μL四甲基联苯胺(TMB)，37℃孵育5min，加入50μL 0.1M硫酸终止；酶标仪读取450nm吸光值。

如图2所示，本发明抗体P48-6-K可以阻断VSIG-3与VISTA结合，且有浓度依赖关系。

实施例6细胞因子的检测

采集健康成年人外周血，用生理盐水(四川科伦药业)1:1稀释，缓慢加入等体积人外周血淋巴细胞分离液(达科为生物技术股份有限公司，

)中，800g离心30min，吸取中间白色层，PBS洗两次；重悬在含10％FBS(胎牛血清，Gibco公司)的RPMI-1640培养基(Gibco公司)中并对细胞进行计数，调整PBMC细胞(外周血单个细胞)浓度为10⁶个/mL。

采用RPMI-1640培养基稀释抗VISTA抗体(起始浓度为6μg/mL，3倍梯度稀释)，加入U型96孔板中，每孔100μL，2个平行孔；加入100μL PBMC细胞溶液，混合均匀；放入37℃、5％二氧化碳培养箱中培养约18h。

使用人CXCL10/IP-10ELISA试剂盒(R&D Systems，货号DY266)检测IP-10(干扰素诱导蛋白10)。检测步骤为：IP-10捕获抗体包板4℃过夜，PBST洗涤3次，1％BSA室温封闭2h，PBST洗涤4次；U型96孔板(包含PBMC细胞和抗体)2000rpm离心5min，取100μL上清加入ELISA板中，配制适宜浓度梯度的标准品，室温孵育1.5h，PBST洗涤4次，加入100μL生物素标记的IP-10检测抗体溶液室温孵育1.5h，PBST洗涤4次；加入100μL链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶溶液，室温孵育0.5h，PBST洗涤6次；加入100μL四甲基联苯胺(TMB)，37℃孵育5min，再加入50μL 0.1M硫酸终止；酶标仪读取450nm吸光值。

结果显示，抗体VSTB112、抗体P48-6-T促进PBMC细胞分泌趋化因子IP-10对应的EC₅₀值分别为：0.0052μg/ml和0.0054μg/ml，两者促进PBMC细胞分泌趋化因子IP-10的活性基本接近，而分泌的趋化因子IP-10可趋化活化单核细胞和T细胞。

实施例7 T细胞增殖实验

PBMC细胞分离方法同实施例4，用CD3⁺T细胞分离试剂盒(Mojosort TM Human CD3T cell Isolation Kit,Biolegend)从PBMC中分离CD3呈现阳性的T细胞(即CD3⁺T细胞)。实验前一日用1μg/ml抗CD3抗体(Recombinant Anti-CD3 mAb，novoprotein)分别和10μg/ml抗体VSTB112、P48-6-K、同型对照IgG1共同铺板，4℃过夜，PBS洗两次后按10万/孔加入CD3⁺T细胞，体积100μL，3天后用CellTiter(CellTiter-GloTM，Promega)检测细胞增殖情况。

如图3所示，抗体P48-6-K和抗CD3抗体共包板情况下，能促进T细胞增殖。

实施例8抗肿瘤作用

实验小鼠：雌性BALBc-hVISTA小鼠(VISTA人源化的小鼠，来源于江苏集萃药康生物科技有限公司)。实验细胞：收集对数生长期的CT26.WT(结直肠癌)细胞，去除培养液、洗涤后接种；接种量：5×10⁵cells/100μL/只；接种位置：小鼠右侧背部大腿上方。分组给药：当肿瘤细胞接种3天后，根据小鼠体重随机分成3组，每组10只；给药途径为腹腔注射(i.p.)，给药频率为每周两次(BIW)；接种当天定义为D0天，并于分组当天，根据实验方案设计开始给药；给药剂量和给药方式如表9所示，给药体积：按照10μL/g计算。

细胞接种后，每周常规监测肿瘤对动物正常行为的影响。具体内容：实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。试验过程中观察到的临床症状均记录在原始数据中。开始给药后，第一周称量体重2次，测量肿瘤体积2次；随后每周称量体重三次，测量肿瘤体积三次。肿瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm³)＝0.5×肿瘤长径×肿瘤短径²，肿瘤体积抑制率TGIT_v＝(1-给药组平均肿瘤体积/对照组平均肿瘤体积)×100％，肿瘤重量抑制率TGIT_w＝(1-给药组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量)×100％。

表9试验设计表

肿瘤体积抑制的结果如图4A、4B和表10A、10B所示，与G1组相比，在接种后第30天，抗体P48-6-T能显著抑制肿瘤生长。如图5所示，各组小鼠的体重之间无显著性差异。

表10A第30天的肿瘤体积抑制率

表10B第30天的肿瘤重量抑制率

组别	肿瘤平均重量(mean/g)	TGIT<sub>w</sub>
			G1	3.5918	—
G2	1.9705	45.14％
			G3	2.2349	37.78％

序列表

<110> 百奥泰生物制药股份有限公司

<120> 抗VISTA抗体及其应用

<150> CN202110333902.7

<151> 2021-03-29

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Tyr Asp Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ile Asp Gly His Phe Asp Ser Ser Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Ser Tyr Ala Val Asp Leu Ala Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asp Gly His Phe Asp Ser Ser Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ser Tyr Ala Val Asp Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Thr Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asp Gly His Phe Asp Ser Ser Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ser Tyr Ala Val Asp Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 12

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asp Gly His Phe Asp Ser Ser Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ser Tyr Ala Val Asp Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 13

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Thr Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asp Gly His Phe Asp Ser Ser Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ser Tyr Ala Val Asp Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 14

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 15

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys

20

<210> 17

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggagtttg gcctgagctg ggtgtttctg gtggctatcc tgaagggcgt gcagtgcgag 60

gtgcagctgg tggagagcgg cggcggactg gtgcagcctg gaggaagcct gcggctgagc 120

tgcgctgcca gcggatatat cttcaccggc tacgatatga gctgggtgcg gcaggccccc 180

ggcaagggat tggagtgggt gagcggcatc gatggccact ttgatagcag cttctacgcc 240

gactccgtga agggcaggtt caccatctcc cgggacaaca gcaagaatac cctgtacctg 300

cagatgaatt ccctgcgggc tgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtccagctac 360

gccgtggatc tggcttttga ttactggggc cagggtaccc tggttaccgt tagcagcgcg 420

agcaccaaag gcccgagcgt gtttccgctg gccccgagca gcaaaagcac cagcggtggc 480

accgcagcgc tgggttgcct ggtgaaagat tatttcccgg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1140

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1407

<210> 18

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgtccgtgc ccacccaggt gctgggcctg ctgctgctgt ggctgaccga cgccaggtgc 60

gatatccaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgcgtgacc 120

attacctgta gagcgagcca gggcattagc agctatctgg cgtggtacca gcagaaacca 180

ggtaaagcgc cgaaattatt aatttatgcg gcgagcagcc tgcaaagcgg cgtgccgagc 240

cgctttagcg gatccggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcaaccg 300

gaagactttg cgacctatta ttgccagcag cattatacca ccccgccgac ctttggccag 360

ggcaccaaag tggaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 702

<210> 19

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Met Gly Val Pro Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ser Trp Arg Trp Gly Ser

1 5 10 15

Leu Leu Phe Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Gly Pro Val Ala Ala

20 25 30

Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln

35 40 45

Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His

50 55 60

Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val

65 70 75 80

Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp

85 90 95

Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp

100 105 110

Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn

115 120 125

Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr

130 135 140

Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val

145 150 155 160

His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser

165 170 175

Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Asp Ser Glu Asn Ile Thr

180 185 190

Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu

195 200 205

Pro Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Ala Ala Ser Asn

210 215 220

Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Asn Ile Gln Gly Ile

225 230 235 240

Glu Asn Pro Gly Phe Glu Ala Ser Pro Pro Ala Gln Gly Ile Pro Glu

245 250 255

Ala Lys Val Arg His Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser

260 265 270

Glu Ser Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro

275 280 285

Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp

290 295 300

Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile

305 310

<210> 20

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atggagtttg gcctgagctg ggtgtttctg gtggctatcc tgaagggcgt gcagtgcgag 60

gtgcagctgg tggagagcgg cggcggactg gtgcagcctg gaggaagcct gcggctgagc 120

tgcgctgcca gcggatatat cttcaccggc tacgatatga gctgggtgcg gcaggccccc 180

ggcaagggat tggagtgggt gagcggcatc gatggccact ttgatagcag cttctacgcc 240

gactccgtga agggcaggtt caccatctcc cgggacaaca gcaagaatac cctgtacctg 300

cagatgaatt ccctgcgggc tgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtccagctac 360

gccgtggatc tggcttttga ttactggggc cagggtaccc tggttaccgt tagcagc 417

<210> 21

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atgtccgtgc ccacccaggt gctgggcctg ctgctgctgt ggctgaccga cgccaggtgc 60

gatatccaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgcgtgacc 120

attacctgta gagcgagcca gggcattagc agctatctgg cgtggtacca gcagaaacca 180

ggtaaagcgc cgaaattatt aatttatgcg gcgagcagcc tgcaaagcgg cgtgccgagc 240

cgctttagcg gatccggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcaaccg 300

gaagactttg cgacctatta ttgccagcag cattatacca ccccgccgac ctttggccag 360

ggcaccaaag tggaaattaa a 381

<210> 22

<211> 1014

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggtaccctgg ttaccgttag cagcgcgagc accaaaggcc cgagcgtgtt tccgctggcc 60

ccgagcagca aaagcaccag cggtggcacc gcagcgctgg gttgcctggt gaaagattat 120

ttcccggaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 180

ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 240

tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc 300

aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 360

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 420

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 480

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 540

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 600

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 660

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 720

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 780

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 840

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 900

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 960

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 1014

<210> 23

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

Claims (11)

1.一种与VISTA结合的抗体或抗原结合片段，

所述抗体或抗原结合片段特异性结合VISTA，并且包含以下中的一个或多个氨基酸序列：

(a)HCDR1，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(b)HCDR2，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(c)HCDR3，其包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(d)LCDR1，其包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(e)LCDR2，其包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成；

(f)LCDR3，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6相比具有单一位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，或由其组成。

2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如SEQ IDNO:1所示的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的HCDR2、如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；和/或

所述抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、如SEQ ID NO:5所示的LCDR2和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3。

3.如权利要求1-2任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的HCDR2、如SEQ ID NO:3所示的HCDR3、如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、如SEQ ID NO:5所示的LCDR2和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3。

4.如权利要求1-3任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:7或8所示的序列，与SEQ ID NO:7或8所示序列具有相比至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:7或8所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列，或由其组成；和/或

所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:9所示的序列，与SEQ ID NO:9所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:9所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列，或由其组成。

5.如权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:9所示的序列；或

所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:8所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:9所示的序列。

6.如权利要求1-5任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的序列，或与SEQ ID NO:10所述序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:10所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列，或由其组成；和/或

所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的序列，或与SEQ ID NO:11所述序列相比具有至少80％同一性的序列，或与SEQ ID NO:11所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列，或由其组成。

7.一种与VISTA结合的抗体，所述抗体的重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的序列；或

所述抗体的重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的序列。

8.一种生物材料，为

(1)多聚核苷酸，其编码如权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求7所述的抗体；

(2)载体，其包含编码如权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求7所述的抗体的多聚核苷酸；

(3)宿主细胞，其包含编码如权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求7所述的抗体的多聚核苷酸。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求7所述的抗体；或者，还包含药学上可接受的载体。

10.诊断或预后试剂盒，其包含如权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求7所述的抗体；任选的，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗VISTA抗体；任选的，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶；任选的，所述试剂盒用于检测VISTA在样品中的存在或其水平；任选的，所述试剂盒还包括针对其它抗原的抗体或抗原结合片段，和/或细胞毒性剂，和任选的，使用说明书。

11.治疗或预防肿瘤、癌症或感染的方法和用途，包括向受试者施用治疗有效量的如权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合片段、如权利要求7所述的抗体或如权利要求9所述的药物组合物，其中所述疾病为T细胞功能障碍病症；或者，所述疾病为肿瘤、癌症、感染。

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